聚合酶链式反应Polymerase chain reaction （ PCR ）

三峡大学医学院盛德乔

shengdq@ctgu.edu.cn

1. 做什么 ?

2. 如何做 ?

3. 如何做好？

PCR 目的 PCR 能让你体外（试管内）扩增 DNA

片段 能够扩增特异的基因 短时间内能够扩增至百万倍

必需知道部分序列！

Polymerase chain reaction (PCR) 是由 K. Mullis 于 1985 发明的 , 这项技术通过模拟 DNA 的复制过程，在体外大量扩增目的 DNA 片段。PCR 技术使我们可以无限制地扩增我们研究的 DNA 片段，特别是哪些不容易得到的目的 DNA 片段。

The Nobel

Prize in Chemistr

y 1993

简 介简 介

Kary B. Mullis

Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4

DNA 复制的关键 解链（模

板） DNA 聚合酶 引物

模拟 DNA 复制过程？

DNA 复制 解链（模板）

加热、酸、碱 引物

人工合成 DNA 聚合酶

分离、基因工程生产

合成 DNA 加热变性模板

94℃ 加入引物后退火

55 ℃ 聚合酶合成（延

伸）新 DNA 链72 ℃

问题？1. 聚合酶热稳定性？2. 自动、程序化处理？

PCR 基本原理

三步曲 : 变性、退火、延伸类似于 DNA 的体内复制。首先待扩增 DNA� 模

板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。 � 这种热变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR 循环， PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

PCR 的基本反应步骤

变性95˚C

延伸72˚C

退火Tm-5˚C

五要素

1. 模板 DNA Template

2. 特异性引物 Primer

3. 耐热 DNA 聚合酶 Taq

4. dNTPs

5. Mg2+

PCR 体系基本组成成分

标准的 PCR 反应体系：

10× 扩增缓冲液 　 10 l

4 种 dNTP 混合物 　 各 200 mol/L

引物 　　　　 　 各 10 ～ 100 pmol 　模板 DNA 　　　 　 0.1 ～ 2 g 　Taq DNA 聚合酶 　 2.5 u 　Mg2+ 　　　　　　 1.5 mmol/L

加双或三蒸水至 　 100 ul

PCR仪

引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，

就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。

实际上，有讲究！

引物（ Primer ）

设计引物应遵循以下原则

1. 引物长度： 15-30bp ，常用为 20 bp 左右。2. 引物扩增跨度： 以 200-500 bp 为宜，特定条件下可

扩增长至 10kb 的片段。3. 引物碱基： G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少

扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4. 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

5. 引物 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6. 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。（常用！）

7. 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.1 ～ 1umol 或 10 ～ 100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

如何设计引物？

1. 手工设计2. PCR 引物试剂软件专业软件： Oligo 6 ， Premier Primer

半专业软件： DNAMAN, Dnasis ， Omiga ， Dnastar

3. 在线引物设计Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/

NCBI: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Primer3

DNA序列

左边引物 右边引物

Primer3 参数设置

单击

Primer3 结果输出

Primer3 结果输出

BLAST--Basic Local Alignment Search Tool

选择物种

选择程序

Primer-BLAST

DNA序列

引物参数

单击

1. 设计引物

2. 引物的特异性

Taq 酶

酶及其浓度　目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应：

一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶另一种为大肠菌合成的基因工程酶

催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

TaKaRa TaqTM （ 5 U/μl ） Invitrogen AccuPrime™ Taq DNA Polymerase

一般 Taq DNA 聚合酶活性半衰期为92.5 130min℃95 40min℃97 5min℃

Taq DNA 聚合酶的出错率 , 一般 PCR 中出错率为 2×10-4 核苷酸 /每轮循环

1.5-2 单位的 Taq DNA 聚合酶就足以进行 30 轮循环。所用的酶量可根据 DNA 、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。

Taq 酶特性

1. 耐热性能2. 保真性能3. 是否为平末端如何选择？

Characteristics Description

OriginMolecular weightOptimal temperatureActivityStabilityFidelityMg2+ concentrationExonuclease activityTransferase activity

Thermus aquaticus strain YT194 kd72--80℃150 nucleotides/sec/molecule>50% at 95℃ for 40 min1.1× 10-4 substitutions per cycle>0.5mM<10mM5’ to 3’only5’ adenosines

Characteristics of Taq PolymeraseCharacteristics of Taq Polymerase

dNTPs dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关

系。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH调节到 7.0 ～ 7.5 ，小量分装， -20℃冰冻保存。

多次冻融会使 dNTP降解。

在 PCR 反应中， dNTP 应为 50 ～ 200umol/L ，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低 ) ，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR

产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+ 结合，使游离的 M

g2+浓度降低。

模 板模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程

度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶 K来消化处理标本。

蛋白质污染有机试剂污染

Mg2+浓度

Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP浓度为 200mol/L 时， Mg2+浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异

扩增，Mg2+浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，

使反应产物减少。

PCR 条件优化 dNTPs浓度 Mg2+浓度 pH值 Taq 用量 循环中每一步时间，循环数 退火温度 加入一些辅助物 : PEG 、 BSA 、甲酰胺 引物设计

PCR 循环参数预变性 94~95 /℃ 5 min 循环（ 25~35 ）

变性 94 /℃ 30 Sec 退火 52~60 ℃ / 30 Sec 延伸 72 /℃ 30~60 Sec

延伸 72 /℃ 10 Min

PCR 扩增产物分析

1. 凝胶电泳分析 （大小？）琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2. 酶切分析 3. 分子杂交 ：

