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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM
BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO
GROSSO
LAURA PEIXOTO DE ARRUDA
C u i a b á - MT
2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO MOLECULAR DE HERPESVÍRUS BOVINO (BOHV) EM
BOVINOS COM DOENÇAS NEUROLÓGICAS NO ESTADO DE MATO
GROSSO
Autor: Laura Peixoto de Arruda Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel. Co-Orientador: Prof. Luciano Nakazato
C u i a b á - MT
2009
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
O p Arruda, Laura Peixoto. Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina. Laura Peixoto de Arruda - Cuiabá, 2009. 63f. Dissertação (Mestre em Ciência Veterinária) – Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso. Orientador(a): Prof Dr. Edson Moleta Colodel Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Nakazato 1. Medicina Veterinária. 2. Patologia Veterinária. 3. Herpesvírus Bovino (BoHV-1 e BoHV-5) 4. Reação em cadeia pela Polimerase 5. Doenças neurológicas 6. Mato Grosso I. Universidade Federal de Mato Grosso CDU
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Aluna: LAURA PEIXOTO DE ARRUDA
Título: Detecção molecular de Herpesvírus Bovino (BoHV) em bovinos com
doenças neurológicas no Estado de Mato Grosso.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Federal de Mato Grosso para a
obtenção do título de Mestre em Ciências
Veterinárias
Aprovado em:
Banca Examinadora:
Prof. Dr.: Edson Moleta Colodel (Orientador)
Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT
Assinatura:___________________________
Prof. Dr.: Ricardo Antônio Amaral de Lemos (Membro)
Instituição: FMVZ/UFMS
Assinatura:___________________________
Profª. Dra.: Caroline Argenta Pescador (Membro)
Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT
Assinatura:___________________________
Profº. Dr.: Luciano Nakazato (Suplente)
Instituição:CLIMEV/FAMEV/UFMT
Assinatura:___________________________
Dedicatória
Dedico este trabalho à Laurita e Anacleto, meus queridos pais, os maiores dharmas que ganhei na minha existência; aos meus irmãos Felipe e Thales, que também sempre foram dharmas na minha vida. Juntos, formamos o quinteto fantástico.
Agradecimentos
A Deus, à minha Mãe e meu Pai, por me impulsionarem a cada dia nesta
existência difícil.
Aos meus pais Anacleto e Laurita, os quais sempre estiveram ao meu lado,
fonte eterna de carinho, compreensão, amor, exemplo, dedicação, apoio, e que
tornaram possível a realização deste mestrado.
Aos meus irmãos Felipe, Thales e também Larissa, por toda a companhia,
amor e carinho, principalmente todos os dias quando eu chegava à noite em casa e
cansada. Obrigada pelas brincadeiras, piadas, abraços, sustos, puxões de orelha,
ombro para desabafar e por todos os momentos de alegria, estresse, ansiedade ou
tristeza vividos.
Ao meu orientador Edson Moleta Colodel, por todo aprendizado que tive, pela
paciência em todas as situações difíceis ou estressantes, pelo companheirismo em
todos os momentos compartilhados no laboratório ou fora dele, por toda ajuda, por
toda compreensão, por ser um exemplo de sabedoria, e sabe, sempre me
entusiasmei e fiquei feliz ao ser chamada de uma das “crias do Moleta”.
À equipe do laboratório de Patologia Veterinária da UFMT (LPV-UFMT), cuja
convivência diária chegou a ser quase maior do que com minha própria família,
sendo, portanto, minha segunda família por todo este período. Primeiramente à
Raquel e Naiani, que me proporcionaram infinitos motivos para sorrir, tornaram mais
fáceis e divertidas as diversas situações estressantes ou trabalhosas vividas no lab
e fora dele. Amigas eternas. Agradeço também à Fabiana Boabaid, Zebu (Eduardo),
Nádia, Patrícia, Danúbia, Paulo Ricardo, Frodo e Sam (Gustavo e Flávio), Mayara,
Natália, Pâmela, Daniel, Salsicha, também ao técnico e amigo Manoel, por todos os
momentos inesquecíveis vividos.
Ao professores amigos queridos Marcos Souza e Caroline Pescador, por
todo aprendizado, ajuda e companheirismo que me proporcionaram no LPV.
À minha querida amiga e psicóloga Evelyn Arruda, pelos ótimos momentos de
alegrias e risadas, pelo apoio, paciência, pela parceria ímpar e por todos os
passeios de moto quando eu sempre cantarolava na garupa.
Aos meus queridos companheiros de Orquestra Sinfônica da UFMT, em
especial meu professor de trompa e amigo Edson Lopes, Odenil, Patrícia Andrade,
Cecília, maestro Fabrício e demais músicos. Confesso que esta terceira família me
proporcionou sempre um maravilhoso bem estar quando as diversas músicas e
sinfonias faziam parte das nossas vidas.
Aos amigos distantes Luciana Dalcin, Eduardo Guaraná, Rodrigo Prado, aos
parentes distantes Romeuzinho e Raquel Peixoto, Lídia, Nanci, Reginalda, Aridelço,
que mesmo não estando sempre presentes, me acompanharam nesta jornada.
Também aos amigos Baby (Bárbara Provenzano), Lucas Andreatta, Fernando e
Ricardo Moraes, Marcos Zarzenon, Rafael Paes, Simone e Tatiane Hirata, Hilvanete,
Juliana Normando e Ana Paula Nicolini, pela amizade e convivência nos mais
diversos momentos.
Ao “Lê”, “huumm”, “Shrimp”, meu anjo, meu lindo Leandro Lima Uliano, que
me faz até faltar as palavras. Conseguiu me fazer companhia e ser tão presente em
minha vida mesmo estando distante.
Aos avós Avany, Anacleto e também vovó Laura, embora eu não faça mais
parte da sua memória em função do Alzheimer.
Ao laboratório de Microbiologia Veterinária e Biologia Molecular Veterinária,
em especial ao professor e co-orientador Luciano Nakazato, Professora Valéria
Dutra, por todo auxílio e acompanhamento; à Daphine e Juçara, pelo aprendizado,
paciência e por serem meu primeiro socorro quando as dúvidas apareciam. Aos
mestrandos Ana Carolina e João, por todo companheirismo e compartilhar os
diversos momentos noturnos, finais de semana e até a incrível situação de falta de
luz; a amizade e todas as situações vividas são inesquecíveis.
Aos meus novos amigos da Unic, em especial ao querido amigo e
companheiro de trabalho Dulcindo, à Glenda Teles e demais estagiários do
Laboratório de Patologia do Hovet-Unic e ao Lázaro Camargo, chefe e amigo ao
qual eu admiro intensamente por ser um exemplo de pessoa e profissional.
Aos animais, em especial July, Cléo e Figura. Ao Tufo e Flecha, que deixaram
saudades, e a todos os animais que contribuíram para o conhecimento e
aprendizado.
RESUMO
Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do sistema
nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de técnicas
moleculares para caracterização diagnóstica representa uma contribuição importante
para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de técnica específica de PCR
multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em
76 amostras de encéfalo de bovinos fixados em formol e incluídos em parafina, com
9 destas em duplicidade para tecidos congelados. Com base nas alterações
histológicas as amostras foram separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de
meningoencefalite necrosante com características histológicas de infecção por BoHV
houve amplificação de DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com
lesões histológicas classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu
amplificação do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de
BoHV-1 nos encéfalo estudadas.
Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato
Grosso.
ABSTRACT
Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the
Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques
represents an important contribution for herpesvirus study. This report describes the
detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR assay in seventy-six
central nervous system (CNS) samples including paraffin-embedded, and in nine
samples those both in fresh frozen and paraffin-embedded. The samples were
divided in 2 groups according to histological features: Group 1-necrotizing
meningoencephalitis characteristic of BoHV infecction (40 samples), Group 2-
mononuclear encephalitis nonspecific (36 samples). The positive case for BoHV-5 in
paraffin-embebbed tissues in each group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1
was negative in all samples tested.
Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1: Meningoencefalite por Herpesvírus bovino. A- Infiltrado
inflamatório mononuclear perivascular moderado (manguito
perivascular). HE. Obj. 40X. B- Corpúsculo de inclusão
intranuclear eosinofílico em astrócito (seta). HE. Obj. 100X.
Figura 2: Meningoencefalite necrosante. A- Desaparecimento do
córtex encefálico e infiltrado inflamatório predominando
macrófagos (células guitter). HE. Obj 10X. B- Células
guitter em fagocitose (detalhe da Fig. 2.A ). HE. Obj 40X
Figura 3: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5.
Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostras em
parafina.
Figura 4: PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5.
Eletroforese em gel de agarose a 2%. Amostra congelada.
57
57
58
58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP: adenosina trifosfato
BoHV-1.3: Herpesvírus Bovino tipo 1.3
BoHV-1: Herpesvírus Bovino tipo 1
BoHV-5: Herpesvírus Bovino tipo 5
BSE: Encefalopatia Espongiforme Transmissível
BT: células turbinadas de bovino para cultivo celular
DNA: ácido desoxirribonucléico
ELISA: enzime-linked immunosorbent assay
gB: glicoproteína B
HS1 e HS2: Herpes Simples Humano 1 e 2
IBR: Rinotraqueíte Infecciosa Bovina
IFD: Imunofluorescência direta
IHQ: imuno-histoquímica
IIC: Inoculação intracerebral em camundongo
IPV: Vulvovaginite Pustular Infecciosa
IPX: imunoperoxidase
Kb: kilobase
mg/kg: miligrama por kilo de peso vivo
Nested-PCR:
NO: óxido nítrico
pb: pares de base
PCR: Reação em cadeia pela polimerase
PEM: polioencefalomalacia
PI: pós-infecção
SNC: Sistema Nervoso Central
UC: região ultra curta do DNA
UL: região ultra longa do DNA
ANEXOS
Páginas
1. Protocolo de Extração de DNA – Material Congelado
2. Protocolo de Extração de DNA – Material em parafina
61
62
SUMÁRIO
Páginas
1. Introdução 15
2. Revisão Bibliográfica 17
2.1. Meningoencefalite por Herpesvírus tipo 5 17
2.1.1. Etiologia 17
2.1.2. Epidemiologia 18
2.1.3. Patogenia e sinais clínicos 20
2.1.4. Achados de necropsia e histopatológico 21
2.1.5. Diagnóstico 23
2.1.6. Diagnóstico Diferencial 25
2.1.6.1. Polioencefalomalacia 25
2.1.6.2. Meningoencefalites 28
2.1.7. Tratamento e profilaxia 28
3. Material e Métodos 29
4. Resultados 31
5. Discussão 32
6. Conclusão 35
Referências Bibliográficas 35
15
Considerações Iniciais
1. INTRODUÇÃO
Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem
um grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças
infecciosas e degenerativas (RIET-CORREA et al., 2002). A identificação, em
meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e o
surgimento da variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vCJD) realçou a
importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o
SNC (BARROS et al., 2006).
