MEZENKİMAL KÖK HÜCRE UYGULAMASI FARELERDE

OLUŞTURULAN KRONİK ASTIM MODELİNDE AKCİĞER

HİSTOPATOLOJİK BULGULARI HAFİFLETMEKTEDİRFatih Fırıncı1, Meral Karaman2, Yusuf Baran3, Alper Bağrıyanık4, Zeynep Ayyıldız1,

Müge Kıray4, İlknur Kozanoğlu5,Osman Yılmaz2, Nevin Uzuner1, Özkan Karaman1

1 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Allerji-Solunum Birimi2 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mulltidisipliner Laboratuvarı

3 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü4 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı

5 Başkent Üniversitesi Adana Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kemik iliği Nakil Bölümü

ÇIKAR İLİŞKİSİ YOKTUR

Kemik iliği stroması, hematopoietik kök hücreler dışında mezenkimal kök hücreler (MKH) olarak bilinen bir hücre grubunu da içermekte

Bu hücreler kemik, kıkırdak, yağ,

tendon, kas gibi farklı mezenkimal dokulara in vitro veya in vivo farklılaşabilen multipotent öncül hücrelerdendir

Kemik iliği hücrelerinin yaklaşık %0.01 ile %0.001’ini oluşturan bu hücreler, cam ve plastiğe yapıştıkları için hematopoietik kök hücrelerinden kolaylıkla ayrılabilirler

Ayrıca MKH kemik iliğinden izole edildikten sonra in vitro koşullarda çoğaltılabilmekte

Bu hücreler, spesifik hücre tiplerine farklılaştırıldıktan sonra çeşitli sistemik ve lokal hastalıkların tedavilerinde kullanılmakta

Donör MKH’inin transplant sonrası alıcıda kardiyak myoblast, hepatik epitelyal nöroektodermal hücrelere farklılaşabileceği

Expert Opin Biol Ther. 2008 May;8(5):569-81

Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells:novel concept for future therapies.

Iyer SS, Rojas M. Nutrition and Health Sciences Program, Atlanta, GA 30322, USA.

Aynı zamanda mezenkimal kök hücrelerin anti-inflamatuar özellikleri de bulunmakta

AMAÇ

Farelerde deneysel olarak oluşturulan kronik astım

modelinde MKH’lerinin akciğer histopatolojisi üzerine

etkisini değerlendirmek

Yöntem Deney hayvanları:

Erişkin 36 adet 20-25 gr ağırlığında dişi BALB/c türü fareler kullanıldı.

Astım modeli: Temelkovski J ve ark. tarafından tanımlanan astım modeli yapıldı.

Çalışma gruplarındaki farelere 0. ve 14. gün iki kez 10µg intraperitoneal ovalbumin uygulanarak duyarlılaştırıldı.

Kontrol grubundaki farelere aynı yol ve dozda salin solusyonu uygulandı.

Çalışma gruplarındaki farelere 21. günden başlamak üzere, günde 30 dakika süre ile haftanın üç günü, 8 hafta boyunca steril salin içindeki % 2.5’lik ovalbumin solusyonundan oluşan aerosol inhale ettirildi.

Temelkovski ve ark.’ları tarafından tanımlanan kronik astım modeli

Mezenkimal kök hücrelerin eldesi

BALB/c türü farelerin femurlarından kemik iliği örnekleri alındı.

Kemik iliği hücreleri DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) besi yeri ortamına ekildi.

MKH’inin yapışma özelliği olmasından dolayı yapışmayan kök hücreler besi ortamı yenilenerek ortamdan uzaklaştırıldı.

Yaklaşık 2 hafta sonra MKH yoğunluğu %80-90 oranına ulaştığında MKH ortamdan tripsin ve EDTA yardımı ile ayrıştırıldı.

Elde edilen hücrelerin flow sitometride CD105, CD73, NG2 eksprese ettikleri, hematopoietik marker olan CD45’i eksprese etmedikleri gösterildi. Böylece bu

hücrelerin MKH olduklarını kesinleştirildi.

MKH green flouresan protein (GFP) ile işaretlendi.

Bu karışım 1 saat süre ile 37.5oC %5 CO2’de inkübe edildi.

Daha sonra yaklaşık 106 MKH 0,1 ml SF içerisinde farelerin kuyruk veninden verildi.

Çalışma Grupları:

4 grup oluşturuldu. Ayrıca çalışma grupları kendi içinde erken ve geç evre olmak

üzere iki alt gruba ayrıldı.

Grup 1 (kontrol, n=6): Bu gruptaki farelere salin verildi.

Grup 2 (astım, n=10): Bu gruptaki farelere astım modeli oluşturulduktan sonra herhangi bir tedavi verilmedi.

Grup 3 (astım+MKH, n=10): Bu gruptaki farelere astım modeli oluşturulduktan sonra MKH verildi

Grup 4 (sadece MKH n=10): Bu gruptaki farelere ise astım modeli oluşturulmadan sadece MKH verildi

Çalışma Grupları

Grup 2, 3 ve 4’teki farelerin yarısı Akciğer histopatolojisi değerlendirmek MKH’lerin akciğere göçünü göstermek amaçlı MKH uygulamasından 1 hafta sonra sakrifiye edildi.

