Post on 06-Nov-2019
Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch-Pharmazeutische Fakultät
Institut für Ernährungswissenschaften Arbeitsgruppe Bioaktive Pflanzenstoffe
Analytische Charakterisierung von Samen zweier Tomatensorten
als Basis einer möglichen Reststoffverwertung
in der Lebensmittelindustrie
Bachelorarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades eines Bachelor of Science
im Studiengang Ernährungswissenschaften (B. Sc.)
vorgelegt von
Anna Westphal
aus Bollberg
Jena, im September 2013
Gutachter: 1. PD Dr. habil. Volker Böhm
Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Arbeitsgruppe Bioaktive Pflanzenstoffe Dornburger Straße 25 07743 Jena
2. Prof. Dr. Konrad Otto
Hochschule Ostwestfalen-Lippe Fachgebiet Getränketechnologie Liebigstraße 87 32657 Lemgo
INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
I Tabellenverzeichnis ....................................................................................................................... III
II Abbildungsverzeichnis ................................................................................................................. IV
III Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................................. V
1 EINLEITUNG ........................................................................................................................ 1
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ............................................................................................. 2
2.1 Tomaten ............................................................................................................................. 2
2.1.1 Aufbau und Inhaltsstoffe der Tomatenfrucht ....................................................................... 2
2.1.2 Der Tomatenmarkt und die Problematik der Reststoffverwertung ..................................... 4
2.2 Carotinoide ......................................................................................................................... 5
2.2.1 Struktur und Vorkommen ..................................................................................................... 5
2.2.2 Funktionen ............................................................................................................................ 7
2.3 Vitamin E ............................................................................................................................ 7
2.3.1 Struktur und Vorkommen ..................................................................................................... 7
2.3.2 Funktionen ............................................................................................................................ 8
2.4 Bestimmung der antioxidativen Kapazität ............................................................................ 9
2.4.1 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu ............................................................................. 10
2.4.2 TEAC-Test ............................................................................................................................ 11
2.4.3 ORAC-Test ........................................................................................................................... 12
2.5 Die Ölgewinnung aus Ölsaaten und deren Fettsäurezusammensetzung .............................. 12
3 MATERIAL UND METHODEN .............................................................................................. 14
3.1 Untersuchungsmaterial ..................................................................................................... 14
3.2 Probenvorbereitung .......................................................................................................... 14
3.3 Trockenmassebestimmung ................................................................................................ 14
3.4 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes ........................................................ 14
3.4.1 HPLC-Analytik ...................................................................................................................... 15
3.4.1.1 HPLC-Analytik Carotinoide ............................................................................... 15
3.4.1.2 HPLC-Analytik Vitamin E ................................................................................... 15
3.5 Bestimmung der antioxidativen Kapazität .......................................................................... 16
3.5.1 Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen Extrakten ............ 16
3.5.2 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu ............................................................................. 17
3.5.3 H-TEAC-III-Test .................................................................................................................... 17
3.5.4 H-ORACFl-Test ...................................................................................................................... 18
3.5.5 αTEAC-Test .......................................................................................................................... 18
3.6 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ....................................................................... 19
3.6.1 Fettextraktion nach Folch ................................................................................................... 19
3.6.2 Methylierung ....................................................................................................................... 19
3.6.3 Dünnschichtchromatographie ............................................................................................ 20
3.6.4 GC-Analytik.......................................................................................................................... 20
3.7 Statistische Datenauswertung ........................................................................................... 20
INHALTSVERZEICHNIS
II
4 ERGEBNISSE ...................................................................................................................... 21
4.1 Bestimmung der Trockenmasse ......................................................................................... 21
4.2 Quantifizierung der Carotinoide ........................................................................................ 21
4.3 Quantifizierung der Vitamin-E-Verbindungen ..................................................................... 21
4.4 Ermittlung der antioxidativen Kapazität ............................................................................. 22
4.4.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität ........................................... 22
4.4.2 Lipophile antioxidative Kapazität ........................................................................................ 25
4.5 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ....................................................................... 25
4.5.1 Fettextraktion und Dünnschichtchromatographie ............................................................. 25
4.5.2 Fettsäurezusammensetzung ............................................................................................... 26
5 DISKUSSION ...................................................................................................................... 28
5.1 Carotinoide in Tomatensamen ........................................................................................... 28
5.2 Vitamin-E-Verbindungen in Tomatensamen ....................................................................... 29
5.3 Antioxidative Kapazität von Tomatensamen ...................................................................... 31
5.3.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität ........................................... 32
5.3.2 Lipophile antioxidative Kapazität ........................................................................................ 36
5.4 Fettsäurezusammensetzung von Tomatensamen ............................................................... 39
6 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 43
7 SUMMARY ........................................................................................................................ 45
LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................................. 47
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN ..................................................................................... VII
A.1 Verzeichnis der verwendeten Geräte ......................................................................................... VII
A.2 Verzeichnis der verwendeten Arbeitsmittel .................................................................................. X
A.3 Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und Lösungen ........................................................... XI
ANHANG B: METHODEN ............................................................................................................. XV
B.1 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes ............................................................... XV
B.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität .................................................................................. XV
B.3 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ............................................................................... XIX
ANHANG C: ANALYSENDATEN ..................................................................................................... XX
Selbstständigkeitserklärung
Danksagung
TABELLENVERZEICHNIS
III
I TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 1 Ausgewählte Inhaltsstoffe von frischen Tomaten ................................................................ 3
Tab. 2 Ausgewählte Methoden zur Bestimmung der AOC ............................................................ 10
Tab. 3 Wassergehalte der zwei Samensorten ................................................................................ 21
Tab. 4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten ........................................................................... 21
Tab. 5 Gehalte an Vitamin-E-Verbindungen in den zwei Samensorten ......................................... 22
Tab. 6 Hydrophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit unterschiedlichen Testmethoden 23
Tab. 7 Lipophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit dem αTEAC-Test ............................. 25
Tab. 8 Rohfettanteile der zwei Samensorten ................................................................................ 26
Tab. 9 Carotinoidgehalt der Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant ............................. 28
Tab. 10 Publizierte Carotinoidgehalte von Tomatensamen im Vergleich zu den eigenen Daten ... 28
Tab. 11 Einfluss einer steigenden Probenkonzentration von Reinsubstanzen, Nahrungsmittel-extrakten und den selbst untersuchten Tomatensamenextrakten auf die AOC (gemessen mit verschiedenen Testmethoden) und den Gesamtphenolgehalt .................................... 33
Tab. 12 Publizierte hydrophile AOC von Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen untersuch-ten Samen ........................................................................................................................... 34
Tab. 13 Publizierte Gehalte an extrahierten Ölgehalten aus Tomatensamen ................................. 39
Tab. 14 Publizierte Fettsäurezusammensetzungen von Öl aus Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen Daten ..................................................................................................................... 40
Tab. C1 Wassergehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung ....... XX
Tab. C2 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der ermittelten Carotinoide in Ethanol ............................................................................................................................ XX
Tab. C3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für Lutein und Zeaxanthin für C30-Develosil RPAQUEOUS-Analysensäule (250 x 4,6 mm; 5 μm) ............................................................ XX
Tab. C4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung .. XX
Tab. C5 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der Tocopherole und Tocotrienole in Ethanol ....................................................................................................... XX
Tab. C6 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für α- und γ-Tocopherol für Knauer Eurospher-100 DIOL-Analysensäule (250 x 4,0 mm; 7 µm) ........................................................................ XXI
Tab. C7 Tocopherolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung XXI
Tab. C8 Vitamin-E-Aktivität der Tocopherole und Tocotrienole ..................................................... XXI
Tab. C9 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung ............................................................................................................................................ XXI
Tab. C10 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem H-TEAC-Test ........................ XXII
Tab. C11 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem ORAC-Test .......................... XXIII
Tab. C12 Lipophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem αTEAC-Test ........................... XXIII
Tab. C13 Summenformel, Trivialname, Abkürzung und Einordnung aller detektierten Fettsäuren .......................................................................................................................................... XXIV
Tab. C14 Fettsäureverteilung in den beiden Samensorten ............................................................. XXV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
IV
II ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1 Horizontaler Querschnitt einer Tomate .................................................................................. 2
Abb. 2 Einteilung der verarbeiteten Tomatenprodukte und einige Beispiele .................................... 4
Abb. 3 Übersicht über die Herstellung von Tomatenerzeugnissen .................................................... 5
Abb. 4 Strukturformeln ausgewählter Carotinoide ............................................................................ 6
Abb. 5 Carotinoidprofil von Tomaten ................................................................................................. 6
Abb. 6 Strukturformeln von Tocopherolen und Tocotrienolen .......................................................... 8
Abb. 7 Übersicht über die Extraktionsschritte für die kombinierte Carotinoid- und Vitamin-E-Be-stimmung ............................................................................................................................... 15
Abb. 8 Übersicht über die Aufarbeitung der Samen und die Extraktionsschritte für die unterschied-lichen Extrakte, die im Anschluss auf deren AOC getestet wurden ...................................... 17
Abb. 9 Übersicht über die Aufarbeitungsschritte für die Analyse der Fettsäurezusammensetzung 19
Abb. 10 Gehalte an α- und γ-Tocopherol in den zwei Samensorten .................................................. 22
Abb. 11 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten vor und nach der Hydrolyse ......................... 23
Abb. 12 Hydrophile AOC bestimmt mit dem H-TEAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samen-sorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen............... 24
Abb. 13 Hydrophile AOC bestimmt mit dem ORAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen .......................... 24
Abb. 14 Lipophile AOC der beiden Samensorten in Abhängigkeit der Verdünnungsstufen............... 25
Abb. 15 DC-Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor und nach der Methylierung mittels n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu einem Standard-gemisch .................................................................................................................................. 26
Abb. 16 Gegenüberstellung der dominierenden Fettsäuren der zwei Samensorten ......................... 27
Abb. 17 Gegenüberstellung einiger relevanter Parameter der Fettverteilung der zwei Samensorten ............................................................................................................................................... 27
Abb. 18 Prozentuale Anteile der Vitamin-E-Verbindungen (bezogen auf Gesamt-Vitamin-E) in Toma-ten der Sorten Waltinger und Red Currant ........................................................................... 30
Abb. 19 Prozentuale Anteile der Schalen, des Fruchtfleisches und der Samen an den Antioxidantien und der AOC von ganzen Tomaten ........................................................................................ 34
Abb. 20 Anteile der hydrophilen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamen-sorten, bestimmt mit dem H-TEAC-III-Test und dem αTEAC-Test; Darstellung in Abhängig-keit von den Verdünnungsstufen ........................................................................................... 37
Abb. 21 Gegenüberstellung der anhand der Einzelsubstanzen theoretisch ermittelten AOC und der tatsächlich bestimmten AOC .................................................................................................. 38
Abb. 22 Fettsäurezusammensetzung verschiedener Pflanzenöle im Vergleich zu dem aus den zwei Samensorten gewonnenem Öl .............................................................................................. 41
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
V
III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
αTE α-Tocopheroläquivalente (engl. α-tocopherol equivalents) αTEAC α-Tocopherol äquivalente antioxidative Kapazität
(engl. α-tocopherol equivalent antioxidant capacity) AAPH 2,2'-Azobis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid Abb. Abbildung ABTS●+ 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Radikalkation AG Arbeitsgruppe a.K. außerhalb der Kalibrierung AOC Antioxidative Kapazität (engl. antioxidant capacity) AUC Fläche unter der Kurve (engl. area under the curve) BHT 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxytoluol bspw. beispielsweise c Konzentration DC Dünnschichtchromatographie DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung ε molarer Extinktionskoeffizient E trans (lat. „weit entfernt bzw. gegenüber“) - geometrische Konfiguration E Extinktion E1cm1% spezifischer Extinktionskoeffizient
ET bzw. SET Ein-Elektronen-Übergang (engl. single electron transfer) et al. und andere (lat. et alii) FAME Fettsäuremethylester (engl. fatty acid methyl ester) FM Frischmasse GAE Gallussäure-Äquivalente (engl. gallic acid equivalents) HAT Wasserstoffatom-Übergang (engl. hydrogen atom transfer) HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid
chromatography) hpts. hauptsächlich MC-FA mittelkettige Fettsäuren (engl. middle chain fatty acids) MeOH Methanol meq Milliäquivalent MgCO3 Magnesiumcarbonat mglw. möglicherweise MtBE Methyl-tert-Butylether MUFA einfach ungesättigte Fettsäuren MW arithmetischer Mittelwert Na2SO4 Natriumsulfat NP normal phase n.q. nicht quantifizierbar n.s. nicht signifikant O2 Sauerstoff ORAC engl. Oxygen Radical Absorbance Assay p Signifikanzniveau bzw. Irrtumswahrscheinlichkeit PDA Photodiodenarray pH lat. pondus hydrogenii PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäuren r Korrelationskoeffizient RC Red Currant (Tomatensorte) ROO● Peroxylradikal
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
VI
RP reversed phase SC-FA kurzkettige Fettsäuren (engl. short chain fatty acids) SFA gesättigte Fettsäuren SPSS Statistical Package for Social Sciences
Stabw Standardabweichung
T Temperatur in °C Tab. Tabelle TE Trolox-Äquivalente (engl. Trolox equivalents) THF Tetrahydrofuran Trolox 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure UV Ultraviolett (Licht im Wellenlängenbereich von~ 200-400 nm) var. Varietät (lat. varietas) VF Verdünnungsfaktor vis visuell (Licht im Wellenlängenbereich von ~ 400-800 nm) W Waltinger (Tomatensorte) Z cis (lat. „zusammen bzw. nah beieinander“) - geometrische Konfiguration
EINLEITUNG
1
1 EINLEITUNG
Die Tomate (Lycopersicon esculentum) stammt ursprünglich aus der Andenregion Südamerikas. Dort
wuchs sie als tropische Wildpflanze, die der modernen Kirschtomate (Lycopersicon esculentum var.
cerasiforme) ähnelt [1,2]. Bald nach der Entdeckung Amerikas, Anfang des 16. Jahrhunderts, gelangte
die Tomate nach Europa, wo sie zunächst aufgrund der angeblichen Giftigkeit nur als Zierpflanze
kultiviert wurde [1,2]. Heute zählt sie nach der Kartoffel zu den weltweit beliebtesten und am
häufigsten angebauten Gemüsesorten [2,3]. Ihre Popularität resultiert daraus, dass sie sowohl als
Frischgemüse als auch in vielen verarbeiteten Formen, wie z. B. als Tomatensaft, -sauce, -mark oder
-suppe, verzehrt wird [1]. Bezüglich der Erntemengen für den Frischgemüsemarkt und für die
verarbeitende Industrie existieren große Unterschiede. In den USA ist der Anteil an Tomaten, der der
industriellen Verarbeitung bereitgestellt wird, fünf- bis sechsmal höher als der Anteil für den frischen
Markt [4]. Die immer größer werdenden Ausmaße dieses Industriezweiges sind mit ernsten wirt-
schaftlichen, technischen und ökologischen Problemen verbunden [5]. In der lebensmittelverarbei-
tenden Industrie fallen ständig große Mengen an Nebenprodukten oder Reststoffen an, die entsorgt
und verwertet werden müssen. Hauptkomponente der Verarbeitungsreststoffe in der Tomaten-
industrie sind Tomatensamen [6], die zu den nicht vermeidbaren Lebensmittelabfällen zählen [7]. In
diesem Zusammenhang erlangt die Thematik der Reststoffverwertung in der Lebensmittelproduktion
einen immer höheren Stellenwert. So wird nach Alternativen gesucht, wie aus eigentlichen Abfall-
produkten neue Produkte hergestellt werden können. Besonders Rückstände aus der Obst- und
Gemüse-verarbeitenden Industrie sind reich an bioaktiven Substanzen, wie sekundären Pflanzen-
stoffen, sowie an Vitaminen und sind somit eine gute Quelle für Lebensmittelzusatzstoffe oder
kosmetische Inhaltsstoffe [8]. Auch die in der tomatenverarbeitenden Industrie anfallenden
Tomatensamen sind ein sogenannter Sekundärrohstoff. Die Erforschung von Verfahren, wie aus dem
üblicherweise als geringwertig angesehenem Nebenprodukt durch die Gewinnung von bioaktiven
Substanzen wertvolle Produkte erzeugt werden können, begann bereits vor fast 100 Jahren. Einen
Schwerpunkt bildet die Weiterverarbeitung zu Speiseöl, welches eine hohe antioxidative Kapazität
besitzt [9].
Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, das Wissen über die chemische Zusammensetzung und
die Inhaltsstoffe von Tomatensamen im Hinblick auf eine nachhaltige Reststoffverwertung in der
Lebensmittelindustrie zu erweitern. Als Untersuchungsmaterial dienten die Samen von zwei
Tomatensorten. Ein erster Schwerpunkt lag auf der Bestimmung und Beurteilung der Carotinoid- und
Vitamin-E-Gehalte der Samen. Diese beiden Substanzklassen tragen u. a. zu dem antioxidativen
Potential bei. Die Samen gelten als wichtigste Quelle für Tocopherole und Tocotrienole in Tomaten.
Diese lipidlöslichen Antioxidantien sind zudem essentielle Vitamine, die hauptsächlich in Pflanzen-
saaten und Ölen vorkommen. Angesichts der gesundheitlichen sowie industriellen Bedeutung von
Antioxidantien in Nahrungsmitteln erfolgte eine Bestimmung der antioxidativen Kapazität der
Tomatensamen. Verschiedene Extrakte der Samen wurden mittels unterschiedlicher Testmethoden
analysiert, verglichen und bewertet. Erfasst wurde letztlich der Anteil an freien und gebundenen
wasserlöslichen sowie an fettlöslichen Antioxidantien. Bezüglich einer möglichen Weiterverarbeitung
der Tomatensamen zu pflanzlichem Öl ist außerdem das Fettsäuremuster von Interesse, da dieses ein
wichtiges Kriterium für ernährungsphysiologisch wertvolle Öle ist. Aus diesem Grund erfolgte eine
gaschromatographische Bestimmung der korrespondierenden Fettsäuremethylester.
THERORETISCHE GRUNDLAGEN
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN
2.1 Tomaten
2.1.1 Aufbau und Inhaltsstoffe der
Die Tomate (Lycopersicon esculentum
essbare Teil der Pflanze aus den befruchteten Blüten entwickelt.
schattengewächse (Solanaceae
wachsen an einjährigen, krautigen Pflanzen
Spross mit großen, gefiederten Blättern
Früchte hervor, die nach der
Form und Farbe erheblich unterscheiden
Weltweit existieren mehr als 2
te es sich um die Sorten Waltingers Cocktail und Red Currant.
Tomate mit einem Fruchtgewicht von bis zu 10
ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß
Currant ist eine Wildtomate, die
tomate genannt wird. Sie stammt aus Südamerika und ist ebenfalls
Fruchtkammern und entwickelt ein Fruchtgewicht bis 10
aromatisch und süß beschrieben, haben aber eine relativ harte
Die Tomatenfrucht besteht aus verschiedenen Geweben: dem
karp, Mesokarp und Endokarp
[15] (Abb. 1).
Abb. 1 Horizontaler Querschnitt einer Tomate
Das Perikarp als Fruchtwand besitzt als äuße
artigen Kutikula überzogen ist
äußeren Schichten verwendet. Das innere Abschlussgewebe bildet das Endokarp und grenzt das
Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo
Mesokarp. Die Plazenta bildet den
Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus
Funiculi (Nabelstränge) sind die Samen mit der Plazenta verbunden.
förmigen Samen sind mit kurzen steifen Härchen bedeckt und von einer stark verschleimenden
Zellschicht umgeben, die botanisch als Myxotesta bezeichnet wird
Samen wird durch ein gallertartiges Ge
Perikarp
Mesokarp
Exokarp
Endokarp
THERORETISCHE GRUNDLAGEN
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
Aufbau und Inhaltsstoffe der Tomatenfrucht
Lycopersicon esculentum) wird als sogenanntes Fruchtgemüse
essbare Teil der Pflanze aus den befruchteten Blüten entwickelt. Sie gehört
Solanaceae), zu der u. a. auch Kartoffel, Paprika oder Aubergine zählen.
krautigen Pflanzen, die einen bis zu 1,5 m hohen sympodial verzweigten
mit großen, gefiederten Blättern aufweisen [10]. Die kleinen gelben Einzelb
nach der botanischen Klassifizierung Beeren sind. Diese können
rbe erheblich unterscheiden.
Weltweit existieren mehr als 2 500 Tomatensorten [11]. Bei den beiden untersuchten Samen handel
Sorten Waltingers Cocktail und Red Currant. Waltingers Cocktail ist eine runde, rote
Fruchtgewicht von bis zu 10 g. Sie besteht aus zwei Fruchtkammern und besitzt
ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß
eine Wildtomate, die gemäß der Übersetzung ins Deutsche auch
omate genannt wird. Sie stammt aus Südamerika und ist ebenfalls rund, rot
und entwickelt ein Fruchtgewicht bis 10 g. Die kleinen Tomaten werden als sehr
aromatisch und süß beschrieben, haben aber eine relativ harte Schale [12-14]
besteht aus verschiedenen Geweben: dem fleischigen Perikarp
karp, Mesokarp und Endokarp unterteilt wird, der Plazenta und den Fruchtkammer
Querschnitt einer Tomate [16]
Das Perikarp als Fruchtwand besitzt als äußeres Abschlussgewebe das Exokarp
artigen Kutikula überzogen ist [17]. Oft wird die botanisch unkorrekte Bezeichnung Schale für die
äußeren Schichten verwendet. Das innere Abschlussgewebe bildet das Endokarp und grenzt das
Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo
bildet den zentralen Gewebebereich, an dem sich die Samen entwickeln. Im
Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus
Funiculi (Nabelstränge) sind die Samen mit der Plazenta verbunden. Die zahlreichen kleinen nieren
förmigen Samen sind mit kurzen steifen Härchen bedeckt und von einer stark verschleimenden
Zellschicht umgeben, die botanisch als Myxotesta bezeichnet wird [3,10]. Der Raum zwischen den
ertartiges Gewebe ausgefüllt [10].
Plazenta
Same
Funiculus
2
angesehen, da sich der
gehört zur Familie der Nacht-
a. auch Kartoffel, Paprika oder Aubergine zählen. Tomaten
m hohen sympodial verzweigten
Einzelblüten bringen die
Diese können sich in Größe,
. Bei den beiden untersuchten Samen handel-
Waltingers Cocktail ist eine runde, rote
g. Sie besteht aus zwei Fruchtkammern und besitzt
ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß. Die Sorte Red
gemäß der Übersetzung ins Deutsche auch rote Johannisbeer-
rund, rot, besteht aus zwei
Die kleinen Tomaten werden als sehr
].
Perikarp, welches in Exo-
Fruchtkammern mit den Samen
res Abschlussgewebe das Exokarp, das von einer wachs-
. Oft wird die botanisch unkorrekte Bezeichnung Schale für die
äußeren Schichten verwendet. Das innere Abschlussgewebe bildet das Endokarp und grenzt das
Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo- und Endokarp ist das
Gewebebereich, an dem sich die Samen entwickeln. Im
Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus [10]. Über sogenannte
Die zahlreichen kleinen nieren-
förmigen Samen sind mit kurzen steifen Härchen bedeckt und von einer stark verschleimenden
. Der Raum zwischen den
Plazenta
Same
Funiculus
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
3
Die Inhaltsstoffe von Tomaten sind ein wichtiges Qualitätsmerkmal und beeinflussen Farbe, Konsis-
tenz, Nährwert, Geschmack und Aroma der Früchte. Dabei ist die chemische Zusammensetzung von
verschiedenen Faktoren abhängig: sowohl Sorte und Reifegrad als auch Umwelt- und Wachstums-
bedingungen haben einen Einfluss auf die Inhaltsstoffe [3]. Eine Übersicht über die wichtigsten
Inhaltsstoffe, Vitamine und Mineralstoffe gibt Tab. 1.
Tab. 1 Ausgewählte Inhaltsstoffe von frischen Tomaten, Gehaltsangaben pro 100 g Frischmasse (nach SOUCI, FACHMANN & KRAUT 2008 [18] und INBARAJ & CHEN 2008 [19])
Inhaltsstoff Gehalt Inhaltsstoff Gehalt
Hauptinhaltsstoffe Vitamine
Wasser (g) 94,2 Vitamin C (mg) 19
Eiweiß (g) 0,95 Gesamtcarotinoide (mg) 7-19A
Kohlenhydrate (g) 2,60 β-Carotin (µg) 230A
Fett (g) 0,21 Lycopin (mg) 9,27A
Mineralstoffe (g) 0,61 Gesamttocopherole (µg) 930
Ballaststoffe (g) 0,95 Folsäure (µg) 22
Mineralstoffe + Spurenelemente Pantothensäure (µg) 310
Natrium (mg) 3,3 Biotin (µg) 4,0
Kalium (mg) 242 Vitamin K (µg) 5,7
Magnesium (mg) 12 Nicotinsäure (µg) 530
Eisen (µg) 332 Riboflavin (µg) 35
Zink (µg) 154 Thiamin (µg) 57
A nach INBARAJ & CHEN 2008 [19], restliche Angaben nach SOUCI, FACHMANN & KRAUT 2008 [18]
Frische Tomaten bestehen zum größten Teil (ca. 94 %) aus Wasser [18]. Die verbleibenden 6 % bein-
halten anorganische Bestandteile, organische Säuren, Zucker, in Ethanol unlösliche Feststoffe (Pro-
teine, Cellulose, Pektin, Polysaccharide), Carotinoide und Lipide [20]. Bei den löslichen Feststoffen in
Tomaten handelt es sich zu mehr als 60 % um Zucker, die zum Aroma der Früchte beitragen [3]. Die
Gehalte sind von Lichtintensität und -dauer abhängig und nehmen mit dem Reifeprozess zu [3,21].
Der freie Zucker setzt sich im Wesentlichen aus Glucose und Fructose sowie geringen Konzentratio-
nen an Saccharose zusammen [21]. MORETTI et al. (1998) bestimmten die höchsten Zuckerkonzentra-
tionen im Plazentagewebe, da dieses die Kohlenhydrate für das Wachstum und die Entwicklung der
Samen bereitstellen muss [22]. Der Lipidanteil in Tomaten besteht aus Triglyceriden, Sterolen, Sterol-
estern, freien Fettsäuren und Kohlenwasserstoffen [3], wobei die Samen zum Großteil des Fettgehal-
tes beitragen. MADHAVI & SALUNKHE (1998) berichten, dass 33 gesättigte und ungesättigte Fettsäuren
im Perikarp von verschiedenen untersuchten Sorten gefunden wurden [3]. Dabei dominierten Linol-,
Linolen-, Öl-, Stearin-, Palmitin- und Myristinsäure. Der Proteingehalt liegt bei etwa 1 % und setzt sich
aus 43,3 % freien Aminosäuren und 56,7 % Protein-Aminosäuren zusammen [21].
Außerdem enthalten Tomaten Vitamin B1 (Thiamin), B2 (Riboflavin), B3 (Nicotinsäure) und B6 sowie
Vitamin C, Folsäure, Pantothensäure, Biotin, Vitamin E und K [3,20]. Im Gegensatz zu den meisten
Gemüsearten ist die vorherrschende organische Säure die Zitronensäure, die zusammen mit der
Äpfelsäure zum typischen Geschmack der Tomaten beiträgt [3,21]. Bei den Mineralstoffen ist der
hohe Kaliumgehalt bei gleichzeitig niedrigem Natriumgehalt hervorzuheben, da sich dieses Verhältnis
positiv auf Bluthochdruck auswirkt [23]. Außerdem können Tomatenpflanzen in allen Teilen ein
Steroid-Glykoalkaloid, das Tomatin, bilden [21]. Im unreifen, grünen Zustand sind ebenfalls geringe
Mengen an Solanin enthalten. Reife rote Tomaten sind allerdings vollständig frei von Alkaloiden [10].
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
4
2.1.2 Der Tomatenmarkt und die Problematik der Reststoffverwertung
Die Tomate gilt sowohl qualitativ als auch quantitativ als bedeutendes Gemüse. Die steigende Nach-
frage beruht zum einen auf ihrem ernährungsphysiologischen Gesundheitswert, der sie zum optima-
len Frischgemüse für eine leichte und gesunde Ernährung macht, und zum anderen auf deren
Verwendung als Basis für viele verarbeitete Produkte [4]. Im Jahr 2011 betrug die weltweite Toma-
tenproduktion über 159 Mio. t [24]. China, Indien, die USA und die Türkei trugen zu mehr als der
Hälfte der Gesamtproduktion bei. Laut BUNDESANSTALT FÜR LANDWIRTSCHAFT UND ERNÄHRUNG sind
Tomaten in Deutschland das beliebteste Gemüse [25]. Im Wirtschaftsjahr 2012/13 verzehrten wir
20,6 kg Tomaten pro Kopf, davon 6,7 kg frische Tomaten und 13,9 kg verarbeitete Tomatenprodukte
[25]. In den USA wurden 80 % der konsumierten Tomaten in Form verarbeiteter konservierter
Produkte verzehrt [26]. Das macht die Tomate zum weltweit führenden Gemüse in der Industrie [27].