Na região Centro-Oeste, assim como em várias regiões do país as
principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas por vírus,
destacando-se entre elas a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre
catarral maligna (BARROS et al., 2006; SANCHES et al., 2000; MENDONÇA et
al., 2008). A polioencefalomalacia é uma doença degenerativa importante nesta
região, que pode estar associada com intoxicação por enxofre (GOULD, 1998),
sal (NAKAZATO et al., 2000), chumbo (DRIEMEIER & BARROS, 2007),
distúrbios no metabolismo da tiamina (LEMOS & RIET-CORREA, 2007), mas
que permanece com a patogenia ainda não completamente elucidada.
A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi
relatada no Estado de Mato Grosso (COLODEL et al., 2002) sendo a doença
neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da
raiva bovina (UBIALI et al., 2008).
O BoHV-5 é um vírus pertencente à família Herpesviridae, subfamília
Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN, 1992). Devido às
semelhanças com estirpes virais respiratórias e genitais, o BoHV-5 foi
inicialmente classificado como BoHV-1.3. Posteriormente, com base em
diferenças epidemiológicas, antigênicas e moleculares, houve a proposta de
reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a compor uma nova espécie da
família Herpesviridae. Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5
apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1 (DELHON et al., 2003). Embora
16
surtos de meningoencefalite por herpesvírus sejam previamente atribuídos a
BoHV-1 em países, como Austrália, Estados Unidos, Canadá e Uruguai, a
maior freqüência desta enfermidade tem sido observada principalmente no
hemisfério sul, em países como Argentina e Brasil (BARROS et al., 2006).
Neste último, a doença foi relatada no Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro, São
Paulo, Mato Grosso do Sul (SILVA et al., 2007a), Goiás (PAULA et al., 2005),
Pará (RIET-CORREA et al., 2006), Minas Gerais (GOMES et al., 2002) e Mato
Grosso (COLODEL et al., 2002).
A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico
que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o
BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas
respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos
classicamente atribuídos ao outro vírus (SILVA et al., 2007a; GOMES et al.,
2003).
Diversos estudos têm proposto a utilização de técnicas moleculares na
rotina de diagnóstico do BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e
nested-PCR (SILVA et al. 2007, CLAUS et al. 2005, ASHBAUGH et al. 1997,
ELY et al. 1996) sendo estas específicas e práticas, além de outras técnicas
existentes, a imuno-histoquímica (HÜBNER et al. 2005, VOGUEL et al. 2003,
MEYER et al. 2001), cultivo celular (SOUZA et al. 2002) e análise de restrição
enzimática (D’ARCE et al. 2002).
Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina
auxiliam a expansão do conhecimento sobre a importância dos herpevírus
bovinos permitindo estudos retrospectivos de prevalência de BoHV-5 e BoHV-
1, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade em diferenciação
sorológica não permitiam levantamento adequado da prevalência de infecção
por esses vírus (ROEHE et al. 1998).
Neste trabalho, demonstramos uma técnica para detecção molecular, de
Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5) e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1), em
amostras, infiltradas em parafina, de encéfalo de bovinos com doença
neurológica. Selecionamos amostras do arquivo do Laboratório de Patologia
Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) entre os
anos 1999 a 2008 que foram testadas negativas para Raiva e que tinham como
17
principais alterações meningoencefalite necrótica e meningoencefalite não
purulenta inespecífica.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Meningoencefalite por Herpesvirus tipo 5
2.1.1 ETIOLOGIA
O Herpesvirus Bovino tipo 5 (BoHV-5) é um vírus pertencente à família
Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus (ROIZMAN
et al., 1992). Nesta família estão incluídos importantes vírus como o Herpes
Simples Humano (HS1 e 2), vírus da doença de Aujeszky e da rinopneumonite
eqüina, entre outros (HALFEN & RIET-CORREA, 2007). Os vírus da subfamília
Alphaherpervirinae apresentam como características gerais o diâmetro de
aproximadamente 70 a 110 nm, genoma DNA linear de fita dupla com
aproximadamente 137 kilobases (Kb) constituído por uma região única longa
(UL) e outra única curta (US); nucleocapsídeo icosaédrico com 162
capsômeros e envelope glicoprotéico (FENNER et al., 1993). Os herpesvírus
codificam várias enzimas envolvidas no metabolismo do ácido nucléico como a
timidina kinase (TK), timidina sintetase, dUTPase e ribonucleotídeo redutase,
além daquelas que participam da síntese do DNA como a DNA polimerase, a
helicase e a primase (ROIZMAN et al., 1992). Atualmente são descritas 10
glicoproteínas do envelope viral, denominadas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK ,
gL, e gM. Estas glicoproteínas possuem diferentes propriedades antigênicas,
funções na replicação viral e interações com a célula infectada (ACKERMANN
et al., 1982). As glicoproteínas gB, gC e gD são importantes componentes
imunogênicos e estão envolvidas nas interações iniciais com a célula
hospedeira. A gC é considerada a mais imunogênica e está relacionada à
adsorção, enquanto a gB e a gD estão envolvidas na penetração e fusão da
18
partícula viral às células alvo (BABIUK et al., 1996). Uma das propriedades
biológicas mais importantes da família Herpesviridae é a habilidade de
estabelecer latência em neurônios dos gânglios sensoriais após a infecção
aguda (STEVENS, 1994). A capacidade de estabelecer e posteriormente
reativar da infecção latente desempenha um papel fundamental na
perpetuação desse vírus na natureza (ROCK, 1994).
Os primeiros isolamentos de herpesvírus a partir de animais com sinais
clínicos neurológicos foram atribuídos ao BoHV-1, vírus associado a várias
síndromes, tais como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite
pustular infecciosa (IPV), balanopostite, conjuntivite e abortos. Porém, estudos
preliminares já apontavam diferenças entre os herpesvírus isolados de focos de
encefalite, daqueles isolados de focos de problemas respiratórios e/ou genitais
(METZLER et al., 1986; RIET-CORRÊA et al., 1989; COLLINS et al., 1993;
D’OFFAY et al., 1993). Devido às semelhanças com estirpes virais respiratórias
e genitais, inicialmente o BoHV-5 foi classificado como BoHV-1.3.
Posteriormente, com base em diferenças epidemiológicas, antigênicas e
moleculares, houve a proposta de reclassificação, na qual o BoHV-5 passou a
compor uma nova espécie da família Herpesviridae. Entretanto, a maior
diferença entre o BoHV-1 e o BoHV-5 está na capacidade do BoHV-5 invadir e
replicar-se no SNC, determinando enfermidade neurológica (ROIZMAN et al.,
1992; BELKNAP et al., 1994). Com relação à composição genômica, o DNA do
BoHV-5 apresenta similaridade de 85% com o BoHV-1. Sugere-se que as
diferenças na seqüência de nucleotídeos entre esses dois vírus estejam
distribuídas por todo o genoma (CHOWDHURY, 1995).
2.1.2 EPIDEMIOLOGIA
A diferenciação sorológica entre o BoHV-1 e o BoHV-5 é de difícil
realização devido à ocorrência de reações cruzadas que não permitem o
estabelecimento da proporção de animais supostamente infectados com o
BoHV-1, que na verdade foram infectados com o BoHV-5. Dessa forma é
desconhecida a prevalência do BoHV-5 no mundo (ROEHE et al., 1997).
19
Porém, surtos de meningoencefalite necrosante herpética têm sido relatados
em vários países como Austrália (JOHNSTON et al., 1962), Estados Unidos
(BARENFUS et al., 1963), Hungria (BARTHA et al., 1969), Canadá (BECK,
1975), Argentina (CARRILLO et al., 1983) e Uruguai (DIAS et al., 1982). No
Brasil já foram descritos casos clínicos ocorridos nos Estados do Rio Grande
do Sul (RIET-CORRÊA et al., 1989; WEIBLEN et al., 1989; SCHILD et al.,
1994; ELIAS et al., 2004), Mato Grosso (COLODEL et al., 2002), Mato Grosso
do Sul (SALVADOR et al., 1998), Goiás (PAULA et al., 2005), São Paulo
(SALVADOR et al., 1998), Paraná (HALFEN & RIET-CORREA, 2007), Rio de
Janeiro, Minas Gerais (SILVA et al., 2007a; GOMES et al., 2002) e Pará (RIET-
CORRÊA et al., 2006). Embora não existam relatos da infecção em outros
Estados, sugere-se que o BoHV- 5 seja enzoótico em todo o país (SOUZA et
al., 2002).
A faixa etária acometida é ampla e a doença ocorre na forma de surtos
ou casos esporádicos. Em Mato Grosso, surtos de meningoencefalite por
herpes afetaram animais de 2 a 72 meses, embora o maior número de casos
ocorreu em bovinos com idade próxima a 24 meses (COLODEL et al., 2002).
No Rio Grande do Sul, surtos ocorrem em animais jovens, entre 1 e 18 meses
de idade (RISSI et al., 2006) embora em alguns casos sejam descritas
ocorrências até 2 anos e meio de idade (RIET-CORREA et al., 1996). No
Brasil, a maioria dos casos ocorre em animais jovens de 13-18 meses
(BARROS et al., 2006).
A morbidade e mortalidade geralmente são baixas, variando de 0,05 a
5% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006). Considerando a morbidade e
mortalidade estipulada dentro de um lote afetado, os índices de morbidade e
mortalidade variam entre 0,8 e 22% (COLODEL et al., 2002). A letalidade
geralmente é próxima a 100% (SALVADOR et al., 1998; RISSI et al., 2006)
embora em alguns surtos sejam encontrados índices de letalidade em torno de
75% ou menos (ELIAS et al., 2004).