Bu gruplardaki kalan diğer fareler MKH uygulamasından 2 hafta sonra sakrifiye edildi akciğer histopatolojisi açısından değerlendirildi

0 14 21 23 25 28 30 32 35 37 39 42 44 46 49 51 53 56 58 60 63 65 67 70 72 74 75 82 89 İntraperitoneal Nebulize OVA MKH Sakrifikasyon OVA (21-74. günler arası, 3/haftada) (0 and 14. gün)

Kontrol grup

Astım +SF

Astım + MKH

Sağlıklı fare + MKH

Akciğer dokusu

Kronik astımda mevcut olan histopatolojik değişiklikler

Goblet hücre hiperplazisiSubepitelyal fibrozis İntraepitelyal

eozinofillerEpitelyal hipertrofi

Düz kas hipertrofisi/hiperplazisi

Artmış vaskülarite

Plazma, T lenfosit ve mast hücre infiltrasyonu

Işık mikroskobik değerlendirmede; Subepitelyal düz kas kalınlığı Epitel kalınlığı Mast hücre sayısı Goblet hücre sayısı

Elektron mikroskobik değerlendirmede; Bazal membran kalınlığı ölçüldü.

Konfokal mikroskobik değerlendirmede; Green floreasan protein ile işaretlenen MKH’lerinin ışıması

gözlendi

İstatistiksel analiz:

SPSS 11.0 programı kullanıldı. Histopatolojik parametrelerin karşılaştırılmasında ki-kare testi kullanıldı, p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

Bulgular Histopatolojik inceleme sonuçları

1. hafta sakrifikasyon sonuçları: Grup 3’teki fareler Grup 2’deki fareler ile karşılaştırıldığında, epitel

kalınlığı dışında diğer histolojik parametlerin anlamlı olarak düzeldiği saptandı

2. hafta sakrifikasyon sonuçları: Grup 3’teki fareler Grup 2’deki fareler ile karşılaştırıldığında tüm

histolojik parametrelerin düzeldiği saptandı

Konfokal mikroskop sonuçları

Grup 4’teki farelerin akciğerlerinde anlamlı derecede MKH olmamasına karşın, Grup 3’deki tüm farelerin akciğer dokularında yeşil flurason eksprese eden işaretli MKH’ler saptandı

Bu durum işaretli MKH’lerin hasar görmüş inflame akciğer dokulara gittiğini göstermekte

Kontrol grubu(ortalama±SD)

Astım grubu(ortalama±SD) P

Bazal membran kalınlığı (nm) 262.61 ± 16.40 651.55 ± 12.32 <0.01

Subepitelyal düz kas kalınlığı (μm) 3.49 ± 0.42 9.26 ± 1.14 <0.01

Epitel yüksekliği (μm) 12.30 ± 1.41 32.26 ± 6.08 <0.01

Mast hücre sayısı (20000 μm2) 0.30 ± 0.12 2.51 ± 0.29 <0.01

Goblet hücre sayısı (100 μm2) 0.71 ± 0.12 2.91 ± 0.47 <0.01

Astım (n:10) Astım + MKH (n:10)

Erken (n:5)(ortalama±SD)

Geç (n:5)(ortalama±SD)

Erken (n:5) (ortalama±SD)

Geç (n:5)(ortalama±SD)

Bazal membran kalınlığı (nm) 651.55± 12.32 654.30 ± 10.65 507.06±10.02* 333.47±15.51#

Subepitelyal düz kas kalınlığı (μm) 9.26 ± 1.14 9.75 ± 0.91 6.40 ± 0.24* 5.07 ± 0.52#

Epitel yüksekliği (μm) 32.26 ± 6.08 30.35 ± 1.50 24.94 ± 1.67 16.16 ± 0.51#

Mast hücre sayısı (20000/μm2) 2.51 ± 0.29 2.41 ± 0.22 1.31 ± 0.26* 1.04 ± 0.17#

Goblet hücre sayısı (100/μm2) 2.91 ± 0.47 3.09 ± 0.40 1.51 ± 0.27* 1.48 ± 0.49#

* p<0,05 grupların erken evrelerinin karşılaştırılması# p< 0,05 grupların geç evrelerinin karşılaştırılması

Sonuç olarak

Çalışmamızda, farelerde oluşturulan kronik astım

modelinde MKH’lerinin İnflame olan akciğer dokusuna göç ettiği Astımın histopatolojik bulgularını hafiflettiği

TEŞEKKÜRLER

İnsanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller Kronik Allerjen Maruziyeti

İnsan astımı ile benzerlikleri: Yüksek Ig E düzeyleri Th2 bağımlı allerjik inflamasyon Havayolu mukozasına eozinofil göçü Havayolu aşırı duyarlılığı Havayolu remodelingi: Goblet hücre hiperplazisi Subepitelyal fibrozis Epitel hipertrofisi