COSTA & HEUVELINK (2005) geben einen Überblick über die Vielfalt an Tomatenprodukten [1] (Abb. 2).
Das am meisten produzierte Erzeugnis ist Tomatenmark [27], da es oft als Basis für weitere Produkte,
wie Ketchup, Suppen und Saucen, dient.
Abb. 2 Einteilung der verarbeiteten Tomatenprodukte und einige Beispiele (nach COSTA & HEUVE-LINK (2005) [1])
Aus verschiedenen Verarbeitungsprozessen der Tomatenindustrie resultiert der sogenannte Toma-
tentreber oder Tomatentrester. Dieser besteht zum größten Teil aus den Schalen, Samen, aber auch
aus faserigen Bestandteilen und aussortierten Tomaten [28]. Die Schalen werden bei konservierten
Erzeugnissen mit Hilfe spezieller Methoden entfernt. Die Abtrennung der Samen erfolgt meist me-
chanisch, wobei oft Bestandteile des Fruchtfleisches unvermeidbar daran haften bleiben. Im Jahr
2009 ergaben sich laut FAOSTAT 12,9 Mio. t Abfall aus 152,7 Mio. t produzierten Tomaten, was
einem Anteil von 8,5 % entspricht [24]. Bei der Gewinnung von Tomatensaft enden bspw. 3-7 % des
Ausgangsmaterials als Abfall [29]. Die Samen machen dabei einen Anteil von etwa 60 % aus [30].
Abb. 3 zeigt ein Fließdiagramm zur Herstellung verschiedener Tomatenerzeugnisse und bildet die
Zweigpunkte ab, an denen verschiedene Reststoffe anfallen. Schon im Jahr 1917 erkannte RABAK
(1917), dass die wirtschaftliche Maßnahme der Wiederverwertung des Abfalls aus der industriellen
Verarbeitung von Tomatenprodukten für die Landwirtschaft und Industrie sehr bedeutend ist [31].
Eine Abfallentsorgung hat neben weiteren Kosten eine Verschmutzung der Umwelt zur Folge, wes-
halb die Abfallaufarbeitung einen immer höher werdenden Stellenwert annimmt.
Tomatensamen sind eine Quelle für Fett und Protein [30]. Arbeiten, die sich intensiver dem Fettge-
halt und der Lipidzusammensetzung widmeten, machten deutlich, dass das gewonnene Öl reich an
ungesättigten Fettsäuren ist und durchaus als Speiseöl, Lebensmittelzusatzstoff oder auch als Zusatz-
stoff in Kosmetika genutzt werden kann [30-35]. Der Proteingehalt der Samen beträgt 22,2-33,9 %
konservierte
Tomatenprodukte
getrocknete
Tomatenprodukte
Lebensmittel auf Tomaten-
Basis
ganze geschälte Tomaten, Tomatensaft, Tomatenmark,
Tomatenpulpe, passierte Tomaten
Tomatenpulver, Tomatenflocken, ganze getrocknete Tomaten
Tomatensuppe, Tomatensauce,
Tomatenketchup, Chilisauce
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
5
[32]. Der Presskuchen, der nach der Ölextraktion zurückbleibt, wird als Proteinquelle z. B. in Futter-
mitteln verwendet [34]. Auch das Lycopin als natürlicher roter Farbstoff der Tomaten geht durch die
Entfernung der Schalen zu einem großen Teil bei der Verarbeitung verloren. BAYSAL et al. (2000)
entwickelten dahingehend eine Extraktionsmethode, um Lycopin und β-Carotin aus Abfällen der
Tomatenmarkherstellung zu gewinnen [36].
2.2 Carotinoide
2.2.1 Struktur und Vorkommen
Carotinoide sind eine heterogene Gruppe sekundärer Pflanzenstoffe, von denen heute rund 750 Ver-
bindungen bekannt sind [38,39]. Meist handelt es sich um Tetraterpene, die aus 8 Isoprenoideinhei-
ten bestehen [40]. Aufgrund ihrer chemischen Struktur werden die Carotinoide in die sauerstoff-
freien Carotine und die sauerstoffhaltigen Xanthophylle eingeteilt, die verschiedene Polaritäten und
Fettlöslichkeiten aufweisen. Zu den Carotinen zählen bspw. α-Carotin, β-Carotin und Lycopin. Lutein,
Zeaxanthin und β-Cryptoxanthin sind typische Vertreter der Xanthophylle (Abb. 4).
Ein auffälliges und typisches Merkmal der Carotinoide ist die lange Polyen-Struktur, die durch die
Absorption bestimmter Teile des sichtbaren Lichtspektrums deren charakteristische Farben (gelb,
orange, rot) bedingt. Außerdem kann jedes Carotinoid durch die Doppelbindungen geometrische
Abb. 3 Übersicht über die Herstellung von Tomatenerzeugnissen (nach EYRING 2004 [37]), grau unter-legt: Reststoffe
Frischtomaten
Entladen 1. Waschen
2. Waschen Sortieren
Schältomaten
Schalen
Schneiden oder Passieren =
Tomatenpulpe Samen
Zerkleinern (Hot Break oder
Cold Break)
Sieben
Zentrifugieren Samen, Schalen, Cellulose
Konzentrieren = Tomatenmark
Transportfertiges Produkt zur Weiterverwendung
Walzen- oder Sprühtrocknung
zu Pulver
Ketchup Suppen und
Saucen
Rückverdünnung zu Tomatensaft
Erhitzen Schälen Verlesen
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
6
Isomere bilden. So existieren für die bekannten Verbindungen mehr als 200 000 verschiedene
Isomere [40]. Aufgrund der höheren thermodynamischen Stabilität dominiert die all-trans-Form
((all-E)-Form) in der Natur [41].
Abb. 4 Strukturformeln ausgewählter Carotinoide
Die mittlere Carotinoid-Zufuhr liegt in Deutschland nach WATZL & BUB (2001) bei 5,3 mg/Tag [40].
Obst und Gemüse sind die Hauptquelle für diese Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe [40]. Aber
auch verschiedene tierische Lebensmittel, wie z. B. Krustentiere, Lachs und Eier, enthalten Carotino-
ide, da Tiere diese ebenfalls über die Nahrung aufnehmen [38]. Carotine kommen in orange-gelb-
rotem Gemüse und Obst vor, Xanthophylle finden sich hauptsächlich in grünblättrigem Gemüse. To-
maten und Tomatenprodukte sind eine gute Quelle für verschiedene Carotinoide, insbesondere das
Lycopin. Dieses Carotin ist für die rote Farbe der Tomaten verantwortlich und trägt zu mehr als 60 %
der Gesamtcarotinoide bei [42] (Abb. 5). Nach einer Studie von GARCÍA-CLOSAS et al. (2004) stehen To-
maten an erster Stelle bei den Versorgungsquellen für Lycopin [43]. Weiterhin wurden die farblosen
Carotinoid-Vorstufen Phytoen und Phytofluen, freie und veresterte Xantophylle sowie kleine Anteile
an weiteren Carotinen (β-Carotin, γ-Carotin, ζ-Carotin, α-Carotin, δ-Carotin) gefunden [19].
Abb. 5 Carotinoidprofil von Tomaten (nach TONUCCI et al. 1995 [42])
GAMA et al. (2006) berichteten, dass die Carotine 86-91 % und die Xanthophylle 9-14 % der Gesamt-
carotinoide der Tomaten ausmachten [44]. Studien über die Verteilung der Carotinoide in Tomaten
ergaben, dass die äußere Perikarpschicht den höchsten Anteil an den Gesamtcarotinoiden aufwies,
β-Carotin 2%
γ-Carotin 10%
ζ-Carotin 1%
Lutein 1%
Lycopin62%
Neurosporin 7%
Phytoen 12%
Phytofluen 5%
(all-E)-β-Carotin
(all-E)-Lycopin
(all-E)-Zeaxanthin
(all-E)-Lutein
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
7
während der β-Carotingehalt in den Fruchtkammern am höchsten war [45]. Somit scheinen die
Schalen der Tomaten besonders reich an Lycopin zu sein, was darauf hindeutet, dass dieses Carotin
an den unlöslichen Faserstoffen anhaftet. β-Carotin war gleichmäßig in den Tomaten verteilt [19]. In
den Samen waren hingegen die Xantophylle vorherrschend [46].
2.2.2 Funktionen
In Pflanzen spielen die Carotinoide eine bedeutende Rolle bei der Photosynthese in Chloroplasten.
Dort sind sie zum einen bei der Lichtabsorption beteiligt, zum anderen schützen sie Chlorophyll vor
oxidativen Schäden [40]. Letzteres beruht auf der antioxidativen Aktivität der Carotinoide, d. h. auf
der Fähigkeit, Elektronen oder Wasserstoffatome abzugeben sowie auf ihrer leichten Oxidierbarkeit
[47]. Diese Schutzfunktionen werden auch in tierischen und menschlichen Geweben diskutiert. Die
Carotinoide erwiesen sich in vitro als Fänger von energiereichem Singulettsauerstoff, der im Körper
zu Zell- und DNA-Schäden führen kann. Die Eigenschaft als Radikalfänger lässt vermuten, dass die
Antioxidanswirkung einen Schutzmechanismus vor Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellt
[47]. So besteht ein positiver Zusammenhang zwischen einer hohen Zufuhr und Gewebekonzentra-
tion an Carotinoiden und einem niedrigeren Risiko für chronische Erkrankungen [48]. Die bekanntes-
te Funktion der Carotinoide im menschlichen Organismus ist wahrscheinlich die Wirkung als Vorstufe
des Vitamin A‘. α-Carotin, β-Carotin und β-Cryptoxanthin sind Provitamin-A-wirksame Verbindungen,
da sie mindestens einen unsubstituierten β-Iononring am Ende der Polyenkette besitzen [38]. In
Folge dessen spielen die Carotinoide eine wichtige Rolle bei der Prävention von Vitamin-A-Mangel-
erkrankungen. Lycopin zeigt diese Wirkung nicht, ihm wird allerdings eine große Bedeutung bei der
Prostata-Krebs-Prävention zugeschrieben [48]. Daneben sind Lutein und Zeaxanthin die zwei Caroti-
noide, die sich besonders im menschlichen Auge anreichern und im Zusammenhang mit dem Schutz
vor häufig auftretenden Augenerkrankungen wie altersbezogener Makuladegeneration (AMD),
Katarakten oder Retinitis pigmentosa stehen [49].
2.3 Vitamin E
2.3.1 Struktur und Vorkommen
Unter dem Begriff Vitamin E werden acht isomere, fettlösliche Moleküle zusammengefasst, zu denen
vier Tocopherole (α-, β-, γ- und δ-Tocopherol) mit gesättigter Seitenkette und vier Tocotrienole
(α-, β-, γ- und δ-Tocotrienol) mit ungesättigter Seitenkette gehören (Abb. 6). Charakterisiert werden
die Tocopherole durch einen 6-Chromanolring mit unterschiedlichem Methylierungsmuster in den
Positionen 5, 7 und 8, und einer Phytyl-Seitenkette mit 16 Kohlenstoffatomen in Position 2. Bei den
Tocotrienolen ist diese isoprenoide Seitenkette ungesättigt mit drei trans-Doppelbindungen in den
Positionen 3‘, 7‘ und 11‘. Die spezifischen Tocopherole und Tocotrienole unterscheiden sich in der
Anzahl und Position der substituierten Methylgruppen am aromatischen Chromanolring, wodurch die
α-, β-, γ- und δ-Isomere entstehen [50]. Tocopherole und Tocotrienole werden zusammen als
Tocochromanole bezeichnet. Die Tocopherole besitzen drei asymmetrische Kohlenstoffatome.
Natürlicherweise liegen die Tocopherole in der RRR-Konformation vor. Das gängigste synthetische
Vitamin E ist das all-rac-α-Tocopherol, ein racemisches Gemisch von gleichen Anteilen aller acht
Stereoisomere.
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
8
Abb. 6 Strukturformeln von Tocopherolen (oben) und Tocotrienolen (unten)
Besonders hohe Gehalte an Vitamin E weisen Pflanzenkeime und -saaten sowie daraus hergestellte
Öle auf. In Weizenkeim-, Sonnenblumen- und Olivenöl liefert RRR-α-Tocopherol mit 50-100 % den
Hauptanteil des Vitamin E, während in Soja- und Maiskeimöl das γ-Tocopherol dominiert [51]. Zu
finden ist dieses Vitamin aber auch in Nüssen, Mandeln und Getreidekeimen. Nach der Nationalen
Verzehrsstudie II sind neben den Fetten alkoholfreie Getränke und Gerichte auf Gemüsebasis Haupt-
lieferanten von Vitamin E [52]. In Tomaten ist Vitamin E ausschließlich in den Samen vorhanden. Da
diese meist bei der Verarbeitung der Tomaten entfernt werden, kommt dem Vitamin in dieser Hin-
sicht keine Bedeutung bei der menschlichen Ernährung zu [20]. Bei Betrachtung des aus den Samen
gewonnenen Öls wird deutlich, dass dieses wesentlich höhere Tocopherolwerte aufweist. Des
Weiteren muss beachtet werden, dass die Tocochromanole unterschiedliche biologische Wirksamkei-
ten aufweisen. Aus diesem Grund wurde das sogenannte α-Tocopherol-Äquivalent (engl. α toco-
pherol equivalent, αTE) eingeführt, wobei die Wirkung von α-Tocopherol gleich 100 % gesetzt wird.
So wird der Gehalt an Vitamin E in Lebensmitteln meist als Summe der αTE angegeben. Der Bedarf an
Vitamin E wird im Zusammenhang mit der Zufuhr an mehrfach ungesättigten Fettsäuren formuliert:
je g Diensäure sollten 0,5 mg RRR-α-Tocopherol aufgenommen werden [51]. Die tägliche Zufuhr-
empfehlung in Deutschland liegt nach der DGE (2008) zwischen 12 und 14 mg α-TE [53].
2.3.2 Funktionen
Die bekannteste und am intensivsten erforschte Funktion des Vitamin E ist dessen Wirkung als lipo-
philes Antioxidans in Pflanzen und Tieren. In tierischen Zellen schützt α-Tocopherol als Bestandteil
aller biologischen Membranen die Membranlipide vor Lipidperoxidation und fängt reaktive Sauer-
stoffspezies ab. Daneben wirkt Vitamin E für die Lipoproteine und Depotfette als Antioxidans [51,54].
Auch der Einfluss von Vitamin E auf biochemische und zellbiologische Prozesse im menschlichen
Körper ist vielseitig. Neben dem antioxidativen Potential besitzen Tocochromanole Gen-regulierende
Eigenschaften, sowie Funktionen als Signalmolekül, die sich zwischen den isomeren Molekülen durch
ihre biologische Verfügbarkeit und Aktivität unterscheiden. Mögliche positive Effekte in der Präven-
tion von Krebs und Atherosklerose wurden ebenfalls ermittelt [55]. Auch in Ölen sind die Tocophe-
role die wichtigsten natürlichen Antioxidantien. Sie stabilisieren Hydroperoxid-Radikale und freie
Radikale und verhindern damit die Lipidperoxidation. Dies hat einen maßgeblichen Einfluss auf die
Aroma- und Geschmacksqualität des Öles [56] und spielt eine wichtige Rolle für die Lagerstabilität
[33]. In den Pflanzenölen besteht ein direkter Zusammenhang zwischen dem Sättigungsgrad und dem
Tocopherol-Gehalt. Liegen viele ungesättigte Fettsäuren in einem Öl vor, so ist die Wahrschein-
lichkeit einer Oxidation größer. Zum Schutz dieser sind entsprechende Tocopherol-Konzentrationen
erforderlich.
R1 R2 R3
α CH3 CH3 CH3 β CH3 H CH3 γ H CH3 CH3 δ H H CH3
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
9
2.4 Bestimmung der antioxidativen Kapazität
Antioxidantien werden im Allgemeinen als Stoffe definiert, die „… in niedrigen Konzentrationen im
Vergleich zum oxidierbaren Substrat, eine Oxidation des Substrates verzögern oder verhindern“ [57].
Das Ausmaß, mit dem Substrate vor einem oxidativem Angriff geschützt werden, wird in Form der
antioxidativen Kapazität (engl. antioxidant capacity, AOC) gemessen. In der Ernährungsforschung
besteht in zweierlei Hinsicht ein wachsendes Interesse an der Bestimmung dieses Parameters. Zum
einen ist der sogenannte oxidative Stress, bei dem wichtige zelluläre Bestandteile durch reaktive Ver-
bindungen oxidiert werden, häufig die Ursache verschiedener Erkrankungen [58]. Um neue Ansätze
zur Prävention entwickeln zu können, spielt die Bestimmung des antioxidativen Status‘ im Organis-
mus eine entscheidende Rolle. Insbesondere die Antioxidantien aus der Nahrung, hauptsächlich
sekundäre Pflanzenstoffe (Carotinoide und Polyphenole, wie Phenolcarbonsäuren und Flavonoide),
Vitamin C und E aus Obst und Gemüse, haben einen vorbeugenden Einfluss auf diese Erkrankungen
[59,60]. Zum anderen profitiert die Lebensmittelindustrie von diesen Erkenntnissen. Die Vorgänge,
die beim oxidativen Verderb von frischen und verarbeiteten Lebensmitteln sowie bei Kosmetika ab-
laufen, werden so besser verstanden. Damit können entsprechende Maßnahmen bei der Lagerung
und Verpackung sowie bei der Zugabe von Antioxidantien als Zusatzstoffe ergriffen werden [58].
Bisher wurden viele Schnelltests zur Bestimmung der gesamten AOC entwickelt. Die Erforschung der
Antioxidantien ist allerdings ein sehr komplexes Feld, sodass noch keine standardisierte, universell
anwendbare Methode existiert, die die AOC von Lebensmitteln und biologischen Proben verlässlich,
exakt und quantitativ erfasst [58,61,62]. Die Tatsache, dass eine Vielzahl verschiedenster Radikal-
spezies, Oxidantien und Antioxidantien vorliegen und dass diese auf vielfältigste Art und Weise
miteinander reagieren, erschweren die Entwicklung einer solch standardisierten Methode [63]. Die
verschiedenen entwickelten Testmethoden weisen Unterschiede bezüglich verwendeter Radikal-
quellen, Substrate, Reaktionsbedingungen und Quantifizierungsmethoden auf.
Des Weiteren muss bedacht werden, dass sowohl hydrophile Antioxidantien (Ascorbinsäure, Poly-
phenole etc.) als auch lipophile Antioxidantien (Vitamin E, Carotinoide etc.) vorliegen, die sich in
ihrem Löslichkeitsverhalten im Testmedium unterscheiden. Der Großteil der antioxidativen Testsys-
teme eignet sich nur für wasser- und alkohollösliche Antioxidantien. MÜLLER (2011) optimierte bzw.
entwickelte verschiedene Methoden neu, um lipophile Antioxidantien messen zu können [58].
Grundsätzlich existieren drei Reaktionsmechanismen, nach denen Antioxidantien Radikale deaktivie-
ren: Adduktbildung, Elektronentransfer (engl. single electron transfer, SET bzw. ET) und Wasserstoff-
atom-Transfer (engl. hydrogen atom transfer, HAT) [58,61]. Die beiden letzteren dienen gleichzeitig
als Ansatz zur Erfassung der AOC und teilen die Testsysteme in zwei Kategorien.
HAT-basierte Methoden messen die Radikalfängerkapazität eines Antioxidans über eine Wasserstoff-
atom-Übertragung [62], durch die eine Radikalkettenreaktion unterbrochen wird.
ROO• + PH → ROOH + P• (1)
ROO• + AH → ROOH + A• (2)
Den meisten HAT-Tests liegt ein kompetitiver Reaktionsmechanismus zugrunde, bei dem Antioxidan-
tien (AH) mit einem fluoreszierenden Substrat (PH) um vorhandene Radikale (z. B. Peroxylradikale
ROO•) konkurrieren [58,61]. Dabei müssen die Antioxidantien schneller mit den Radikalen reagieren
als die Substrate, um diese effektiv vor dem oxidativen Angriff zu schützen [64]. Somit beinhalten die
HAT-Testmethoden im Allgemeinen drei Komponenten:
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
10
a. einen synthetischen, thermolabilen Peroxylradikal-Generator,
b. ein fluoreszierendes Substrat, das bei oxidativem Angriff seine optischen Eigenschaften
ändert und damit den Reaktionsverlauf nachvollziehbar macht und
c. eine antioxidativ wirksame Probe, die mit dem Substrat um die gebildeten Radikale kon-
kurriert und damit die Reaktion verzögert [61].
Schließlich wird das Ausmaß, mit dem diese Oxidation verhindert wird, bestimmt und eine Quantifi-
zierung mit Hilfe eines standardisierten Antioxidans‘ (meist Trolox) vorgenommen [65].
Dagegen messen SET-basierte Methoden die Fähigkeit von Antioxidantien, Elektronen zu übertragen
um Oxidantien, wie Metalle, Carbonyle oder freie Radikale, zu reduzieren [63]. An der Reaktion ist
eine antioxidative Probe (AH) und ein Substrat bzw. Oxidationsmittel (PH) beteiligt. Es handelt sich
folglich um eine einfache Redoxreaktion, bei der ein Elektron von dem Antioxidans auf das Oxidans
übertragen wird. Daher wird die bestimmte AOC auch als Reduktionskapazität bezeichnet [61].
PH(n) + AH → PH(n-1) + AH•+ (3)
Die Reduktion des Oxidans‘ resultiert in einer Absorptions- bzw. Farbänderung, die photometrisch
gemessen wird. Die Farbveränderung verhält sich dabei proportional zur Konzentration des Antioxi-
dans‘ [61]. Folgende Tabelle (Tab. 2) gibt eine Übersicht über einige Testmethoden zur Bestimmung
der AOC.
Tab. 2 Ausgewählte Methoden zur Bestimmung der AOC (nach HUANG et al. 2005 [61], VALENTINI 2009 [65])
Bezeichnung Messung von
Was
sers
toff
ato
m-
tran
sfer
(H
AT)
ORAC Oxygen Radical Absorbance
Capacity AOC gegenüber Peroxylradikalen
TRAP Total Radical Trapping
Antioxidant Parameter AOC gegenüber Peroxylradikalen
TOSC Total Antioxidant
Scavenging Capacity
AOC gegenüber Peroxylradikalen, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit
Elek
tro
nen
- tr
ansf
er (
SET)
TEAC Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity AOC gegenüber ABTS•+
Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu
molybdänreduzierende Fähigkeit von
Antioxidantien
FRAP Ferric Ion Reducing
Antioxidant Power
eisenreduzierende Fähigkeit von Antioxidantien
Aufgrund der Tatsache, dass für die Arbeit drei der aufgeführten Tests (ORAC, TEAC, Gesamtphenol-
test nach Folin-Ciocalteu) angewendet wurden, schließt sich eine nähe Erläuterung dieser an.
2.4.1 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu
Diese kolorimetrische Testmethode wurde viele Jahre gemäß ihrem Namen zur Bestimmung des Ge-
samtphenolgehaltes in Pflanzenerzeugnissen genutzt [63]. Das verwendete Folin-Ciocalteu-Reagenz
besteht aus einer Mischung aus Phosphomolybdat und Phosphowolframat, die exakte Zusammen-
setzung ist allerdings unbekannt. Durch eine Reaktion mit den in einer Probe enthaltenen phenoli-
schen Gruppen entsteht ein blau gefärbtes Produkt, welches photometrisch bei 765 nm gemessen
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
11
wird [66]. Hierbei wird angenommen, dass ein einzelnes Elektron von dem Substrat, dem Phenol, auf
das komplexierte sechswertige gelbe Molybdän (Mo6+) übertragen wird, wodurch eine Reduktion
zum fünfwertigen blauen Molybdän (Mo5+) stattfindet. Damit wird deutlich, dass der zugrunde lie-
gende Reaktionsmechanismus auf einer Ein-Elektronen-Übertragung (SET-Mechanismus) basiert und
die reduzierende Kapazität einer Probe gemessen wird. Infolgedessen gilt dieser Test als unkompli-
zierte und exakte Methode zur Bestimmung der AOC. Aufgrund der Ähnlichkeit der Reaktions-
mechanismen wurde beim Vergleich des Gesamtphenoltests mit SET-basierten antioxidativen Tests,
wie dem TEAC, oft eine lineare Korrelation zwischen dem Gesamtphenolgehalt und der AOC nachge-
wiesen [61,67]. Diese Erkenntnis impliziert, dass die phenolischen Inhaltsstoffe überwiegend zu den
antioxidativen Eigenschaften in vielen Pflanzen beitragen. Daneben existieren einige Berichte, so
auch eine Studie von EVERETTE et al. (2010), die zeigten, dass das Folin-Ciocalteu-Reagenz auch mit
anderen reduzierenden Verbindungen außer Phenolen, wie bestimmten Thiolen, Vitaminen oder
Aminosäuren, reagiert und nicht nur spezifisch für Phenole ist [66].
2.4.2 TEAC-Test
Der TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)-Test wurde 1993 von MILLER et al. entwickelt und
später durch andere Forschungsgruppen überarbeitet [68,69]. Die Bestimmung der AOC basiert bei
diesem Test auf der Absorption des farbigen Radikalkations ABTS•+ [68]. Im Allgemeinen wird der
TEAC-Test den SET-Reaktionen zugeordnet. Allerdings kann das genannte Radikalkation sowohl durch
Reduktion per Elektronen-Übertragung als auch durch Radikalfänger per Wasserstoffatom-Übertra-
gung neutralisiert werden [63]. Demzufolge nutzt die Methode sowohl den SET- als auch den HAT-
Mechanismus. ABTS (2,2‘-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)) wird durch Peroxylradikale
oder andere Oxidantien in seine blau-grün gefärbte Radikalform ABTS•+ umgewandelt, dessen Ab-
sorption bei etwa 730 nm spektralphotometrisch gemessen wird. Antioxidantien besitzen die Fähig-
keit, dieses Radikal zu reduzieren und bewirken dadurch eine Entfärbung der Reaktionslösung. Die
Abnahme der Absorption von ABTS•+ in Gegenwart der Probe bzw. Trolox-Standardlösungen wird zu
einem festgelegten Zeitpunkt gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt [63].
Inzwischen existieren drei Varianten des TEAC-Tests. In der ursprünglichen Version, dem TEAC I,
dient die Peroxidaseaktivität von Metmyoglobin zur Generierung des Radikalkations ABTS•+ [70].
Durch die Aktivierung von Metmyoglobin mit Wasserstoffperoxid entsteht Ferrylmyoglobin, das mit
ABTS reagiert und das Radikalkation erzeugt [68]. Antioxidantien verzögern hierbei die Bildung des
Radikalkations um die sogenannte Lag-Phase, die als Maß für die AOC dient [70]. Kritik wurde von
STRUBE et al. (1997) an der Reihenfolge der Reagenzienzugabe geäußert [71]. Die antioxidative wir-
kende Probe wurde bereits vor der Radikalbildung in das Reaktionsmedium gegeben, wodurch nicht
nur das Abfangen freier Radikale, sondern auch der hemmende Einfluss auf die Radikalbildung er-
fasst wurde. Das kann eine Überschätzung der AOC zur Folge haben. STRUBE et al. (1997) optimierten
die Methode daraufhin mit einem sogenannten „Post-addition Assay“ [71]. Dabei wird die Probe erst
nach der Erzeugung der Radikale zugegeben, sodass nur die radikalabfangende Wirkung des Antioxi-
dans‘ wiedergespiegelt wird.
Im Laufe der Zeit wurden weitere Test-Abwandlungen bezüglich ABTS•+-Bildung, eingesetzter Wellen-
längen sowie Quantifizierungsmethoden vorgenommen [63]. Bei dem TEAC-II-Test wurde bspw. das
ABTS-Radikal mittels Mangandioxid gebildet und nach der Zugabe von Antioxidantien die Abnahme
der Extinktion gemessen [72]. Diese Testvariante diente ursprünglich zur Analyse von lipidlöslichen
Antioxidantien [70], woraus sich die Kennzeichnung als L-TEAC-II-Test ergab. Durch den Austausch
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
12
des wasserlöslichen Trolox gegen sein fettlösliches Analogon α-Tocopherol als Kalibrierstandard
wurde der Test daraufhin in α-Tocopherol Equivalent Antioxidant Capacity (αTEAC)-Test umbenannt
[58]. RE et al. (1999) nutzten Kaliumperoxodisulfat als alternative Radikalquelle zur Oxidation von
ABTS [69]. Dies entspricht dem TEAC-III-Test, für den ebenfalls eine hydrophile und eine lipophile
Variante existieren [69]. Die hydrophile Variante des TEAC-III-Tests (im Folgenden als H-TEAC-Test
bezeichnet) sowie der αTEAC-Test fanden Anwendung bei der Analyse der Tomatensamen.