A meningoencefalite por herpes não possui caráter sazonal e afeta
bovinos de ambos os sexos e diferentes raças. Atinge principalmente animais
criados extensivamente em pastagens e raramente ocorre em animais
confinados (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al. 2002;ELIAS et al., 2004).
Os surtos da doença geralmente estão associados a condições de estresse
20
relacionadas a diversas práticas de manejo, como desmame, castração,
vacinação, transporte, troca de pastos, modificações na alimentação ou
intempéries (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et al. 2006). A
enfermidade também pode estar associada a introdução de bovinos de outros
locais, favorecendo a disseminação viral em novos rebanhos (COLODEL et al.
2002; SALVADOR et al., 1998).
2.1.3 PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS
O Herpesvírus Bovino tipo 5 é transmitido principalmente por contato
direto, embora também possa ocorrer por contato indireto. A mucosa nasal,
orofaríngea e ocular são sítios de replicação primária. O vírus invade
terminações nervosas e é transportado ao encéfalo, onde o BoHV-5 pode se
replicar ativamente ou estabelecer latência (ENGELS & ACKERMANN, 1996;
VOGUEL et al., 2003). A principal via de acesso do vírus ao encéfalo, segundo
estudos experimentais em coelhos e bovinos, é através da mucosa nasal e
trato olfatório (VOGUEL et al. 2003; BELTRÃO et al., 2000) embora o vírus
possa utilizar outras rotas de acesso, como as fibras sensoriais e autonômicas
que compõem o nervo trigêmeo, sendo este um acesso mais lento e menos
eficiente (BELTRÃO et al., 2000; DIEL et al., 2005).
O período de incubação é em geral de 10-15 dias, mas o vírus pode ficar
latente, e a doença pode ocorrer vários meses após a infecção (PEREZ et al.,
2002). O gânglio de Gasser constitui o principal local de latência, embora o
DNA viral também seja detectado, por PCR, no córtex cerebral, tálamo,
mesencéfalo, ponte, medula, cerebelo e menos frequentemente no bulbo
olfatório (VOGUEL et al., 2003). A reativação e excreção do vírus pode ocorrer
naturalmente, em situações de estresse e experimentalmente com
administração de dexametasona (PEREZ et al., 2002; VOGUEL et al., 2003).
Geralmente, na reativação viral os animais não apresentam sinais clínicos, mas
em infecções experimentais em bovinos, o reaparecimento dos sinais e
desenvolvimento de enfermidade neurológica tem sido frequente (VOGUEL et
al., 2003; PEREZ et al., 2002). A eliminação de BoHV-5 ocorre até o 17º dia
21
pós-infecção (PI) nas secreções nasais e até o 9º dia PI nas secreções orais; o
pico de eliminação viral ocorre 4-7 dias PI (BARROS et al., 2006).
Os animais afetados apresentam sinais clínicos caracterizados por
anorexia, corrimento nasal e ocular, isolamento do rebanho (COLODEL et al.,
2002; SALVADOR et al., 1998, HALFEN & RIET, 2007), depressão profunda
(RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002;
RISSI et al., 2006), febre (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; RISSI et
al., 2006), sialorréia (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et
al., 2006), cegueira (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998;
COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006; HALFEN &
RIET 2007), nistagmo (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002),
marcha para trás ou andar em círculos (SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al.,
2004), pressão da cabeça contra objetos (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al.,
2004; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET 2007), tremores musculares
(COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004), deambular cambaleante,
inabilidade para ingestão de água ou apreensão de alimentos, paralisia da
língua (COLODEL et al., 2002; BARROS et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007),
bruxismo (ELIAS et al., 2004; BARROS et al., 2006), decúbito prolongado com
dificuldade para voltar à estação e, decúbito esternal evoluindo para decúbito
lateral, movimentos de pedalagem, opistótono e morte (RIET-CORREA et al.,
1989; SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004;
BARROS et al., 2006; RISSI et al., 2006; HALFEN & RIET, 2007). O curso da
enfermidade é de 3-15 dias, com evolução média de 6 dias (BARROS et al.,
2006). Nos casos de evolução mais longa os animais também apresentam
emagrecimento progressivo (SALVADOR et al., 1998).
2.1.4 ACHADOS DE NECROPSIA E HISTOPATOLÓGICO
Na necropsia com frequência não são evidenciadas lesões significativas
(SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001; COLODEL et al., 2002; RISSI et
al., 2006;). As alterações encontradas variam de acordo com a intensidade de
lesões degenerativas e inflamatórias do encéfalo. As principais alterações
22
macroscópicas incluem malácia cortical, comumente localizada no córtex
frontal telencefálico, iniciando como áreas tumefeitas, marrom-amareladas ou
hemorrágicas e que se tornam gelatinosas e acinzentadas com a progressão
da doença (SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002; BARROS et al.,
2006; RISSI et al., 2006). Em outras porções do encéfalo também são descritas
eventualmente a ocorrência de áreas gelatinosas na substância cinzenta
(malácia) do tálamo, núcleos da base e cápsula interna (ELIAS et al., 2004;
RISSI et al., 2006). Nos casos mais avançados ocorrem depressões
acentuadas indicando desaparecimento segmentar do córtex telencefálico, por
vezes com aspecto granular ao corte (COLODEL et al., 2002; ELIAS et al.,
2004; RISSI et al., 2006). Outras alterações encontradas incluem hiperemia
difusa das leptomeninges (RISSI et al., 2006; BARROS et al., 2006),
achatamento de circunvoluções, protrusão cerebelar pelo forâmen magno,
congestão e focos de hemorragia submeningeana (RIET-CORREA et al., 1989;
SALVADOR et al., 1998; COLODEL et al., 2002, PEREZ et al. 2002).
Microscopicamente, a infecção por herpesvírus causa meningoencefalite
não-supurativa com malácia em diversas áreas do SNC, caracterizada por
gliose focal e/ou difusa, infiltrado inflamatório perivascular misto, principalmente
composto por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, por vezes com número
discreto de neutrófilos, localizados tanto na substância branca quanto cinzenta,
mais pronunciados na substância branca, podendo formar até 16 camadas
(SALVADOR et al., 1998; ELIAS et al., 2004). Há necrose não laminar
ocorrendo principalmente na substância cinzenta do córtex cerebral, cujas
alterações variam de acordo com o grau de evolução da doença. As lesões
mais recentes são caracterizadas por necrose neuronal aguda (neurônios
eosinofílicos e retraídos, satelitose, neuronofagia), tumefação do endotélio
vascular, aumento do espaço perineuronal e perivascular, espongiose da
neurópila em camadas corticais profundas (COLODEL et al., 2002; BARROS et
al., 2006). Corpúsculos de inclusão eosinofílicos intranucleares são observados
em neurônios, mas principalmente astrócitos tumefeitos com núcleo aumentado
de volume e com cromatina rebatida formando um halo periférico.
Ocasionalmente, são encontrados corpúsculos basofílicos que ocupam todo o
núcleo de tamanho aumentado (RIET-CORREA et al., 1989;; SALVADOR et
al., 1998;COLODEL et al., 2002; RISSI et al., 2006). Em alguns relatos os
23
corpúsculos de inclusão não são encontrados (BARENFUS et al., 1963;
CARRILLO et al., 1983) ou raramente vistos (GEORGE et al., 1991). Com a
progressão da enfermidade, superior a 3 dias observa-se infiltrado de
macrófagos de citoplasma espumoso (células Gitter) nas áreas de malácia e
região submeningeana. Ocasionalmente encontram-se áreas descorticadas,
com substituição da neurópila por células Gitter e as meninges repousando
sobre os vasos sanguíneos. No tálamo, cápsula interna, núcleos da base,
tubérculo quadrigêmeo, ponte, cerebelo e medula oblonga e medula cervical a
malácia geralmente é caracterizada por múltiplos nódulos gliais nos casos
menos avançados e por acúmulos focais de macrófagos nos casos com lesões
mais severas (SALVADOR et al., 1998) ou também são vizualizadas áreas
contendo neurônios retraídos, fortemente eosinofílicos, gliose difusa ou
multifocal e aumento dos espaços perivasculares (ELIAS et al., 2004). Segundo
RISSI et al. (2006) a intensidade das lesões quanto a localização no encéfalo,
foi mais acentuada, em ordem decrescente, na região cortical dos lobos
frontais do telencéfalo, na cápsula interna e núcleos da base, no tálamo, no
tronco encefálico, no córtex parietal, córtex occipital e cerebelo.
2.1.5 DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da Meningoencefalite por Herpesvírus tipo 5 pode ser
presuntivo com base na anamnese, epidemiologia, sinais clínicos, achados de
necropsia e histopatológicos característicos (ELIAS et al., 2004; RISSI et al.,
2006; COLODEL et al., 2006). No entanto, a histopatologia associada a
inclusões intranucleares não distingue entre BoHV-5 e BoHV-1.
No diagnóstico laboratorial indireto, a sorologia tem valor limitado, uma
vez que os métodos rotineiros disponíveis para a detecção de anticorpos não
diferenciam animais infectados pelo BoHV-5 daqueles infectados pelo BoHV-1
(TEIXEIRA et al., 2001). Entretanto, há diferenciação sorológica entre os dois
vírus através da técnica ELISA de bloqueio monoclonal para glicoproteína E
(gE) de BoHV-1, que permite distinguir anticorpos anti-BoHV-1 de anticorpos
anti-BoHV-5 (WELLEMBERG et al., 2001).
24
As técnicas de diagnóstico confirmatórias envolvem o isolamento do
BoHV- 5 do encéfalo ou de secreção nasal dos animais doentes, podendo ser
realizado em células de linhagem de rim bovino CRIB, MDBK (Madin Darby
bovine kidney), cultivos primários de células de testículo de terneiro (TT), de
pulmão de feto bovino e de células turbinadas de bovino (BT),observando o
efeito citopático e confirmação através de testes de soroneutralização ou
imunofluorescência (RIET-CORRÊA et al., 1989; BELKNAP et al., 1994;
D’OFFAY et al., 1995; SALVADOR et al., 1998; MEYER et al., 2001;
KUNRATH et al., 2004), cuja distinção entre BoHV-5 e BoHV-1 pode ser
realizada através de utilização de anticorpos monoclonais contra as
glicoproteínas do envelope viral (OLDONI et al., 2004; KUNRATH et al., 2004).
