Analisi degli alimenti(LMC-6: PACKAGING)

Giorgio Bonaga

Anno Accademico 2010/2011

Laurea Magistrale in

CHIMICA

ANALISI DEI CONTAMINANTIDA PACKAGING

Bisfenolo A (BPA)Bisphenol A (BPA) is 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane.

H3C CH3

OHHO

Sintetizzato per la prima volta dal chimico russo A.P. Dianin nel 1891, attualmente viene preparato per condensazione dell’acetone (da cui deriva la lettera A) con due equivalenti di fenolo. La reazione è catalizzata da una acido o da una resina di poliestere sulfonato.

BPA

polisteri

USI DEL BPA

polisulfonati

chetonipolieteri

inibitorepolimerizzazione

PVC

policarbonati

precursore di

ritardatoridi fiamma

BADGEBADGE is an acronym for Bisphenol A diglycidyl ether

H3C CH3

OOO O

BADGE

BADGE E DERIVATI REGOLAMENTATI

H3C CH3

OOO O

H3C CH3

OOO

HOOH

H3C CH3

OOHOOH OH

OH

H3C CH3

OOClOH OH

Cl

H3C CH3

OOO

ClOH

H3C CH3

OOClOH OH

OH

BADGE

BADGE.H2O

BADGE.2H2O

BADGE. HCl

BADGE.2HCl

BADGE.HCl.H2O

RESINE EPOSSIDICHE

resinapigmentisolventi

agenti dicross-linking

resinaepossidic

a

Struttura di resina epossidica:

Sintesi di resina epossidica:

H2C CH2 CH2

O

H2C CH OCH2 CCH3

CH3

O CH2 CHOH

CH2 O

O

CCH3

CH3

O CH2 CH CH2

O

n

NaOH

CCH3

CH3

HO OH H2C CH2

OCH2 Cl+

bisphenol A epichlorhydrine

EPOXY EQUIVALENT WEIGHT (EEW) = quantità di resina espressa in grammi che contiene un grammo-equivalente di gruppo epossidico. L’equivalente epossidico determina anche lo stato fisico e la reattività della resina.

EEW 300 resine liquide la cui reattività dipende dall’elevata concentrazione di gruppi epossidici.

EEW > 300 resine solide la cui reattività è anche legata alla presenza di ossidrili secondari, la cui rilevanza aumenta con l’incremento del peso molecolare.

VANTAGGI E SVANTAGGI DELLE RESINE EPOSSIDICHE

VANTAGGI: i film hanno una notevole resistenza verso i principali agenti

chimici; eccellente resistenza all’abrasione e all’urto; eccezionale adesione a superfici di diversa natura; termostabilità nell’intervallo da -70°C a +100°C; quelle a basso peso molecolare non richiedono solventi per la loro

sintesi.

SVANTAGGI: i film sono abbastanza costosi; possono ingiallire ed opacizzare in presenza di radiazioni UV e a

contatto con l’ossigeno atmosferico; in condizioni spinte possono diventare fragili e il film si polverizza.

RESINE EPOSSI-FENOLICHE

Sono sintetizzate a partire da resine epossidiche e resine fenoliche. Le resine fenoliche sono polimeri generalmente termoindurenti, ottenuti dalla reazione del fenolo con la formaldeide. La reazione è una sostituzione elettrofila nella quale tre molecole di formaldeide sostituiscono gli atomi di idrogeno nelle posizioni orto e para del fenolo. Il 2,2,4-tris(idrossimetil)fenolo che, a sua volta, reagisce con altre molecole di fenolo con eliminazione di una molecola di acqua in ciascuna reazione. Il risultato netto è la condensazione di molecole di fenolo attraverso gruppi metilenici in posizione orto e para.

OH

**

*

CO

HH+ 3

OH

OHHO

OH

OH

*

**

OH

HO

OH

OH

*

**

RESINE EPOSSI-FENOLICHE

resineepossidich

e

catalizzatori

pigmenti

resinefenoliche

resineepossi-

fenoliche

La parte fenolica della resina conferisce le proprietà di resistenza verso acidi e solventi, mentre la pesina epossidica conferisce flessibilità, adesione e durezza. Per queste ragioni le resine epossi-fenoliche sono usate come rivestimento interno di cisterne, contenitori metallici e silos industriali.

VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AL BPA Presso la comunità scientifica le conseguenze dell’esposizione al BPA sono controverse:• sulla base delle conoscenze tossicocinetiche del BPA nel sangue umano (rapida biotrasformazione e velocissima escrezione) le modeste concentrazioni di BPA nel sangue umano non sono ritenute significative per la valutazione del rischio tossicologico

• a causa della rapida e completa escrezione di BPA somministrato per via orale, l’urina è il fluido biologico più idoneo a valutare l’esposizione al BPA.