2.4.3 ORAC-Test
Der ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)-Test ist eine etablierte Methode, die auf einer
Wasserstoffatom-Übertragung basiert. Das angewendete Verfahren wird explizit als H-ORACFl be-
zeichnet. Die Kennzeichnung H-ORAC impliziert die Anwendung auf hydrophile Antioxidantien. Die
Grundlagen zu diesem Verfahren lieferten WAYNER et al. (1986), einige Änderungen wurden später
von CAO et al. (1993) und OU et al. (2001) vorgenommen [73-75]. Als Radikalgenerator bildet
2,2‘-Azobis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid (AAPH) durch thermische Zersetzung Peroxylradikale
[78], die ein fluoreszierendes Substrat oxidieren und damit abbauen, woraus eine Fluoreszenzab-
nahme resultiert. Bei diesem Substrat handelte es sich ursprünglich um das Protein β-Phycoerythrin,
bei dem einige Autoren allerdings feststellten, dass die Verbindung unter den Reaktionsbedingungen
nicht photostabil ist und dass Wechselwirkungen mit Polyphenolen durch unspezifische Protein-
bindungen stattfinden [75].
Aufgrund dieser Tatsachen modifizierten OU et al. (2001) die Methode weiter, indem sie das photo-
stabile Fluoreszein als Indikatorfarbstoff verwendeten [75]. Daher resultiert die Bezeichnung
H-ORACFl. In Anwesenheit von Antioxidantien wird die Reaktion zwischen den Peroxylradikalen und
dem Fluoreszein verzögert, da ein Teil der Peroxylradikale mit den Antioxidantien reagiert und
dadurch neutralisiert wird [65]. Die erreichte Verzögerung der Fluoreszenzabnahme dient als Mess-
größe für die AOC [76]. Die Reaktion wird so lange verfolgt, bis alle Antioxidantien und das Fluores-
zein durch die Peroxylradikale oxidiert wurden [74], die Fluoreszenz bis auf Null abgesunken ist. Als
Referenzsubstanz zur Erstellung einer Kalibriergerade wird Trolox verwendet. Zur Quantifizierung der
AOC wird die Fläche unter der gemessenen Fluoreszenzkurve (area under the curve, AUC) der Probe
ermittelt und anschließend die Fläche des Blindwertes (ohne Antioxidantien) abgezogen [65]. Die
Fläche unter der Kurve ist proportional der AOC [74]. Die Einzigartigkeit des ORAC-Tests besteht
darin, dass sowohl Ausmaß als auch Dauer der Fluoreszenzabnahme durch die Antioxidantien in
einer Messgröße erfasst werden [75].
2.5 Die Ölgewinnung aus Ölsaaten und deren Fettsäurezusammensetzung
Die Gewinnung von Ölen aus pflanzlichen Materialien kann durch verschiedene technologische Ver-
fahren realisiert werden. Als Rohstoffe dienen jeweils ölhaltige Samen, Keime oder Früchte. Das am
häufigsten angewandte Verfahren ist die Extraktion mit Lösungsmitteln [9]. Diese Methode zur Öl-
gewinnung verursacht gegenüber der traditionellen Methode, dem Pressen der Ölsaaten, nur etwa
50 % der Kosten einer Pressung. Außerdem ermöglicht die Vorgehensweise deutlich niedrigere Rest-
ölgehalte [77]. Als weitere Möglichkeiten zur Ölgewinnung kann eine Kombination aus beiden Ver-
fahren oder auch eine Hochdruckextraktion (z. B. mit überkritischem Kohlenstoffdioxid) zum Einsatz
kommen [9].
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
13
Zudem wird zwischen kaltgepressten und raffinierten Ölen unterschieden. Kaltgepresste Speiseöle
werden ohne Wärmezufuhr ausschließlich durch mechanische Verfahren gewonnen. Im Gegensatz
dazu werden dem Rohöl bei der Raffination unerwünschte, natürliche Begleitstoffe und Verunreini-
gungen entzogen, indem es entschleimt, entsäuert, gebleicht und gedämpft wird [78]. Allerdings
gehen bei diesem Prozess auch Aromakomponenten und ernährungsphysiologisch relevante Inhalts-
stoffe verloren [54].
Pflanzenöle bestehen hauptsächlich aus Triglyceriden, Ester aus drei Fettsäuren und Glycerin. Die Zu-
sammensetzung oder das Muster der Fettsäuren ist für viele Eigenschaften des entsprechenden Öles
verantwortlich. Dazu zählen Parameter, die für die industrielle Herstellung, sowie Lagerung und Ver-
wendung von Bedeutung sind, wie z. B. die Viskosität, der Schmelzpunkt, die Stabilität beim Erhitzen,
die Oxidierbarkeit, aber auch die ernährungsphysiologischen Eigenschaften [79]. Neben der Art der
Fettsäuren ist deren Position an dem Glycerinmolekül für unterschiedliche physikalische und chemi-
sche Eigenschaften verantwortlich [79]. Die Fettsäuren unterscheiden sich zum einen in ihrer Ketten-
länge und zum anderen in ihrem Sättigungsgrad. Die meisten natürlich vorkommenden Fettsäuren
haben eine gerade Anzahl an Kohlenstoffatomen [80]. Bezüglich des Sättigungsgrades wird zwischen
gesättigten (SFA) sowie einfach (MUFA) und mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) unterschie-
den. Die ungesättigten Fettsäuren können weiter in sogenannte ω(omega)-Serien eingeteilt werden.
Dieser griechische Buchstabe kennzeichnet das Methyl-Ende einer Fettsäure und ist die Grundlage
einer Nomenklatur, bei der die Doppelbindung angezeigt wird, die sich in nächster Nähe zu dem
Methyl-Ende befindet [81]. Demnach gibt es in Abhängigkeit von der Position der Doppelbindung die
essentiellen ω3- und ω6-Fettsäuren sowie die nicht essentiellen ω9-Fettsäuren.
Pflanzenöle zählen zu den wichtigsten Quellen, die den Menschen mit Fettsäuren versorgen. Diese
spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus, da sie Energie liefern, Bestandteile biologischer Mem-
branen sind und sich auf die Genregulation auswirken [81]. Aus ernährungsphysiologischer Sicht
sollte auf die Zusammensetzung der Fettsäuren geachtet werden, da diese gerade in Abhängigkeit
vom Sättigungsgrad unterschiedliche biologische Effekte hervorrufen. Eine hohe Aufnahme von ge-
sättigten Fettsäuren steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Serumcholesterinwerten und den
hohen Sterberaten aufgrund der koronaren Herzkrankheit [82]. Den ungesättigten ω3- und ω6-Fett-
säuren werden wiederum positive Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System nachgesagt [81].
Der sogenannte P:S-Index, der das Verhältnis der mehrfach ungesättigten zu den gesättigten Fett-
säuren darstellt, sollte nach KANG et al. (2005) zwischen 1,0 und 1,5 liegen [82]. Pflanzenöle sind
generell reich an ungesättigten Fettsäuren. Außerdem tragen die enthaltenen fettlöslichen Vitamine
A, D, E und K zu den gesundheitlich bedeutsamen Inhaltsstoffen von Pflanzenölen bei [83].
Im Hinblick auf eine sinnvolle Reststoffverwertung für die großen Mengen an Tomatensamen, die in
der verarbeitenden Industrie anfallen, wurden auch hier Verfahren zur Ölgewinnung aus diesen
Samen entwickelt. In den Samen wurde ein Fettgehalt von etwa 25 % festgestellt [30] und Schätzun-
gen zufolge könnten weltweit mehr als 0,14 Mio. t Öl pro Jahr aus den Samen der Tomatentrester
gewonnen werden [9]. RABAK (1917) berichtete, dass schon im Jahr 1901 von dem Italiener Battaglia
Untersuchungen zu diesem Öl angestellt wurden [31]. Später konnten genauere Analysen zu der
Fettzusammensetzung und dem Fettsäuremuster betrieben werden. Dabei wurde ein hoher Gehalt
an ungesättigten Fettsäuren, speziell der Linolsäure, festgestellt [34].
MATERIAL UND METHODEN
14
3 MATERIAL UND METHODEN
Die verwendeten Reagenzien, Geräte und Arbeitsmittel für die einzelnen Testmethoden sind im
Anhang A aufgelistet. Die ausführlichen Methodenbeschreibungen befinden sich im Anhang B.
3.1 Untersuchungsmaterial
Gegenstand der Untersuchungen waren Samen der zwei Tomatensorten Waltinger und Red Currant.
Beide Samen wurden von Herrn Hoser aus Wolfratshausen (Bayern) zur Verfügung gestellt und
stammen aus dem Jahr 2010. Bei der Sorte Waltinger lagen ca. 3 600 Samen mit einem Gewicht von
4,96 g vor. Die Samenanzahl der Sorte Red Currant belief sich auf ca. 3 220 mit einem Gewicht von
3,72 g. Dies verdeutlicht, dass die Waltinger-Samen ein geringfügig höheres Samengewicht hatten.
Beide Samensorten wurden bis zum Untersuchungszeitpunkt in verschlossenen Papiertütchen im
Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt.
3.2 Probenvorbereitung
Die Tomatensamen sollten für die Analysengänge in pulverisiertem Zustand vorliegen. Aufgrund der
sehr geringen Probenmengen konnten die Samen nicht in einer Labormühle vermahlen werden,
sondern wurden stattdessen mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser zu einem möglichst homo-
genen Pulver zerkleinert und vermahlen. Im Anschluss wurde das Samenmehl bis zur Aufarbeitung
portionsweise bei - 30 °C eingefroren.
3.3 Trockenmassebestimmung
Für die Bestimmung der Trockenmasse wurden für eine Zweifachbestimmung jeweils 500 mg der ver-
mahlenen Samenproben in luftdicht verschlossene Probengläschen eingewogen. Gleichzeitig wurden
drei Gläschen für den Blindwert an der Umgebungsluft stehen gelassen und anschließend ebenfalls
luftdicht verschlossen. Die Bestimmung des Wassergehaltes in den Proben erfolgte nach der titri-
metrischen Karl-Fischer-Methode, die sich besonders für Lebensmittel mit geringem Wassergehalt
eignet. Dabei wurden letztendlich nur ca. 50 mg Probensubstanz verwendet, sodass dennoch eine
Dreifachbestimmung durchgeführt werden konnte. Grundlage dieser Bestimmungsmethode ist die
sogenannte „Bunsengleichung“, bei der Iod und Schwefeldioxid nur in Gegenwart von Wasser mit-
einander reagieren (Gl. 4). Dadurch wird das Wasser spezifisch und selektiv erfasst.
2 H2O + SO2 + I2 ↔ SO42- + 2 I- + 4 H+ (4)
3.4 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes
Die Bestimmung des Carotinoid- und des Vitamin-E-Gehaltes erfolgte nach einer kombinierten
Methode, die in der AG Bioaktive Pflanzenstoffe entwickelt wurde. Diese orientiert sich an einer
Methode, die für Hartweizen, Grieß und Nudeln entworfen wurde [38] und in ähnlicher Weise auch
für Saaten und Presskuchen angewandt wurde [54,84]. Vor der flüssigchromatographischen Analyse
erfolgte die Aufarbeitung der Samen und die Extraktion mit Methanol (MeOH)/Tetrahydrofuran
(THF) (1/1, v/v, + 0,1 % BHT) unter gleichzeitiger Homogenisierung mittels Ultra-Turrax. Eine Über-
sicht über die einzelnen Extraktionsschritte gibt Abb. 7. Die detaillierten Extraktionsschritte werden
im Anhang B.1 beschrieben.
MATERIAL UND METHODEN
15
Abb. 7 Übersicht über die Extraktionsschritte für die kombinierte Carotinoid- und Vitamin-E-
Bestimmung
Alle Arbeitsschritte wurden im Labor unter gedämpftem Licht durchgeführt, da die Carotinoide licht-
empfindlich sind und so Abbau- und E/Z-Isomerisierungsreaktionen vermieden werden können [85].
Die Tocochromanole sind ebenso leicht oxidierbar und alle Bedingungen, die eine Oxidation während
der Probenaufarbeitung und -lagerung hätten verursachen können, wie z. B. Hitze oder Licht, wurden
weitgehend ausgeschlossen.
3.4.1 HPLC-Analytik
Die erhaltenen Extrakte wurden in zwei verschiedenen HPLC-Apparaturen analysiert. Die flüssig-
chromatografische Auftrennung der Carotinoide wurde mithilfe einer Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC,
engl. reversed phase) erreicht, während bei der Vitamin-E-Bestimmung eine Normalphasen-HPLC
(NP-HPLC, engl. normal phase) zum Einsatz kam.
3.4.1.1 HPLC-Analytik Carotinoide Die flüssigchromatographische Analyse der Carotinoide erfolgte nach einer modifizierten Methode in
Anlehnung an MÜLLER et al. (2011) mit einer RP-C30-Säule [86]. Die Trennung von Carotinoiden erfolgt
meist an RP-Materialien [87]. Außerdem wurden die meisten Trennungen von Lutein und Zeaxanthin,
die nach RYMAL & NAKAYAMA (1974) die bedeutendsten Verbindungen in Tomatensamen sind, an RP-
Systemen durchgeführt [46,88]. Zur Optimierung der Trennung wurde eine binäre Gradienten-
methode mit Methyl-tert-Butylether (MtBE) und Methanol verwendet. Die HPLC-Bedingungen
befinden sich im Anhang A.1.
3.4.1.2 HPLC-Analytik Vitamin E Die Analyse der Tocochromanole erfolgte mittels NP-HPLC nach der modifizierten Methode von
FRANKE et al. (2010)[84]. Bei der Auftrennung des Vitamin-E-Extraktes wird eine NP-HPLC bevorzugt,
da diese alle acht Tocochromanole auftrennen kann [89]. Außerdem erlaubt diese Methode das
Arbeiten mit unpolaren Lösungsmitteln, in denen sich die einzelnen Vitamin-E-Verbindungen besser
lösen. Die HPLC-Bedingungen werden im Anhang A.1 erläutert.
Quellung mit HPLC-Wasser
Extraktion 3 x 5 min am Ultra-Turrax
Filtration der Extrakte über Büchner-Trichter
Zugabe von MgCO3 (basisch), Na2SO4, internen Standards und Lösungsmittel
Eindampfen der vereinigten Extrakte
Vitamin-E-HPLC Carotinoid-HPLC
Tomatensamen
MATERIAL UND METHODEN
16
Die einzelnen Carotinoid- und Vitamin-E-Verbindungen wurden über den Vergleich der Retentions-
zeiten mit denen der Standardsubstanzen identifiziert. Zur Quantifizierung wurden die Peakflächen
mit denen der Standards definierter Konzentrationen verglichen. Die Stammlösungen von
(all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin wurden dafür im Verhältnis 1:100, 1:200, 1:500 und 1:1 000 mit
Ethanol verdünnt. Für die Standardkalibrierung der Tocopherole wurden aus den Stammlösungen
von α- und γ-Tocopherol folgende Verdünnungen hergestellt: 1:100, 1:200, 1:500, 1:1 000, 1:2 000,
1:5 000, 1:10 000. Bei den Konzentrationsberechnungen wurden die Wiederfindungsraten der inter-
nen Standards einbezogen. Anhand der molaren Massen der Einzelverbindungen wurden die
Gesamtcarotinoid-Gehalte und Gesamttocopherol-Gehalte ermittelt.
Die photometrische Konzentrationsbestimmung der Carotinoid- und Tocopherol-Stammlösungen
wurde regelmäßig durchgeführt. Die Extinktionsmessung erfolgte in Mikro-Quarzküvetten bei den
entsprechenden Absorptionsmaxima. Mit Hilfe der spezifischen Extinktionskoeffizienten (E1cm1% )
(Tab. C2, C5) wurden die Konzentrationen nach folgender Formel berechnet:
c [g/100 ml] = E
E1cm1% · VF (5)
VF: Verdünnungsfaktor
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der relevanten Carotinoide und Tocopherole wurden
anhand des Basislinienrauschens festgelegt. Die Nachweisgrenze entspricht etwa dem dreifachen
und die Bestimmungsgrenze etwa dem zehnfachen Basislinienrauschen [90] (Tab. C3,C6).
3.5 Bestimmung der antioxidativen Kapazität
3.5.1 Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen
Extrakten
Um die AOC der Tomatensamen bestimmen zu können, war eine vorangehende Aufarbeitung und
Extraktion notwendig (Abb. 8). Durch die unterschiedlichen Extraktionen und eine Hydrolyse konnte
die AOC von freien und gebundenen wasserlöslichen sowie von lipidlöslichen Substanzen analysiert
werden. Zu Beginn wurde eine Extraktion mit 70 %igem Ethanol durchgeführt, wodurch ein hydro-
philer Extrakt entstand, der als Überstand jeweils abgenommen wurde. Dieser wurde mit drei ver-
schiedenen antioxidativen Tests analysiert. Der Rückstand wurde anschließend durch Inkubation mit
Salzsäure- und Natriumhydroxid-Lösung hydrolysiert und wiederum mit 70 %igem Ethanol extrahiert.
Die drei antioxidativen Testmethoden wurden auch mit diesem hydrophilen Extrakt durchgeführt.
Letztlich wurde der verbliebene Rückstand vollständig getrocknet und mit n-Hexan extrahiert, wobei
der abgenommene Überstand diesmal ein lipophiler Extrakt war. Dieser wurde dem entsprechenden
lipophilen αTEAC-Test unterzogen. Die ausführlichen Arbeitsschritte sind im Anhang B.2 zu finden.
Um Messwerte innerhalb der jeweiligen Kalibrierung zu erhalten, wurden für die einzelnen Tests aus
den Extrakten stets noch zwei Verdünnungen hergestellt. Letztendlich wurden die unverdünnte
Probe, eine 1:2-Verdünnung und eine 1:5-Verdünnung gemessen.
MATERIAL UND METHODEN
17
Abb. 8 Übersicht über die Aufarbeitung der Samen und die Extraktionsschritte für die unterschied-lichen Extrakte, die im Anschluss auf deren AOC getestet wurden
3.5.2 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu
Die Vorgehensweise bei der Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes erfolgte nach MÜLLER et al.
(2010), die einige Modifikationen an der Originalmethode von SINGLETON & ROSSI (1965) vornahmen
[91,92]. Der Test beruht auf einer Redoxreaktion der Phenole in alkalischem Milieu mit Phospho-
molybdat und Phosphowolframat zu einem blauen Farbkomplex, dessen Extinktion bei 750 nm
gemessen wird.
Na2WO4/Na2MoO4 → (Phenol-MoW11O40)–4 (6)
Mo(VI) (gelb) + e– → Mo(V) (blau) (7)
Die Durchführung des Tests erfolgte in Makroküvetten. Die Bestimmung der Gesamtphenolgehalte in
den Proben erfolgte mittels einer Gallussäure-Kalibriergeraden [91] und die Ergebnisse wurden als
Gallussäure-Äquivalente (GAE) in mg/100 g Probe angegeben. Alle Arbeitsschritte werden im
Anhang B.2 beschrieben.
3.5.3 H-TEAC-III-Test
Die Durchführung des H-TEAC-III-Tests erfolgte in Anlehnung an die Originalmethode von RE et al.
(1999), die durch MÜLLER et al. (2010) modifiziert und angepasst wurde [69,91]. Die Erzeugung des
stabilen blau-grün gefärbten ABTS-Radikals erfolgte mit einer Kaliumperoxodisulfat-Lösung. Die ent-
haltenen hydrophilen Antioxidantien reduzieren das Radikal und bewirken eine Entfärbung der Reak-
tionslösung (Gl. 9). Der Test wurde in Halbmikroküvetten durchgeführt. Die Abnahme der Absorption
in Gegenwart der Probe bzw. Trolox-Standardlösungen wurde nach 2 min spektralphotometrisch bei
734 nm gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt [63]. Die Angabe der TEAC-Werte der Proben
erfolgt als Trolox-Äquivalente (TE) in µmol/100 g Probe. Die Details zur Methode befinden sich im
Anhang B.2. Ab sofort wird der Test vereinfacht H-TEAC-Test genannt.
Tomatensamen
Extraktion mit 70 %igem Ethanol
Rückstand
Hydrolyse
Extraktion mit 70 %igem Ethanol
trockener Rückstand
Extraktion mit n-Hexan
Überstand = hydrophiler Extrakt
Überstand = hydrophiler Extrakt
Überstand = lipophiler Extrakt
H-TEAC
H-ORACFl
Gesamtphenoltest nach FC
H-TEAC
H-ORACFl
Gesamtphenoltest nach FC
αTEAC
vor
der
Hyd
roly
se
=
frei
e Su
bst
anze
n
nac
h d
er H
ydro
lyse
=
geb
un
den
e Su
bst
anze
n
MATERIAL UND METHODEN
18
(8)
3.5.4 H-ORACFl-Test
Dem angewendeten H-ORACFl-Test liegt die Originalmethode von OU et al. (2001) zugrunde [75].
Auch hier wurden Anpassungen nach MÜLLER et al. (2010) vorgenommen [91]. Der Test wurde auf
einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt und basiert auf einer Fluoreszenzabnahme von Fluores-
zein durch eine Reaktion mit Peroxylradikalen. Diese wurden durch AAPH erzeugt.
(9)
Die Fluoreszenzintensität wurde jede Minute für 4 Stunden bei 37 °C gemessen (Anregung: 490 nm,
Emission: 520 nm). Die Ergebnisse wurden als Trolox-Äquivalente (TE) in mmol/100 g Probe angege-
ben. Die ausführlichen Details zur Methode sind im Anhang B.2 zu finden. Im Folgenden wird dieser
Test vereinfacht nur noch ORAC-Test genannt.
3.5.5 αTEAC-Test
Die Durchführung des lipophilen α-Tocopheroläquivalente-antioxidative Kapazitätstests wurde nach
MÜLLER et al. (2010) vorgenommen [93]. Die Erzeugung des ABTS-Radikals erfolgte entsprechend
MILLER et al. (1996) mittels Mangandioxid [72]. Der αTEAC-Test beruht auf der Reduktion des farbigen
ABTS-Radikal durch lipophile Antioxidantien. Als Kalibriersubstanz diente α-Tocopherol. Die Abnah-
me der Absorption in Gegenwart der Probe bzw. α-Tocopherol-Standardlösungen wurde nach 2 min
spektralphotometrisch bei 734 nm gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt. Die Angabe der
TEAC-Werte der Proben erfolgte als µmol αTE/100 g Probe. Die Details zur Methode befinden sich im
Anhang B.2.
Der Versuch wurde aufgrund nicht zufriedenstellender Ergebnisse zweimal durchgeführt. Die Mess-
reihenfolge von Proben, Blindwert und Standards war wie folgt:
1. Durchgang: Proben → Blindwert + Standards → Proben
2. Durchgang: Blindwert + Standards → Proben → Blindwert + Standard
•+
ABTS (farblos) ABTS•+
(blaugrün)
+ O2 - N2
T > 30 °C
Antioxidantien
Fluoreszenz-
verlust
AAPH
Fluoreszein
Antioxidantien
R1 = COOH, R2 = OCOOH
MATERIAL UND METHODEN
19
Gaschromatographie
3.6 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung
Die Ermittlung des Fettsäuremusters eines Fettes wird heute routinemäßig durch Gaschromato-
graphie der Fettsäuremethylester (FAME) realisiert. Insgesamt waren für diese Analyse drei Arbeits-
schritte notwendig (Abb. 9), die im Folgenden näher erläutert werden.
Abb. 9 Übersicht über die Aufarbeitungsschritte für die Analyse der Fettsäurezusammensetzung
3.6.1 Fettextraktion nach Folch
Zunächst mussten die Lipide aus dem Probenmaterial, den Tomatensamen, isoliert werden. Eine
Fettextraktion aus biologischen Proben sowie Pflanzenmaterialien kann durch unterschiedliche Me-
thoden und unter Verwendung verschiedener lipophiler Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische
erfolgen. Ein klassisches und verlässliches Verfahren ist die Methode nach FOLCH et al. (1957), bei der
Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 (v/v) als Extraktionsmittel dienen [94,95]. Aufgrund der
geringen Probenmenge von nur 300 mg wurde die Methode in einem kleinen Maßstab durchgeführt
und daher als „Mini-Folch-Methode“ bezeichnet. In der Originalmethode wurde ein Teil Probe zu 20
Teilen Extraktionsmittelgemisch verwendet [94]. Wird entsprechend mit 300 mg Probenmaterial
gearbeitet, wird das 20fache Volumen (6 ml) an Extraktionsmittel benötigt. Bei der vorliegenden
Analyse wurden allerdings 9 ml Chloroform/Methanol-Gemisch eingesetzt und es wurde jeweils eine
Dreifachbestimmung für die zwei Samensorten durchgeführt. Die ausführliche Beschreibung der
Vorgehensweise befindet sich im Anhang B.3.
3.6.2 Methylierung
Die erhaltenen Fettextrakte wurden im Anschluss einer Spaltung und Derivatisierung zu den korres-
pondierenden FAME unterzogen. Diese Methylierung ist ein notwendiger Arbeitsschritt, um die Fett-
säuren gaschromatographisch trennen zu können. Die Lipidkomplexe weisen aufgrund ihres hohen
Molekulargewichtes eine geringe Flüchtigkeit auf [96] und können die GC-Säule nicht passieren. Die
daraus gebildeten FAME besitzen einen niedrigeren Siedepunkt, sind weniger polar und ermöglichen
die GC-Analyse [97]. Da sich herausstellte, dass es sich bei den Lipiden in den beiden Samensorten
ausschließlich um Triacylglyceride handelte (siehe 3.5.3), wurde die Natriummethylat-Methode ange-
wendet. Diese gehört zu den basenkatalysierten Methylierungverfahren, die sich für Triglyceride,
aber nicht für freie Fettsäuren eignen [98]. Die FAME wurden letztlich in zwei verschiedenen Gas-
chromatographen analysiert (siehe 3.6.4). Die Vorgehensweise bei der Methylierung ist im An-
hang B.3 beschrieben.
Fettextraktion nach Folch
Methylierung/Umesterung mit Natriummethylat
Dünnschichtchromatographie
Dünnschichtchromatographie
MATERIAL UND METHODEN
20
3.6.3 Dünnschichtchromatographie
Um festzustellen, (1) welche Lipidklassen in den aus den Samen gewonnen Ölen enthalten sind und
(2) ob die anschließende Methylierung erfolgreich war, wurden die entsprechenden Lösungen der
zwei Samensorten zusätzlich dünnschichtchromatographisch getrennt. (1) Zur Ermittlung der in den
Ölen enthaltenen Lipidklassen wurden die aus den Ölextrakten für die Methylierung hergestellten
2 %igen Lösungen mit n-Hexan verwendet. Von diesen Lösungen wurden 15 µl punktuell auf die
Kieselgelplatte aufgetragen. (2) Zur Kontrolle der Methylierung wurden 15 µl der 2 %igen methylier-
ten Lösungen punktuell aufgetragen. Parallel dazu wurden 5 µl eines Mischstandards ebenfalls als
Punkt auf die Platte gebracht. Die Trennung erfolgte innerhalb von 30 min mit einem Laufmittel-
gemisch aus n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v). Die Entwicklung der Banden wurde
durch das Besprühen der Platte mit 2‘,7‘-Dichlorfluoreszein (in Ethanol) visualisiert. Die Auswertung
erfolgte unter UV-Licht durch Vergleich der Banden der Proben mit denen des Mischstandards.
3.6.4 GC-Analytik
Die Analyse der FAME wurde mit zwei verschiedenen Shimadzu-Gaschromatographen (GC3 und
GC4), die mit je einem Flammenionisationsdetektor gekoppelt waren, durchgeführt. Auf der kürzeren
Säule (60 m) mittlerer Polarität (DB 225MS) des GC3 konnten die FAME in etwa 70 Fettsäuren aufge-
trennt werden. An dem GC4 mit einer 200 m langen hochpolaren (CP-select for FAME) Säule konnte
hingegen die Trennung der trans-Isomere realisiert werden. Wichtige Chromatographieparameter
sowie Einstellungen der Messprogramme können dem Anhang A.1 entnommen werden.
Die Chromatogramme wurden mit Hilfe der Software GC Lab Solutions ausgewertet. In Abhängigkeit
von den Wechselwirkungen mit der stationären Phase der Säule und der Siedetemperatur wiesen die
einzelnen FAME unterschiedliche Retentionszeiten auf. Anhand dieser und durch den Vergleich mit
verschiedenen FAME-Referenzstandards konnten die entsprechenden Fettsäuren identifiziert wer-
den. Die Summe der Peakflächen aller vorhandenen Fettsäuren wurde gleich 100 % gesetzt und der
Anteil jeder einzelnen Fettsäure durch Bezug der Einzelpeakflächen zur Gesamtpeakfläche errech-
net. Die als Reste angegebenen Integrale, die nicht als Fettsäuren identifiziert wurden, wurden von
dem Software-Programm herausgerechnet. Die Ergebnisse werden in Prozent der Gesamtfettsäuren
angegeben.
