Analytické metódy

Serológia – súčasť imunológie, zaoberajúca sa reakciami medzi antigénom a

protilátkou, základná diagnostická metóda v imunológii

Serologické metódy – zisťujú prítomnosť protilátok zo séra pacienta proti

infekčnému agens

Sérum – tekutá nebunečná zložka krvi, ktorá neobsahuje zrážacie faktory krvi

Plazma – na rozdiel od séra tieto faktory obsahuje.

Sérová skúmavka s gelom Skúmavka s EDTA

Vyšetrenie parametrov humorálnej imunity

Jednoduchá radiálna imunodifuze

Najstaršia imunochemická metóda - stanovenie imunoglobulínov, komplementu

Tvorba komplexu Ag - Ab v prostredí agarózy (0,5 – 2%)

Aplikace antigénu do jamiek v gelu, ktorý obsahuje Ab.

Podľa koncentrácie Ag vznikajú precipitačné prstence

Priemer prstenca precipitátu je úmorný množstvu vyšetrovaného Ag

Dvojitá imunodifuzeDo jamiek sa aplikuje ako Ag tak aj Ab, ktoré difundujú proti sebe.

Stanovenie funkcie a zložiek komplementu

Vyšetrenie C3 a C4 zložky

C3 - najvyšia sérová koncentrace z komplementových proteínov.

Klúčová komponenta komplementovej kaskády

Chová sa ako proteín akútnej fáze, časté zvýšené koncentrace

C4 - sa chová podobne ako C3

PATOLOGIE - PATOLOGIE +

imunokomplexové choroby (zvl. SLE)bakteriální endokarditiskryoglobulinémiehypergamaglobulinémievrozená deficiencehereditární angioedém (HAE)

akutní a chronické záněty

Vyšetrenie CH50

Testuje sa aktivácia komplementu klasickou cestou, ktorý je schopný lyzovať baranie erytrocyty senzibilzované králičou protilátkou

Meria sa hemolýza erytrocytov po aktivácii komplementovej kaskády a vzniku MAC komplexu.

PATOLOGIE - PATOLOGIE +

hemokoagulace (DIC)vrozené deficience různých složekkomplementuhereditární angioedém (HAE)dále viz snížení C3 a C4

nemá diagnostický význam

Vyšetrenie C1 inhibítoru

Dôležitý regulačný proteín, inhibujíci komplementovú kaskádu

Význam stanovenia u chorých s heriditárnym angioneurotickým edénom (HAE)

Nefelometrie a turbidometrie

Bežné analytické metódy používané k stanoveniu veľkej skupiny proteínov

Merajú množstvo imunitných komplexov (špecifická vazba Ab s Ag)

Koncentrácia antigénu je úmerná rýchlosti tvorby zákalu a hustote zákalu

Nefelometria

Meria intenzitu rozptýleného svetla od komplexu Ag s Ab

Svetlo je merané detekčným systémom

Turbidometria

Optická metóda založená na meraní prechádzajúceho svetla

Meria sa stupeň zákalu - turbidita

Elektroforéza bielkovín

Separácie proteínov na základe ich pohyblivosti v elektrickom poli

Sérové proteíny sa rozdelia na 5 hlavných frakcií

Vyšetrenie pre zachytenie monoklonálneho imunoglobulínu – paraproteínu

V prípade pozitívneho nálezu sa robí jeho typizácia imunofixačným vyšetrením

--

++

LEGENDA: vzorek č. 3: susp. paraprotein vzorek č. 7, 8: susp. paraprotein ostatní vzorky: polyklonální imunoglobuliny (norm. nález)

Imunofixácia

Kombinácia elektroforézy s následnou imunoprecipitácoiu za použitia špecifických antisér

Citlivá metóda

Sérum sa rozdelí v gelu v niekoľkých dráhach

Do každej dráhy je nanesené iné antisérum (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda)

Imunoglobulíny tvoria s antisérom komplex (precipitát).

Bence Jensonova bielkovina - stanovuje sa v moči

- proteinúria voľných ľahkých reťazcov

--

++

IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA ZDRAVÉ OSOBY

LEGENDA: sloupec č. 1: elektroforéza séra

další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce

--

++

IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM

LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 6

sloupec č. 4 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgM

Vyšetrenia protilátok proti:

1, baktériám - Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum

2, vírusom - herpetické viry (HSV, EBV, CMV), HIV, hepatitída, klieštová encefalitída,

3, parazitom – Toxoplasma gondii, Toxocara canis

Aglutinace

- Špecifická protilátka naviazaná na nosič (latex, erytrocyt)- V prítomnosti antigénu vo vzorku = aglutinace (viditelná zrazenina)- Reakcia funguje aj pri dôkaze protilátky, v tomto prípade je naviazaný

na nosič antigén- Nevýhodou je nízka citlivosť

- Veľmi častá serologická metóda v imunológii

- Detekcia protilátok aj antigénu

Princíp- vazba antigénu na dno mikrotitračnej

doštičky- pridanie pacientskej vzorky (vazba

protilátky pri pozitivite)- pridaná druhá protilátka s naviazaním

enzýmom- pridanie substrátu, ktorý je štiepený

enzýmom naviazaným na druhej protilátke

- farebná reakcia a fotometrické meranie

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Nepriama Elisa

Sendvičová Elisa – na dno doštičky je naviazaná protilátka, detekujeme antigén prítomný vo vzorku

Mikrotitračná 96 – jamková doštička s 8-kanálovou pipetou a s príslušným roztokom konjugátu

Imunoblotting

Kombinácia elektroforézy a vizualizačných metód

Princíp

- Rozdelenie antigénu infekčného agens na gely (agarózový, polyakrilamidový)

podľa molekulovej hmotnosti

- Prenesenie jednotlivých antigénov na nitrocelulózovú membránu (fixovanie)

- Imunodetekcia (rovnaký postup ako pri Elise)

- Vyhodnotenie vzorku

- Často sa používa ako verifikačná metóda po Elise

- vysoká špecifickosť a citlivosť

Výsledok imunoblotu s pacientskými vzorkami

Schéma vírusu Hepatitídy B

Dynamika tvorby protilátok u hepatitídy B

Chlamydia trachomatis IP Referenčná hodnota IP

IgA 1,09 < 1,1

IgM 0,41 < 1,1

IgG 0,81 < 1,1

Chlamydia trachomatis IP Referenčná hodnota IP

IgA 1.64 < 1,1

IgM 0.31 < 1,1

IgG 0.92 < 1,1

Chlamydia trachomatis ELISA: Prítomné pozitívne protilátky triedy IgA proti Chlamydia trachomatis, nárůst hladiny protilátok z hraničnej hodnoty (1.9.2010) na pozitívnu. Hladiny IgG protilátok majú hraničnú hodnotu – může sa jednať o počiatok infekcie. Protilátky IgM nemusia byť tvorené. Při stanovení diagnózy je veľmi dộležitý klinický obraz choroby!

Diagnostika Chlamydia trachomatis - ELISA

1.odber

2. odber