O mesmo pode ser realizado através da prova de imunoperoxidase (IPX) sobre
cultivo de células infectadas (ROEHE et al., 1997; VOGUEL et al., 2002).
Em tecidos fixados em formol e inclusos em parafina, a imuno-
histoquímica (IHQ) é a técnica mais indicada. A marcação por anticorpo
primário para BoHV-5 detecta antígenos virais com concentrações diferentes
em vários locais do sistema nervoso central, sendo mais intenso na região
cortical do telencéfalo. Há marcação de neurônios, células da glia, macrófagos
(D’OFFAY et al., 1995) e células mononucleares do infiltrado perivascular
(HÜBNER et al., 2005). A otimização da técnica permite a detecção inclusive
em material de arquivo, através de métodos adequados de recuperação
antigênica associado a anticorpos eficazes na detecção de BoHV-5 (HÜBNER
et al., 2005). Geralmente, a quantidade de vírus isolado não tem correlação
com a detecção através da IHQ. A técnica revela a presença de antígenos do
BoHV-5 essencialmente nos locais do SNC que demonstram lesões
inflamatórias (MEYER et al., 2001).
As técnicas moleculares, para a detecção do genoma viral, como a PCR
e nested-PCR (GOMES et al., 2002) podem ser empregadas com sucesso para
o diagnóstico da infecção pelo BoHV-5. O multiplex PCR foi desenvolvido para
diferenciação de BoHV-1 e BoHV-5 simultaneamente a partir da codificação de
região genômica da glicoproteína B (COSTA et al., 2005), glicoproteína D
(ALEGRE et al., 2001) ou glicoproteína C (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS et
al., 2005). A técnica tem sido empregada tanto em tecido fresco quanto em
material incluso em parafina (ELY et al., 1996; GOMES et al., 2002; FERRARI
25
et al., 2007). Também pode ser utilizada além destas técnicas, a análise de
restrição enzimática no genoma (D’ARCE et al., 2002) para diferenciação entre
os dois herpesvírus.
2.1.6 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é o agente causador da
meningoencefalite herpética em bovinos (ROIZMAN et al., 1992), embora
ocasionalmente o herpesvírus bovino tipo 1(BHV-1) possa também causar
encefalites (SILVA et al., 2007a). A enfermidade pode ser confundida com
polioencefalomalacia, intoxicação pelo chumbo e outros agentes que
conduzam a sinais clínicos neurológicos (RIET-CORREA et al., 2002).
2.1.6.1 Polioencefalomalacia
Polioencefalomalacia (PEM) é um termo descritivo para a necrose com
amolecimento (malácia) da substância cinzenta (pólio) do encéfalo, também
designada necrose cerebrocortical (BARROS et al., 2006). O termo PEM, no
entanto, tem gerado controvérsia, pois foi empregado para designar uma
doença específica de ruminantes associada à deficiência de tiamina, e não
somente a uma lesão (JENSEN et al., 1956). Portanto, polioencefalomalacia
pode ser um termo utilizado em doenças como a intoxicação por sal (privação
hídrica) em suínos e bovinos (NAKAZATO et al., 2000), intoxicação por
chumbo em bovinos (DRIEMEIER & BARROS et al., 2007), meningoencefalite
por BoHV-5 (RIET-CORREA et al., 2006) e intoxicação por enxofre (GOULD,
1998).
Também se denomina como polioencefalomalacia uma doença
neurológica associada a distúrbios do metabolismo da tiamina. Os ruminantes
dependem de síntese de tiamina pelas bactérias ruminais, portanto, alterações
da flora ruminal podem levar à diminuição na produção de tiamina por falta de
26
bactérias que a sintetizam ou por presença de bactérias que produzem
tiaminases,que hidrolizam a tiamina (JENSEN et al., 1956; LEMOS & RIET-
CORREA, 2007). A deficiência de tiamina causa alteração da glicólise e
alteração da produção de ATP, pois é cofator para enzima transcetolase que
atua na via pentose fosfato, essencial para produção da maioria do ATP. A
tiamnina também é cofator de outras enzimas do cliclo de Krebs (CEBRA &
CEBRA, 2004).
No Brasil, a PEM tem sido diagnosticada em vários Estados, sem que a
etiologia tenha sido esclarecida. Alguns surtos são associados com intoxicação
por cloreto de sódio/privação hídrica e outros a altos níveis de enxofre (LEMOS
& RIET-CORREA, 2007). Ocorre principalmente em bovinos adultos, em
pastejo extensivo, apresentando-se tanto na forma isolada como em surtos,
com morbidade variando em torno de 1%, podendo chegar a 14%, e letalidade
de 43% a 100% (BARROS et al., 2006).
Os sinais clínicos são diversos, incluindo cegueira total ou parcial de
origem central, andar a esmo ou em círculos, movimentos involuntários,
incoordenação, tremores musculares, pressão da cabeça contra objetos,
opistótono, nistagmo, estrabismo lateral, ataxia, diminuição dos reflexos
palpebral e pupilar, diminuição do tônus da língua, depressão, tendência a
afastar-se do rebanho, decúbito esternal e lateral e morte. Nas fases iniciais o
animal pode apresentar agressividade e excitação (NAKAZATO et al., 2000;
CEBRA & CEBRA, 2004; LIMA et al., 2005; LEMOS & RIET-CORREA, 2007;
KUL et al., 2006; BARROS et al., 2006).
Os achados de necropsia variam com a severidade e curso clínico da
doença. Nos estudos de NAKAZATO et al. (2000) a maioria dos casos de PEM
não havia relato de alterações macroscópicas. Dentre as alterações freqüentes,
nos casos de evolução rápida o encéfalo está tumefeito por edema com
achatamento dos giros cerebrais e herniação da porção caudal do telencéfalo
pelo forâmen magno. As lesões corticais do telencéfalo variam desde
alterações leves de cor (marrom-amarelada) até amolecimento e alteração
acentuada na coloração do córtex telencefálico. Nos casos com evolução mais
prolongada nota-se encéfalos de tamanho reduzido com desaparecimento do
córtex cerebral (NAKAZATO et al., 2000; LIMA et al., 2005; BARROS et al.,
2006).
27
Histologicamente a PEM se caracteriza por necrose laminar do córtex
cerebral, observando-se aumento dos espaços perineuronais e perivasculares,
e aumento da eosinofilia do citoplasma neuronal com picnose, proliferação dos
vasos sangüíneos com células endoteliais tumefeitas e de núcleos
arredondados (NAKAZATO et al., 2000), vacuolização da neurópila, esferóides
axonais, hemorragias e discretos astrócitos reativos, gliose e infiltrado
inflamatório mononuclear (LIMA et al., 2005). Dependendo do tempo de
evolução é seguida de infiltração por macrófagos grandes com núcleos
periféricos e citoplasma espumoso (células gitter) e cavitação. Em casos
crônicos o córtex é substituído por células gitter. Pode ocorrer malácia dos
núcleos da base, tálamo e mesencéfalo (LEMOS & RIET-CORREA, 2007). Nos
casos associados à intoxicação por cloreto de sódio podem ocorrer discreta a
moderada infiltração de eosinófilos principalmente nos espaços
submeningeanos e perivasculares do córtex cerebral, e em alguns casos na
neurópila, associados a hemorragia moderada a severa (NAKAZATO et al.,
2000).
O diagnóstico é realizado com base nos achados histopatológicos e
reforçado pela epidemiologia, quadro clínico, achados de necropsia. A resposta
ao tratamento com tiamina também auxilia o diagnóstico. As dosagens dos
níveis de enxofre da água e pastagem, somando-se às quantidades da mistura
mineral e verificando as quantidades consumidas pelos animais, complementa
os quadros suspeitos de intoxicação por enxofre, assim como o nível de gás
sulfeto de hidrogênio da camada gasosa dorsal do rúmen (LIMA et al., 2005;
BARROS et al., 2006). Em suspeitas de intoxicação por sal, a confirmação
pode ser obtida por dosagem dos níveis de sódio no líquor. A
meningoencefalite por BoHV-5 possui semelhanças histológicas que dificultam
e podem confundir com PEM, principalmente devido às extensas áreas de
malácia cortical e infiltrado de células gitter. A diferenciação pode ser feita pela
presença de lesões inflamatórias na substância branca e corpúsculos de
inclusão intranucleares nos casos de infecção por BoHV-5 (LEMOS & RIET-
CORREA, 2007).
No início da enfermidade, os animais apresentam boa resposta ao
tratamento com 10-20mg/kg de tiamina e 0,2mg/kg de dexametasona via
intramuscular, repetindo o protocolo a cada 4 ou 6 horas, dependendo da
28
gravidade do caso (BARROS et al., 2006). Desconhece-se se a tiamina tem
alguma ação no tratamento da intoxicação por cloreto de sódio, mas nos casos
observados no Uruguai não houve resposta ao tratamento com tiamina
(LEMOS & RIET-CORREA, 2007).
2.1.6.2 Meningoencefalites
Diversas doenças infecciosas em bovinos causam alterações
microscópicas relacionadas a inflamações do sistema nervoso central,
caracterizadas por infiltrado inflamatório perivascular, vasculite, infiltrado
inflamatório meningeano, gliose multifocal ou difusa. As doenças de origem
viral causam inflamações não-supurativas, predominando linfócitos,
plasmócitos e macrófagos; por vezes há infiltrado inflamatório misto com
predomínio de células mononucleares (BARROS et al., 2006). No Brasil, a
Raiva é a principal doença inflamatória de origem viral do sistema nervoso de
bovinos, atribuído pelo caráter zoonótico e pelo índice elevado de ocorrência
em levantamentos realizados em animais que morreram com sintomatologia
nervosa (SANCHES et al., 2000; UBIALI et al., 2007). No estudo
histopatológico, nem sempre são visualizados corpúsculos de inclusão
intracitoplasmáticos, sendo as técnicas de Imunofluorescência direta (IFD) e
inoculação intracerebral em camundongos recém nascidos (IIC) os testes
padrões de diagnóstico (MAPA, 2005). Nos casos histologicamente
classificados como meningoencefalite ou meningoencefalomielite não-
supurativa aguda, o auxílio das técnicas IFD, IIC e imuno-histoquímica são
necessárias para relacionar a inflamação com a infecção pelo vírus da Raiva
(PEDROSO et al., 2008).