3.7 Statistische Datenauswertung
Alle Analysen wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Berechnung der Mittelwerte (Mw),
Standardabweichungen (Stabw) und Variationskoeffizienten (VK) erfolgte mit Hilfe des Tabellen-
kalkulationsprogramms Excel (Microsoft Office 2007). Der Variationskoeffizient diente zur Beurtei-
lung der Streuung innerhalb einer Dreifachbestimmung. Idealerweise sollte dieser 10 % nicht über-
schreiten. In einigen Fällen, besonders bei sehr kleinen Verdünnungen bei den antioxidativen Tests,
war es trotz Wiederholung der Analyse nicht möglich, unter diese 10 % zu gelangen (siehe
Diskussion). Die Ergebnisse in allen Tabellen sind als Mw ± Stabw angegeben. In den Diagrammen
sind die Mittelwerte mit den entsprechenden Standardabweichungen als Fehlerbalken dargestellt.
Die statistische Datenauswertung wurde mit Hilfe des Programms IBM SPSS Statistics 21 für Windows
(SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Für die Korrelationsrechnung nach PEARSON wurde das Signifi-
kanzniveau (p) mit 0,05 festgelegt. Der paarweise Vergleich von Mittelwerten erfolgte mit dem
verbundenen und unverbundenen t-Test. Hierfür lag das Signifikanzniveau bei 0,05.
ERGEBNISSE
21
4 ERGEBNISSE
Die ausführlichen Analysendaten befinden sich im Anhang C.
4.1 Bestimmung der Trockenmasse
Die Bestimmung des Wassergehaltes der beiden Samensorten Waltinger und Red Currant mittels
Karl-Fischer-Titration ergab Werte zwischen 7 und 8 % (Tab. 3). Damit betrug die Trockenmasse
92-93 %.
Tab. 3 Wassergehalte der zwei Samensorten (in %)
Wassergehalt
Waltinger 7,91 ± 0,33A
Red Currant 7,01 ± 0,44B
Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)
4.2 Quantifizierung der Carotinoide
In beiden Samensorten wurden die Xantophylle (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin gefunden. Die
Gehalte beider Verbindungen lagen allerdings nur im µg-Bereich pro 100 g Samen (Tab. 4).
(all-E)-Zeaxanthin bildete jeweils den größeren Anteil. (all-E)-Lutein konnte in beiden Samensorten
nachgewiesen, in den Red-Currant-Samen aber nicht quantifiziert werden, da die Werte unterhalb
der Bestimmungsgrenze lagen. Die Waltinger-Samen wiesen gegenüber den Red-Currant-Samen
einen etwa viermal höheren Gesamtcarotinoid-Gehalt auf.
Tab. 4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten
Carotinoide (µg/100 g) Gesamtcarotinoide
(all-E)-Lutein (all-E)-Zeaxanthin (µg/100 g) (µmol/100 g)
Waltinger 58,8 ± 3,4 100,1 ± 7,7A 158,9 ± 10,8A 0,28 ± 0,02A
Red Currant n.q. 38,0 ± 4,8B 38,0 ± 4,8B 0,07 ± 0,01B
n.q. nicht quantifizierbar (unterhalb LOQ, siehe Tab. A3) Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)
4.3 Quantifizierung der Vitamin-E-Verbindungen
Durch den Vergleich der HPLC-Chromatogramme mit denen der Standardsubstanzen wurde deutlich,
dass beide Samensorten α- und γ-Tocopherol enthielten. Es konnten keine Tocotrienole nachgewie-
sen werden. Die Quantifizierung der jeweiligen Tocopherole lässt erkennen, dass γ-Tocopherol bei
beiden Samensorten zu 97-98 % des Gesamttocopherol-Gehaltes beitrug (Abb. 10), sodass α-Toco-
pherol nur eine untergeordnete Rolle spielte. Dabei wiesen die Samen der Tomatensorte Waltinger
sowohl höhere α-Tocopherol- als auch γ-Tocopherol-Gehalte im Gegensatz zu den Red-Currant-
Samen auf. Die γ-Tocopherol-Gehalte der Waltinger-Samen waren mit 32,7 mg/100 g etwa doppelt
so hoch wie die der Red-Currant-Samen mit 17,5 mg/100 g.
ERGEBNISSE
22
Tab. 5 Gehalte an Vitamin-E-Verbindungen in den zwei Samensorten
α-Tocopherol
(mg/100 g) γ-Tocopherol (mg/100 g)
∑ Tocopherole (µmol/100 g)
Waltinger 0,68 ± 0,01A 32,7 ± 1,7A 78,5 ± 4,0A
Red Currant 0,56 ± 0,05B 17,5 ± 0,6B 42,5 ± 1,3B
Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)
Abb. 10 Gehalte an α- und γ-Tocopherol in den zwei Samensorten
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für beide Tocopherole (p < 0,05, t-Test)
4.4 Ermittlung der antioxidativen Kapazität
4.4.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität
Der Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu (FC), der H-TEAC-Test sowie der ORAC-Test wurden für
die Samen der zwei Tomatensorten jeweils zweimal angewendet: Zunächst wurden die hydrophilen
Ethanol-Extrakte ohne vorherige Hydrolyse mit den drei Tests auf deren AOC untersucht. Im An-
schluss wurde der entstandene Rückstand hydrolysiert, ebenfalls mit 70 %igem Ethanol extrahiert
und nochmals mit den drei Testmethoden analysiert (siehe Abb. 8). Bei der Anwendung der Tests vor
der Hydrolyse wurden die frei in der Lösung vorliegenden antioxidativen Substanzen erfasst. Die
Hydrolyse führte anschließend zur Freisetzung der glykosidisch gebundenen Verbindungen, sodass
auch diese analysiert werden konnten.
Wie im Abschnitt 3.5.1 beschrieben, wurden stets der unverdünnte Extrakt (VF 1) sowie eine
1:2-Verdünnung (VF 2) und eine 1:5-Verdünnung (VF 5) analysiert. Im Folgenden wird von drei
Verdünnungsstufen gesprochen, auch wenn die Verdünnungsstufe 1 dem unverdünnten Extrakt
entspricht. Aus Tab. 6, die eine Übersicht über die mit den verschiedenen hydrophilen Testmethoden
bestimmten AOC gibt, ist zu entnehmen, dass die Ergebnisse in unterschiedlicher Art und Weise
angegeben wurden. Bei dem Gesamtphenoltest nach FC wurde im Gegensatz zum H-TEAC-Test und
ORAC-Test kein eindeutiger Effekt der Probenkonzentration auf die AOC festgestellt, sodass ein
Mittelwert aus allen drei Verdünnungsstufen gebildet wurde. Bei den anderen beiden Tests zeigte
sich bei allen gemessenen Proben die Tendenz, dass mit sinkender Probenkonzentration (steigender
Verdünnungsstufe) höhere AOC auftraten. Dementsprechend wurden aus den Dreifachbestimmun-
gen jeder Verdünnungsstufe die Mittelwerte gebildet.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Waltinger Red Currant
c [m
g/1
00
g]
γ-Tocopherol
α-Tocopherol
*
ERGEBNISSE
23
0
100
200
300
400
500
600
Waltinger Red Currant
Ges
amtp
hen
ole
[m
g G
AE/
10
0g]
nach Hydrolyse
vor Hydrolyse
Tab. 6 Hydrophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit unterschiedlichen Testmethoden
Gesamtphenole nach FC
(mg GAE/100 g) VF
H-TEAC (mmol TE/100 g)
ORAC
(mmol TE/100 g) W
alti
nge
r
vor Hydrolyse 167,6 ± 1,7 *˚
1 1,17 ± 0,03 *˚ 7,1 ± 0,8
2 1,28 ± 0,05 * 8,7 ± 0,5 *
5 1,43 ± 0,01 * 13,4 ± 0,8 *
nach Hydrolyse
203,2 ± 3,4 *˚
1 1,01 ± 0,00 *˚ -
2 1,25 ± 0,03 * 10,3 ± 0,9 *
5 1,45 ± 0,04 * 13,5 ± 0,7 *
Red
Cu
rran
t
vor Hydrolyse
204,8 ± 4,7 *˚
1 1,50 ± 0,01 *˚ 11,8 ± 2,9
2 1,81 ± 0,02 *˚ 12,6 ± 0,2 *
5 2,04 ± 0,02 *˚ 18,8 ± 0,8 *
nach Hydrolyse
309,4 ± 9,9 *˚
1 1,44 ± 0,01 *˚ -
2 1,84 ± 0,02 *˚ 16,2 ± 1,5 *
5 2,26 ± 0,02 *˚ 18,9 ± 1,0 *
VF: Verdünnungsfaktor * Werte desselben VF unterscheiden sich signifikant innerhalb einer Spalte zwischen den zwei Samensorten (p < 0,05,
t-Test) ˚ Werte desselben VF unterscheiden sich signifikant innerhalb einer Spalte vor und nach der Hydrolyse innerhalb einer
Samensorte (p < 0,05, t-Test)
Die Samen der Sorte Red Currant wiesen in allen drei Testvarianten sowohl vor als auch nach der Hy-
drolyse stets höhere AOC auf als die Waltinger-Samen. Die AOC der Waltinger-Samen betrug im Mit-
tel nur 66-76 % der AOC der Red-Currant-Samen. Die Diagramme, die beide Samensorten gegen-
überstellen, verdeutlichen diese Tatsache (Abb. 11-13). Bei dem ORAC-Test fehlen die Werte beider
Samensorten für den VF 1 nach der Hydrolyse, da diese außerhalb der Kalibrierung lagen und nicht
errechnet werden konnten. Bei den Waltinger-Samen lag der Gesamtphenolgehalt vor der Hydrolyse
bei 167,6 mg GAE/100 g und nach der Hydrolyse bei 203,2 mg GAE/100 g. Für die Red-Currant-Samen
betrugen die Werte 204,8 und 309,4 mg GAE/100 g. Bei den anderen beiden Testverfahren war die
Auswertung durch die Einbeziehung der Verdünnungsstufen komplexer. Zur Vereinfachung dienen
die Diagramme.
*
Abb. 11 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten vor und nach der Hydrolyse
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse (p < 0,05, t-Test)
ERGEBNISSE
24
Abb. 12 Hydrophile AOC bestimmt mit dem H-TEAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensor-ten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen (Darstellung verdeutlicht den Verdünnungseffekt: mit steigender Verdünnungsstufe (VF) stieg die AOC, gilt entsprechend auch für Abb. 13, 14 und 21)
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für alle VF (p < 0,05, t-Test)
Abb. 13 Hydrophile AOC bestimmt mit dem ORAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für VF 2 und VF 5 (p < 0,05, t-Test)
Bei einem Vergleich der Werte vor und nach der Hydrolyse fällt bei dem Gesamtphenoltest und dem
ORAC-Test auf, dass die AOC nach der Hydrolyse stets höher war, auch wenn die Unterschiede
teilweise nur geringfügig waren. Bei dem H-TEAC-Test zeigten sich bei diesem Vergleich in Abhängig-
keit von den Verdünnungsstufen allerdings unterschiedliche Ergebnisse, was in Abb. 12 deutlich wird.
Bei den unverdünnten Lösungen (VF 1) beider Samensorten waren die Werte vor der Hydrolyse
höher, bei Verdünnungsfaktor 5 lagen die Werte für die Red-Currant-Samen nach der Hydrolyse wie-
derum höher. Bei den Waltinger-Samen waren die Gehalte an freien und gebundenen antioxidativ
wirkenden Substanzen bei den Verdünnungsstufen 2 und 5 nahezu identisch. Keine Unterschiede
fanden sich auch bei VF 2 der Red-Currant-Samen.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
vor Hydrolyse nach Hydrolyse vor Hydrolyse nach Hydrolyse
Waltinger Red Currant
hyd
rop
hile
AO
C
[mm
ol T
E/1
00
g]
VF 5VF 2VF 1
0
5
10
15
20
25
vor Hydrolyse nach Hydrolyse vor Hydrolyse nach Hydrolyse
Waltinger Red Currant
hyd
rop
hile
AO
C
[mm
ol T
E/1
00
g]
VF 5
VF 2
VF 1
*
* *
*
ERGEBNISSE
25
4.4.2 Lipophile antioxidative Kapazität
Zu Beginn fällt auf, dass wieder eine Abhängigkeit der AOC von der Probenkonzentration vorlag und
aus diesem Grund die Mittelwerte für jede Verdünnungsstufe angegeben wurden (Tab. 7). Dabei war
die gleiche Tendenz wie bei den hydrophilen Tests zu beobachten: mit zunehmender Verdünnung
stieg die AOC. Bei allen Ergebnissen ließ sich jeweils eine große Streuung um den Mittelwert fest-
stellen (Abb. 14), woraus Variationskoeffizienten deutlich über 10 % resultierten. Trotz einer Wieder-
holung des Tests konnte keine Verbesserung dieser Streuungsparameter erreicht werden. Durch die
hohen Standardabweichungen unterschieden sich die bestimmten AOC nicht zwischen den zwei
Samensorten. Bei der Durchführung wurden einige Schwierigkeiten festgestellt, die auch bei der
Wiederholung nicht behoben werden konnten (siehe 5.3.2).
Tab. 7 Lipophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit dem αTEAC-Test
VF antioxidative Kapazität (µmol αTE/100 g)
Waltinger Red Currant
1 41,3 ± 7,0 * 56,5 ± 7,6
2 64,8 ± 22,2 * 110,0 ± 17,4
5 133,0 ± 60,7 * 256,1 ± 72,0
* Werte unterscheiden sich nicht signifikant (p > 0,05, t-Test)
Abb. 14 Lipophile AOC der beiden Samensorten in Abhängigkeit der Verdünnungsstufen
n. s. = kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Samensorten für alle VF (p > 0,05, t-Test)
4.5 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung
4.5.1 Fettextraktion und Dünnschichtchromatographie
Um die Fettsäurezusammensetzung der zwei Samensorten zu analysieren, wurden zunächst die
Lipide aus den Samen mittels einer Mini-Folch-Methode extrahiert. Die in Tab. 8 aufgeführten Roh-
fettanteile der Samen verdeutlichen, dass die Samen der Sorte Waltinger einen etwas höheren
Fettanteil aufwiesen (25,8 % gegenüber 20,2 %). Allerdings können diese Ergebnisse nur als Nähe-
rungswerte angesehen werden, da keine absolut quantitative Fettgehaltsbestimmung vorgenommen
wurde.
0
50
100
150
200
250
300
350
Waltinger Red Currant
lipo
ph
ile A
OC
[µ
mo
l αTE
/10
0 g
]
VF 5
VF 2
VF 1
n.s.
ERGEBNISSE
Tab. 8 Rohfettanteile der zwei Samensorten
Werte mit verschiedenen Buchstaben
Die dünnschichtchromatographische Auftrennung liefert
Vorgehensweise: Zum einen
beider Samensorten aufgetragen
glichen. Wie erwartet, waren nur flu
Somit bestanden die aus den Samen extrahierten Öle
dieser Erkenntnis konnte die anschließende Methylierungsmethode ausgewählt werden, da sich
nicht jede Methode für jede Fettfraktion eignet.
zur Umwandlung der veresterten Fettsäuren
tographie machte zum anderen
erfolgreich verlief (Abb. 15, rechts).
ständig verschwunden und es erschienen zwei
Abb. 15 DC-Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Methylierung mittels einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Tria5 = FAME, 6 = Cholesterinester)
4.5.2 Fettsäurezusammensetzung
Die Fettsäuren wurden, ausgedrückt als Methylester
samt konnten 29 verschiedene Fettsäuren bestimmt werden.
Anteile aller Fettsäuren, sowie eine Erläuterung der Abkü
C13, C14).
Waltinger Red Currant
Waltinger
5
4
3
2
1
der zwei Samensorten
Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t
Die dünnschichtchromatographische Auftrennung lieferte zwei wichtige Ergebnisse
Zum einen wurden die nach der Mini-Folch-Methode erhaltenen Fett
aufgetragen (Abb. 15, links), aufgetrennt und mit einem Standardgemisch ver
waren nur fluoreszierende Banden auf Höhe der Triacyglyceride sichtbar.
Somit bestanden die aus den Samen extrahierten Öle ausschließlich aus Triacylglyceriden
dieser Erkenntnis konnte die anschließende Methylierungsmethode ausgewählt werden, da sich
ede Methode für jede Fettfraktion eignet. Die angewendete Natriummethylat
veresterten Fettsäuren in die entsprechenden FAME. D
zum anderen deutlich, dass die Umwandlung der Triacylglyceride in die FAME
, rechts). Die Banden auf Höhe der Triacylglyceride waren nahezu voll
ständig verschwunden und es erschienen zwei fluoreszierende Banden bei den F
Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Methylierung mittels n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Tria5 = FAME, 6 = Cholesterinester)
Fettsäurezusammensetzung
ausgedrückt als Methylester, mittels Gaschromatographie analysiert. Insge
samt konnten 29 verschiedene Fettsäuren bestimmt werden. Eine Übersicht über die prozent
Anteile aller Fettsäuren, sowie eine Erläuterung der Abkürzungen befindet sich im Anhang
Fettanteil
25,8 ± 1,9Red Currant 20,2 ± 0,6
Waltinger Red Currant
Waltinger Red Currant
Stan-dard
vor der Methylierung
nach der Methylierung
2
3
6
5
4
1
26
< 0,05, t-Test)
wichtige Ergebnisse für die weitere
erhaltenen Fettextrakte
, aufgetrennt und mit einem Standardgemisch ver-
oreszierende Banden auf Höhe der Triacyglyceride sichtbar.
aus Triacylglyceriden. Mit Hilfe
dieser Erkenntnis konnte die anschließende Methylierungsmethode ausgewählt werden, da sich
Natriummethylat-Methode diente
Die Dünnschichtchroma-
Triacylglyceride in die FAME
auf Höhe der Triacylglyceride waren nahezu voll-
bei den FAME.
Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu
einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Triacylglyceride,
, mittels Gaschromatographie analysiert. Insge-
Eine Übersicht über die prozentualen
rzungen befindet sich im Anhang C (Tab.
Fettanteil (%)
25,8 ± 1,9A
20,2 ± 0,6B
ERGEBNISSE
27
57%20%
13%
5%2%
3%
Red Currant
Größtenteils waren signifikante Unterschiede zwischen beiden Samensorten vorhanden. Die er-
mittelten Werte besaßen nur geringe Standardabweichungen, d. h. die Messungen waren gut repro-
duzierbar. Aufgrund dessen ergaben sich bereits bei nur sehr geringen Abweichungen signifikante
Unterschiede. So waren beide Samensorten trotzdem vergleichbar. Die dominierende Fettsäure in
beiden Samensorten war die Linolsäure mit Anteilen von 57 % bzw. 59 %. Anteilsmäßig folgten für
beide Samensorten Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und α-Linolensäure (Abb. 16). Die mehrfach
ungesättigten Fettsäuren nahmen etwa 60 % der Gesamtfettsäuren ein. Der Gehalt an einfach
ungesättigten und gesättigten Fettsäuren betrug jeweils rund 20 % (Abb. 17). Die dominierende
Fettsäure unter den gesättigten Fettsäuren war die Palmitinsäure, die in beiden Samensorten zu
etwa 13 % vorkam. Daraus resultierte ein P/S-Index von 3. Weiterhin waren sowohl ω6- als auch ω3-
Fettsäuren vorhanden. Zu den ω6-Fettsäuren trug die Linolsäure zum größten Teil bei, Delta-11-
cis,14-cis-Eicosadiensäure und Delta-13-cis,16-cis-Docosadiensäure bildeten den Rest. α-Linolensäure
war die einzige ω3-Fettsäure.
0
10
20
30
40
50
60
70
SFA MUFA PUFA ∑ ω-3 ∑ ω-6
An
teil
[%]
Waltinger
Red Currant
59%18%
13%
4% 3%3%
Waltinger
C18:2 c9,c12
C18:1 c9
C16:0
C18:0
C18:3 c9,c12,c15
andere FA
Abb. 16 Gegenüberstellung der dominierenden Fettsäuren der zwei Samensorten
Abb. 17 Gegenüberstellung einiger relevanter Parameter der Fettverteilung der zwei Samensorten
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten (p < 0,05, t-Test)
* *
* *
*
DISKUSSION
28
5 DISKUSSION
5.1 Carotinoide in Tomatensamen
Während zahlreiche Untersuchungen zu der Carotinoidzusammensetzung ganzer Tomaten existieren,
ist der Kenntnisstand zu diesen Pigmenten in Tomatensamen vergleichsweise gering. Das Haupt-
augenmerk liegt bei Tomaten auf dem Lycopin, das besonders in verarbeiteten Tomatenprodukten
eine quantitativ bedeutende Rolle spielt. Als wichtiges Antioxidans werden ihm präventive Effekte
bei verschiedenen Erkrankungen zugesprochen. Interessant ist, dass die zwei Sorten von Tomaten,
aus denen die Samen stammten, im Jahr 2010 auf ihre Carotinoidgehalte untersucht wurden (Tab. 9).
Hierbei betrugen die Lycopinanteile 85-90 %. Außerdem wurden geringe Mengen an β-Carotin und
Lutein bestimmt.
Tab. 9 Carotinoidgehalt der Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant (in mg/100 g FM) (nicht veröffentlichte Ergebnisse der AG Bioaktive Pflanzenstoffe, 2010)
(all-E)- Lutein
(all-E)-Zeaxanthin
(all-E)- β-Carotin
(Z)-Lycopin
(all-E)-Lycopin
Gesamt-Lycopin
Gesamt-carotinoide
Waltinger 0,27 n.n. 1,59 0,69 10,12 10,82 12,67
Red Currant 0,20 n.n. 1,43 0,77 12,82 13,59 15,23
n.n. nicht nachweisbar
Nun stellte sich die Frage, ob einige dieser Carotinoide auch in den Samen dieser Tomatensorten vor-
kommen. Die Farbe der Samen ließ bereits vermuten, dass keine hohen Gehalte zu erwarten waren.
Trotz des hohen Lycopinanteils in den Tomaten wurde dieses Carotin in den Samen mittels HPLC
nicht nachgewiesen. So wurden lediglich sehr geringe Gehalte an (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin
detektiert. In der Literatur existieren nicht viele Daten über die Carotinoidzusammensetzung von
Tomatensamen. Drei Arbeiten stammen aus den 1970er und 1980er Jahren, eine ist aktueller aus
dem Jahr 2005. Ein Vergleich der eigenen Daten mit den publizierten Carotinoidgehalten, sowie ein
Vergleich der publizierten Werte untereinander zeigen fast keinerlei Übereinstimmungen (Tab. 10).
Tab. 10 Publizierte Carotinoidgehalte von Tomatensamen im Vergleich zu den eigenen Daten (in µg/100 g)
RYMAL & NAKAYAMA 1974
[46]A
RODRIGUEZ et al. 1975
[99]
AL-WANDAWI
et al. 1985 [100]
KNOBLICH et al. 2005
[101]
eigene Daten
W RC
Lutein 59,7-90,2 %
650 58,8 n.q.
Zeaxanthin
100 100,1 38,0
α-Carotin
60 40
β-Carotin 5,3-22,2 % 1 290 0 1 440
γ-Carotin
80
Lycopin 4,5-14,1 % 820 0 13 000
A Samen drei verschiedener Tomatensorten, Angabe als % der Gesamtcarotinoide
n.q. nicht quantifizierbar
RYMAL & NAKAYAMA (1974) untersuchten drei verschiedene Samensorten [46]. Sie beschrieben, dass
die Xantophylle bei allen Sorten gegenüber den Carotinen überwogen. Diese Tatsache stimmt mit
DISKUSSION
29
den eigenen Werten überein, allerdings dominierte in der Literatur Lutein, bei den eigenen Analysen
Zeaxanthin. Demgegenüber wurden von RODRIGUEZ et al. (1975) überhaupt keine Xantophylle nachge-
wiesen [99]. Hier zeigte β-Carotin die höchsten Gehalte, gefolgt von Lycopin. Qualitativ gesehen,
enthielten die Samen dieselben Carotinoide wie die Tomatenfrucht, allerdings in wesentlich geringe-
ren Konzentrationen. Dieser Aussage kann nicht zugestimmt werden. Unverhältnismäßig hohe
Lycopingehalte wurden von KNOBLICH et al. (2005) nachgewiesen [101]. Die aufgeführten 13 mg/100 g
entsprechen den Gehalten, die in ganzen Tomaten bestimmt wurden (Tab. 9). Auch wenn die Samen
Reststoffprodukte aus der Tomatenindustrie waren und dadurch noch Tomatenreste daran haften
konnten, muss hier dennoch ein Irrtum vorliegen. In einem Textabschnitt dieser Arbeit wurden
zudem 130 µg Lycopin/kg angegeben, was eher der Realität entspricht, sodass es sich um einen
Fehler bei den angegebenen Einheiten handeln könnte.
Generell ist über die Bedeutung der Carotinoide in Samen im Gegensatz zu anderen Pflanzen-
geweben nicht viel bekannt. Carotinoide in Samen sind u. a. für die Bildung von einem Phytohormon,
der Abscisinsäure, notwendig, die die Samenruhe reguliert. Außerdem tragen sie zu dem anti-
oxidativen System in den Samen bei, welches radikal-induzierten Membranschädigungen sowie der
Saatalterung entgegenwirkt [102].
Als Stoffgruppe sind Carotinoide sehr empfindlich gegenüber Licht, Wärme und Sauerstoff, was im
Hinblick auf die Ölgewinnung und Verarbeitung der Samen eine bedeutende Rolle spielt. In raffinier-
ten Ölen sind nahezu keine Carotinoide vorhanden, da sie durch die verschiedenen Aufarbeitungs-
schritte, wie Bleichen und Dämpfen, zerstört werden [103,104]. Dabei sind die Xanthophylle Lutein
und Zeaxanthin anfälliger als die unpolaren Carotine [84]. In Tomatensaatöl wurde Lycopin mit etwa
9,6 mg/100 g als Hauptcarotinoid beschrieben [6]. Damit trug es 82 % zu den Gesamtcarotinoiden
bei. Außerdem enthielt es beachtliche Mengen an β-Carotin und Lutein mit Anteilen von 14 % und
4 %. Damit muss es sich bei dem untersuchten Öl noch weitgehend um das Rohöl gehandelt haben.
Die hohen Carotinoid- und speziell Lycopinanteile des Öles weisen darauf hin, dass bei der Herstel-
lung möglicherweise auch die Schalen extrahiert wurden. In verschiedenen anderen kaltgepressten
Ölen, Saaten und Presskuchen wurden dagegen nur Lutein und Zeaxanthin nachgewiesen [84].
Die Aussagen zu den in Tomatensamen enthaltenen Carotinoiden unterscheiden sich teilweise er-
heblich, was eine abschließende Bewertung erschwert. Unumstritten ist allerdings, dass sie nur einen
geringen Teil zu den Carotinoiden in Tomaten beitragen. Im Hinblick auf die Reststoffverwertung
leisten sie einen Beitrag zu den Inhaltsstoffen in Tomatensaatöl, solange auch die Schalen verwendet
werden und das Öl in unraffinierter Form vorliegt. Letztlich nehmen die Tomatenschalen eine
wesentlich bedeutendere Rolle bei der Verwertung von Tomatentrester ein, da sie das wertvolle
Lycopin in großen Mengen enthalten. Dieses wird bspw. als Farbstoff für fettreiche Produkte
verwendet oder auch als Krebsmedikament eingesetzt [32].
5.2 Vitamin-E-Verbindungen in Tomatensamen
Das lipidlösliche Vitamin E kommt hauptsächlich in Pflanzensamen vor. Aus diesem Grund haben
Tomatensamen einen großen Anteil an dem Vitamin-E-Gehalt von Tomaten. Die ganzen Tomaten der
beiden Sorten Waltinger und Red Currant hatten einen Vitamin-E-Gehalt von ca. 3,5 mg/100 g. Den
dominierenden Anteil nahm α-Tocopherol ein (Abb. 18), was charakteristisch für Tomaten und
Tomatenprodukte ist [105]. Die Samen enthielten dagegen eine fünf- bis zehnfach höhere
Tocopherol-Konzentration und vorrangig γ-Tocopherol. Dabei war der γ-Tocopherol-Gehalt der
Waltinger-Samen fast doppelt so hoch wie der der Red-Currant-Samen und damit signifikant
DISKUSSION
30
verschieden. α-Tocopherol machte nur 2-3 % des gesamten Vitamin-E-Gehaltes der Samen aus.
