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Técnicas Cromatográficas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR NORTE – RS
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL
Frederico Westphalen, Julho de 2013
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Fundamentos
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
• PRECIPITAÇÃO
• DESTILAÇÃO
• TROCA IÔNICA
• EXTRAÇÃO POR SOLVENTES
• CROMATOGRAFIA
• ELETROFORESE
Fundamentos
M. TSWEET (1903): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentospigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.
LCCromatografia a
Líquido
SFCCromatografia a
Fluido Supercrítico
GCCromatografia a
Gás
LCPlanar
LCColuna
CromatografiaPapel
CCDCromatografia
Camada Delgada
ColunaEmpacotada
Coluna "Open Tubular" Capilar
dc < 350 um
Coluna Capilarempacotadadc <= 350 um
Coluna Microbore
350 um < dc < 1 mm
Coluna "Analítica"
1 mm < dc < 8 mm
Coluna Preparativadc >= 8 mm
CROMATOGRAFIA
Fundamentos
Modalidades e Classificação
FM = Líquido
FM = Gás
Cromatografia Líquida
Cromatografia Gasosa
Em CG a FE
pode ser:
Sólida
Líquida
Cromatografia
Gás-Sólido (CGS)
Cromatografia
Gás-Líquido (CGL)
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Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do
pico cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção da Fase Móvel
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tR’ = tR – tM)
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um
analito é o Tempo de Retenção Ajustado tR’
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A migração um analito pela
coluna provoca
inevitavelmente o
alargamento da sua banda:TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separação deficiente de analitos
com retenções próximas.
Picos mais largos e menos
intensos = menor detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de
dispersão do analito.
Eficiência = número de pratos teóricos
1 prato teórico = 1 equilíbrio entre a FM e a FE
Quanto maior o número de pratos teóricos, maior o
número de equilíbrios, maior eficiência.
n = 5,545 (tR)2
Wh
Wb = largura do pico na base
Wh = largura do pico a meia altura
Resolução (Rs) = separação entre picos vizinhos
Rs1 SATISFATÓRIA
Rs = 2 (tR2 – tR1 )
Wb1 + Wb2
Rs = 1,17 (tR2 – tR1 )
Wh1 + Wh2
SÉRIE ELUOTRÓPICA
• CROMATOGRAFIA FASE REVERSA
FASE ESTACIONÁRIA: APOLAR FASE MÓVEL: POLAR
• CROMATOGRAFIA FASE NORMAL
FASE ESTACIONÁRIA: POLARFASE MÓVEL: APOLAR
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High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography
• Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho
• CLAE
HPLCHPLC
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DetectorSistema de Tratamento
de Dados
Bomba HPLC
Injetor
Precoluna
Coluna Analitica
Filtro em linha Scavenger
Reservatórios para
os solventes
HPLCHPLC
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Eluição Isocrática / Eluição Isocrática / GradienteGradiente
• ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida.
• GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.
Aplicações HPLCAplicações HPLCSubstâncias químicasSubstâncias químicas
• Proteínas
• Ácidos nucléicos
• Aminoácidos
• Corantes
• Polissacarídeos
• Pigmentos plantas
• Metabólitos plantas
• Produtos farmacêuticos
• Compostos iônicos
• Íons metálicos
• Cátions e ânions
• Lipídeos polares
• Complexos metais pesados
• Explosivos
• Polímeros sintéticos
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• Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel
• NPC– Fase móvel Apolar hexano, isooctano– Fase estacionária Polar sílica, alumina
• RPC– Fase móvel Polar metanol, água– Fase estacionária Apolar C8, C18
Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)
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Analgésicos ComprimidosColuna: Pecosphere 3x3 C18
(3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)
Fase Móvel: 15% ACN em HAc a 0.1%
Fluxo: 2 mL/min
Detecção: UV a 240 nm
Identificação Picos
1. Acetaminofeno
2. Cafeína
3. Salicilamida
4. Ácido Acetilsalicílico
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CGCG
Fonte: RITA CERDEIRA
Cilindro de gás
Injector da amostra
Coluna CG aquecida
Detector
Registrador
Cromatograma
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Fase MóvelCARACTERÍSTICAS da FASE MÓVEL, OU GÁS DE
ARRASTE:
• InerteInerte não interage nem com a amostra, nem com a não interage nem com a amostra, nem com a
fase estacionária, apenas transporta a amostra através da fase estacionária, apenas transporta a amostra através da
coluna.coluna.
• PuroPuro isento de impurezas que possam contaminar a isento de impurezas que possam contaminar a
amostra, ou gerar ruído no sinal.amostra, ou gerar ruído no sinal.
• Compatível com o DetectorCompatível com o Detector
• Exemplos – Exemplos – HH22, N, N22, He, He
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FASE ESTACIONÁRIA:
• Líquido depositado sobre superfícies de:Líquido depositado sobre superfícies de:
Tubos finos – colunas capilaresTubos finos – colunas capilaresSólidos – colunas empacotadasSólidos – colunas empacotadas
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• QUIMICA:QUIMICA:– Determinação de antioxidantes, nutrientes ou Determinação de antioxidantes, nutrientes ou
contaminantes em alimentoscontaminantes em alimentos• INDÚSTRIA:INDÚSTRIA:
– Monitorização de processos industriaisMonitorização de processos industriais• SAÚDE:SAÚDE:
– Análises dos constituintes do sangueAnálises dos constituintes do sangue– Análise forenseAnálise forense
• AMBIENTE:AMBIENTE:– Determinação de resíduos de pesticidas em produtos Determinação de resíduos de pesticidas em produtos
alimentares, águas ou esgotosalimentares, águas ou esgotos– Determinação de gases e solventes orgânicos na Determinação de gases e solventes orgânicos na
atmosfera, solos ou riosatmosfera, solos ou rios– ......
AplicaçõesAplicações