Além da raiva, outras enfermidades virais são importantes como causa
de inflamação no sistema nervoso em bovinos, como a Febre Catarral Maligna,
doença de Aujeszky (BARROS et al., 2006).
2.1.7 TRATAMENTO E PROFILAXIA
29
Nos casos de meningoencefalite por herpes não há tratamento e
geralmente a letalidade é próxima a 100%. Há animais que se recuperam mas
o percentual é baixo (RIET-CORREA et al., 1989; ELIAS et al, 2004). Não há
medidas de controle e profiláticas diretas para os casos de infecção por BoHV-
5. A doença pode ser minimizada reduzindo situações de estresse,
principalmente no desmame, quando há diminuição dos níveis de anticorpos da
imunidade passiva (RISSI et al., 2006). Adicionalmente há necessidade de
examinar animais antes da introdução dos mesmos no plantel, podendo testá-
los sorologicamente; isolar animais afetados e eliminar do rebanho animais
sorologicamente positivos quando o número de animais reagentes for pequeno.
Como método de controle, principalmente em surtos, aponta-se a
vacinação do rebanho como uma possível alternativa. Estudos demonstram
que há proteção cruzada entre os vírus BoHV-1 e BoHV-5, pois a vacina
contendo antígenos apenas de BoHV-1 induz a produção de anticorpos com
atividade neutralizante contra o BoHV-5 (VOGUEL et al., 2002). Os testes in
vivo, de vacinas inativadas produzidas com amostra de BoHV-5, produzidas de
suspensões virais com títulos altos e adjuvante oleoso, induzem a produção de
níveis satisfatórios de anticorpos após a terceira dose (HALFEN et al., 2000).
Em coelhos, os animais imunizados com vacina contendo antígenos
para BoHV-1 obtiveram grau de proteção contra BoHV-5 (BELTRÃO et al.,
2000).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Nos anos 1999, 2000, 2005, 2006, 2007 e 2008, um total de 402 amostras de
encéfalo de bovinos com quadro clínico neurológico, foram coletadas por
veterinários autônomos e veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do
Mato Grosso (INDEA-MT) e encaminhadas ao Laboratório de Patologia
Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas
amostras foram negativas no teste de imunofluorescência direta e prova
30
biológica que caracterizam o diagnóstico de infecção pelo vírus da raiva. Deste
grupo foram selecionadas 76 amostras sendo assim distribuídas: 1999 (n=3),
2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26), 2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras
foram recebidas no LPV-UFMT em solução formalina e deste total, 9 amostras
de encéfalos foram encaminhadas contendo também fragmentos refrigerados e
congelados. Preferencialmente selecionaram-se fragmentos de regiões do
córtex telencefálico, corpo estriado, tálamo e mesencéfalo para análise
molecular, principalmente de áreas que tinham lesões microscópicas mais
evidentes. Algumas amostras (16) continham apenas medula oblonga e
cerebelo.
As amostras de encéfalo enviadas foram processadas por métodos
convencionais para análise histológica e coradas pela hematoxilina-eosina. As
amostras foram classificadas em dois grupos distintos: Grupo 1. Amostras
classificadas como meningoencefalite necrosante e não purulenta associadas
com BoHV-5, sendo caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório
mononuclear meningeano e perivascular, áreas multifocais de malácia com
gliose, células gitter e corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos e/ou
neurônios (em 9 amostras), representando 22,5% dos casos ou amostras com
lesões sugestivas de Meningoencefalite por BoHV-5, com lesões
características sem que se tenha encontrado corpúsculos de inclusão. Grupo
2. Amostras classificadas como encefalite não purulenta inespecífica, quando
havia apenas variável intensidade de infiltrado inflamatório mononuclear
perivascular, freqüentemente focal ou multifocal, e por vezes com infiltrado
meningeano discreto.
As amostras de encéfalo pertencentes a estes 2 grupos foram
submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para BoHV-1 e BoHV-5
(CLAUS et al. 2005). A extração de DNA foi obtida de amostras inclusas em
parafina ou material fresco congelado, por método fenol-clorofórmio
(SAMBROOK et al. 1989) modificado. Os primers utilizados foram B1,
específico para BoHV-1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3 nt. 185–204),
B5, para BoHV-5 (5-CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3nt. 322–339) e Bcon,
primer consenso [5-AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3nt. 519–538 (BoHV-1)
e nt. 461–480 (BoHV-5)]. A leitura foi feita por eletroforese em gel de agarose
2,0%, corados com brometo de etídeo e analisadas em transluminador (UV-
31
300nm). Controles negativos e positivos para BoHV1 e BHV5 foram inseridos
em cada PCR.
Além disso, testou-se 30 amostras de encéfalo bovino, aparentemente
sadios, sem alterações macro e microscópicas significativas. Estas amostras
foram obtidas em abatedouro com Inspeção Federal (SIF 585) mantendo-se
fragmentos de encéfalo sobre refrigeração e em solução de formalina 10% e
após 30 dias foram processados por técnicas rotineiras para estudo histológico.
Adicionalmente, de 11 bovinos deste grupo, coletaram-se amostras dos
gânglios de Gasser, que foram divididos, sendo que parte foi refrigerada e
parte foi mantida em solução de formalina 10%.
Para controle positivo da reação foi utilizado DNA provenientes dos
isolados SV-56/90 de BoHV-1 e SV-507/99 de BoHV-5 (SILVA et al. 2007a)
obtidas no Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria.
4 RESULTADOS
De 402 amostras de encéfalo de bovino, que foram testadas negativas para
raiva bovina nos anos 1999 e 2000, 2005 a 2008, encaminhadas para o LPV-
UFMT, 76 (18,90%) foram classificadas dentro dos dois Grupos de estudo
propostos para esse trabalho. Destas, 40 (52,63%) tinham lesões
características ou sugestivas de infecção por BoHV-5 (Grupo 1) e 36 (47,36%)
tinham encefalite não purulenta inespecífica (Grupo 2).
Neste estudo não houve amplificação de BoHV-1 em amostras inclusas
em parafina ou congeladas. Identificou-se DNA de BoHV-5 em material incluso
em parafina em 40% (16/40) das amostras do Grupo 1 e em 33,33% (12/36) do
Grupo 2 (Figuras 1 e 2).
Do total de 76 amostras enquadradas dentro dos dois grupos de estudo,
67 amostras possuíam apenas material incluso em parafina, que ficou por
diferentes períodos em solução de formol a 10%. Algumas amostras foram
deixadas por períodos longos de fixação, variando de menos de um mês até
32
pouco mais de um ano. Houve diminuição crescente de positividade
principalmente nas amostras que permaneciam fixadas por 50 dias ou mais.
Outras nove amostras tinham materiais de encéfalo em parafina e
conservados sob congelamento, seis pertencentes ao Grupo 1, e três ao Grupo
2. Identificou-se DNA de BoHV-5 em quatro das 6 amostras do Grupo 1 e em
duas das 3 amostras do Grupo 2. Dessas mesmas amostras em parafina,
apenas duas do Grupo 1 e uma do Grupo 2 foram positivas, havendo um
decréscimo em 50% de positividade das mesmas amostras quando a análise
foi realizada utilizando-se o material encaminhado em formalina e incluso em
parafina.
Dos materiais obtidos em frigorífico, uma amostra de gânglio Gasser
amplificou DNA de BoHV-5 em material congelado , as demais foram negativas
tanto para BoHV-5 como BoHV-1.
5 DISCUSSÃO
Nesse trabalho, detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5)
através da técnica de PCR em 40% das amostras do Grupo 1 e em 33,33%
das amostras do Grupo 2.
FERRARI et al. (2007) encontraram 75% de positividade na PCR para
BoHV-5 em amostras de encéfalos com meningoencefalite necrosante que
permaneceram por uma semana ou mais em formalina tamponada a 10%. Nos
estudos retrospectivos realizados por ELY et al. (1996), demonstraram que em
32 casos de meningoencefalite não supurativa, 7 (21,87%) amostras foram
detectadas como positivas para BoHV-5 e 1 (3,25%) detectado como BoHV-1,
através das técnicas PCR e imunoperoxidase em amostras inclusas em
parafina, as outras 24 amostras permaneceram sem diagnóstico. Em nosso
estudo as amostras ficaram por períodos variáveis em solução de formalina, de
poucos dias a mais de um ano. O tempo de fixação causa degradação do DNA
e compromete o resultado da análise (KARLSEN et al. 1994). Nos estudos de
GARMATZ et al. (2004), em 6 bovinos com diagnóstico histopatológico de febre
catarral maligna (FCM) resultaram negativos no teste da PCR, atribuindo-se ao
33
tempo prolongado de fixação em formol a discordância entre achados
histopatológicos característicos e os resultados do teste da PCR. Nos estudos
de CRAWFORD et al. (1999) a PCR para FCM, em períodos de fixação
superiores a 45 dias produziram resultados negativos ou fraco positivos.
A influência do tempo de fixação também pôde ser avaliada em relação
às amostras testadas fixadas em formalina e congeladas. Do total de 6
amostras positivas na PCR realizada em fragmentos de tecido congelado, a
positividade caiu em 50% quando realizada a PCR do mesmo material incluso
em parafina. Dentre as amostras com tecido congelado do Grupo 1, duas foram
negativas no PCR tanto em material fresco quanto incluso em parafina.
Quantidades insuficientes de DNA viral no tecido, quantidade escassa de
amostra e falhas na extração do DNA são as principais causas que podem
levar a ocorrência de resultados negativos, assim como ausência do DNA.
Encefalite não-purulenta inespecífica é frequentemente encontrada em
bovinos em nosso laboratório (UBIALI et al. 2008), aparenta uma condição
inflamatória no encéfalo mas sem caracteristicas morfológicas compatíveis com
etiológicas conhecidas. Esta lesão é por vezes encontrada em bovinos sem
manifestação clínica neurológica, incluindo amostras obtidas em frigoríficos. No
presente estudo, todas as amostras do Grupo 2 eram de bovinos que tinham
no histórico sinais clínicos de distúrbios no sistema nervoso central e em 33,3%
das amostras havia DNA de BoHV-5, o que caracteriza nestas amostras a
infecção pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 como determinante do quadro clínico-
patológico. Sabe-se que nem todos os casos de meningoencefalite por herpes
apresentam a característica evidente de malácia. Nos estudos de RISSI et al.