SEYBOLD et al. (2004) beschrieben, dass der α-Tocopherol-Gehalt der Samen nur 2 % des gesamten
α-Tocopherol-Gehaltes der Tomaten ausmachte, da sich dieses hauptsächlich in den Randschichten
der Tomate befindet [105]. Die Samen trugen immerhin zu 65 % des γ-Tocopherol-Gehaltes bei.
Diese Verteilung der Tocopherole wurde auch bei Paprika festgestellt, die ebenfalls zur Familie der
Nachtschattengewächse gehört [106].
Abb. 18 Prozentuale Anteile der Vitamin-E-Verbindungen (bezogen auf Gesamt-Vitamin-E) in
Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant (nicht veröffentlichte Ergebnisse der AG Bioaktive Pflanzenstoffe, 2010)
Untersuchungen von Tomatensaatöl auf dessen Vitamin-E-Gehalte ergaben höhere Konzentrationen
als die, die bei den Samen ermittelt wurden. Während der Vitamin-E-Gehalt der Waltinger-Samen
334 mg/kg und der Red-Currant-Samen 180 mg/kg betrug, wurden für die Öle zwischen 1 261 und
1 452 mg/kg Öl angegeben [6,33]. In Abhängigkeit von der Extraktionsmethode bestimmten ELLER
et al. (2010) zwischen 940 mg/kg (beschleunigte Lösungsmittelextraktion mit Ethanol) und
1 110 mg/kg (Extraktion mit überkritischem CO2) [107]. Bei GOFFMANN & MÖLLERS (2000) war der
Gesamttocopherol-Gehalt von Rapssamen etwa 15 % niedriger als der von den daraus extrahierten
Ölen [108]. Dafür war die Tatsache verantwortlich, dass die für die Ölgewinnung angewandte
Soxhlet-Extraktion effizienter war, um die Tocopherole zu extrahieren, als die „Batch-Extraktions-
methode“, nach der die Samen behandelt wurden. Da die ermittelten Vitamin-E-Konzentrationen der
eigenen Samen aber sogar 72-85 % niedriger waren als die der oben genannten Tomatensaatöle,
könnte zusätzlich die zweijährige Lagerdauer einen Einfluss gehabt haben. GOFFMANN & MÖLLERS
(2000) stellten bei Rapssamen keine signifikanten Änderungen des Tocopherol-Gehaltes über 24 Wo-
chen bei Raumtemperatur fest [108]. GOPALAKRISHNAN et al. (1996) beschrieben dagegen eine 50 %ige
Reduzierung des Tocopherol-Gehaltes in Flax- und Rapssamen nach 30-tägiger Lagerung [109].
In der Literatur ergaben sich große Unterschiede bei den dominierenden Tocopherolen von Toma-
tensaatöl. LAZOS et al. (1998) bestimmten δ-Tocopherol als Hauptkomponente [33]. Bei MÜLLER et al.
(2013) und ELLER et al. (2010), die kein oder nur sehr wenig δ-Tocopherol nachwiesen, dominierte
γ-Tocopherol [6,107]. Die α-Tocopherol-Gehalte waren bis auf geringere Werte von ELLER et al. (2010)
(30-50 mg/kg) vergleichbar (202 bzw. 246 mg/kg) [107]. Aufgrund der Tatsache, dass in den
Tomatensamen hauptsächlich γ-Tocopherol vorkam und dass hohe γ-Tocopherol-Gehalte typisch für
Saatöle sind, erscheinen die Literaturdaten von MÜLLER et al. (2013) korrekter [6]. Im Vergleich mit
anderen kommerziellen Pflanzenölen ist der Vitamin-E-Gehalt des Tomatensaatöls fünfmal höher als
der Vitamin-E-Gehalt von Olivenöl (260 mg/kg) und doppelt so hoch wie der von kaltgepresstem
Sonnenblumenöl (639 mg/kg) [84,110]. Vergleichbare Konzentrationen wies bspw. Öl aus Hage-
buttensamen oder Apfelkernen auf [111].
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Waltinger
Red Currant
Anteil
α-Tocopherol
β-Tocopherol
γ-Tocopherol
β-Tocotrienol
DISKUSSION
31
FRANKE et al. (2010) analysierten außerdem die Tocopherol-Gehalte einzelner Saaten [84]. Demnach
wiesen Leinsamen ähnliche Tocopherol-Gehalte und Verteilungen auf wie die Red-Currant-Samen
(19,3 mg/100 g gegenüber 18,0 mg/100 g). Die Waltinger-Samen waren mit Rapssamen vergleichbar
(33,4 mg/100 g gegenüber 33,7 mg/100 g), allerdings wiesen letztere etwa gleich hohe Konzentra-
tionen an α- und γ-Tocopherol auf, während bei den Tomatensamen deutlich das γ-Tocopherol
dominierte.
Als wichtiges fettlösliches Vitamin beeinflusst Vitamin E maßgeblich die lipophile AOC von Pflanzen-
ölen [112]. Die verschiedenen Tocochromanole besitzen die Fähigkeit, Doppelbindungen ungesättig-
ter Fettsäuren in Ölen vor oxidativen Schäden zu schützen. Die untersuchten Tomatensamen
erwiesen sich als gute Quelle für Tocopherole und eignen sich besonders für die Herstellung von Öl.
Dabei unterschieden sich die Vitamin-E-Gehalte der Waltinger-Samen mit einer fast doppelt so
hohen Konzentration signifikant von den Red-Currant-Samen. Sowohl der Genotyp als auch klimati-
sche Bedingungen während des Wachstums und der Reifung, Lagerbedingungen und -dauer, die
Versorgung der Tomatenpflanzen mit Kalium oder der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren
können einen Einfluss auf den Vitamin-E-Gehalt haben [84,113,114]. Verschiedene Raffinations-
schritte würden auch hier eine Reduktion der Tocopherole bewirken. Im Gegensatz zu den Caro-
tinoiden waren die Verluste allerdings nicht so erheblich [33], sodass das Tomatensaatöl dennoch als
ausgezeichnete Vitamin-E-Quelle gilt. Die Vitamin-E-Aktivität des von MÜLLER et al. (2013) unter-
suchten Tomatensaatöls entspricht etwa 37 mg αTE/100 g (Umrechnungstabelle siehe Anhang
Tab. A8) [6]. Nach den DACH-Referenzwerten sollte eine Erwachsener 12-14 mg αTE/100 g pro Tag zu
sich nehmen [53]. Mit 18 g Tomatensaatöl (etwa 4-5 Teelöffeln) kann bereits die Hälfte dieser Nähr-
wertempfehlung gedeckt werden.
5.3 Antioxidative Kapazität von Tomatensamen
Die positiven Effekte von vielen Nahrungsmitteln und Getränken für die menschliche Gesundheit
werden auf deren antioxidative Aktivität zurückgeführt [64]. Aufgrund dieser Tatsache wächst das
Interesse der Gesellschaft und Wissenschaft an der Bestimmung dieses Parameters. Trotz zahlreicher
Methoden, die zur Bestimmung der AOC entwickelt wurden, existiert bis heute kein universell an-
wendbares Verfahren [61,63]. Die Problematik besteht darin, dass die verschiedenen Testmethoden
untereinander nicht vergleichbar sind. Jede Methode lässt nur eine Aussage in Bezug auf die verwen-
deten Reaktionen und Bedingungen zu [61,115]. Auch wenn die Interpretation und Auswertung der
Ergebnisse dadurch erschwert wird, vermitteln die erzielten Werte eine Vorstellung von der
schützenden Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen und pflanzlichen Nahrungsmitteln [64]. In Ab-
hängigkeit von den Reaktionsmechanismen, die den einzelnen Tests zugrundeliegen, und den ver-
wendeten Radikale bzw. Oxidantien reagieren die antioxidativen Substanzen auf unterschiedlichste
Art und Weise. Aus diesem Grund rieten SCHLESIER et al. (2002) mindestens zwei Tests mit unter-
schiedlichen Reaktionsmechanismen zu verwenden [116]. Problematisch ist außerdem die Wahl des
Kalibrierstandards. NENADIS et al. (2007) bezeichneten dies als einen „Critical control point“ bei der
Bewertung der AOC [117]. Aufgrund dessen sollten sich auch die Kalibrierstandards in den verwen-
deten Tests unterscheiden.
Diese Anforderungen wurden bei der Bestimmung der AOC der Samen berücksichtigt. Sie wurden mit
Hilfe drei verschiedener hydrophiler und einem lipophilen antioxidativen Test auf deren Fähigkeit
untersucht, Substrate vor oxidativem Angriff zu schützen [65]. Dabei kamen ebenfalls verschiedene
Standardsubstanzen zum Einsatz. Bei den drei hydrophilen Tests wurde zum einen Gallussäure
DISKUSSION
32
(Gesamtphenoltest nach FC) verwendet, zum anderen Trolox (H-TEAC, ORAC). α-Tocopherol diente
zur Kalibrierung bei dem lipophilen αTEAC-Test. Die Grundprinzipien der Testmethoden beruhen zum
einen auf der Reduktionskapazität (SET-Mechanismus) oder auf der radikalfangenden Aktivität (HAT-
Mechanismus) der Antioxidantien. Um konzentrationsabhängige Effekte feststellen und diskutieren
zu können, wurden außerdem jeweils drei Probenkonzentrationen hergestellt und gemessen [118].
Vor der eigentlichen Messung der AOC waren einige Schritte zur Probenvorbereitung notwendig, die
die Endergebnisse enorm beeinflussen können. Dazu zählten u. a. die stufenweisen Extraktions-
schritte, die Hydrolyse, das vollständige Trocknen oder auch die Herstellung der Verdünnungen.
Zunächst spielt die Extraktion eine bedeutende Rolle, um eine möglichst hohe Ausbeute an antioxi-
dativen Substanzen zu erreichen. Die Bestimmung von hydrophilen und lipophilen Antioxidantien in
demselben Medium erwies sich als untauglich. WU et al. (2004) betonten, dass die hydrophile und
lipophile AOC separat bestimmt und anschließend beide Werte verrechnet werden sollten [119].
Damit wird verhindert, dass bestimmte lipophile Komponenten mit den Hydrophilen extrahiert
werden. Eine weitere mögliche Fehlerquelle können chemische Veränderungen sein, die sich wäh-
rend der Extraktion vollziehen. Möglich wären eine Oxidation oder eine thermische Schädigung der
Phenole [60].
5.3.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität
Zur Bestimmung der hydrophilen AOC der Tomatensamen wurden der Gesamtphenoltest nach Folin-
Ciocalteu, der H-TEAC-Test und der ORAC-Test angewandt. Die Samen wurden mit 70 %igem Ethanol
extrahiert, der Rückstand anschließend einer Hydrolyse unterzogen und mit dem gleichen Lösungs-
mittel nochmals extrahiert. Damit wurden die frei vorliegenden und schließlich auch die gebundenen
antioxidativen Verbindungen erfasst.
Der Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu liefert nicht nur Aussagen zu dem Gesamtphenolgehalt,
sondern dient auch zur Bestimmung der reduzierenden AOC. Auf diesem Gebiet erfreut sich diese
Methode allgemeiner Beliebtheit, da sie als einfach und präzise gilt [61,63]. Bereits bei den Vor-
versuchen bewährte sich diese Einschätzung. Im Vergleich zu den anderen beiden hydrophilen Tests
stellte sich der Gesamtphenoltest als die zuverlässigste und robusteste Methode heraus. Darüber
hinaus wurden bei der Auswertung der Ergebnisse keine konzentrationsabhängigen Effekte fest-
gestellt, sodass ein Mittelwert aus allen drei Verdünnungsstufen gebildet werden konnte. In dem
H-TEAC-Test und ORAC-Test zeigten die unterschiedlichen Probenkonzentrationen dagegen einen
eindeutigen Einfluss. Mit abnehmender Konzentration der Probenlösung stieg die AOC deutlich an.
Dieses Phänomen des sogenannten Verdünnungseffektes wurde von HENGST et al. (2009) genauer
untersucht [118]. Dafür wurden bestimmte Reinsubstanzen und Nahrungsmittelextrakte mit sieben
gängigen antioxidativen Testmethoden, darunter der Gesamtphenoltest, H-TEAC III und ORAC,
untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die in den verschiedenen Tests verwendeten Proben-
konzentrationen einen signifikanten Einfluss auf die AOC hatten (Tab. 11).
Die grundlegenden Ursachen für diesen Verdünnungseffekt sind allerdings bislang unbekannt. Durch
die Existenz zahlreicher unbekannter Faktoren, die einen Einfluss auf die verschiedenen Mess-
methoden nehmen, war es bislang unmöglich, eine eindeutige Erklärung zu finden. Darüber hinaus
variierten die Ergebnisse innerhalb der Studie von HENGST et al. (2009) und so wurden ebenfalls
einige Abweichungen gegenüber anderen Publikationen festgestellt [118]. Dabei erfolgte eine
kritische Betrachtung der Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen anderer Laboratorien. Die Angabe
von Literaturwerten kann bspw. als Mittelwert verschiedener Konzentrationen erfolgen oder aber
DISKUSSION
33
auch als Mittelwert von wiederholten Messungen gleicher Konzentration. Aus diesem Grund wurde
von HENGST et al. (2009) empfohlen, mindestens drei Probenkonzentrationen zu messen und sich
dieser Tatsachen bewusst zu sein, um Analysenwerte richtig zu bewerten [118].
Tab. 11 Einfluss einer steigenden Probenkonzentration von Reinsubstanzen, Nahrungsmitteextrakten und den selbst untersuchten Tomatensamenextrakten auf die AOC (gemessen mit verschie-denen Testmethoden) und den Gesamtphenolgehalt (nach HENGST et al. 2009 [118])
Gesamtphenoltest H-TEAC III ORAC
Ascorbinsäure ↑* ↔ ↑ Gallussäure cal ↓ ↕ Harnsäure ↔ ↓ ↕ Erdbeernektar ↓* ↓ ↓*
Weißer Tee ↓ ↓* ↓ Tomatenextrakt ↕ ↓* ↑
Tomatensamenextrakte (Waltinger und Red Currant)
↕ ↓ ↓
↔ konstant, ↑ Zunahme, ↓ Abnahme, ↕ fluktuierend, cal Kalibrierstandard, * geringfügige Zunahme/Abnahme (Variations-koeffizient innerhalb der gesamten Probenkonzentrationen war unter 10 %)
Bei Betrachtung der ermittelten Tendenzen für die Tomatensamenextrakte zeigten sich im Vergleich
mit den Ergebnissen von HENGST et al. (2009) teilweise Übereinstimmungen, teilweise Abweichungen
[118]. Bei dem Gesamtphenoltest wurden, außer bei dem weißen Tee, ebenso wie bei den Tomaten-
samen keine bedeutenden konzentrationsabhängigen Effekte beschrieben. Vereinbar sind auch die
Tendenzen bei dem H-TEAC-III-Test. Bei fast allen Substanzen (außer der Ascorbinsäure) und auch bei
den eigenen untersuchten Samenextrakten nahm die AOC mit steigender Probenkonzentration ab.
Inhomogene Trends zeigten sich dagegen bei dem ORAC-Test. Die bei den Samenextrakten beobach-
tete Abnahme der AOC mit zunehmender Probenkonzentration wurde nur bei dem Tomatenextrakt
beschrieben. Bei dem weißen Tee wurde bspw. eine gänzlich entgegengesetzte Tendenz festgestellt.
Auffällig beim Vergleich der Ergebnisse aller drei Testmethoden war, dass die Red-Currant-Samen
gegenüber den Waltinger-Samen stets eine höhere AOC aufwiesen. Der Gehalt an antioxidativen
Substanzen in ganzen Tomaten hängt von vielen Faktoren ab, die selbstverständlich auch einen Ein-
fluss auf die enthaltenen Samen haben. Dazu zählen Sorte, genetische Faktoren, Umweltfaktoren
(Temperatur, Licht, Wasser, Nährstoffversorgung), verwendete Agrartechniken (Einsatz von Pflanzen-
wachstumsgeneratoren, Erntezeitpunkt) und Lagerungsbedingungen nach der Ernte [120]. Die
Literatur konzentriert sich bezüglich der Effekte von Umweltfaktoren auf die Antioxidantien Lycopin,
Ascorbinsäure und andere phenolische Substanzen in Tomaten. In den Samen waren keine nennens-
werten Mengen an Lycopin enthalten (siehe 5.1), sodass dieses Carotinoid nicht bedeutend zur AOC
beiträgt. TOOR et al. (2005), die die antioxidative Aktivität in verschiedenen Tomatenfraktionen von
drei unterschiedlichen Tomatensorten untersuchten, fanden heraus, dass der mittlere Ascorbin-
säuregehalt in den Schalen signifikant höher war als in den Samen und im Fruchtfleisch [121]. Zusätz-
lich wurden auf Basis des tatsächlichen Gewichtsanteils der einzelnen Fraktionen in Tomaten die
Anteile berechnet, mit der Samen, Schalen und Fruchtfleisch an den Antioxidantien und der AOC
beteiligt waren. So wurde deutlich, dass die Samen 23 % zur AOC und 28 % zu den Gesamtphenolen
von Tomaten beitrugen (Abb. 19). TOOR et al. (2005) bestimmten diese zwei Parameter sowohl in den
hydrophilen als auch in den lipophilen Extrakten [121]. Dabei wurde deutlich, dass die hydrophilen
Extrakte der drei Fraktionen den größten Anteil (91-93 %) der AOC ausmachten.
DISKUSSION
34
Abb. 19 Prozentuale Anteile der Schalen, des Fruchtfleisches und der Samen an den Antioxidantien
und der AOC von ganzen Tomaten (nach TOOR et al. 2005 [121])
Diese Gesamtphenolgehalte und die TEAC-Werte von TOOR et al. (2005) betragen im Vergleich mit
denen der Waltinger- und Red-Currant-Samen nur etwa ein Zehntel (Tab. 12) [121]. Eine mögliche
Ursache für diese Abweichungen könnte die bestimmte Trockenmasse sein. Die Waltinger- und Red-
Currant-Samen hatten einen Trockenmasseanteil zwischen 92 und 93 %. Ein überraschend geringer
Trockenmasseanteil von im Mittel 6 % wurde von TOOR et al. (2005) bestimmt [121]. Diese erheb-
lichen Unterschiede können entweder nur durch eine irrtümliche Verwechslung von Trockenmasse
und Wassergehalt zustande gekommen sein oder es haftete noch so viel Fruchtfleisch an den Samen,
dass der Wassergehalt der Samenfraktion enorm in die Höhe getrieben wurde. Dies würde auch die
niedrigen antioxidativen Werte erklären. Das wässrige Fruchtfleisch besitzt geringere AOC und würde
die Werte für die Samenfraktion verringern. Außerdem wurden zur Bestimmung der Gesamtphenole
nach FC und bei dem TEAC-Test andere Vorgehensweisen genutzt, so wurde nicht der TEAC III,
sondern der TEAC II verwendet.
Tab. 12 Publizierte hydrophile AOC von Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen untersuchten Samen
Gesamtphenole
nach FC (mg GAE/100 g)
H-TEAC (mmol TE/100 g)
ORAC
(mmol TE/100 g)
vor Hydrolyse
nach Hydrolyse
vor Hydrolyse
nach Hydrolyse
vor Hydrolyse
nach Hydrolyse
Waltinger 167,6 203,2 1,2-1,4A 1,0-1,4A 8,7-13,4B 10,3-13,5B
Red Currant 204,8 309,4 1,5-2,0A 1,4-2,3A 12,6-18,8B 16,2-18,9B
TOOR et al. 2005 [121] 22,0 0,114
GAHLER et al. 2003 [122]
31,0 91,9C
A Angabe der Werte von drei Verdünnungsstufen (1:1, 1:2, 1:5) B Angabe der Werte von nur zwei Verdünnungsstufen (1:2, 1:5) C Wert beinhaltet freie und gebundene antioxidative Substanzen
Die Tatsache, dass Samen oder Kerne im Vergleich zu den Schalen den höchsten Beitrag zur antioxi-
dativen Aktivität leisten, wurde bspw. bei Trester aus roten Weintrauben beobachtet [123]. Grund
waren die hohen Proanthocyanidingehalte. Auch GAHLER et al. (2003) stellten überraschend fest, dass
0 20 40 60 80 100
Gesamtphenole
Flavonoide
Lycopin
Ascorbinsäure
antioxidative Kapazität
Anteil in %
Schale
Fruchtfleisch
Samen
DISKUSSION
35
der Gesamtphenolgehalt in den Samen der untersuchten Tomaten mit 31,0 mg GAE/100 g im Ver-
gleich zum inneren Fruchtfleisch und den äußeren Schichten (Perikarp und Schale) am höchsten war
[122]. In der Regel sind allerdings die äußeren Randschichten von Früchten und Gemüse reicher an
Phenolen [122]. Im Vergleich mit den eigenen Werten war der Gehalt wiederum sehr gering (Tab.
12). Weiterhin wurde beschrieben, dass eine Hydrolyse zu höheren Gesamtphenolgehalten in allen
Fraktionen führte. Dies wurde bei den eigenen untersuchten Samen ebenfalls festgestellt. Hierbei
muss beachtet werden, dass GAHLER et al. (2003) die Hydrolyse nicht mit dem Rückstand einer ersten
Extraktion (für die freien Substanzen) durchführten, sondern vom Ausgangsmaterial ausgingen [122].
Somit wurde die Summe aus freien und gebundenen Substanzen angegeben. Für die eigenen Samen
wurden diese beiden Werte separat angegeben. Bei den Gesamtphenolen war bei beiden Samen-
sorten Waltinger und Red Currant der Anteil an gebundenen Substanzen deutlich höher als der Anteil
an freien Substanzen. In dem H-TEAC-Test und ORAC-Test waren die Unterschiede weniger deutlich.
Aufgrund des Verdünnungseffektes konnte hier keine eindeutige Aussage getroffen werden.
Beim Vergleich des TEAC- und ORAC-Tests, die dieselbe Referenzsubstanz Trolox nutzen, fällt auf,
dass letzterer höhere AOC ergab. Dieser Unterschied wird dadurch veranlasst, dass beide Testmetho-
den auf verschiedenen Reaktionsmechanismen beruhen. So werden verschiedene Radikalquellen,
Substrate, Reaktionsbedingungen und Quantifizierungsmethoden verwendet. TABART et al. (2009)
bestimmten die AOC verschiedener phenolischer Verbindungen mittels unterschiedlicher Test-
methoden [124]. Nahezu alle mit dem ORAC getesteten phenolischen Verbindungen zeigten eine
höhere AOC, als wenn diese mit dem TEAC gemessen wurden. So zeigten bspw. Kämpferol-3-O-
Glykosid, Hesperidin und Naringenin eine sehr niedrige bis gar keine AOC im TEAC-Test. Im ORAC-
Test erwiesen sie sich als starke Antioxidantien.
Ein Aspekt, der eine besondere Rolle zu spielen scheint, ist die Messdauer der zwei Tests. Im TEAC-
Test erfolgte die Extinktionsmessung 2 min nachdem die ABTS•+-Lösung mit der Probe vermischt
wurde, eine sogenannte Endpunkt-Messung. Im ORAC-Test wird der Reaktionsverlauf bis zum Abfall
der Fluoreszenzkurve auf Null gemessen, d. h. bis alle Antioxidantien mit den Radikalen reagiert
haben. Im TEAC-Test kommt es durch die kurze Messzeit oft zu einer Unterschätzung der AOC. Pro-
blematisch sind langsame Reaktionen, die eine lange Zeit zum Erreichen des Endpunktes benötigen.
SAMANIEGO S´ANCHEZ et al. (2007) bestimmten die AOC von nativem Olivenöl mittels TEAC-Test und
verlängerten die Reaktionszeit sogar bis auf 30 min [125]. PRIOR et al. (2005) behaupteten, dass
Testmethoden, die das AUC-Verfahren nutzen, zu exakteren Ergebnissen führen als Tests, deren
Messung zu einem festgelegten Zeitpunkt erfolgt [63]. Gerade auch bei Lebensmittelproben, die oft
aus vielen verschiedenen Stoffen zusammengesetzt sind und die eine komplexe Reaktionskinetik
vorzeigen, eignet sich der ORAC-Test besser als der TEAC-Test. VAN DEN BERG et al. (1999)
schlussfolgerten, dass die quantitative Beurteilung der AOC mit dem TEAC-Test sehr mühsam oder
sogar unmöglich ist [126]. Die Methode kann aber durchaus herangezogen werden, um zumindest
eine Einstufung der Antioxidantien zu erhalten.
Bei einem Vergleich des Gesamtphenolgehaltes und der AOC wurde eine geringe bis mittlere
Korrelation festgestellt (Gesamtphenole-TEAC: r = 0,58, Gesamtphenole-ORAC: r = 0,68). Literatur-
daten sind in dieser Hinsicht sehr gegensätzlich. Von verschiedenen Autoren wurde eine starke
Korrelation zwischen dem Gesamtphenoltest und dem TEAC-Test beschrieben, mit der Begründung,
dass beiden ähnliche Reaktionsmechanismen zugrundeliegen [61,127]. Ebenso wurden von ANDRE et
al. (2007) eine gute Korrelation zwischen den Gesamtphenolen und dem ORAC gefunden [128]. Bei
TABART et al. (2009) und KÄHKÖNEN et al. (1999) zeigten sich allerdings keine signifikanten
Korrelationen zwischen Gesamtphenolgehalt und AOC bei den untersuchten Standardsubstanzen
DISKUSSION
36
bzw. Pflanzenextrakten [124,129]. Eine mögliche Ursache könnte sein, dass der Gesamtphenoltest
nach FC nicht spezifisch für Phenole ist, da auch andere Substanzen durch das Folin-Ciocalteu-
Reagenz oxidiert werden können. Dazu zählen möglicherweise Zucker oder Proteine [130]. Eine hohe
signifikante Korrelation konnte dagegen bei der AOC gemessen mit dem TEAC-Test und ORAC-Test
festgestellt werden (r = 0,92). SILVA et al. (2007) beschrieben hingegen nur eine mäßige Korrelation
zwischen diesen beiden Testmethoden, da der ORAC-Test im Gegensatz zum TEAC-Test wesentlich
mehr antioxidative Substanzen erfasst [127]. Außerdem misst der TEAC die reduzierende Aktivität
von Antioxidantien in Bezug auf das ABTS-Radikal, während der ORAC die Fähigkeit von Antioxi-
dantien bestimmt, radikalische Kettenreaktionen abzubrechen.
Die Übertragbarkeit der mit den Testmethoden bestimmten AOC auf tatsächliche Lebensmittel bleibt
allerdings fraglich. In einer heterogenen Lebensmittelmatrix laufen wesentlich mehr Wechselwirkun-
gen mit anderen Inhaltsstoffen ab als in einer kontrollierten, homogenen Lösung mit einem künstli-
chen Radikalgenerator oder Oxidans. In der Realität werden die radikalischen Reaktionen durch Licht,
Metallionen oder Hitze während der Verarbeitung oder Lagerung in Gang gesetzt [61] und sind
wesentlich schlechter kontrollierbar. Wie sich die AOC der Tomatensamen bspw. bei einer Aufarbei-
tung zu Öl oder anderen Extraktionsverfahren im großtechnischen Maßstab in der Industrie verhal-
ten, bleibt somit ungewiss. Dahingehend müssen noch einige Forschungen durchgeführt werden.
Auch wenn die Industrie z. B. das ORAC-Verfahren bereits so weit annimmt, dass die Hersteller von
Nutrazeutika die ORAC-Werte auf ihren Produkten ausweisen [63], so sollten diese dennoch kritisch
betrachtet werden. Die Tests basieren auf rein chemischen Reaktionen in vitro und weisen keine
Ähnlichkeit mit biologischen Systemen auf. Zudem geben sie keine Aussagen zu Bioverfügbarkeit,
Stabilität in vivo, Geweberetention der Antioxidantien sowie Reaktivität in situ [61].
TOOR et al. (2005) stellten letzten Endes heraus, dass das Entfernen der Schalen und Samen bei der
Herstellung von verarbeiteten Tomatenprodukten mit einem Verlust an wichtigen antioxidativ wirk-
samen Stoffen einhergeht, die bei einer Reststoffverwertung sinnvoll genutzt werden könnten [121].
Bisher existieren nicht viele Arbeiten, die sich mit der AOC von Tomatensamen befassen. Aufgrund
der Tatsache, dass jährlich aber enorme Mengen an Samen anfallen, wäre es wünschenswert, mehr
über die genaue Zusammensetzung der Antioxidantien in Erfahrung bringen zu können.