Southern印迹杂交 斑点杂交

4. 核酸序列分析

PCR 常见问题假阴性，扩增不出特异带假阳性 出现非特异性扩增带 出现片状拖带或涂抹带

提高 PCR 反应特异性的策略

3’ 5’

5’ 3’

5’5’

Cycle 1: Annealing Cycle 1: Annealing temperature 68 ℃temperature 68 ℃

3’ 5’

5’ 3’

5’5’

Cycle 2: Annealing Cycle 2: Annealing temperature 66 ℃temperature 66 ℃

3’ 5’

5’ 3’

5’5’

Cycle 3: Annealing Cycle 3: Annealing temperature 64 ℃temperature 64 ℃

3’ 5’

5’ 3’

5’5’

Cycle 4: Annealing Cycle 4: Annealing temperature 62 ℃temperature 62 ℃

提高 PCR保真性的策略

PCR 扩增长片段 DNA 的策略

几种重要的 PCR衍生技术

1. 反转录 PCR 技术 (RT-PCR)

2. 原位 PCR 技术 (in site PCR)

3. 不对称 PCR asymmetric PCR

4. 锚定 PCR anchored PCR

5. 多重 PCR Multiplex PCR

6. 实时定量 PCR 技术 Real time PCR

RT-PCR

1. 定义： Reverse transcriptase-PCR （ RT-PCR ）——即逆转录 PCR ，是将 RNA 的逆转录（ RT ）和 cDNA

的聚合酶链式扩增反应（ PCR ）相结合的技术。 RT-P

CR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中 RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。

2. 优点：去除了内含子序列，包含所有的编码序列（表达？）；分子较小，易于操作；半定量。

RT-PCR

RT

PCR

步骤： 提取样品中的总 RNA 总 RNA 用 oligo (dT) 作引物逆转录成产生 cD

NA/RNA杂交链 用一套特异的引物扩增靶基因。巢式 PCR 或常规

Real time PCR

实时荧光定量 PCR 技术于 1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR污染问题、自动化程度高等特点。

实时定量 PCR (real-time quantitative PCR) 是指在 PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出 PCR 产物进行分离。

扩增与检测分开进行 使用荧光染料检测 DNA 对 PCR终点的 DNA 量进行定性或定量 使用凝胶区别不同片断大小的 DNA

DN

A E

ngin

e常规 PCR 的检测方法

实时定量 PCR 的原理

相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复 96次扩增的扩增曲线图

起点定量

终点定量

终点处检测产物量不恒定

起点量是样本中原来的 DNA 量，更有意义；终点量经过 PCR 放大，并非研究所期望的数据。

起点定量误差小，终点定量误差大。

实时定量 PCR 的原理实时荧光 PCR 的检测方法

Chr

omo4

在扩增仪上整合荧光检测元件 使用荧光染料或荧光探针实时监测 DNA 产物的量 通过扩增曲线分析初始模板中特定基因的量 使用序列特异的探针区别不同的 DNA 通过双链 DNA 的熔解曲线鉴定不同大小和序列的 DNA 分子

实时定量 PCR 的原理

Threshold line

C(t) value

Ct值的概念Ct值的定义是 PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 (Ct值可以通过标准曲线或经验来设定 )

实时定量 PCR 的原理

实时荧光定量 PCR方法利用循环阈值（ Ct ）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该 Ct值具有极好的重复性。

实时定量 PCR 的原理确定初始模板的浓度

初始模板的 Log浓度与其 Ct呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。浓度增加 1 倍， CT值减小 1 个单位

浓度增加 10 倍， CT值减小 3.3 个单位

106 105 104 103 102 10

106

105

104

103

102

10

unknown 104

103

Unknown contains 3108 copies

实时定量 PCR 的原理荧光信号的获取

光源 光学元件

反应管 光学元件

热循环仪

检测

实时定量 PCR 的原理

非特异性的荧光染料 SYBR Green I 特异性的荧光探针 TaqMan Molecular Beacon 等

DNA 产物的荧光标记

Realtime PCR 常用的方法

1. SYBR green （荧光染料掺入法）

在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料， SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后（与小沟结合），发射荧光信号。

游离的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

2. Taqman probe （探针法） PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性

的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

PCR 扩增时， Taq 酶的 5’-3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步

实时 PCR （ Realtime PCR ）技术原理

R荧光报告基团

Q荧光淬灭基团

3. Molecular Beacon （分子信标）——一种特异的荧光实时 PCR探针，这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸杂交事件，分子信标是一段双重标记的寡核苷酸 (25-40nt) 形成具有一个环 (探针 ) 和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在 5′ 端，淬灭剂 3′端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和淬灭剂分子通过探针自身互补形成的茎结构紧靠在一起，因此抑制了荧光信号。当 PCR 退火时，如果探针遇到靶 DNA 序列，信标将优先和靶 DNA 结合而不是形成发夹结构。由于茎结构被破坏，荧光报告物质与碎灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光。

实时定量 PCR 在生物学研究中的应用

DNA 定量病原体检测转基因动植物研究和转基因食品检验 基因整合拷贝数的研究

RNA 定量 基因表达量研究， mRNA

基因型分析 SNP 分析法医学鉴定

实时荧光定量 PCR 技术的主要应用

1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等

2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证

3. 基因分型：例如 SNP 检测，甲基化检测等

PCR 反应的特点

1. 特异性强2. 灵敏度高3. 简便、快速4. 对样品要求低

分子生物学科研领域

（一）目的基因的克隆

（二）基因的体外突变

（三） DNA和 RNA 的微量分析

（四） DNA 序列测定

（五）基因突变分析

PCR 的主要用途

临床医学领域1. 病原体诊断2. 遗传性疾病诊断3. 肿瘤的诊断4. 法医学