(2006), em um estudo de 19 casos, todos os bovinos apresentavam como
principal característica a meningoencefalie não-supurativa, sendo apenas
alguns casos destes com malácia, variando quanto à localização e intensidade.
Há também estudos de cepas de BoHV-5 com neurovirulência diferentes, o que
poderia determinar padrões morfológicos distintos (FLORES et al. 2009). Para
determinar a importância deste achado, a ausência de amplificação de BoHV-5
em 77% das amostras pode ter ocorrido devido as amostras serem negativas
ou falso-negativas relacionadas ao local de coleta. A coleta e encaminhamento
de amostras de locais pertinentes são importantes para confiabilidade
diagnóstica dos resultados. Trabalhos em bovinos infectados
34
experimentalmente por BoHV-5 relatam que o vírus encontra-se na maioria dos
casos presente no córtex frontal, gânglio de Gasser, mesencéfalo e tálamo
(VOGUEL et al. 2003). Dentre as 36 amostras do Grupo 2, doze foram
encaminhadas ao laboratório, sem partes pertinentes principais, impedindo
análise histológica de locais onde as lesões são mais constantes, ou
diferenciação entre outras patologias que causam lesões histológicas
semelhantes. Também é necessário diferenciar a infecção do BoHV com
outras infecções virais que acomete bovinos, principalmente pela infecção
pelos vírus da raiva e febre catarral maligna. Neste estudo, as amostras foram
testadas para Raiva pelos métodos de imunofluorescência direta e prova
biológica, resultando negativas. Sabe-se que em alguns casos de raiva podem
ocorrer resultados discrepantes entre as duas provas laboratoriais de eleição
(PEIXOTO et al. 2000, LEMOS 2005) e, dependendo da localização das lesões
e das amostras analisadas, ambos diagnósticos podem ser negativos (SILVA et
al. 1974). A vasculite é a principal alteração em casos de febre catarral
maligna, porém infiltrado perivascular mononuclear são achados no encéfalo
de bovinos com esta patologia. A intensidade dessas lesões varia no sistema
nervoso central (SNC) de acordo com a região anatômica afetada. As lesões
mais proeminentes são encontradas nos vasos da rete mirabile carotídea,
leptomeninge, espaços de Virchow-Robin e lesões menos graves no
parênquima, especialmente na substância branca (GARMATZ 2004).
Dentre o Grupo de amostras obtidas em frigorífico uma amostra
amplificou BoHV-5, possivelmente associada característica do herpesvírus em
estabelecer latência em gânglios sensoriais após infecção aguda (VOGUEL et
al. 2003) e indicando a importância de associar as técnicas de caracterização
etiológica com a observação de alterações morfológicas para complementação
diagnóstica.
Neste estudo trabalhamos também com amostras de encéfalo de bovinos com
polioencefalomalacia (COLODEL, 2009 dados não publicados). BoHV-5 e
BoHV-1 têm sido isolados de casos onde não se observam lesões inflamatórias
significativas da infecção viral (RISSI et al. 2008, SILVA et al. 2007b). BoHV-5
pode ser detectado através do isolamento viral em caso caracterizado
histologicamente como PEM (COLODEL et al. 2002). Realizamos PCR para
BoHV-1 e BoHV-5 em 27 amostras inclusas em parafina, originárias de bovinos
35
com PEM no Estado de Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul. Dentre estas, 9
amostras amplificaram DNA de BoHV-5, sugerindo que o vírus poderia estar se
replicando em conseqüência de fatores relacionados com o desenvolvimento
de PEM, ou que estava em estado de latência (DAVID et al. 2007).
A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no
Estado de Mato Grosso é desconhecida. Meningoencefalite associada ao
BoHV-1 foi observada por SILVA et al. (2007a) em diferentes Estados; dentre
26 amostras isoladas de doença neurológica, cinco (19,3%) eram por BoHV-1.
A utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1
e BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras
testadas foram negativas para BoHV-1.
6 CONCLUSÃO
A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no
Estado de Mato Grosso é desconhecida. A utilização de um método molecular
para detectar simultaneamente BOHV- 1 e BoHV-5 facilita este levantamento.
No presente estudo, todas as amostras testadas obtiveram resultado negativo
para BoHV1.
Nos quatro grupos avaliados neste trabalho detectou-se DNA de
Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) através da técnica de PCR.
Existem diversos métodos de detecção de BoHV-5. Dentre eles, os mais
usados são imuno-histoquímica, PCR e isolamento viral. Entretanto, fatores
como intensidade e distribuição de lesões, autólise e tempo de fixação em
formol são variáveis importantes a serem levadas em consideração para que
se tenha sucesso no diagnóstico (ELY et al. 1996; KARLSEN et al. 1994).
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45
APÊNDICE A- Artigo submetido para a revista Pesquisa Veterinária
Brasileira
Detecção molecular de Herpesvírus Bovino tipo 1 e 5 (BoHV 1 e BoHV5)
em amostras de encéfalo de bovinos com doenças neurológicas no
Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas em parafina 1
Laura P. Arruda2, Luciano Nakazato3, Valéria Dutra3, Ricardo A. A. Lemos4,
Ana P.A. Nogueira4, Danielle A. das Neves5, Veronique M.C.L. Cortada5,
Raquel A.S. Cruz3, Caroline A. Pescador3, Edson M. Colodel3
ABSTRACT.- Arruda, L.P., Nakazato, L., Dutra, V., Lemos, R.A.A., Nogueira,
A.P.A., Das Neves, D.A., Cortada, V.M.C.L.,Cruz, R.A.S., Pescador, C.A. &
Colodel, E.M. 2008. [Molecular detection of Bovine Herpesvirus type 1 and
5 (BoHV) in formalin fixed and paraffin-embedded samples of neurological
diseases in cattle of Mato Grosso State, Brazil]. Detecção molecular do
Herpesvírus Bovino (BoHV) em amostras de encéfalo de bovinos com doenças
neurológicas no Estado de Mato Grosso conservadas em formol e infiltradas
em parafina. Pesquisa Veterinária Brasileira. Departamento de Clínica
Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,
Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa s/n,
Bairro Coxipó, Cuiabá, MT 78068-900, Brazil. E-mail: moleta@ufmt.br
Herpesvirus is one of the main causes of neurological diseases of cattle in the
Midwest Region of Brazil. The application of molecular diagnostic techniques
represents an important contribution for herpesvirus study. This report
describes the detection of BoHV-5 and BoHV-1 by a specific multiplex PCR
1 Aceito em 2 Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT 78068-900. 3 Departamento de Clinica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá, MT 78068-900. email: moleta@ufmt.br 4 Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Cx. Postal 649, Campo Grande, MS 79070-900 5 Agência Estadual de Defesa Sanitária Animal e Vegetal de MS, Laboratório de Diagnóstico de Doenças Animais e Análises de Alimentos. R: Senador Filinto Muller, 1146 - Campo Grande, MS - 79074-902
46
assay in seventy-six central nervous system (CNS) samples including paraffin-
embedded, and in nine samples those both in fresh frozen and paraffin-
embedded. The samples were divided in 2 groups according to histological
features: Group 1-necrotizing meningoencephalitis characteristic of BoHV
infecction (40 samples), Group 2- mononuclear encephalitis nonspecific (36
samples). The positive case for BoHV-5 in paraffin-embebbed tissues in each
group was 40% and 33,3%, respectively. BoHV-1 was negative in all samples
tested. 6 Index terms: Bovine herpesvirus, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato Grosso.
RESUMO
Infecção por Herpesvirus é uma das principais causas de doença do
sistema nervoso em bovinos na região Centro-Oeste do Brasil. O uso de
técnicas moleculares para caracterização diagnóstica representa uma
contribuição importante para o estudo dessa doença. Relatamos o uso de
técnica específica de PCR multiplex para identificar o herpesvírus bovino tipo 5
(BoHV-5) e tipo 1 (BoHV-1) em 76 amostras de encéfalo de bovinos fixados
em formol e incluídos em parafina, com 9 destas em duplicidade para tecidos
congelados. Com base nas alterações histológicas as amostras foram
separadas em 2 grupos. Dentre 40 amostras de meningoencefalite necrosante
com características histológicas de infecção por BoHV houve amplificação de
DNA de BoHV-5 em 16 amostras e em 36 amostras com lesões histológicas
classificadas como encefalite não purulenta inespecífica ocorreu amplificação
do DNA de BoHV-5 em 12 amostras. Não houve amplificação de BoHV-1 nos
encéfalo estudadas.
Termos de indexação: Herpesvírus bovino, PCR, BoHV-1, BoHV-5, Mato
Grosso.
INTRODUÇÃO
47
Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos abrangem um
grupo de enfermidades importantes que incluem principalmente as doenças
infecciosas e degenerativas (Riet-Correa et al. 2002). A identificação, em
meados da década de 1980, da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e a
relação com a variante da doença humana Creutzfeldt-Jakob (vCJD) realçou a
importância socio-econômica e de saúde pública das doenças que acometem o
SNC (Barros et al. 2006).
As principais enfermidades que afetam o SNC de bovinos são causadas
por vírus, destacando-se a raiva, meningoencefalite por BoHV-5 e febre
catarral maligna (Barros et al. 2006; Sanches et al. 2000, Mendonça et al.
2008). A ocorrência de meningoencefalite por herpesvirus em bovino foi
relatada no Estado de Mato Grosso (Colodel et al. 2002) sendo a doença
neurológica inflamatória mais importante para bovinos no Estado, depois da
raiva bovina (Ubiali et al. 2008) e tem sido relatada em vários outros Estados,
como Rio Grande do Sul (Rissi et al. 2006), Rio de Janeiro (Silva et al. 2007),
São Paulo, Mato Grosso do Sul (Salvador et al. 1998), Goiás (Paula et al.
2005), Pará (Riet-Correa et al. 2006), Paraná e Minas Gerais (Claus et al.
2007; Gomes et al. 2002).
A infecção pelo BoHV-5 em bovinos determina um quadro neurológico
que inclui diversos sinais clínicos. Entretanto, estudos demonstram que tanto o
BoHV-1 como o BoHV-5 podem não estar estritamente associados às suas
respectivas síndromes clínicas e estarem envolvidos em casos clínicos
classicamente atribuídos ao outro vírus (Silva et al. 2007a). Diversos estudos
têm proposto a utilização de técnicas moleculares na rotina de diagnóstico do
BoHV-5 e diferenciação do BoHV-1, como a PCR e nested-PCR (Silva et al.