5.3.2 Lipophile antioxidative Kapazität
Die lipophile AOC von Lebensmitteln oder pflanzlichen Materialien beruht hauptsächlich auf deren
Gehalt an unpolaren Carotinoiden und Vitamin-E-Verbindungen [112]. Die experimentelle Bestim-
mung erfolgte mit dem αTEAC-Test, einer von MÜLLER et al. (2010) modifizierten Variante des TEAC-
II-Tests [93]. Dieser diente ursprünglich zur Analyse lipophiler Antioxidantien [116], bei der das ABTS-
Radikal durch eine chemische Reaktion mit Mangandioxid erzeugt wird [63]. Als Ausgangsmaterial für
die Gewinnung der lipophilen Substanzen aus den Tomatensamen diente der zuvor hydrolysierte, mit
70 %igem Ethanol extrahierte Rückstand. Für die darauffolgende Extraktion mit n-Hexan musste
dieser Rückstand vollständig getrocknet werden.
In den untersuchten Samen wurden Vitamin-E-Gehalte von 78,5 µmol/100 g bei den Red-Currant-
Samen bzw. 42,5 µmol/100 g bei den Waltinger-Samen bestimmt, wobei γ-Tocopherol den Haupt-
anteil einnahm. Daneben wurden geringe Carotinoidkonzentrationen ermittelt. Aufgrund dieser
Tatsache wurde erwartet, dass die Samen eine gewisse lipophile AOC aufweisen. Die detektierten
Vitamin-E-Verbindungen α- und γ-Tocopherol zählen zu den unpolareren Tocopherolen, sodass die
Wahrscheinlichkeit, dass diese zuvor mit 70 %igem Ethanol bereits extrahiert wurden, gering ist.
DISKUSSION
37
Dagegen sind Lutein und Zeaxanthin Vertreter der Xantophylle, die eine geringere Lipophilie auf-
weisen. Deren antioxidative Wirkungen wurden möglicherweise bereits teilweise in den hydrophilen
Tests erfasst.
Bei der Auswertung des αTEAC-Tests wurde ein deutlicher Verdünnungseffekt festgestellt. Mit ab-
nehmender Probenkonzentration stiegen die lipophilen TEAC-Werte an, weshalb die Mittelwerte für
jede Verdünnungsstufe angegeben wurden. Trotzdem wiesen die Mittelwerte hohe Standardab-
weichungen und folglich Variationskoeffizienten deutlich über 10 % auf. Dies ließ auf einige Schwie-
rigkeiten bei der Versuchsdurchführung schließen. Trotz Wiederholung der Messungen mit einer
abgeänderten Messreihenfolge von Proben, Blindwert und Standards (siehe 3.5.5) konnte keine
Verbesserung dieser Streuungsparameter erreicht werden.
Vermutlich lagen zwei Ursachen zugrunde: Zum einen wurden lediglich sehr geringe Extinktions-
differenzen zwischen Blindwert und Proben erreicht. Die daraus bestimmten AOC nahmen dement-
sprechend sehr geringe Werte an. Obwohl die Kalibrierung an die geringen Konzentrationen ange-
passt wurde, lagen die Werte trotzdem teilweise unterhalb der Standardkonzentrationen. Zum
anderen wurde eine unerwartet schnelle Abnahme der Absorption der ABTS•+-Arbeitslösung beo-
bachtet. Innerhalb von 60 min nahm die Extinktion um ca. 0,05 ab, die Messungen dauerten aller-
dings etwa 1,5-2 h. Allein durch diese Tatsache kann eine höhere AOC bei den Proben vorgetäuscht
werden, die am Ende des Messzeitraumes gemessen werden.
Abb. 20 Anteile der hydrophilen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamen- sorten, bestimmt mit dem H-TEAC-III-Test und dem αTEAC-Test; Darstellung in Abhängig- keit von den Verdünnungsstufen
Die Versuchsergebnisse lassen aufgrund der hohen Standardabweichungen keine präzise Auswertung
zu. Die Samen der Waltinger-Cocktailtomaten wiesen Werte zwischen 41,3 ± 7,0 und
133,0 ± 60,7 µmol αTE/100 g auf, die Samen der Red-Currant-Tomaten zwischen 56,5 ± 7,63 und
256,1 ± 72,0 µmol αTE/100 g. Signifikante Unterschiede zwischen beiden Samensorten konnten auf-
grund der hohen Streuungen nicht festgestellt werden. In Abb. 20 werden die Anteile der hydro-
philen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamensorten dargestellt. Ein Ver-
gleich beider AOC ist trotz der unterschiedlichen Standardsubstanzen Trolox und α-Tocopherol
möglich, da beide Einzelsubstanzen in ihrer antioxidativen Wirkung sehr ähnlich sind. KRANL et al.
(2005) beschrieben keine signifikanten Unterschiede in der AOC zwischen beiden Substanzen bei
einer Bestimmung mittels lipophilem TEAC-Test [131]. Aus der Abbildung wird deutlich, dass die
0 1 2 3 4 5
VF 1
VF 2
VF 5
VF 1
VF 2
VF 5
Wal
tin
ger
Red
C
urr
ant
Antioxidative Kapazität (mmol TE/100 g bzw. mmol αTE/100 g)
H-TEAC
αTEAC
DISKUSSION
38
hydrophilen Extrakte hauptsächlich (94-98 %) zur gesamten AOC beitrugen. Diese Tatsache wurde
auch von TOOR et al. (2005) beschrieben [121].
TOOR et al. (2005) bestimmten die hydrophile und lipophile AOC der Samenfraktion der Tomaten mit
dem TEAC-II-Test [121]. Die Verwendung von Trolox als Standardsubstanz bei der lipophilen Variante
führt nach MÜLLER (2011) zu uneinheitlichen Reaktionsbedingungen [58]. Das hydrophile Trolox kann
nur in wässrigen Lösungsmitteln gelöst werden, während sich die Proben in einem lipophilen Milieu
befinden. Der Austausch gegen das fettlösliche Analogon α-Tocopherol erreichte, dass n-Hexan
sowohl für die Kalibriersubstanz als auch für die lipophilen Verbindungen als Lösungsmittel genutzt
werden konnte [58]. TOOR et al. (2005) bestimmten eine lipophile AOC von 9,4 µmol TE/100 g, die
deutlich unter den eigenen Werten liegt [121].
Die AOC der einzelnen Tocopherole und Tocotrienole sowie Carotinoide wurde bereits mit verschie-
denen lipophilen Testmethoden analysiert [93,112]. Die Tocochromanole, speziell α-Tocopherol,
gelten als wirksame kettenbrechende und Peroxylradikal-fangende Antioxidantien. Bei der Analyse
mit dem αTEAC-Test wurden keine signifikanten Unterschiede in der AOC aller Vitamin-E-Isoformen
gefunden. Weder der Methylierungsgrad noch Sättigungsunterschiede der Seitenketten beein-
flussten die Fähigkeit, das synthetische ABTS-Radikal zu reduzieren [93].
Auf Basis der Gehalte an Tocochromanolen und Carotinoiden in den jeweiligen Samen und den anti-
oxidativen Aktivitäten dieser Substanzen aus der Literatur [93,112] wurden die theoretischen Anteile
dieser Verbindungen an der AOC berechnet. γ-Tocopherol trug aufgrund seines hohen Mengen-
anteils hauptsächlich zur AOC bei. Abb. 21 stellt die theoretischen AOC und die tatsächlich ermittel-
ten AOC (in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen) gegenüber.
Abb. 21 Gegenüberstellung der anhand der Einzelsubstanzen theoretisch ermittelten AOC (weiße Balken) und der tatsächlich bestimmten AOC (graue Balken, zusätzliche Darstellung des Verdünnungseffektes durch Angabe der Verdünnungsfaktoren)
Aufgrund der geringeren γ-Tocopherol-Gehalte ist die theoretische AOC der Red-Currant-Samen
geringer als die der Waltinger-Samen. Dagegen weisen letztere eine niedrigere tatsächliche lipophile
AOC auf. Ein gewisser Anteil der AOC konnte nicht auf die antioxidative Aktivität der Carotinoide und
Vitamin-E-Verbindungen zurückgeführt werden. Noch nicht identifizierte lipophile Minorkomponen-
ten oder synergistische Wechselwirkungen zwischen Carotinoiden und Tocochromanolen könnten
dafür verantwortlich sein [6]. Nach MÜLLER et al. (2011) sollte stets bedacht werden, dass die
theoretische AOC
theoretische AOC
VF1
VF1
VF2
VF2
VF5
VF5
0 50 100 150 200 250 300 350
Red Currant
Red Currant
Waltinger
Waltinger
Lipophile AOC [µmol αTE/100 g]
DISKUSSION
39
Betrachtung der AOC der einzelnen antioxidativen Substanzen in einer Lebensmittelmatrix unzweck-
mäßig ist, um die gesamte AOC zu bestimmen [112]. Das Auftreten von synergistischen oder antago-
nistischen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Antioxidantien können bedeutende Abweichungen
hervorrufen.
Für Tomatensaatöl wurde mit dem αTEAC-Test eine hohe lipophile AOC von ca. 600 µmol αTE/100 g
bestimmt [6]. Neben den Tocopherolen, die auch in den Samen nachgewiesen wurden, enthielt das
Öl hohe Mengen an Lycopin und β-Carotin. Lycopin besitzt unter den Carotinoiden die stärkste
Fähigkeit, ABTS-Radikale abzufangen [112] und hat damit einen großen Einfluss auf die AOC des Öles.
Dieses Carotin zeigte eine vierfach höhere Aktivität als α-Tocopherol, Lutein und Zeaxanthin zeigten
eine doppelt so hohe Aktivität [112]. Eine Kalkulation der theoretischen Anteile dieser Verbindungen
an der AOC ergab, dass die Lycopin-Isomere insgesamt 12 %, γ-Tocopherol 22-56 % der gesamten
antioxidativen Aktivität des Öles ausmachte. Ein Anteil von 8-45 % der AOC konnte auch hier nicht
auf die antioxidative Aktivität der Carotinoide und Vitamin-E-Verbindungen zurückgeführt werden.
5.4 Fettsäurezusammensetzung von Tomatensamen
Nach RABAK (1917) wurden Untersuchungen zu dem aus Tomatensamen gewonnenen Öl und dessen
Eigenschaften bereits seit 1901 durchgeführt [31]. Aufgrund der Tatsache, dass die industrielle Verar-
beitung von Tomaten seit dieser Zeit immer größere Ausmaße annahm, befassten sich später einige
weitere Forschungsgruppen mit dieser Thematik. Alle Autoren, bis hin zu denen, die sich aktuell
damit auseinandersetzen, beurteilten die als Abfallprodukt aus der Industrie anfallenden Tomaten-
samen als gute Quelle für pflanzliches Speiseöl [5,33,107,132-134]. Es eignet sich in nativer oder
raffinierter Form sowohl als Salatöl [107] als auch zum Kochen [33]. SOGI & SIDDIQ (2011) berichteten,
dass es sogar bei der Margarine- und Mayonnaiseherstellung verwendet wurde [32].
Bevor eine Analyse der Fettinhaltsstoffe und speziell der Fettsäuren erfolgen konnte, musste das Öl
in einem ersten Arbeitsschritt aus den Samen extrahiert werden. Meist wird dafür die Lösungs-
mittelextraktion angewendet, die das gängigste Verfahren in der Industrie ist. Für die eigenen Unter-
suchungen wurden als Extraktionsmittel Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 entsprechend
der Methode nach FOLCH et al. (1957) verwendet [94]. In der Literatur wurde meist eine Soxhlet-
Extraktion mit n-Hexan oder Petrolether durchgeführt [5,33,133,134], einige Arbeitsgruppen wählten
die traditionelle Pressmethode [83,132]. Tab. 13 fasst die damit erzielten Ausbeuten der Ölgehalte
zusammen. Auch wenn die eigenen Daten nur als Näherungswerte angesehen werden können, liegen
diese größtenteils innerhalb der Literaturwerte.
Tab. 13 Publizierte Gehalte an extrahierten Ölgehalten aus Tomatensamen
Quelle Ölgehalt (%)
eigene Daten Waltinger 25,8 20,2 Red Currant
TAKÁSOVÁ et al. 1995 [135] 20,0
LAZOS et al. 1998 [33] 21,8
SOGI & SIDDIQ 2011 [32] 20,5-29,6
SHAO et al. 2012 [9] 25,9
FAHIMDANESH & BAHRAMI 2013 [134] 33,6-37,4
DISKUSSION
40
LAZOS et al. (1998) beschrieben das gewonnene Öl bei Raumtemperatur als rötlich-gelbe Flüssigkeit,
die einen milden tomatig-fruchtigen Geruch aufwies [33]. Die Farbe des Öles nach der eigens durch-
geführten Extraktion wies keinen rötlichen Schimmer auf, es war nur gelblich.
Die Fettsäuren wurden in Form der Methylester gaschromatographisch bestimmt. Größtenteils
waren beide Samensorten vergleichbar. Bei beiden waren die Gehalte an ungesättigten Fettsäuren
mit 80 % viermal höher als die der gesättigten Fettsäuren mit 20 %. Minimale Abweichungen ergaben
sich zwischen den Werten für die einfach und mehrfach ungesättigten Verbindungen. Die Samen der
Sorte Waltinger wiesen etwas weniger Ölsäure und etwas mehr Linol- und α-Linolensäure als die der
Sorte Red Currant auf. Daraus ergab sich ein Anteil von 19,2 % einfach ungesättigten Fettsäuren für
die Waltinger-Samen im Gegensatz zu 20,8 % für die Red-Currant-Samen. Letztere besaßen einen
geringfügig niedrigeren Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Im Folgenden wird nicht zwi-
schen den zwei Samensorten unterschieden, sondern die Werte werden jeweils zusammengefasst.
Die bestimmten Anteile an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren decken sich überwiegend mit
den Angaben aus der Literatur (Tab. 14). Allein bei CANTARELLI et al. (1993) lag der ungesättigte Anteil
um 10 % niedriger als bei den anderen publizierten Werten und den eigenen Daten [5]. Diese
Arbeitsgruppe untersuchte den Einfluss der Hot-Break und Cold-Break-Behandlung von Tomaten auf
die Öle, die aus deren Samen gewonnen wurden. In Übereinstimmung mit den Literaturwerten war
auch hier die Linolsäure die dominierende Fettsäure, gefolgt von der Ölsäure. Allerdings lagen die
Linolsäuregehalte mit Werten um 40 % unter den Werten der anderen Literaturdaten. In dem Hot-
Break-Öl betrug der Anteil an Linolsäure 42,8 %, in dem Cold-Break-Öl 37,6 %. Demgegenüber wies
das Cold-Break-Öl ca. 10 % mehr Ölsäure auf, sodass dieses Öl letztendlich auch einen minimal
höheren Gesamtwert für die ungesättigten Fettsäuren besaß (70,6 % gegenüber 68,6 %). Meist lagen
die Linolsäuregehalte von Tomatensaatöl zwischen 50 und 60 % [33]. α-Linolensäure war die einzige
omega-3-Fettsäure, die das Öl der Tomatensamen enthielt.
Tab. 14 Publizierte Fettsäurezusammensetzungen von Öl aus Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen Daten
C16:0 C18:0 C20:0 C18:1 C18:2 C18:3 SFA UFA
eigene Daten Waltinger 13,4 4,0 0,5 18,1 59,2 2,5 19,1 80,9
Red Currant 13,4 4,7 0,6 19,9 57,0 2,3 19,8 80,2
EL-TAMIMI et al. 1979 [132]A 24,8 2,4 2,2 15,5 52,7 2,3
LAZOS & KALATHENOS 1988 [133] 13,8 3,4 0,5 21,4 55,0 4,0 19,1 80,9
CANTARELLI et al. 1993 [5]
Cold Break 16,9 9,5 0,8 29,7 37,6 n.n. 29,4 70,6
Hot Break 23,4 4,0 1,3 18,3 42,8 0,7 31,3 68,6
TAKÁSOVÁ et al. 1995 [135] 13,0 4,5 19,7 59,4 2,8 17,7 82,3
LAZOS et al. 1998 [33]B 14 6 0,3 22 54 2 20 80
BOTINEŞTEAN et al. 2012 [83] 17,2 9,2 48,2
FAHIMDANESH & BAHRAMI 2013 [134] 12,3 5,2 0,4 22,2 56,1 2,8
A Werte für Öl aus Abfallverwertung mit Lösungsmittelextraktion
B Werte für Rohöl
SFA - gesättigte Fettsäuren, UFA - ungesättigte Fettsäuren
Palmitinsäure war die dominierende gesättigte Fettsäure in beiden Samensorten mit einem Anteil
von 13,4 %, gefolgt von der Stearinsäure mit 4-5 %. Höhere Palmitinsäure-Anteile von 24,8 % wurden
von EL-TAMIMI et al. (1979) ermittelt [132]. Dieselbe Arbeitsgruppe berichtete über geringere Stearin-
säuregehalte und relativ hohe Arachinsäuregehalte von 2 %. Myristinsäure, Palmitoleinsäure,
DISKUSSION
41
Margarinsäure, C18:2 trans, Arachinsäure, C20:1, Behensäure und Lignocerinsäure wurden in
geringen Mengen bzw. nur in Spuren gefunden [33]. Mit Ausnahme der C18:2 trans deckt sich dies
mit den eigenen Daten. Nach LAZOS et al. (1998) fällt das Saatöl in die Kategorie der Linol- und
Ölsäure-reichen Öle und eignet sich daher sowohl für den Verzehr als auch für einige industrielle
Anwendungen wie z. B. Hydrierung oder Shortening [33]. Auch EL-TAMIMI et al. (1979) charak-
terisierten Tomatensaatöl als geeignet für die Fetthärtung [132]. Unterschiede einzelner Fettsäure-
gehalte beim Vergleich der Literaturwerte können u. a. auf die Verwendung unterschiedlicher Kultur-
sorten oder die Anbau- und Umweltbedingungen zurückgeführt werden [5].
Ein Vergleich des Fettsäuremusters des Öles beider Samensorten mit kommerziellen Pflanzenölen
zeigt, dass das Tomatensaatöl dem Sojaöl sehr ähnlich ist (Abb. 22). Allerdings weist Sojaöl höhere
Anteile an α-Linolensäure auf. Von MOUNTS et al. (1994) wurde ein Sojaöl mit geringem
α-Linolensäure-Anteil entwickelt [136]. Nach ELLER et al. (2010) ist Tomatensaatöl diesem sehr
ähnlich [107].
Abb. 22 Fettsäurezusammensetzung verschiedener Pflanzenöle (nach VACLAVIK & CHRISTIAN 2008 [137]) im Vergleich zu dem aus den zwei Samensorten gewonnenem Öl (normiert auf 100 %)
LAZOS et al. (1998) bestimmten einige weitere Fettkennzahlen von Tomatensaatöl, wie Verseifungs-
zahl, Iodzahl, Peroxidzahl, Dichte oder Brechungsindex, die Auskunft über die Zusammensetzung des
Tomatensaatöls geben können [33]. Die hohe Iodzahl von 105 deutet auf einen hohen Ungesättigt-
heitsgrad hin. Damit zählt es zu den halbtrocknenden Ölen [133]. Die Peroxidzahl als ein Maß für die
Verdorbenheit eines Fettes lag unter 20 meq/kg und damit in einem zufriedenstellenden Bereich.
Der Schmelzpunkt von kaltgepresstem Tomatensaatöl lag bei ca. - 4 °C [83]. Nach EL-TAMIMI et al.
(1979) betrug die Haltbarkeitsdauer von Tomatensaatöl etwa zwei Monate [132]. Außerdem hatte
eine Lagerung der Samen über zwei Jahre keinen Einfluss auf die Haltbarkeit des daraus gewonnen
Öles. Aus dieser Erkenntnis kann geschlussfolgert werden, dass die Samen mehrerer Saisons bei
Raumtemperatur gelagert werden können bevor die Ölextraktion stattfindet. Dies könnte von Be-
deutung sein, wenn die Samenmenge einer Saison nicht ausreichend für eine Extraktion ist.
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Palmöl
Rapsöl
Olivenöl
Sonnenblumenöl
Sojaöl
Waltinger
Red Currant
Fettsäuregehalt
SFA
MUFA
PUFA
α-Linolensäure
DISKUSSION
42
LAZOS et al. (1998) untersuchten außerdem, welchen Effekt eine Aufreinigung von Tomatensaatöl auf
diverse Eigenschaften hat [33]. Dafür verglichen sie das Rohöl und das gereinigte Öl, welches
entschleimt, entsäuert und gebleicht wurde. So wird beschrieben, dass die wesentlichen physika-
lischen und chemischen Eigenschaften durch die drei Raffinationsschritte nicht beeinflusst wurden.
Allerdings wird gleichzeitig von einer Abnahme des Säuregrades, der Farbintensität, der
unverseifbaren Bestandteile und der Oxidationsstabilität sowie von einem Anstieg des Rauchpunktes
und einer Veränderung der spezifischen Extinktionen bei 232 und 270 nm berichtet, sodass dass sehr
wohl von einer Beeinflussung einiger physikochemischer Eigenschaften gesprochen werden kann.
Bezüglich des Fettsäureprofils konnten allerdings tatsächlich keine Unterschiede zwischen den
beiden Ölen festgestellt werden. Die Aufreinigung führte lediglich zu höheren Werten bei der
Fettsäure C18:2 trans, die in den eigens untersuchten Ölen nicht detektiert wurde. Die Zunahme an
dieser trans-Fettsäure von 0,1 % auf 0,8 % wurde mit den hohen Temperaturen bei dem Bleich-
vorgang begründet, die zu einer cis/trans-Isomerisierung führten.
Außerdem untersuchten mehrere Arbeitsgruppen die Sterolgehalte von Tomatensaatöl. ELLER et al.
(2010) bestimmten in Abhängigkeit der Extraktionsmethode zwischen 10,6 und 12,3 mg/g Öl, LAZOS
et al. (1998) ermittelten 4,6 mg/g Öl [107,33]. Die meisten Pflanzenöle besitzen Phytosterolgehalte
zwischen 1 und 5 mg/g [138]. Die in dem Tomatensaatöl beschriebenen Hauptsterole waren β-Sito-
sterol, Cholesterol, Stigmasterol und Campesterol [33,107]. Der vergleichsweise hohe Cholesterol-
gehalt im Gegensatz zu anderen Pflanzenölen, die nur Spuren dieses Sterols aufweisen, ist charak-
teristisch für Samen der Familie der Solanaceae [139]. Im Allgemeinen herrscht die Ansicht, dass
Pflanzen kein Cholesterol enthalten. Allerdings handelt es sich hierbei um ein Irrtum, welches aus
den Tatsachen resultiert, dass Pflanzen generell nur sehr kleine Mengen an Cholesterol aufweisen
und dass die Analysenmethoden für den Nachweis von Cholesterol in diesem Bereich bis vor kurzem
noch nicht gut entwickelt waren [140]. Pflanzen enthalten sowohl freies als auch verestertes Choles-
terol, welches Bestandteil von Membranen ist und als Teil von den Oberflächenlipiden von Blättern
auftritt [140]. NODA et al. (1988) wiesen, neben dem dominierenden Sitosterol, geringfügige Mengen
an Cholesterol in Rapssamen nach, während in den Rapsblättern ein umgekehrtes Verhältnis auftrat
[141]. Auch wenn Cholesterol im Vergleich zu den anderen Sterolen nur geringe Gehalte aufwies,
kann es in Pflanzenölen einen Anteil an den Gesamtsterolen von 5 % ausmachen [142]. Bei Tomaten-
saatöl ergaben sich Cholesterolgehalte zwischen 60 und 70 mg/100 g [109]. Relativ hohe Cholesterol-
gehalte wurden z. B. auch in Leindotteröl gefunden (18,8 mg/100 g Öl) [143]. Verglichen mit den
Cholesterolgehalten tierischer Produkte, wie Butter (250 mg/100 g) oder Eigelb (1 260 mg/100 g)
[144], sind die Gehalte in pflanzlichen Ölen allerdings unbedeutend gering.
ZUSAMMENFASSUNG
43
6 ZUSAMMENFASSUNG
Die Tomate (Lycopersicon esculentum) wird als der Deutschen liebstes Gemüse betitelt. Der größte
Anteil an Tomaten wird in Form verarbeiteter Produkte, wie z. B. Tomatenmark, -sauce, -saft oder
Ketchup, verzehrt. Epidemiologische Studien zeigten, dass ein häufiger Verzehr von Tomaten oder
Tomatenprodukten das Risiko für verschiedene Krebsarten, wie Prostata-, Lungen- oder Darmkrebs,
und kardiovaskuläre Erkrankungen senkt. Die steigende Nachfrage nach diesen Produkten führte zu
einer enormen Entwicklung der tomatenverarbeitenden Industrie. Damit sind allerdings wirtschaft-
liche, technische und ökologische Probleme verbunden, da große Mengen an Reststoffen entstehen,
die entsorgt und verwertet werden müssen. Hauptbestandteil des sogenannten Tomatentresters
sind Tomatensamen, die im Hinblick auf eine sinnvolle Reststoffverwertung als Ausgangsmaterial für
neue Produkte dienen können. Aus diesem Grund besteht Interesse an der chemischen Zusammen-
setzung und besonders den bioaktiven Substanzen der Samen.
Die vorliegende Arbeit hatte daher folgende Zielstellungen:
1. Bestimmung und Beurteilung der Carotinoid- und Vitamin-E-Gehalte der Tomatensamen.
2. Ermittlung der antioxidativen Kapazität der Samen mit verschiedenen Testmethoden und Er-
fassung der Anteile an freien und gebundenen wasserlöslichen sowie an fettlöslichen
Antioxidantien.
3. Untersuchung des Fettsäuremusters der Samen.
Untersucht wurden Samen von den zwei Tomatensorten Waltingers Cocktail und Red Currant, wobei
letztere eine Wildform ist und auch rote Johannisbeertomate genannt wird.
Die Carotinoid- und Vitamin-E-Analyse erfolgte im Anschluss an eine kombinierte Extraktions-
methode mit Methanol/Tetrahydrofuran mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).
Der Carotinoid-Gehalt beider Samensorten bestand lediglich aus sehr geringen Mengen an den
Xanthophyllen (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin, wobei letzteres dominierte. In den Samen
wurden keine Carotine gefunden. Der Gesamtcarotinoid-Gehalt der Waltinger-Samen betrug
158,9 ± 10,8 µg/100 g und war signifikant höher als der der Red-Currant-Samen mit
38,0 ± 4,8 µg/100 g. Letztlich spielten die Carotinoidverbindungen bezüglich der Inhaltsstoffe von
den Tomatensamen nur eine untergeordnete Rolle.
Die flüssigchromatographische Trennung der Tocochromanole ergab, dass γ-Tocopherol mit einem
Anteil von 97-98 % in beiden Samensorten das Hauptvitamer war. Daneben wurden geringe Gehalte
an α-Tocopherol ermittelt. Die Waltinger-Samen wiesen mit 78,5 ± 4,0 µmol/100 g fast doppelt so
hohe Gesamt-Vitamin-E-Gehalte auf wie die Red-Currant-Samen mit 42,5 ± 1,3 µmol/100 g. Die
ermittelten Vitamin-E-Konzentrationen der eigenen Samen waren 72-85 % niedriger als die von
Tomatensaatöl aus publizierten Studien. Zum einen könnte die zweijährige Lagerdauer der Samen
einen Einfluss auf die Tocopherol-Gehalte gehabt haben, zum anderen könnten unterschiedliche
Extraktionsverfahren dafür verantwortlich gewesen sein. Im Vergleich mit den Vitamin-E-Gehalten
anderer kommerzieller Pflanzenöle, wie Oliven- oder Sonnenblumenöl, war der Vitamin-E-Gehalt der
Tomatensaatöle aus der Literatur signifikant höher. Die Red-Currant-Samen wiesen ähnliche
Tocopherol-Konzentrationen wie Leinsamen auf, die Waltinger-Samen waren mit Rapssamen ver-
gleichbar. Tomatensaatöl gilt ohne Zweifel als ausgezeichnete Vitamin-E-Quelle. Außerdem beein-
flusst dieses fettlösliche Vitamin maßgeblich die lipophile antioxidative Kapazität von Pflanzenölen.