Gli studi sulla tossicità del BPA risalgono circa all’anno 2000, ad eccezione di alcune ricerche sull’estrogenicità del BPA che risalgono agli anni ‘30.• il BPA non è genotossico, non è carcerogeno e studi ripetuti sulla dose tossica, che includono test di tossicità sulla riproduzione e crescita con un ampio intervallo di dosi, mostrano che gli effetti nocivi si manifestano soltanto ad una dose > 50 mg/Kg peso corporeo/giorno.

RESINE PER RIVESTIMENTI INTERNIDI BARATTOLI, SCATOLE, TUBI

Le resine epossidiche e epossi-fenoliche sono utilizzate come rivestimento interno di contenitori per alimenti.

SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO SMALTATO BIANCO

SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO TRASPARENTE

Resine epossidiche + TiO2 prodotti ittici (in acqua)pomodorimais

prodotti ittici (in olio)ortaggi verdisciroppi di fruttacibi per animali

Resine epossi-fenoliche

NovolaccheCon un rapporto aldeide: fenolo < 1 ed una catalisi acida si ottengono le novolacche, polimeri termoplastici perché costituiti da lunghe molecole lineari.

CH2 CH2H2C CH2 CH2

OH OH OH OH

ResoliCon un rapporto aldeide:fenolo > 1 ed una catalisi basica si ottengono i resoli, polimeri termoindurenti dalla struttura reticolare assimilabile a quella di una novolacca in cui residui di aldeide fanno da ponte tra due catene lineari.

CH2 CH2H2C CH2 CH2

OH OH OH OH

CH2 CH2

H2C CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

RESINE EPOSSI-FENOLICHE

(*) I. A. Lang et al.: J. Am. Med. Assoc., 300 (11), 1303-1310 (2008).

Gli studi relativi agli effetti di BPA a basso dosaggio non sono considerati sufficientemente convincenti per valutare il rischio dell’esposizione al BPA (EFSA, 2006).

La dose giornaliera tollerabile (tolerable daily intake = TDI) del BPA, basata sulla dose senza effetti nocivi osservati (no-observed-adverse-effect-level = NOAEL) divisa per un fattore di sicurezza (di incertezza) pari a 100, è stata posta a 0.05 mg/Kg p.c./giorno dall’AFC panel dell’EFSA (2006).

La United States Environmental Protection Agency (US EPA) ha calcolato per il BPA una dose di riferimento (reference dose = RfD) pari a 0.05 mg/Kg p.c./giorno, basata sulla riduzione di peso corporeo osservato in ratti alimentati con dosi di 50 mg/Kg p.c./giorno per 103 settimane, applicando un fattore di incertezza pari a 1000 alla dose con il minimo effetto osservato (lowest-observed-effect-level = LOAEL).

I. A. Lang et al. (*) hanno condotto il primo studio incrociato sugli effetti sulla salute umana dell’esposizione al BPA. Certi livelli di BPASono significativamente correlati a disturbi cardiovascolari, diabete e all’aumento anomalo del livello di alcuni enzimi epatici.

EUROPA - BPA FRANCIA

Ottobre 2008: l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) afferma che i contenitori di policarbonato usati nel packaging degli alimenti per l’infanzia non superano i livelli stabiliti dall’EFSA anche quando vengono scaldati in forno a microonde per meno di 10 minuti.

Marzo 2009: il Ministro francese della Sanità, Roselyne Bachelot-Narquin, in disaccordo con le conclusioni dell’AFSSA dichiara che “la decisone delle autorità Canadesi di vietare l’uso del BPA nella produzione delle babies bottles non è dovuta all’opinione pubblica, ma ai risultati di indagini scientifcamente attendibili”.

GERMANIA

Settembre 2008: il Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), cioè l’ Istituto Federale Tedesco per la valutazione del rischio, afferma che in considerazione delle ricerche di Lang, non ci sono ragioni significative per modificare la valutazione del rischio dell’esposizione al BPA.

PAESI BASSI

Novembre 2008: la Dutch Food and Consumer Product Safety Authority (VWA) afferma che le babies bottles di policarbonato non cedono livelli misurabili di BPA e, pertanyo, vanno considerate sicure.

SVIZZERA

Febbraio 2009: sulla base dei risultati di agenzie sanitarie pubbliche, il Swiss Federal Office for the Public Health afferma che l’assunzione di BPA attraverso gli alimenti e le bevande non rappresenta un rischio per i consumatori, compresi i neonati e i bambini. Nonostante ciò l’ufficio federale suggerisce un uso corretto delle babise bottles di policarbonato e fornisce un elenco di soluzioni alternative.

ITALIA

Novembre 2008: vengono considerati sicuri i livelli di BPA riportati da Lang e pertanto non vengono modificati i limiti della resina negli alimenti.