2007a; Claus et al. 2005, Ashbaugh et al. 1997; Ely et al. 1996) sendo estas
específicas e práticas, além de outras técnicas existentes, a imuno-
histoquímica (Hübner et al. 2005, Voguel et al. 2003, Meyer et al. 2001), cultivo
celular (Souza et al. 2002) e análise de restrição enzimática (D’arce et al.
2002).
Métodos que permitam detecção viral em materiais inclusos em parafina
auxiliam a expansão do conhecimento a respeito dos herpevírus bovinos em
amostras negativas para raiva, bem como em qualquer amostra arquivada em
laboratórios de rotina histopatológica, permitindo estudos retrospectivos de
48
prevalência do Bohv-5, já que a similaridade entre os dois vírus e a dificuldade
em diferenciação sorológica não permitiam boa documentação da prevalência
do BoHV-5 no Brasil e no mundo (Roehe et al. 1998).
Este trabalho tem por objetivo detectar o Herpesvírus Bovino 5 (BoHV-5)
e o Herpesvírus Bovino 1 (BoHV-1) em encéfalos de bovinos testados
negativos para Raiva e característicos de meningoencefalite por BoHV-5, além
de bovinos diagnosticados com meningoencefalite não purulenta inespecífica,
em amostras conservadas em formol e inclusas em parafina, ocorridos nos
anos 1999 a 2008 no Estado de Mato Grosso.
MATERIAL E MÉTODOS
Nos anos 1999 a 2008, um total de 402 amostras de encéfalo de bovinos
com quadro clínico neurológico, foram coletadas por veterinários autônomos e
veterinários do Instituto de Defesa e Agropecuária do Mato Grosso (INDEA-MT)
e encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade
Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Estas amostras foram negativas no teste
de imunofluorescência direta e prova biológica que caracterizam o diagnóstico
de infecção pelo vírus da raiva. Deste grupo foram selecionadas 76 amostras
sendo assim distribuídas: 1999 (n=3), 2000 (n=9), 2005 (n=17), 2006 (n=26),
2007 (n=14) e 2008 (n=7). As amostras foram recebidas no LPV-UFMT em
solução formalina e deste total, 9 amostras de encéfalos foram encaminhadas
contendo também fragmentos refrigerados e congelados. Preferencialmente
selecionaram-se fragmentos de regiões do córtex telencefálico, corpo estriado,
tálamo e mesencéfalo para análise molecular, principalmente de áreas que
tinham lesões microscópicas mais evidentes. Algumas amostras (16)
continham apenas medula oblonga e cerebelo.
As amostras de encéfalo enviadas foram processadas por métodos
convencionais para análise histológica e coradas pela hematoxilina-eosina. As
amostras foram classificadas em dois grupos distintos: Grupo 1. Amostras
classificadas como meningoencefalite necrosante e não purulenta associadas
com BoHV-5, sendo caracterizadas pela presença de infiltrado inflamatório
mononuclear meningeano e perivascular, áreas multifocais de malácia com
49
gliose, células gitter e corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos e/ou
neurônios (em 9 amostras), representando 22,5% dos casos ou amostras com
lesões sugestivas de Meningoencefalite por BoHV-5, com lesões
características sem que se tenha encontrado corpúsculos de inclusão (Figuras
1 e 2). Grupo 2. Amostras classificadas como encefalite não purulenta
inespecífica, quando havia apenas variável intensidade de infiltrado inflamatório
mononuclear perivascular, freqüentemente focal ou multifocal, e por vezes com
infiltrado meningeano discreto.
As amostras de encéfalo pertencentes a estes 2 grupos foram
submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para BoHV-1 e BoHV-5
(Claus et al. 2005). A extração de DNA foi obtida de amostras inclusas em
parafina ou material fresco congelado, por método fenol-clorofórmio (Sambrook
et al. 1989) modificado. Os primers utilizados foram B1, específico para BoHV-
1 (5-CAA CCG AGA CGG AAA GCT CC-3 nt. 185–204), B5, para BoHV-5 (5-
CGG ACG AGA CGC CCT TGG-3nt. 322–339) e Bcon, primer consenso [5-
AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3nt. 519–538 (BoHV-1) e nt. 461–480
(BoHV-5)]. A leitura foi feita por eletroforese em gel de agarose 2,0%, corados
com brometo de etídeo e analisadas em transluminador (UV-300nm). Controles
negativos e positivos para BoHV1 e BHV5 foram inseridos em cada PCR.
Além disso, testou-se 30 amostras de encéfalo bovino, aparentemente
sadios, sem alterações macro e microscópicas significativas. Estas amostras
foram obtidas em abatedouro com Inspeção Federal (SIF 585) mantendo-se
fragmentos de encéfalo sobre refrigeração e em solução de formalina 10% e
após 30 dias foram processados por técnicas rotineiras para estudo histológico.
Adicionalmente, de 11 bovinos deste grupo, coletaram-se amostras dos
gânglios de Gasser, que foram divididos, sendo que parte foi refrigerada e
parte foi mantida em solução de formalina 10%.
Para controle positivo da reação foi utilizado DNA provenientes dos
isolados SV-56/90 de BoHV-1 e SV-507/99 de BoHV-5 (Silva et al. 2007a)
obtidas no Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria.
RESULTADOS
50
De 402 amostras de encéfalo de bovino, que foram testadas negativas
para raiva bovina nos anos 1999 e 2000, 2005 a 2008, encaminhadas para o
LPV-UFMT, 76 (18,90%) foram classificadas dentro dos dois Grupos de estudo
propostos para esse trabalho. Destas, 40 (52,63%) tinham lesões
características ou sugestivas de infecção por BoHV-5 (Grupo 1) e 36 (47,36%)
tinham encefalite não purulenta inespecífica (Grupo 2).
Neste estudo não houve amplificação de BoHV-1 em amostras inclusas
em parafina ou congeladas. Identificou-se DNA de BoHV-5 em material incluso
em parafina em 40% (16/40) das amostras do Grupo 1 e em 33,33% (12/36) do
Grupo 2 (Figuras 3 e 4).
Do total de 76 amostras enquadradas dentro dos dois grupos de estudo,
67 amostras possuíam apenas material incluso em parafina, que ficou por
diferentes períodos em solução de formol a 10%. Algumas amostras foram
deixadas por períodos longos de fixação, variando de menos de um mês até
pouco mais de um ano. Houve diminuição crescente de positividade
principalmente nas amostras que permaneciam fixadas por 50 dias ou mais.
Outras nove amostras tinham materiais de encéfalo em parafina e
conservados sob congelamento, seis pertencentes ao Grupo 1, e três ao Grupo
2. Identificou-se DNA de BoHV-5 em quatro das 6 amostras do Grupo 1 e em
duas das 3 amostras do Grupo 2. Dessas mesmas amostras em parafina,
apenas duas do Grupo 1 e uma do Grupo 2 foram positivas, havendo um
decréscimo em 50% de positividade das mesmas amostras quando a análise
foi realizada utilizando-se o material encaminhado em formalina e incluso em
parafina.
Dos materiais obtidos em frigorífico, uma amostra de gânglio Gasser
amplificou DNA de BoHV-5 em material congelado , as demais foram negativas
tanto para BoHV-5 como BoHV-1.
DISCUSSÃO
Nesse trabalho, detectou-se DNA de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5)
através da técnica de PCR em 40% das amostras do Grupo 1 e em 33,33%
das amostras do Grupo 2.
51
Ferrari et al. (2007) encontraram 75% de positividade na PCR para
BoHV-5 em amostras de encéfalos com meningoencefalite necrosante que
permaneceram por uma semana ou mais em formalina tamponada a 10%. Nos
estudos retrospectivos realizados por Ely et al. (1996), demonstraram que em
32 casos de meningoencefalite não supurativa, 7 (21,87%) amostras foram
detectadas como positivas para BoHV-5 e 1 (3,25%) detectado como BoHV-1,
através das técnicas PCR e imunoperoxidase em amostras inclusas em
parafina, as outras 24 amostras permaneceram sem diagnóstico. Em nosso
estudo as amostras ficaram por períodos variáveis em solução de formalina, de
poucos dias a mais de um ano. O tempo de fixação causa degradação do DNA
e compromete o resultado da análise (Karlsen et al. 1994). Nos estudos de
Garmatz et al. (2004), em 6 bovinos com diagnóstico histopatológico de febre
catarral maligna (FCM) resultaram negativos no teste da PCR, atribuindo-se ao
tempo prolongado de fixação em formol a discordância entre achados
histopatológicos característicos e os resultados do teste da PCR. Nos estudos
de Crawford et al. (1999) a PCR para FCM, em períodos de fixação superiores
a 45 dias produziram resultados negativos ou fraco positivos.
A influência do tempo de fixação também pôde ser avaliada em relação
às amostras testadas fixadas em formalina e congeladas. Do total de 6
amostras positivas na PCR realizada em fragmentos de tecido congelado, a
positividade caiu em 50% quando realizada a PCR do mesmo material incluso
em parafina. Dentre as amostras com tecido congelado do Grupo 1, duas foram
negativas no PCR tanto em material fresco quanto incluso em parafina.
Quantidades insuficientes de DNA viral no tecido, quantidade escassa de
amostra e falhas na extração do DNA são as principais causas que podem
levar a ocorrência de resultados negativos, assim como ausência do DNA.
Encefalite não-purulenta inespecífica é frequentemente encontrada em
bovinos em nosso laboratório (Ubiali et al. 2008), aparenta uma condição
inflamatória no encéfalo mas sem caracteristicas morfológicas compatíveis com
etiológicas conhecidas. Esta lesão é por vezes encontrada em bovinos sem
manifestação clínica neurológica, incluindo amostras obtidas em frigoríficos. No
presente estudo, todas as amostras do Grupo 2 eram de bovinos que tinham
no histórico sinais clínicos de distúrbios no sistema nervoso central e em 33,3%
das amostras havia DNA de BoHV-5, o que caracteriza nestas amostras a
52
infecção pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 como determinante do quadro clínico-
patológico. Sabe-se que nem todos os casos de meningoencefalite por herpes
apresentam a característica evidente de malácia. Nos estudos de Rissi et al.