ZUSAMMENFASSUNG
44
Aufgrund der Tatsache, dass bis heute kein universell anwendbares Verfahren zur Bestimmung der
antioxidativen Kapazität existiert, wurden hierfür verschiedene Testmethoden verwendet. Allerdings
konnte die antioxidative Kapazität immer nur in Relation zu dem verwendeten Radikal ermittelt wer-
den. Um die hydrophilen und lipophilen antioxidativen Verbindungen in den Samen separat erfassen
zu können, wurden diese nacheinander mit Lösungsmitteln verschiedener Polarität (zunächst mit
70 %igem Ethanol, anschließend mit n-Hexan) extrahiert. Zusätzlich wurde eine Hydrolyse durchge-
führt. Dadurch wurden die freien und gebundenen hydrophilen Antioxidantien separat erfasst. Zur
Bestimmung der hydrophilen antioxidativen Kapazität wurden der Gesamtphenoltest nach Folin-
Ciocalteu, der H-TEAC-III-Test und der H-ORACFl-Test angewandt. Mit Ausnahme des Gesamtphenol-
tests nach FC wurde bei diesen Testmethoden ein deutlicher Verdünnungseffekt festgestellt, dessen
Ursachen allerdings bislang unbekannt sind. Mit zunehmender Probenkonzentration sank die antioxi-
dative Kapazität. Beim Vergleich der beiden Samensorten wiesen die Red-Currant-Samen stets höhe-
re antioxidative Kapazitäten auf, was sortenbedingte Ursachen haben könnte. Literaturwerte lagen
deutlich unterhalb der eigenen Werte. Die Hydrolyse führte bei allen Testvarianten zu einer Frei-
setzung von gebundenen antioxidativen Substanzen. Bei den Gesamtphenolen war der Anteil an ge-
bundenen Verbindungen deutlich höher als der Anteil an freien Substanzen. So war der Gesamtphe-
nolgehalt der freien Verbindungen bei den Waltinger-Samen 167,6 ± 1,7 mg GAE/100 g, bei den Red-
Currant-Samen 204,8 ± 4,7 mg GAE/100 g, der Gehalt der gebundenen Substanzen betrug
entsprechend 203,2 ± 3,4 mg GAE/100 g und 309,4 ± 9,9 mg GAE/100 g. Des Weiteren maß der
ORAC-Test gegenüber dem H-TEAC-Test, wie erwartet, höhere gesamte antioxidative Kapazitäten
(ORAC: W 19,0 - 26,9 mmol TE/100 g, RC 28,8 - 37,7 mmol TE/100 g; H-TEAC: W 2,2 -
2,9 mmol TE/100 g, RC 2,9 - 4,3 mmol TE/100 g). Für beide Samen wurde eine mäßige Korrelation
zwischen dem Gesamtphenolgehalt und der antioxidativen Kapazität festgestellt.
Die lipophile antioxidative Kapazität wurde mittels αTEAC-Test bestimmt, bei dem ebenfalls ein Ver-
dünnungseffekt auftrat. Aufgrund einiger Schwierigkeiten bei der Versuchsdurchführung wiesen die
Ergebnisse hohe Streuungen auf, was eine präzise Auswertung erschwerte. Die lipophilen Extrakte
trugen zu 2-6 % zu der gesamten antioxidativen Kapazität bei, die hydrophilen Extrakte machten den
Hauptanteil aus. γ-Tocopherol trug aufgrund seines hohen Mengenanteils hauptsächlich zur lipophi-
len antioxidativen Kapazität bei. Grundsätzlich enthielten die Tomatensamen antioxidativ wirksame
Substanzen, die zusätzliche positive Effekte auf die aus der Reststoffverwertung gewonnenen
Produkte haben können.
Um das Fettsäuremuster der beiden Tomatensamensorten analysieren zu können, wurden diese
nach einer Mini-Folch-Methode extrahiert. Im Anschluss wurden die Fettsäuren in Form der Methyl-
ester gaschromatographisch bestimmt. Dabei wurde festgestellt, dass beide Samensorten vergleich-
bar waren. Die Gehalte an ungesättigten Fettsäuren waren mit 80 % viermal höher als die der ge-
sättigten Fettsäuren mit 20 %. Dabei wurde ein Anteil von 19,2 % einfach ungesättigten Fettsäuren
für die Waltinger-Samen im Gegensatz zu 20,8 % für die Red-Currant-Samen bestimmt. Letztere
besaßen dafür einen geringfügig niedrigeren Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Die domi-
nierende Fettsäure war Linolsäure mit 57-59 %, gefolgt von Ölsäure mit 18-20 %. α-Linolensäure war
die einzige ω-3-Fettsäure, die im Öl der Tomatensamen enthalten war. Palmitinsäure war die domi-
nierende gesättigte Fettsäure mit einem Anteil von 13 %, gefolgt von Stearinsäure mit 4-5 %. Das
extrahierte Öl war in seinem Fettsäuremuster Sojaöl sehr ähnlich. Aufgrund des hohen Gehaltes an
ungesättigten Fettsäuren und speziell der essentiellen Linolsäure eignet sich das Öl der Tomaten-
samen als pflanzliches Speiseöl. Die Verwertung der Samen zur Herstellung von Öl kann ein bedeu-
tender Beitrag zur Reduktion des Abfallentsorgungsproblems sein.
SUMMARY
45
7 SUMMARY
Tomatoes are the German’s favorite vegetable. The majority of tomatoes are consumed in form of
processed products like tomato pulp, sauce, juice or ketchup. Based on epidemiological studies there
is a positive link between higher dietary intake of tomatoes or tomato products and lower risk of
various types of cancer like prostate, lung or stomach cancer and cardiovascular diseases. The
increasing demand for those products resulted in a huge development of tomato processing
industries. But this is associated with economical, technical and ecological problems. Processing
operations generate huge amounts of waste, which have to be disposed or utilized. Main component
of tomato pomace are the seeds which could be the basic material for new products. For that reason
there is an increased interest in the chemical composition of the seeds and especially their bioactive
substances. Therefore, the aims of the present study were determination and evaluation of
carotenoid and vitamin E contents of tomato seeds, determination of the antioxidant capacity using
various assays and thereby the assessment of proportion of free und bound water-soluble and fat-
soluble antioxidants. Additionally, the fatty acid composition of tomato seeds were to be identified.
Seeds of two different tomato varieties were examined: Waltingers Cocktail and Red Currant. The
latter is a wild tomato variety.
Liquid chromatographic analysis of carotenoid and vitamin E contents followed a combined
extraction method with methanol/tetrahydrofuran. Carotenoid contents, determined in both seeds,
were composed of very little amounts of (all-E)-lutein and (all-E)-zeaxanthin, of which the latter
dominated. Total carotenoid content of Waltinger seeds was 158.9 ± 10.8 µg/100 g and therefore
significantly higher than the carotenoid content of Red Currant seeds with 38.0 ± 4.8 µg/100 g. In the
end, carotenoids played just a minor role concerning chemical constituents of tomato seeds.
Relating to vitamin E γ-tocopherol was the main vitamer in the seeds with a percentage of 97-98%.
Significantly lower amounts of α-tocopherol were found. Total vitamin E content of Waltinger seeds
(78.5 ± 4.0 µmol/100 g) was nearly twice as high as that of Red Currant seeds
(42.5 ± 1.3 µmol/100 g). Compared to tomato seed oil from published studies, the vitamin E contents
of the two seeds were 72-85% lower. One reason could be the duration of storage of the seeds for
two years, another reason could be the use of different extraction methods. Vitamin E contents of
tomato seed oils from the literature were significantly higher than those of other commercial plant
oils like olive oil or sunflower oil. Red Currant seeds had tocopherol contents similar to flaxseeds,
Waltinger seeds were comparable to rape seeds. Finally, tomato seed oil is considered to be an
excellent source of vitamin E and this lipid-soluble vitamin contributes essentially to the antioxidant
capacity of plant oils.
Until today there is no standardized method to determine the antioxidant capacity in foods. That’s
why several assays were used, but the measured antioxidant capacity could only be seen in relation
to the applied radicals. To investigate hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity of the seeds
separately they were extracted consecutively with solvents of different polarities (starting with
ethanol (70 %), then using hexane). Additionally, a hydrolysis was performed to liberate bound
substances. Total phenolic assay, H-TEAC-III assay and H-ORACFl assay were used to determine
hydrophilic antioxidant capacity. Except for total phenolic assay an influence of the sample
concentration on the antioxidant capacity was observed. There was a decrease of the antioxidant
capacity with increasing sample concentration. The reasons for this effect are unknown up to now.
Comparing both seed varieties Red Currant seeds showed higher antioxidant capacities. Data from
SUMMARY
46
the literature were notably below the own data. Within all assays, hydrolysis led to a release of
bound antioxidants. Within total phenolics, the amount of bound compounds
(W 203.2 ± 3.4 mg GAE/100 g, RC 309.4 ± 9.9 mg GAE/100 g) was significantly higher than the
amount of free compounds (W 167.6 ± 1.7 mg GAE/100 g, RC 204.8 ± 4.7 mg GAE/100 g). As expec-
ted, the ORAC assay measured higher antioxidant capacities compared to the H-TEAC assay (H-TEAC:
W 2.2 – 2.9 mmol TE/100 g, RC 2.9 – 4.3 mmol TE/100 g; ORAC: W 19.0 – 26.9 mmol TE/100 g, RC
28.8 – 37.7 mmol TE/100 g). Furthermore, there was just a sligth correlation between total phenolics
and antioxidant capacity. Within lipophilic αTEAC assay, an influence of the sample concentration on
the antioxidant capacity was observed as well. Due to some problems within the test execution
results showed high standard deviations that aggravated a precise evaluation. But it became clear,
that lipophilic extracts contributed just slightly (2-6%) to the total antioxidant capacity compared to
hydrophilic extracts.
For analysis of the fatty acid composition the seeds were extracted on the basis of a mini Folch
method. Subsequently, the fatty acids were determined by gas chromatography of the fatty acid
methyl esters. The results for both seeds were comparable. Total unsaturated fatty acids were 80%
and with that four times higher than saturated fatty acids with 20%. The content of mono-
unsaturated fatty acids of the Waltinger seeds was 19.2%, that of the Red Currant seeds 20.8%. The
latter had a slightly lower percentage of polyunsaturated fatty acids. The major fatty acid was linoleic
acid with 57-59%, followed by oleic acid with 18-20%. α-Linolenic acid was the single ω-3 fatty acid.
Palmitic acid was found to be the dominant saturated fatty acid with 13%, followed by stearic acid
with 4-5%. Concerning the fatty acid profile the extracted oil from the tomato seeds was quite similar
to soybean oil. Because of the high amount of unsaturated fatty acids and especially because of the
essential linolenic acid, tomato seed oil is suitable as edible oil. Finally, the utilization of the seeds for
oil production can lead to a reduction of the waste management problem.
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ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
VII
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
A.1 Verzeichnis der verwendeten Geräte
Allgemeine Laborgeräte
Analysenwaage AE 160 (Mettler, Gießen)
Analysenwaage AC 211 S (Sartorius, Göttingen)
Apparatur zur Probenaufkonzentrierung Dri-Block DB 3A (Techne, Staffordshire)
Apparatur zur Probenaufkonzentrierung (Jüke Systemtechnik, Altenberge)
pH-Meter CG 840 (Schott, Hofheim)
Reagenzglasschüttler IKA Vibrax VXR (IKA Labortechnik, Staufen)
Reagenzglasschüttler MS1 Minishaker (IKA Labortechnik, Staufen
Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)
Rotationsverdampfer Rotavapor R-124 und Wasserbad B-480 (Büchi, Flavil, Schweiz) mit Membran-
vakuumpumpe MZ-2C (Vacuubrand, Wertheim)
Ultraschallbad Sonorex RK 100 (Bandelin, Berlin)
Ultra-Turrax T25 mit Dispergierstab S25KV-18G (IKA Labortechnik, Staufen)
Ultra-Turrax T 25 mit Dispergierstäben S25N-8G und S25N-10G (IKA Labortechnik, Staufen)
Wasserbad Sub 14 (Grant Instruments, Cambridge)
Zentrifuge Multifuge X1 (Thermo Fisher Scientific, Heraeus, Osterode)
Zentrifuge Rotina 46 (Hettich, Tuttlingen)
Zentrifuge 5702 R (Eppendorf, Hamburg)
Zentrifuge 5425 (Eppendorf, Hamburg)
Analytische HPLC - Carotinoide
HPLC-Bedingungen:
Säule: C30-Analysensäule; 250 x 4,6 mm; 5 µm mobile Phase: Gradient von MeOH (A) und MtBE (B) Säulentemperatur: 13 ± 1 °C Flussrate: 1,0 ml/min Injektionsvolumen: 50 µl Laufzeit: 75 min Detektor: Photodiodenarray; 450 nm
Merck-Hitachi, Darmstadt Jasco, Gross-Umstadt
Autosampler: L-7200
Pumpe: L-7100
Entgaser: L-7614
PDA-Detektor: L-7450
Interface: D-7000
Säulen-Thermostat: Jetstream plus
Software: D-7000 HPLC System Manager
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
VIII
Gradient:
Trennsäule: C30-Develosil RPAQUEOUS; 250 x 4,6 mm; 5 μm (Phenomenex, Aschaffenburg)
Vorsäule: C18 Security Guard4 x 3,0 mm (Phenomenex, Aschaffenburg)
Analytische HPLC - Vitamin E
HPLC-Bedingungen:
Säule: Eurospher 100 DIOL; 250 x 4,0 mm; 7 µm mobile Phase: n-Hexan/MtBE (98/2, v/m), isokratisch Säulentemperatur: 35 ± 1 °C Flussrate: 1,5 ml/min Injektionsvolumen: 20 µl Laufzeit: 45 min Detektor: Fluoreszenz-Detektor
Anregung: 292 nm; Emission: 330 nm
Trennsäule: Knauer Eurospher-100 DIOL; 250 × 4,0 mm; 7 μm (Knauer, Berlin)
Vorsäule: Knauer Eurospher-100 DIOL; 5 × 4,0 mm; 7 μm (Knauer, Berlin)
Antioxidative Tests
Mikrotiterplattenphotometer Fluostar Optima (BMG Labtech, Offenburg) Software: Optima Spektralphotometer V-530 (Jasco, Groß-Umstadt) Software: Spectra Manager
Zeit (min) A (%)
MeOH B (%) MtBE
0 90 10
40 50 50
42 40 60
60 40 50
70 90 10
75 90 10
Merck, Darmstadt
Autosampler: AS-2000A
Pumpe: L-6200A
Fluoreszenz-Detektor: F-1080
Interface: D-6000
Säulen-Thermostat: L-5025
Software: D-7000 HPLC System Manager
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
IX
Analytische GC - Fettsäuren
Chromatographieparameter von GC3 und GC4:
GC3 GC4
Gerät: SHIMADZU GC 17 A SHIMADZU 2010
Autosampler: AOC 5000, SHIMADZU AOC 5000, SHIMADZU
Software: GC Lab Solution GC Lab Solution
Säule: Durabond 225MS CP Select
Länge: 60 m 200 m
Innendurchmesser: 0,25 mm 0,25 mm
Filmdicke: 0,25 µm 0,25 µm
Trägergas: Helium Helium
vlin: 42,3 cm/s 35,2 cm/s
Brennergas: Wasserstoff, Luft Wasserstoff, Luft
Injektortemperatur: 260 °C 260 °C
Injektionsvolumen: 1,0 µl 1,0 µl
Injektionsmodus: Split Split
Split Ratio: 1:100 1:100
Detektor: FID FID
Detektortemperatur: 270 °C 270 °C
Programmdauer: 70 min 83 min
Temperaturprogramm - GC 3:
Druckprogramm - GC 3:
Temperaturprogramm - GC 4:
isotherm 176 °C
Druck - GC 4: isobar 495,1 kPa
Rate (°C/min) Temp. (°C) Hold Time (min)
- 70 2,0
10 180 0,0
2,0 220 5,0
2,0 230 27,0
Rate (kPa/min) Pressure (kPa) Hold Time (min)
- 136 2,0
10 166 0,0
0,5 176 5,0
0,5 178 27,0
Rate (°C/min) Temp. (°C) Hold Time (min)
- 171 60
25 250 20
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
X
A.2 Verzeichnis der verwendeten Arbeitsmittel
Pasteurpipetten (kurz, lang) Kolbenhubpipetten
Research (variable) 10-100 µl, 20-200 µl, 30-300 µl (Mehrkanal) (Eppendorf, Hamburg) Reference (variable) 100-1000 µl (Eppendorf, Hamburg)
Multipette plus (Eppendorf, Hamburg) Nichipet EX 1000-5000 µl (Nichiryo, Tokyo, Japan)
Carotinoid- und Vitamin-E-Analytik
Braunglas-Rundkolben (250 ml) Braunglas-Spitzkolben (50 ml) Braunglas-V-Vials Büchnertrichter Erlenmeyerkolben (50 ml) Quarzküvetten, 1 cm Schichtdicke (zur Konzentrationsbestimmung der Standards) (Suprasil QS,
Hellma Analytics, Müllheim) Maßkolben (5 ml) Reaktionsgefäße (1,5 ml) Rundfilter Nr. 390 (Munktell, Bärenstein) Vakuum-Saugflasche
Antioxidative Tests
Maßkolben (1 ml, 2 ml, 10 ml, 20 ml, 100 ml) Reaktionsgefäße (1,5 ml) Plastikschalen (100 ml) (Labcor Products)
Extraktion und Hydrolyse
Einmalspritzen Injekt® Luer Solo 2 ml (B. Braun, Melsungen) Glasperlen Maßkolben (5 ml) Membranfilter Phenex RC 0,2 µm, 15 mm Syringe Filters, non-sterile, PP-Housing, Luer/Slip
(Phenomenex, Aschaffenburg) Plastik-Zentrifugenröhrchen (15 ml)
a) Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu
Makroküvetten (2,5 ml)
b) H-TEAC-III-Test
Halbmikroküvetten (1,5 ml)
c) H-ORACFl-Test
96-Well-Mikrotiterplatten
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
XI
d) αTEAC-Test
Faltenfilter MN 615 ¼ (Macherey-Nagel, Düren) Rundfilter Nr. 390 (Munktell, Bärenstein) Vakuum-Saugflasche Halbmikroküvetten (1,5 ml)
Fettextraktion nach FOLCH und Methylierung
Pyrexröhrchen (15 ml) Schliffröhrchen (10 ml) Mikro-Weißglas-Vials mit 150 µl Insert
Dünnschichtchromatographie
DC-Kammer DC-Kieselgelplatte 60 F254 (Merck, Darmstadt) UV-Gerät Typ HT (Helios Apparatebau, Jena)
A.3 Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und Lösungen
Chloroform Ethanol Methanol Methyl-tert-Butyl-Ether (MtBE) n-Hexan Tetrahydrofuran HPLC-Wasser (Reinstwasser, 18 MΩ): MilliQ Synthesis A 10 (Millipore, Molsheim) Stickstoff
Carotinoid- und Vitamin-E-Analytik
Standardsubstanzen:
Carotinoide: CaroteNature (Lupsingen, Schweiz) β-apo-8‘-Carotinal: CaroteNature (Lupsingen, Schweiz) Tocopherole: Calbiochem (Darmstadt) Tocotrienole: Davos Life Science (Singapur) α-Tocopherolacetat: Sigma-Aldrich (Taufkirchen)
- Stammlösungen 50-100 μg/ml MeOH (Xanthophylle) bzw. Cyclohexan/Toluol (4/1, v/v)(Carotine), Stammlösung β-apo-8‘-Carotinal 16 mg/50 ml Cyclohexan/Toluol, Lagerung bei - 25 °C - Stammlösungen T und T3 ca. 1 mg/ml Ethanol, Stammlösung α-TAC ca. 5 mg/ml, Lagerung bei - 25 °C
Butylhydroxytoluol (BHT; 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol) (Sigma-Aldrich)
Magnesiumhydroxidcarbonat (Sigma-Aldrich)
Methanol/Tetrahydrofuran (1/1, v/v, + 0,1 % BHT)
Natriumsulfat, entwässert (Acros)
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
XII
Antioxidative Tests
Extraktion und Hydrolyse
Ethanol (70 %) meta-Phosphorsäure (0,75 mol/l) Natriumhydroxid-Lösung (2,0 mol/l in 75 % MeOH) n-Hexan Salzsäure (1,0 mol/l)
a) Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu
Natriumcarbonat-Lösung
- 50,625 g Natriumcarbonat-Decahydrat (Na2CO3 · 10 H2O, Merck) oder 18,763 g Natriumcarbonat
(wasserfrei, Roth) in 250 ml HPLC-Wasser lösen
Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz
- Folin-Ciocalteu-Reagenz (Fluka) 1:10 mit HPLC-Wasser verdünnen (Volumen von Probenanzahl
abhängig)
- bei jeder Analyse frisch herstellen
2 mM (340,24 mg/l) Gallussäure-Stammlösung für Kalibrierung
- 37,63 mg Gallussäure · H2O (Fluka) in 100 ml HPLC-Wasser lösen
- je 1,25 ml der Stammlösung in 1,5 ml-Tubes füllen und bei - 25 °C einlagern
b) H-TEAC-III-Test
75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)
- 218 mg Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4, wasserfrei, Merck) oder 221 mg Natriumdihydrogen-
phosphat-Monohydrat (NaH2PO4 · H2O, Merck), 1,494 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 · 2 H2O, Fluka) und 8,766 g Natriumchlorid (Acros) in 1 l HPLC-Wasser lösen, auf pH ~ 7,4
einstellen
- im Kühlschrank aufbewahren
7 mM ABTS-Stammlösung
- 38,4 mg ABTS (Sigma-Aldrich) in 10 ml HPLC-Wasser lösen
2,45 mM Kaliumperoxodisulfat-Lösung
- 6,62 mg Kaliumperoxodisulfat (Fluka) in 10 ml HPLC-Wasser lösen
ABTS•+
-Arbeitslösung I
- 10 ml ABTS-Stammlösung mit 10 ml Kaliumperoxodisulfat-Lösung in einem Becherglas mischen,
Lösung bei RT in dunkler Flasche aufbewahren, ABTS•+ hat sich nach 24 h vollständig gebildet - im Kühlschrank aufbewahren
ABTS•+
-Arbeitslösung II
- ABTS•+-Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnen bis E734 ≅ 0,70 ± 0,05 (in Küvette testen)
- ca. 2 h bei RT stehen lassen (in dunkler Flasche)
- zu Testbeginn nochmals Extinktion prüfen
- bei jeder Analyse frisch herstellen
2,5 mM Trolox-Stammlösung zur Kalibrierung
- 12,5 mg Trolox (Sigma-Aldrich) in 20 ml HPLC-Wasser lösen
- je 1,5 ml der Stammlösung in 1,5 ml-Tubes füllen und bei - 25 °C einlagern
- für Verdünnungsreihe Stammlösung 1:10 verdünnen, bei jeder Analyse frisch herstellen
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
XIII
c) H-ORACFl-Test 75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)
- siehe H-TEAC III
0,12 mM Fluoreszein-Arbeitslösung I
- 10 mg Fluoreszein (Riedel-de-Haën) in 250 ml Phosphatpuffer lösen - im Kühlschrank aufbewahre
1,2 µm Fluoreszein-Arbeitslösung II
- Fluoreszein-Arbeitslösung I 1:100 mit Phosphatpuffer verdünnen
- bei jeder Analyse frisch herstellen
129 mM AAPH-Stammlösung
- 705 mg AAPH (Acros) in 20 ml Phosphatpuffer lösen
- bei jeder Analyse frisch herstellen, im Kühlschrank aufbewahren
2,5 mM Trolox-Stammlösung zur Kalibrierung
- 12,5 mg Trolox in 20 ml HPLC-Wasser lösen
- je 1,5 ml der Stammlösung in 1,5 ml-Tubes füllen und bei - 25 °C einlagern
d) αTEAC-Test 75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)
- siehe H-TEAC III
ABTS-Stammlösung
- eine gute Spatelspitze ABTS in einigen ml Phosphatpuffer lösen
ABTS•+
-Arbeitslösung I
- einen Löffel Mangandioxid (Merck) in einen Faltenfilter geben, einige ml Phosphatpuffer
durchlaufen lassen und Puffer verwerfen
- ABTS-Stammlösung darüber laufen lassen und mit einigen ml Puffer nachwaschen (dabei bildet sich
grünes ABTS•+)
- Lösung Membran-filtrieren - mehrere Wochen haltbar
ABTS•+
-Arbeitslösung II
- ABTS•+-Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnen bis E734 ≅ 0,70 ± 0,05 (in Küvette testen)
- ca. 2 h bei RT stehen lassen (in dunkler Flasche)
- zu Testbeginn nochmals Extinktion prüfen
- bei jeder Analyse frisch herstellen
α-Tocopherol-Stammlösung zur Kalibrierung
- 200 µl Stammlösung in 2 ml-Maßkolben pipettieren und unter Stickstoffstrom abblasen
- Kolben mit n-Hexan bis zur Marke auffüllen, schütteln
Fettextraktion nach FOLCH
Chloroform
Glaswolle
n-Hexan
Methanol
Natriumchlorid-Lösung 2 %ig Natriumsulfat wasserfrei
ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN
XIV
Methylierung nach Natriummethylat-Methode
n-Hexan
Natrium-Methylat (Acros organics)
Natrium-Hydrogensulfat-Monohydrat kristallin (Merck, Darmstadt)
Dünnschichtchromatografie
Laufmittel:
- n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v)
Sprühreagenz:
- 2’,7’-Dichlorfluoreszein (Fluka,Buchs, Schweiz); 0,2 % in Ethanol
Mischstandard(PhL, Chol, FFs, TAG, FAME, CE):
- 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine (Larodon fine chemicals)
- Cholesterin (Sigma-Aldrich, Taufkirchen)
- Magaric acid (C17), 99 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen) - Tripalmitin, ca 90 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Palmitinsäuremethylester, 99 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Cholesterylpalmitat, 91 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Stammlösung: Standardgemisch mit 60 mg/ml in Chloroform, Lagerung im Kühlschrank
GC-Analyse
FAME-Mix Referenzstandards mit 99,99 % Reinheit:
- No. 463, 674 (NU-CHE PREP, INC., Elysian, U.S.)
- BR2, BR4, ME 93 (Larodan, Malmö, Sweden)
- Alpenmilch
ANHANG B: METHODEN
XV
ANHANG B: METHODEN
B.1 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes
Kombinierte Extraktion von Carotinoiden und Vitamin E:
Jeweils 300 mg der gemahlenen Probensubstanz wurden in einer Dreifachbestimmung in 50-ml-Erlen-
meyerkolben mit Schliff eingewogen. Anschließend wurden zu jeder Probe 5 ml HPLC-Wasser gegeben,
gründlich gemischt und 5 min quellen gelassen. Dann wurden 200 mg Magnesiumhydroxidcarbonat,
200 mg Natriumsulfat, jeweils 100 µl der internen Standards (β-apo-8‘-Carotinal und α-Tocopherol-
acetat) sowie 40 ml MeOH/THF (1/1, v/v, + 0,1 % BHT) zugegeben. Natriumsulfat sollte das Wasser
binden und damit aus der Probe entfernen. Magnesiumhydroxidcarbonat hatte Pufferfunktion. Diese
Probenlösung wurde 5 min am Ultra-Turrax im Eisbad extrahiert. Der Überstand wurde über einen
Büchnertrichter durch einen Filter Nr. 390 unter Vakuum filtriert. Die Extraktion des Rückstandes mit ca.
40 ml Lösungsmittel und anschließender Filtration wurden zweimal wiederholt. Die vereinigten Filtrate
wurden in einen 250-ml-Braunglas-Rundkolben überführt und im Rotationsverdampfer unter reduzier-
tem Druck bei 30-35 °C bis auf ca. 10 ml eingeengt. Diese Lösung wurde in braune 50-ml-Spitzkolben
überführt und bis zur Trockne eingedampft. Am Ende des Einengens wurde 1 ml Ethanol in den Spitz-
kolben gegeben, um eventuell noch vorhandenes Wasser aus dem Extrakt zu entfernen und um den
Siedepunkt herabzusetzen. Der Rückstand wurde anschließend mehrere Male mit wenig Ethanol im
Ultraschallbad gelöst, in einen 5-ml-Maßkolben überführt und mit Ethanol auf 5 ml aufgefüllt. Diese
Lösung wurde in Zentrifugengläser umgefüllt und 5 min mit 4 400 U/min zentrifugiert. Für die
Carotinoid-Analyse wurde von dem Überstand 1 ml in Reaktionsgefäße abgefüllt und nochmals 2 min
mit 14 000 U/min zentrifugiert. Dieser Überstand wurde in Braunglas-Vials gefüllt. Für die Vitamin-E-
Analyse wurden von dem obigen Überstand aus den Zentrifugengläsern 200 µl in Reaktionsgefäße
abgefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit Stickstoff abgeblasen und der Rückstand in 800 µl
n-Hexan/Methyl-tert-Butylether (MtBE) (98/2, v/m) im Ultraschallbad gelöst. Dieser Extrakt wurde
ebenfalls 2 min mit 14 000 U/min zentrifugiert und der Überstand in Braunglas-Vials gefüllt.
B.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität
Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen Extrakten:
a) Extraktion mit 70 %igem Ethanol
Es wurden in einer Dreifachbestimmung 75 mg der Samensubstanz in 15 ml-Falcontubes eingewogen
und etwa 8 Glasperlen sowie 1 ml 70 %iger Ethanol dazugegeben. Das Falcontube wurde daraufhin in-
tensiv geschüttelt und kurz ins Ultraschallbad getaucht. Es schloss sich eine Zentrifugation (4 400 U/min,
5 min) an. Der entstandene Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen und in ein 5 ml-
Maßkolben überführt. Diese Extraktionsschritte wurden zweimal wiederholt. Am Ende wurde der Maß-
kolben mit 70 %iger Ethanol bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Diese hydrophile Lösung
wurde bei - 30 °C eingefroren und am nächsten Tag für die entsprechenden antioxidativen Tests
(H-ORACFl, H-TEAC, Gesamtphenoltest nach FC) verwendet.