EFSA - BPA(European Food Safety Authority)

Novembre 2006: TDI (BPA) = 0.05 mg/Kg p.c./giorno

Luglio 2008: per gli adulti e i neonati l’esposizione al BPA ≤ alla TDI

Ottobre 2008: il parere dell’EFSA sulle ricerche di I. A. Lang stabilisce la mancanza di evidenze sulla relazione tra BPA e le patologie prese in considerazione. Di conseguenza l’EFSA non modifica la TDI

EFSA – BADGE( E DERIVATI REGOLAMENTATI)

Luglio 2004:

TDI(BADGE): 0.15 mg/Kg p.c./giorno

BADGE e cloridrin-derivati (BADGE.2HCl, BADGE.HCl e BADGE.H2O.HCl) non sono considerati pericolosi rispetto la

cancerogenicità e la genotossicità in vivo. Viene confermato il limite di 1.0 mg/Kg alimento.

MIGRAZIONE - NORMATIVA

• SML(s) = Limite di Migrazione Specifica (singolo)

Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, se non diversamente specificato.

• SML(T) = Limite di Migrazione Specifica (Totale)

Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, espresso come totale del gruppo di sostanze indicate.

Direttiva CE 82/711

MIGRAZIONE - NORMATIVA

TIPO DI PRODOTTO SIMULANTE ABBREVIAZIONE

alimenti acquosi(con pH > 4.5)

acqua distillata o acquadi qualità equivalente

Simulante A

alimenti acidi(con pH 4.5)

soluzione di acido aceticoal 3% (p/v)

Simulante B

prodotti alcolicisoluzione di etanolo

al 10% (v/v)Simulante C

alimenti a base di olioolio di oliva rettificato o

altri simulanti oleosiSimulante D

alimenti secchi no no

MIGRAZIONE - NORMATIVACONDIZIONI DI CONTATTO NEI CASI

PIU’ CRITICICONDIZIONI TEST

DURATA DEL CONTATTO TEMPO

t 5 minVEDERE CONDIZIONI

CRITICHE5 min < t 0.5 h 0.5 h0.5 h < t 1 h 1 h1 h < t 2 h 2 h2 h < t 4 h 4 h4 h < t 24 h 24 h

t > 24 h 10 daysTEMPERATURA DI CONTATTO(°C) TEMPERATUTA (°C)

T 5 5 5 < T 20 2020 < T 40 4040 < T 70 70

70 < T 100o temperatura di

reflusso100 < T 121 (*)121 < T 130 (*)130 < T 150 (*)

T > 150 (*)

(*) questa temperatura è usata solo con il simulante D. Per i simulanti A, B e C il test può essere sostituito con una prova condotta a 100°C o a temperatura di reflusso, per un periodo di tempo che è quattro volte maggiore di quello stabilito dalle norme generali.

BPADirettiva 2004/19/EC del 01/03/2004 SML(T) = 0.6 mg/Kg

BADGERegolamento (CE) N. 1895/2005 del 18/11/2005

SML(T) del BADGE e dei suoi derivati regolamentati:

la somma BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O non può

superare:

9 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento

9 mg/6 dm2

la somma BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O non

può superare:

1 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento

1 mg/6 dm2

MIGRAZIONE- LIMITI NORMATIVI

Simulante D

SML(s) di BPA, BADGE & derivati regolamentati, secondo quanto descritto nella Direttiva CE 82/711 e successive modificazioni, sulle scatole nuove

SCHEMA ANALITICO

ESTRAZIONE

LC-MS/MS RISULTATI

ALIMENTI

CONFRONTOMATRICI ALIMENTARI vs SIMULANTI

Simulanti A & B

ESTRAZIONE È stata utilizzata soltanto per gli alimenti e il simulante D.

Per l’estrazione del BPA, BADGE and i suoi derivati regolamentati l’estrazione solida-liquida-liquida seguita da clean-up con SPE è stata sostituita con il metodo QuEChERS

Il metodo QuEChERS è stato realizzato con DisQue Dispersive Sample Preparation Kit, contenente DisQue di estrazione (tubo 1) and DisQue di clean-up (tubo 2).