(2006), em um estudo de 19 casos, todos os bovinos apresentavam como
principal característica a meningoencefalie não-supurativa, sendo apenas
alguns casos destes com malácia, variando quanto à localização e intensidade.
Há também estudos de cepas de BoHV-5 com neurovirulência diferentes, o que
poderia determinar padrões morfológicos distintos (Flores et al. 2009). Para
determinar a importância deste achado, a ausência de amplificação de BoHV-5
em 77% das amostras pode ter ocorrido devido as amostras serem negativas
ou falso-negativas relacionadas ao local de coleta. A coleta e encaminhamento
de amostras de locais pertinentes são importantes para confiabilidade
diagnóstica dos resultados. Trabalhos em bovinos infectados
experimentalmente por BoHV-5 relatam que o vírus encontra-se na maioria dos
casos presente no córtex frontal, gânglio de Gasser, mesencéfalo e tálamo
(Vogel et al. 2003). Dentre as 36 amostras do Grupo 2, doze foram
encaminhadas ao laboratório, sem partes pertinentes principais, impedindo
análise histológica de locais onde as lesões são mais constantes, ou
diferenciação entre outras patologias que causam lesões histológicas
semelhantes. Também é necessário diferenciar a infecção do BoHV com
outras infecções virais que acomete bovinos, principalmente pela infecção
pelos vírus da raiva e febre catarral maligna. Neste estudo, as amostras foram
testadas para Raiva pelos métodos de imunofluorescência direta e prova
biológica, resultando negativas. Sabe-se que em alguns casos de raiva podem
ocorrer resultados discrepantes entre as duas provas laboratoriais de eleição
(Peixoto et al. 2000, Lemos 2005) e, dependendo da localização das lesões e
das amostras analisadas, ambos diagnósticos podem ser negativos (Silva et al.
1974). A vasculite é a principal alteração em casos de febre catarral maligna,
porém infiltrado perivascular mononuclear são achados no encéfalo de bovinos
com esta patologia. A intensidade dessas lesões varia no sistema nervoso
central (SNC) de acordo com a região anatômica afetada. As lesões mais
proeminentes são encontradas nos vasos da rete mirabile carotídea,
leptomeninge, espaços de Virchow-Robin e lesões menos graves no
parênquima, especialmente na substância branca (Garmatz 2004).
53
Dentre o Grupo de amostras obtidas em frigorífico uma amostra
amplificou BoHV-5, possivelmente associada característica do herpesvírus em
estabelecer latência em gânglios sensoriais após infecção aguda (Voguel et al.
2003) e indicando a importância de associar as técnicas de caracterização
etiológica com a observação de alterações morfológicas para complementação
diagnóstica.
Neste estudo trabalhamos também com amostras de encéfalo de bovinos com
polioencefalomalacia (Colodel, 2009 dados não publicados). BoHV-5 e BoHV-1
têm sido isolados de casos onde não se observam lesões inflamatórias
significativas da infecção viral (Rissi et al. 2008, David et al. 2007). BoHV-5
pode ser detectado através do isolamento viral em caso caracterizado
histologicamente como PEM (Colodel et al. 2002). Realizamos PCR para
BoHV-1 e BoHV-5 em 27 amostras inclusas em parafina, originárias de bovinos
com PEM no Estado de Mato Grosso e do Mato Grosso do Sul. Dentre estas, 9
amostras amplificaram DNA de BoHV-5, sugerindo que o vírus poderia estar se
replicando em conseqüência de fatores relacionados com o desenvolvimento
de PEM, ou que estava em estado de latência (David et al. 2007).
A importância do BoHV-1 na ocorrência de doenças de bovinos no
Estado de Mato Grosso é desconhecida. Meningoencefalite associada ao
BoHV-1 foi observada por Silva et al. (2007a) em diferentes Estados; dentre 26
amostras isoladas de doença neurológica, cinco (19,3%) eram por BoHV-1. A
utilização de um método molecular para detectar simultaneamente BOHV- 1 e
BoHV-5 facilita este levantamento. No presente estudo, todas as amostras
testadas foram negativas para BoHV-1.
Existem diversos métodos de detecção de BoHV-5. Dentre eles, os mais
usados são imuno-histoquímica, PCR e isolamento viral. Entretanto, fatores
como intensidade e distribuição de lesões, autólise e tempo de fixação em
formol são variáveis importantes a serem levadas em consideração para que
se tenha sucesso no diagnóstico (Ely et al. 1996; Karlsen et al. 1994).
Agradecimentos: Ao Prof. Dr. Rudi Weiblen e Mariana Sá e Silva, da Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM), Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Setor de
Virologia, pela disponibilização de isolados virais controles positivos para BoHV-1 e BoHV-5
utilizados (SV-56/90 e SV-507/99). Ao Indea-MT e Laboratório de Apoio à Saúde Animal
54
(LASA), pelo encaminhamento de amostras negativas para raiva, para este estudo. Ao Prof.
Dr. David Driemeier, do Departamento de Patologia Clínica Veterinária, UFRGS, Porto Alegre,
pela disponibilização de amostras de Mato Grosso pertencentes ao Programa Nacional de
Vigilância de Encefalopatia Espongiformes transmissíveis.
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58
1 2 3 4 5 6 7
Figura 3.- PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5 em bovinos com doença neurológica. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Canaleta 1: marcador; canaleta 2: controle negativo; canaleta 3: controle positivo para BoHV-1; canaleta 4: controle positivo para BoHV-5; canaleta 5 e 6: amostras de tecido em parafina positivas para BoHV-5; canaleta7: amostra negativa para BoHV.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 4. PCR multiplex para detecção BoHV-1 e BoHV-5. Eletroforese em gel de agarose a 2%. Canaleta 1: marcador; canaleta 2: controle negativo; canaleta 3: controle positivo para BoHV-1; canaleta 4: controle positivo para BoHV-5; canaleta 7: amostra de tecido congelado positiva para BoHV-5; canaletas 5,6,8,9 e 10: amostras negativas para BoHV.
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TABELA 1. Municípios do Estado de Mato Grosso com amostras de encéfalo de
bovinos com doença neurológica usados para pesquisa molecular de BoHV-5 e
BoHV1
MUNICÍPIOS Nº DE AMOSTRAS
Arenápolis 2 Barra do Bugres 2 Barra do Garças 3
Cáceres 5 Canarana 1
Castanheira 1 Carlinda 1 Colíder 1 Colniza 1
Confresa 2 Cuiabá 4
Diamantino 1 Glória d'Oeste 1
Guarantã do Norte 1 Indiavaí 1 Itiquira 2 Juína 1
Juscimeira 1 Mirassol d’Oeste 4
Nobres 1 Nossa Senhora do Livramento 1
Nova Brasilândia 3 Nova Canaã do Norte 1
Nova Marilândia 1 Nova Mutum 1 Nova Olímpia 1 Nova Ubiratã 1
Nova Xavantina 1 Paranatinga 1 Pedra Preta 2
Poconé 2 Pontal do Araguaia 1 Pontes e Lacerda 4
Porto dos Gaúchos 1 Porto Esperidião 1
Porto Estrela 4 Poxoréu 2
Rondonópolis 3 Rosário Oeste 3
Santo Antônio do Leverger 1 São José dos Quatro Marcos 1
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ANEXO 1
1. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA EM MATERIAL FRESCO
CONGELADO
(SAMBROOK, et al. 1989)
1. Reservar 2g do material fresco em eppendorf;
2. Acrescentar 1000ml de tampão de lise;
3. Agitar em vórtex para homogeneização;
4. Manter em banho Maria a 65ºC overnigth até total digestão do material;
5. Adicionar 500µl de Fenol;
6. Adicionar 500ml de Clorofórmio;
8. Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos;
9. Retirar o DNA sobrenadante;
10. Adicionar Acetato de Sódio 3M pH 4,5;
11. Adicionar isopropanol na proporção 1:1;
12. Centrifugar a 4000 rpm por 2 minutos;
13. Descatar o sobrenadante;
14. Adicionar etanol 70%;
15. Centrifugar a 4000 rpm durante 2 minutos;
16. Desprezar o sobrenadante;
17. Secar o pellet em estufa a 37°C durante 20 minutos ou em temperatura ambiente;
18. Adicionar 100µl de água Mili Q.
19. Agitar em vórtex para homogeneização;
20.Armazenar a 4 ºC.
62
ANEXO 2
1. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA EM MATERIAL INCLUSO EM
PARAFINA
(SAMBROOK, et al. 1989) modificado
1. Realizar 10 cortes do bloco parafinado a 5µm em micrótomo rotativo;
2. Acrescentar xilol e agitar os tubos com amostra. Deixar por 30 minutos;
3. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos e retirar o sobrenadante;
4. Repetir a etapa 2 e 3;
5. Adicionar etanol absoluto e agitar os tubos com amostra. Deixar por 30 minutos;
6. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos e retirar o sobrenadante;
7. Repetir a etapa 5 e 6;
8. Adicionar etanol 70% e agitar os tubos com amostra. Deixar por 30 minutos;
9. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos e retirar o sobrenadante;
10. Repetir a etapa 8 e 9;
11. Adicionar água destilada estétil e agitar os tubos com amostra. Deixar por 15
minutos.
12. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos e retirar o sobrenadante;
13. Repetir a etapa 11 e 12;
14. Acrescentar 1000 ml de tampão de lise;
15. Agitar em vórtex para homogeneização;
16. Manter em banho Maria a 65ºC overnigth até total digestão do material;
17. Adicionar 500µl de Fenol;
18. Adicionar 500ml de Clorofórmio;
19. Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos;
20. Retirar o DNA sobrenadante;
21. Adicionar Acetato de Sódio 3M pH 4,5;
22. Adicionar isopropanol na proporção 1:1;
23. Centrifugar a 4000 rpm por 2 minutos;
24. Descatar o sobrenadante;
25. Adicionar etanol 70%;
26. Centrifugar a 4000 rpm durante 2 minutos;
27. Desprezar o sobrenadante;
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28. Secar o pellet em estufa a 37°C durante 20 minutos ou em temperatura ambiente;
29. Adicionar 100µl de água Mili Q.
30. Agitar em vórtex para homogeneização;
31. Armazenar a 4 ºC.
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