ANHANG B: METHODEN
XVI
b) Hydrolyse und Extraktion mit 70 %igem Ethanol
Der Rückstand der 1. Extraktion wurde hydrolysiert, indem zunächst 0,5 ml Salzsäure (1,0 mol/l) in das
Falcontube zugegeben und 30 s geschüttelt wurde. Diese Lösung wurde für 30 min bei 37 °C im Wasser-
bad inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 0,5 ml Natriumhydroxid-Lösung (2,0 mol/l in 75 %
MeOH). Auch diese Lösung wurde 30 s geschüttelt und für 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.
Anschließend wurde sie 30 s geschüttelt, mit 0,5 ml meta-Phosphorsäure (0,75 mol/l) versetzt,
nochmals 30 s geschüttelt und zentrifugiert (5 000 U/min, 5 min). Der Überstand wurde in einen 5 ml-
Maßkolben überführt, der Rückstand mit 0,5 ml 70 %igem Ethanol vermischt und zentrifugiert
(4 400 U/min, 5 min). Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt. Letztendlich wurde der Maßkolben
mit 70 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Diese hydrolysierte,
hydrophile Lösung wurde bei - 30 °C eingefroren und am nächsten Tag für die entsprechenden
antioxidativen Tests (H-ORACFl, H-TEAC, Gesamtphenoltest nach FC) verwendet.
c) Extraktion mit n-Hexan
Der erhaltene Rückstand der 2. Extraktion wurde vollständig getrocknet, indem er ein bis zwei Tage
untern dem Abzug an der Luft trocknete und mit Stickstoff abgeblasen wurde. Zu dem vollständig
trockenen Rückstand wurde 1 ml n-Hexan gegeben, geschüttelt und zentrifugiert (4 400 U/min, 5 min)
an. Der entstandene Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen und in ein 5 ml-Maßkol-
ben überführt. Diese Extraktionsschritte wurden zweimal wiederholt. Am Ende wurde der Maßkolben
mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Dieser lipophile Extrakt wurde sogleich
für den entsprechenden antioxidativen Test (αTEAC) verwendet.
Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu:
Der Gesamtphenoltest wurde in Makroküvetten umgesetzt, in die jeweils 300 µl Probe, 1 500 µl Folin-
Ciocalteu-Phenol-Reagenz (1:10 mit HPLC-Wasser verdünnt) und 1 200 µl Natriumcarbonat-Lösung
gegeben wurden. Die Küvetten wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen.
Anschließend wurde deren Extinktion gegen Luft bei 750 nm gemessen. Mit Wasser (als Blindwert) und
den 5 Gallussäure-Kalibrierstandards wurde in derselben Weise verfahren. Zur Kalibrierung wurde aus
einer 2 mM Gallussäure-Stammlösung folgende Verdünnungsreihe erstellt:
Verdünnung Gallussäure-Konzentration
[mg/l] [µM]
1:40 8,51 50
1:20 17,01 100
1:10 34,02 200 1:5 68,05 400
1:4 85,06 500
Für die Bestimmung der Gesamtphenolkonzentrationen wurden die Blindwertabsorptionen von den
Standard- und Probenabsorptionen subtrahiert. Anhand der Gallussäure-Standardreihe wurden die die
Gesamtphenolmengen für die Proben berechnet. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als Gallussäure-
Äquivalente (GAE) in mg/100 g Probe.
ANHANG B: METHODEN
XVII
H-TEAC-Test:
Der H-TEAC-Test wurde in Halbmikroküvetten durchgeführt. Um das stabile Radikalkation ABTS•+ zu
erzeugen, wurden 10 ml einer 7 mM ABTS-Stammlösung mit 10 ml einer 2,45 mM Kaliumperoxodisulfat-
Lösung vermischt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur in einer dunklen Flasche aufbewahrt.
Innerhalb von 24 h kam es zur vollständigen Bildung des ABTS-Radikals [145]. Das Radikal ist in dieser
Form für mehr als zwei Tage stabil, wenn es im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert wird [69]. Diese
sogenannte ABTS•+-Arbeitslösung I wurde anschließend im Kühlschrank aufbewahrt. Die ABTS•+-
Arbeitslösung II wurde für den Gebrauch täglich frisch hergestellt. Dafür wurde die Arbeitslösung I mit
Phosphatpuffer (75 mM, pH 7,4) verdünnt, bis eine Absorption von 0,7 ± 0,05 bei 730 nm erreicht war.
Diese Lösung wurde ca. 2 h bei Raumtemperatur in einer dunklen Flasche stehen gelassen und vor
Testbeginn nochmals auf ihre korrekte Extinktion überprüft. Für die Messung wurden 100 µl jeder Probe
in ein 1,5-ml-Tube pipettiert. Anschließend wurden 1000 µl ABTS•+-Arbeitslösung II zugegeben und der
Zeitmesser gestartet. Das Tube wurde kurz geschüttelt und die Lösung vollständig in Halbmikroküvetten
überführt. Nach insgesamt 2 min wurde die Extinktion bei 734 nm gemessen. In derselben Art und
Weise wurden Wasser (als Blindwert) und jeder Trolox-Kalibrierstandard gemessen. Zur Kalibrierung
wurde eine 2,5 mM Trolox-Stammlösung zunächst 1:10 mit HPLC-Wasser verdünnt und daraus folgende
Verdünnungsreihe erstellt:
Verdünnung Trolox-Konzentration (µM)
1:20 12,5
1:10 25
1:5 50
1:2 125
1:1 250
Für die Auswertung wurden zunächst die Standard- und Probenabsorptionen von den Blindwertabsorp-
tionen subtrahiert. Anhand der Trolox-Standardreihe wurden die TEAC-Werte für die Proben berechnet.
Die Angabe der TEAC-Werte der Proben erfolgt als Trolox-Äquivalente (TE) in µmol/100 g Probe.
H-ORACFl-Test:
Der ORAC-Test wurde auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt. Fluoreszein, welches in Phos-
phatpuffer (75 mM, pH 7,4) gelöst wurde, diente als fluoreszierender Indikatorfarbstoff. Eine 1,2 µM
Fluoreszein-Arbeitslösung II wurde für die Analysen stets frisch aus einer 120 µM Arbeitslösung I, die im
Kühlschrank aufbewahrt wurde, hergestellt. Im BMG FluoStar Optima wurden Fluoreszenzfilter mit einer
Wellenlänge von 490 nm (Anregung) und 520 nm (Emission) verwendet. Zunächst wurden jeweils 10 µl
Wasser (als Blindwert und Negativkontrolle), 10 µl jedes Trolox-Kalibrierstandards und 10 µl jeder Probe
in je vier Wells pipettiert. Anschließend wurden 25 µl Fluoreszein-Arbeitslösung II und 100 µl 75 mM
Phosphatpuffer (pH 7,4) zugegeben, sodass alle Reaktionen in dem Phosphatpuffer abliefen. Die Mikro-
titerplatte wurde für 10 min im Plattenlesegerät auf 37 °C temperiert. Durch die Zugabe von 150 µL
frisch hergestellter und eisgekühlter 129 mM AAPH-Stammlösung wurde die Reaktion gestartet. Die
Fluoreszenzintensität wurde jede Minute für 4 h bei 37 °C gemessen. Zur Kontrolle der Photostabilität
des Fluoreszeins wurden 2 Wells (Negativkontrolle) mit 150 µl Phosphatpuffer anstatt AAPH-Stamm-
lösung befüllt. Aus einer 2,5 mM Trolox-Stammlösung wurde folgende Verdünnungsreihe erstellt:
ANHANG B: METHODEN
XVIII
Verdünnung Trolox-Konzentration (µM)
1:25 0,1
1:5 0,5
1:2,5 1,0
1:1,5 1,5
1:1,25 2,0
Zur Berechnung der ORAC-Werte wurde zunächst die relative Fluoreszenz nach jeder Minute bestimmt.
Dabei wurde die Fluoreszenzintensität der Probe, der Standards und des Blindwertes durch die
Fluoreszenzintensität des Mittelwertes der Negativkontrolle dividiert. Im Anschluss wurde die Area
Under the Curve (AUC) der Proben, der Standards und des Blindwertes nach folgender Formel berech-
net:
AUC = 1 + �f1+ f2+ f3+ …. + fi
f0 (10)
Dabei entspricht f0 der relativen Fluoreszenz bei 0 min und fi der relativen Fluoreszenz bei dem Zeitpunkt
i. Daraus wurde die Netto-AUC berechnet, indem die AUC des Blindwertes von der AUC der jeweiligen
Probe bzw. des Standards abgezogen wurde.
AUCnet = AUCProbe/Standard - AUCBW (11)
Die Netto-AUC wurde gegen die Trolox-Konzentrationen aufgetragen und eine quadratische Regression
durchgeführt. Anhand dieser Trolox-Regression wurden die ORAC-Werte für die Proben errechnet und
als Trolox-Äquivalente (TE) in mmol/100 g Probe angegeben.
αTEAC-Test:
Für den αTEAC-Test wurde zunächst eine gute Spatelspitze ABTS in einigen ml Phosphatpuffer (75 mM,
pH 7,4) gelöst. Diese Stammlösung wurde über ein Filterpapier, auf dem sich ein Löffel Mangandioxid
befand, laufen gelassen und mit einigen ml Phosphatpuffer nachgewaschen. Dabei bildete sich das
grüne ABTS•+. Im Anschluss wurde diese sogenannte ABTS•+-Arbeitslösung I über einen Büchnertrichter
durch einen Filter Nr. 390 unter Vakuum filtriert. Für die ABTS•+-Arbeitslösung II, die für den Versuch
stets frisch hergestellt wurde, wurde die Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnt bis eine Absorp-
tion von 0,7 ± 0,05 bei 730 nm erreicht war. Diese Lösung wurde ca. 2 h bei Raumtemperatur in einer
dunklen Flasche stehen gelassen und vor Testbeginn nochmals auf ihre korrekte Extinktion überprüft.
Für die Kalibrierung wurde eine α-Tocopherol-Stammlösung in einen 2-ml-Maßkolben pipettiert und
unter Stickstoffstrom abgeblasen. Anschließend wurde der Kolben mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt
und geschüttelt. Von dieser Lösung wurde zur Erstellung einer Kalibriergerade eine Verdünnungsreihe
wie folgt hergestellt:
Verdünnung α-Tocopherol -Konzentration (µM)
1:100 2,42
1:50 4,85
1:25 9,70
1:10 24,24
1:5 48,48
ANHANG B: METHODEN
XIX
Die photometrische Konzentrationsbestimmung der α-Tocopherol-Stammlösung wurde an dem
entsprechenden Versuchstag durchgeführt. Die Extinktionsmessung erfolgte in Mikro-Quarzküvetten bei
dem Absorptionsmaximum λmax von 292 nm. Mit Hilfe des spezifischen Extinktionskoeffizienten
(E1%,1cm = 75,8) von α-Tocopherol wurde die Konzentration nach folgender Formel berechnet:
c [g/100 ml] = E
E1cm1% · VF (5)
VF: Verdünnungsfaktor
Für die Messungen wurden je 100 µl Probe, Blindwert (n-Hexan) bzw. α-Tocopherol-Standard in ein
Tube pipettiert, anschließend 1 000 µl der ABTS•+-Arbeitslösung II zugegeben und der Zeitmesser gestar-
tet. Das Tube wurde 30 s geschüttelt, dessen Inhalt in eine Halbmikroküvette überführt und diese 30 s
mit 1 200 U/min zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Nach insgesamt 2 min wurde die Extinktion bei
734 nm gemessen.
Aus der linearen Regression der α-Tocopherol-Kalibrierung wurden die TEAC-Werte berechnet. Deren
Angabe erfolgte in µmol αTE/100 g Probe.
B.3 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung
Fettextraktion nach Folch:
Zu der gemahlenen Probensubstanz von 300 mg in einem Pyrexröhrchen wurden zunächst 3 ml
Methanol gegeben und 2 min am Ultra-Turrax homogenisiert. Anschließend wurde die zweifache Menge
Chloroform (6 ml) zugegeben und weitere 2 min homogenisiert. Das Pyrexröhrchen wurde 30 min
geschüttelt und mit 3 ml einer 2 %igen Natriumchlorid-Lösung versetzt. Diese Lösung wurde gründlich
mit einem Vortexer geschüttelt und mit 4 000 U/min für 5 min zentrifugiert. Dadurch entstanden zwei
Phasen. Dazwischen befand sich ein Pellet aus den Tomatensamen. Die obere Phase enthielt alle lipid-
unlöslichen, hydrophilen Substanzen während die untere Phase nahezu alle Lipide enthielt [94]. Nach
FOLCH et al. (1957) besteht die obere Phase aus Chloroform/Methanol/Wasser in dem ungefähren
Verhältnis 3:48:47 (v/v/v). Die Anteile in der unteren Phase betragen in etwa 86:14:1 (v/v/v) [94]. Die
untere Chloroformphase wurde abgenommen, mit Natriumsulfat vom Wasser befreit und in ein 10-ml-
Schliffröhrchen überführt. Diese Probenlösung wurde bei 30 °C unter Stickstoffstrom eingeengt. Die
resultierenden Fettmengen wurden zurückgewogen, sodass ein ungefährer Fettanteil in den
Tomatensamen abgeschätzt werden konnte. Dies ist allerdings keine exakte Methode zur quantitativen
Fettbestimmung. Für eine komplette Fettausbeute hätte ein Salzsäureaufschluss durchgeführt werden
müssen.
Methylierung:
Aus den extrahierten Fettmengen wurden mit n-Hexan 2 %ige Lösungen erstellt und diese 5 min auf
einem Reagenzglasschüttler vermischt. Anschließend wurden 0,5 ml Natriummethylat hinzugegeben
und weitere 5 min geschüttelt. Eine Zugabe von Natrium-Hydrogensulfat-Monohydrat neutralisierte das
Gemisch, welches nochmals 5 min geschüttelt und im Anschluss 5 min mit 4 000 U/min zentrifugiert
wurde. Von der oberen Phase wurden 2x150 µl abgenommen und in je ein Vial überführt.
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XX
ANHANG C: ANALYSENDATEN
Tab. C1 Wassergehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c)
Wassergehalt (in %)
a b c Mw Stabw
Waltinger 7,53 8,17 8,02 7,91 0,34
Red Currant 6,52 7,12 7,38 7,01 0,44
Tab. C2 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der ermittelten Carotinoide in
Ethanol (nach BRITTON 1995 [146])
Carotinoid-Standardsustanzen λmax (nm) E1cm1%
(all-E)-Lutein 445 2550
(all-E)-Zeaxanthin 450 2540
Tab. C3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für Lutein und Zeaxanthin für C30-Develosil RPAQUEOUS-
Analysensäule (250 x 4,6 mm; 5 μm)
Carotinoid-Standardsubstanzen Nachweisgrenze (µg/ml) Bestimmungsgrenze (µg/ml)
(all-E)-Lutein 0,0059 0,0197
(all-E)-Zeaxanthin 0,0063 0,0210
Tab. C4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c) (in
µg/100 g)
(all-E)-Lutein (all-E)-Zeaxanthin Gesamtcarotinoide
Waltinger
a 55,2 91,2 146,4
b 61,8 104,3 166,1
c 59,4 104,7 164,0
Mw 58,8 100,1 158,9
Stabw 3,4 7,7 10,8
Red Currant
a n.q. 41,3 41,3
b n.q. 40,1 40,1
c n.q. 32,5 32,5
Mw - 38,0 38,0
Stabw - 4,8 4,8
Tab. C5 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der Tocopherole und Tocotrienole
in Ethanol (nach WERNER 2010 [38], FRANKE et al. [147])
Vitamin-E-Standardsubstanzen λmax (nm) E1cm1%
α-Tocopherol 292 75,8
γ-Tocopherol 298 91,4
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XXI
Tab. C6 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für α- und γ-Tocopherol für Knauer Eurospher-100 DIOL-
Analysensäule (250 x 4,0 mm; 7 µm)
Vitamin-E-Standardsubstanzen Nachweisgrenze (µg/ml) Bestimmungsgrenze (µg/ml)
α-Tocopherol 0,0053 0,0177
γ-Tocopherol 0,0071 0,0238
Tab. C7 Tocopherolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c)
α-Tocopherol (mg/100 g)
γ-Tocopherol (mg/100 g)
Gesamttocopherole (µmol/100 g)
Waltinger
a 0,68 30,9 74,4
b 0,68 34,4 82,5
c 0,67 32,7 78,7
Mw 0,68 32,7 78,5
Stabw 0,01 1,7 4,0
Red Currant
a 0,55 17,3 42,0
b 0,52 18,1 43,9
c 0,62 17,0 41,5
Mw 0,56 17,5 42,5
Stabw 0,05 0,6 1,3
Tab. C8 Vitamin-E-Aktivität der Tocopherole und Tocotrienole (nach FRANKE et al. 2010 [84])
Vitamin-E-Verbindung mg αTE/mg Substanz
α-Tocopherol 1,00
β-Tocopherol 0,40
γ-Tocopherol 0,10
δ-Tocopherol 0,01
α-Tocotrienol 0,30
β-Tocotrienol 0,05
γ-Tocotrienol 0,01
δ-Tocotrienol keine Angabe
Tab. C9 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung
(a,b,c)
Gesamtphenolgehalt (mg GAE/100 g)
VF a b c Mw Stabw Mw aller
VF Stabw
Wal
tin
ger
vor
Hydrolyse
1 176,6 173,4 158,4 169,5 9,7
167,6 1,7 2 175,9 162,6 159,7 166,1 8,6
5 167,9 170,9 163,0 167,3 4,0
nach
Hydrolyse
1 196,7 202,3 200,3 199,8 2,8
203,2 3,4 2 204,0 201,9 203,8 203,2 1,2
5 206,5 199,4 213,9 206,6 7,3
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XXII
gesamt
1 373,4 375,7 358,6 369,2 9,2
370,8 2,7 2 379,9 364,4 363,6 369,3 9,2
5 374,4 370,4 376,9 373,9 3,3 R
ed
Cu
rran
t
vor
Hydrolyse
1 212,9 194,7 206,2 204,6 9,2
204,8 4,7 2 213,5 204,8 210,7 209,7 4,5
5 206,1 196,3 198,2 200,2 5,2
nach
Hydrolyse
1 298,3 300,8 295,1 298,1 2,8
309,4 9,9 2 311,2 322,7 307,2 313,7 8,1
5 303,8 315,9 329,9 316,5 13,1
gesamt
1 511,2 495,4 501,4 502,7 8,0
514,3 10,6 2 524,7 527,5 517,9 523,4 4,9
5 509,9 512,2 528,2 516,7 10,0
Tab. C10 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem H-TEAC-Test
Hydrophile AOC (µmol TE/100 g)
VF a b c Mw Stabw
Wal
tin
ger
vor Hydrolyse
1 1203,7 1154,9 1150,6 1169,7 29,5
2 1324,6 1287,9 1231,4 1281,3 46,9
5 1447,4 1429,1 1419,5 1432,0 14,2
nach
Hydrolyse
1 1005,2 1006,7 1009,1 1007,0 2,0
2 1242,9 1227,8 1289,4 1253,4 32,1
5 1473,4 1404,7 1470,1 1449,4 38,8
gesamt
1 2208,9 2161,6 2159,7 2176,7 27,9
2 2567,4 2515,7 2520,8 2534,7 28,5
5 2920,8 2833,8 2889,6 2881,4 44,1
Re
d C
urr
ant
vor
Hydrolyse
1 1502,7 1481,1 1502,7 1495,5 12,5
2 1811,0 1786,1 1820,6 1805,9 17,8
5 2064,2 2033,3 2031,8 2043,1 18,3
nach
Hydrolyse
1 1422,6 1437,7 1449,7 1436,7 13,6
2 1827,1 1820,6 1858,2 1835,3 20,1
5 2247,4 2240,0 2281,8 2256,4 22,3
gesamt
1 2925,4 2918,9 2952,4 2932,2 17,8
2 3638,2 3606,6 3678,8 3641,2 36,2
5 4311,6 4273,3 4313,6 4299,5 22,8
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XXIII
Tab. C11 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem ORAC-Test
Hydrophile AOC (mmol TE/100 g)
VF a b c Mw Stabw W
alti
nge
r
vor
Hydrolyse
1 6,27 7,39 7,76 7,14 0,77
2 8,09 8,96 9,00 8,68 0,52
5 12,45 13,91 13,88 13,41 0,83
nach
Hydrolyse
1 9,04 a.K. a.K. - -
2 10,32 9,31 11,18 10,27 0,93
5 12,92 14,24 13,25 13,47 0,69
gesamt
1 15,31 - - - -
2 18,41 18,27 20,18 18,95 1,07
5 25,37 28,15 27,13 26,88 1,41
Re
d C
urr
ant
vor
Hydrolyse
1 10,26 15,12 9,96 11,78 2,90
2 12,40 12,87 12,63 12,63 0,24
5 18,22 19,65 18,51 18,79 0,75
nach
Hydrolyse
1 a.K. a.K. a.K. - -
2 16,56 17,46 14,53 16,18 1,50
5 19,40 19,47 17,78 18,88 0,96
gesamt
1 - - - - -
2 28,95 30,33 27,16 28,81 1,59
5 37,62 39,12 36,28 37,67 1,42
a.K. Werte außerhalb der Kalibrierung
Tab. C12 Lipophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem αTEAC-Test
Lipophile AOC (µmol αTE/100 g)
VF a b c Mw Stabw
Waltinger
1 34,30 41,33 48,34 41,33 7,02
2 39,47 81,04 73,92 64,81 22,23
5 79,30 120,75 198,87 132,97 60,71
Red Currant
1 48,91 56,33 64,17 56,47 7,63
2 92,21 110,56 126,90 109,89 17,36
5 203,03 227,30 338,10 256,14 72,00
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XXIV
Tab. C13 Summenformel, Trivialname, Abkürzung und Einordnung aller detektierten Fettsäuren
Summenformel chemische Bezeichnung Trivialname Klassifizierung
Sättigungsgrad Position der Doppelbindung
C-14:0 Tetradecansäure Myristinsäure SFA
C-15 aiso 12-Methyltetradecansäure SFA
C-15:0 Pentadecansäure SFA
C-16:0 iso 14-Methylpentadecansäure iso-Palmitinsäure SFA
C-16:0 Hexadecansäure Palmitinsäure SFA
C-16:1 c9 Delta-9-cis-Hexadecensäure Palmitoleinsäure MUFA
C-17:0 iso 15-Methylhexadecansäure 15-Methylpalmitinsäure SFA
C-16:2 c9,12 PUFA
C-17:0 aiso 14-Methylhexadecansäure 14-Methylpalmitinsäure SFA
C-17:0 Heptadecansäure Margarinsäure SFA
C-18:0 iso 16-Methylheptadecansäure SFA
C-18:0 Octadecansäure Stearinsäure SFA
C-18:1 t10 MUFA
C-18:1 c9 Delta-9-cis-Octadecensäure Ölsäure MUFA omega-9
C-18:1 c11 Delta-11-cis-Octadecensäure cis-Vaccensäure MUFA
C-18:1 c13 MUFA
C-18:2 c9,c12 Delta-9-cis, 12-cis-Octadecadiensäure Linolsäure PUFA omega-6
C-19:0 aiso 16-Methyloctadecansäure SFA
aC-18:3 c9,c12,c15 Delta-9-cis, 12-cis, 15-cis-Octadecatriensäure α-Linolensäure PUFA omega-3
C-20:0 Eicosansäure Arachinsäure SFA
C-20:1 c11 Delta-11-cis-Eicosensäure Gondosäure MUFA omega-9
C-20:2 c11,c14 Delta-11-cis, 14-cis-Eicosadiensäure PUFA omega-6
C-22:0 Docosansäure Behensäure SFA
C-22:1 c11 Delta-11-cis-Docosensäure Cetoleinsäure MUFA
C-22:2 c13,c16 Delta-13-cis, 16-cis-Docosadiensäure PUFA omega-6
C-23:0 Tricosansäure SFA
C-24:0 Tetracosansäure Lignocerinsäure SFA
C-25:0 Pentacosansäure SFA
C-26:0 Hexacosansäure Cerotinsäure SFA
ANHANG C: ANALYSENDATEN
XXV
Tab. C14 Fettsäureverteilung in den beiden Samensorten (in %)
Symbol Waltinger Red Currant
C-14:0 0,092 ± 0,002 * 0,062 ± 0,001
C-15:0 aiso) 0,005 ± 0,001 0,007 ± 0,001
C-15:0 0,012 ± 0,001 * 0,018 ± 0,001
C-16:0 iso 0,049 ± 0,002 * 0,025 ± 0,003
C-16:0 13,394 ± 0,013 13,37 ± 0,078
C-16:1 c9 0,226 ± 0,005 * 0,147 ± 0,006
C-17:0 iso 0,010 ± 0,001 * 0,006 ± 0,002
C-16:2 n4 0,017 ± 0,002 * 0,011 ± 0,002
C-17:0 aiso 0,136 ± 0,002 * 0,241 ± 0,003
C-17:0 0,081 ± 0,001 * 0,093 ± 0,001
C-18:0 iso 0,348 ± 0,004 * 0,167 ± 0,003
C-18:0 4,006 ± 0,036 * 4,665 ± 0,012
C-18:1 t10 0,014 ± 0,002 0,015 ± 0,002
C-18:1 c9 18,128 ± 0,049 * 19,858 ± 0,058
C-18:1 c11 0,748 ± 0,009 * 0,621 ± 0,002
C-18:1 c13 0,015 ± 0,002 * 0
C-18:2 c9,c12 59,180 ± 0,067 * 57,011 ± 0,062
C-19:0 aiso 0,040 ± 0,002 * 0,085 ± 0,002
aC-18:3 c9,c12,c15 2,451 ± 0,004 * 2,302 ± 0,009
C-20:0 0,480 ± 0,012 * 0,581 ± 0,004
C-20:1 c11 0,083 ± 0,004 * 0,103 ± 0,001
C-20:2 c11,c14 0,012 ± 0,003 0,011 ± 0,000
C-22:0 0,146 ± 0,011 * 0,184 ± 0,002
C-22:1 c11 0,016 ± 0,004 * 0,04 ± 0,002
C-22:2 c13,c16 0,012 ± 0,003 * 0,038 ± 0,005
C-23:0 0,018 ± 0,006 0,020 ± 0,004
C-24:0 0,171 ± 0,001 * 0,204 ± 0,003
C-25:0 0,033 ± 0,002 * 0,027 ± 0,002
C-26:0 0,077 ± 0,025 0,088 ± 0,025
∑ 100,0 100,0
Summe
SFA 19,099 ± 0,090 * 19,843 ± 0,082
MUFA 19,230 ± 0,0420 * 20,784 ± 0,051
PUFA 61,671 ± 0,067 * 59,373 ± 0,056
Summe C-18:1 t-FA 0,014 ± 0,002 0,015 ± 0,002
C-16:0/C-18:1cis9 0,739 ± 0,003 * 0,673 ± 0,006
C-16:0/C-18:1 ges. 0,738 ± 0,003 * 0,673 ± 0,006
Summe ω-3 2,451 ± 0,004 * 2,302 ± 0,009
Summe ω-6 59,203 ± 0,063 * 57,060 ± 0,058
ω6/ω3 24,154 ± 0,024 * 24,790 ± 0,115
SC-FA (C-4>C-8) 0,000 0,000
MC-FA (C-10>C-14) 0,092 ± 0,002 * 0,062 ± 0,001
* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten (p < 0,05, t-Test)
Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Ich versichere, dass alle Ausführungen, die anderen Schriften entnommen wurden, kenntlich gemacht
sind und die Arbeit in gleicher oder ähnlicher Fassung noch nicht Bestandteil einer Studien- oder
Prüfungsleistung war.
Jena, September 2013 ……………....…….………………………..
Unterschrift
Danksagung
Mein persönlicher Dank gilt an erster Stelle PD Dr. Volker Böhm für die fachliche Unterstützung und
Betreuung meiner Arbeit. Ich bedanke mich außerdem für die Bereitstellung des Themas und damit
gleichzeitig bei Herrn Hoser, der die Tomatensamen für die Analysen zur Verfügung stellte.
Den Mitarbeitern sowie Doktoranden, Diplomanden und Master-Studenten der AG Bioaktive
Pflanzenstoffe möchte ich für die gute Zusammenarbeit und Unterstützung im Laboralltag danken.
Carsten Rohrer danke ich besonders für die Hilfe bei der Fettsäureanalyse. Christin Arnold danke ich für
die Beantwortung von einigen statistischen Fragestellungen.
Weiterhin gilt meiner Familie und nahen Freunden, die mich beim Schreiben der Arbeit stets
unterstützten und Geduld zeigten, ein großer Dank.