LC-MS/MS API 3200 (Applied Biosystems) triplo quadrupolo MS equipaggiato

con Turbo V Ionspray. Agilent (1200 Series), utilizzando una pompa binaria per HPLC

Colonna HPLC: Phenomenex® Luna 3 m C18 (2) 100 Å, 150 x 3.00 mm, con precolonna Security-Guard

Mass Spectrometry: Multiple Reaction Monitoring (MRM)

BPA

Sorgente: ESI (ioni negativi) Fase mobile: Solvente A = 10 mM acetato d’ammonio in ACN Solvente B = 10 mM ammonio acettao in H2O

Velocità flusso 0,5 ml/min

Tempo totale (min)

Flusso(ml/min)

A (%)

B (%)

0 0,5 70 30

3 0,5 70 30

4 0,5 90 10

5 0,5 70 30

8 0,5 70 30

BPA

BP

A

CHROMATOGRAMMA DI BPA STANDARD (500 ppb)

BADGE AND ITS REGULATED DERIVATIVES

Sorgente: ESI (ioni positivi)

Fase mobile: Solvent A = 0.5% acido formico in ACN Solvent B = 0.5% acido formico in H2O

Velocità flusso: 0,5 ml/min

Tempo totale(min)

Flusso(ml/min)

A (%)

B (%)

0,0 0,5 50 505,5 0,5 50 509,0 0,5 95 5

10,0 0,5 95 510,1 0,5 50 502,.0 0,5 50 50

BA

DG

E.H

2O

BA

DG

E.2

HC

l +

BA

DG

E.H

2O

.HC

l

BA

DG

E.2

H2O

BA

DG

E.H

Cl

BA

DG

E

CROMATOGRAMA DEI BADGEs (500 ppb)

RISULTATI - RECUPERI

COMPOUND 

 

LOD (ppb)

 

LOQ (ppb)

R E C O V E R I E S%

Tuna in water

Tuna in olive oil

TomatoesGreen Beans

Peaches in syrup

White Beans

Anchovy fillets in olive oil

BPA 8 16 55.8 ± 5.8 70.0 ± 8.5 74.3 ± 5.1 78.1 ± 5.3 92.0 ± 2.0 54.7 ± 3.4 68.9 ± 1.4

BADGE.2H2O 4 8121.0 ±

6.685.7 ± 11.5

87.5 ± 9.763.4 ± 11.3

82.0 ± 7.1 72.4 ± 3.7 67.0 ± 1.5

BADGE.HCl.H2O 16 32107.9 ±

13.7107.0 ±

2.588.8 ± 6.3 82.2 ± 5.1

95.0 ± 15.1

91.3 ± 5.4 90.3 ± 1.8

BADGE.2HCl 32 64102.2 ±

8.564.0 ± 4.3

104.5 ± 9.7

73.0 ± 9.0 81.0 ± 4.4 87.2 ± 5.5144.2 ±

4.4

BADGE.H2O 4 8 91.0 ± 5.0102.0 ±

2.686. 7± 6.3 97.6 ± 9.4 90.3 ± 9.6 85.2 ± 6.9

102.0 ± 10.1

BADGE.HCl 16 32 88.7 ± 7.8 60.4 ± 8.6103.0 ±

4.692.9 ± 3.6

105.0 ± 4.2

86.1 ± 5.5 87.0 ± 3.2

BADGE 4 8120.0 ±

4.372.0 ± 4.3

114.0 ± 1.7

102.7 ± 3.4

110.7 ± 9.0

92.5 ± 3.3101.0 ±

0.3

 COMPOUND RECOVERIES - SIMULANT D%

BPA 62.0 ± 1.8BADGE.2H2O 82.1 ± 2.4

BADGE.HCl.H2O 99.8 ± 1.6

BADGE.2HCl 67.7 ± 4.9

BADGE.H2O 118.0 ± 2.5

BADGE.HCl 80.0 ± 3.7BADGE 123.0 ± 2.7

FOOD vs SIMULANT A

BPA

BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O

FOOD vs SIMULANT B

BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O

BPA

FOOD vs SIMULANT D

BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O

BPA

HPLC - FLD

• Estrazione con ACN (24 h, T ambiente) di scatole nuove rivestite con resine epossidiche epossi-fenoliche;

• Analisi degli estratti in ACN e dgli estratti mediante QuEChERS di matrici alimentari;

• Colonna HPLC: Waters® X Terra, RP18 5 m, 150mm x 4,6 mm

• Fase mobile: ACN:H2O (50:50, v/v)

• Velocità flusso: 0,5 ml/min

• Diluizione del campione: 1:2 con H2O

• Volume iniettato: 20 µL

exc = 275 nm, em = 325 nm

ESTRATTO DI RESINE EPOSSIDICHE

BA

DG

E 2

H2O

BP

A

BA

DG

E

BA

DG

E.

H2O

?B

AD

GE.2

H2O

RISULTATI

CONCLUSIONI

I risultati relativi agli alimenti sono differenti da quelli relativi ai simulanti, con una discordanza significativa in più del 60% dei casi;

Il trend di migrazione del BPA è differente da quello dei BADGEs;

Il BADGE scompare negli alimenti in relazione alla durata delle sue interazioni con la matrice alimentare;

I test di conformità con i simulanti non sembrano essere in grado di valutare la migrazione reale;

È necessario realizzare le analisi della migrazione dalle resine sia con i simulanti che con gli alimenti reali.