聚合酶链式反应 及点突变的检测方法
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聚合酶链式反应 及点突变的检测方法. 聚合酶链式反应 于 1983 年由美国 Cetus 公司的 K.Mullis 建立 ，并 和定点突变的发明者 M.Smith 一起荣获1993年度诺贝尔化学奖， 为生命科学领域的研究开创了崭新时代。. PCR 反应的特点. 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长 ， 从 pg (10 -12 ) 可扩增至 m g (10 -6 ) 水平 简便、快速 2 ～ 4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板. - PowerPoint PPT Presentation
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聚合酶链式反应及点突变的检测方法
聚合酶链式反应于 1983 年由美国 Cetus 公司
的 K.Mullis建立，并和定点突变的发明者
M.Smith 一起荣获 1993 年度诺贝尔化学
奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。
PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从 pg (10-12) 可扩增至 g (10-6) 水平 简便、快速 2 ～ 4 小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板
一、 PCR 反应原理和反应过程
DNA 的体外复制包括 3 个步骤： 变性（ denaturation ） :94 C ~95 C 退火（ annealing ） :40 C ~70 C 延伸（ extension ） :72 C
3 个步骤作为 PCR 的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。
PCR 原理
5’5’3’
3’
d.NTPs
耐热 DNA 聚合酶引物
5’3’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’5’
3’
添加反应混合液及样本
变性
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’5’
3’
退火
加入试管中
延伸
5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’
继续延伸
5’ 3’
5’3’5’
5’
Taq
Taq
3’
5’3’
Taq
Taq5’
5’
循环
PCR 原理
5’3’5’ 3’
5’3’5’
3’
5’5’3’
3’
5’3’5’ 3’ 第二个循环
4 个拷贝
第三个循环8 个拷贝
5’3’5’
3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’3’5’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
第 n 个循环2n 个拷贝
PCR 原理
94 C(30 s)
40-60 C(30 s)
72 C(30-60 s/kb)
Melt Anneal Extend
The Polymerase Chain Reaction (PCR)
1820-30X
94 C(30 s)
40-60 C(30 s)
72 C(30-60 s/kb)
Melt Anneal Extend
Cycle #2
NIH20-30X
PCR 演示文件
二、 PCR 的反应体系和反应条件
（一） PCR 反应体系
参与 PCR 反应的主要成份 :
模板、引物、 dNTP 、 Taq DNA 聚合酶和
缓冲液等。
1 模板 包括基因组 DNA 、 RNA 、质粒 DNA 、线粒体 DNA 等
模板 DNA 需较高的浓度
RNA 作为模板时，须先将 RNA 逆转录为 cDNA ，再以
cDNA 作为扩增的模板
模板量： 1000ng 、 500ng 、 100ng 、 50ng
2 、引 物（ Primers)
引物决定 PCR 扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段
化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则
设计引物的原则： 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负
链序列互补 长度为 18 ~ 25 个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 引物退火温度计算： Tm=2 （ A+T ）
+4 （ C+G ） 引物的 5` 端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位
点、生物素等标记）引物浓度： 0.1 ~ 0.2umol/L, 浓度过高容易生成引物二聚体
3 、脱氧核苷三磷酸（ dNTP ）
是 dATP 、 dCTP 、 dGTP 和 dTTP4 种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 dNTP 浓度： 20 ~ 200umol/L, 浓度升高增加非特异性扩增
4 、 DNA 聚合酶 从一种生活在热泉（ 80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（ Thermus aquaticus, Taq ）中提取， 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用 :
模板指导下，以 dNTP 为原料，在引物 3’-OH 末端加上脱氧单核苷酸，形成 3’, 5’ - 磷酸二酯键，使DNA 链沿 5’→3’ 方向延伸，催化 DNA 合成。
最适酶量： 1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）
Taq DNA 聚合酶复制的保真性： Taq DNA 聚合酶无 3’ → 5’ 外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。
Taq DNA 聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为 1/30000 ，碱基替换率为 1/8000 ，故扩增的片段越长，错配的机率越高。
耐热的 DNA 多聚酶：
Pwo DNA polymerase 、 Tth DNA
polymerase 、 Pfu DNA polymerase具有较高的热
稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率 2 ~ 10倍。
5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高 Taq 酶的活性有直接影响 虽然 Taq 酶的活性只与游离的 Mg2+ 浓度有关， 但 PCR 反应体系中 dNTP 、引物、模板 DNA 及 鳌合剂的存在均可与 Mg2+ 结合而降低游离 Mg2+ 的浓度从而影响酶的活性。 当 dNTP 浓度为 200umol/L 时， MgCl2 的浓度为
1.5mmol/L 较宜。
6、其它反应因素 pH ：调节至酶反应所需的最适 pH （ pH =7.2左右）
盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与
模板杂交
基质： BSA 、 gelatin 、 Tween20 、 DTT 等（牛血清
白蛋白或明胶等基质可以保护 Taq 酶的活性）
（二） PCR 的反应条件
反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（ PCR效率及产物量）
1 、温度
变性温度： 94 ~ 97 ℃ 退火温度：低于引物 Tm 5 ℃左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度： 72度，此时 Taq 酶具有较高的
酶 促活性
2、时间
第一次变性应给予足够时间（ 5 ~ 7 分钟）
每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为 30 秒 ~ 1 分钟，时间过长易导致非特异性扩增
3 、循环次数 重复次数一般设为 25 ～ 35 个循环
扩增反应的平台效应：
理论上， PCR 反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增 25-25 个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长
指数增长期 线形增长期 平台期
循环数 #
理论值
实际值Lo
g 产
物D
NA
PCR 过程的实时监测
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：
引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的 DNA 片段间的竞争等
三、 PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR 技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR 实验系统中的污染源及防污染措施
防污染体系：
正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有
效的去污染措施、反应体系中以 dUTP 取代
dTTP ，再加入尿嘧啶糖苷酶（ UNG ）即可
破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量
（二） PCR技术的质量保证
分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存
分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置
对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）
分析后因素：报告形式、反馈的信息等
第二节 以 PCR 为基础的相关技术
以 PCR 为基础的相关技术 逆转录 PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量 PCR (quantitative PCR ) 多重 PCR (multiplex PCR) 免疫 PCR差异显示 PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位 PCR (in situ PCR)
一、逆转录 PCR （ RT-PCR ）
以细胞内总 RNA 或 mRNA 为材料进行体外
扩增的技术。
主要用于克隆 cDNA 、合成 cDNA探针，检
测 RNA病毒、分析基因表达等
逆转录生成 cDNA 方式：
以随机进行的 PCR 扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物
以 oligo(dT) 作为引物， mRNA3` 末端 polyA尾与之互补
以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增
二、定量 PCR
对 DNA 或 RNA 样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 在定量 PCR 反应体系中，除了常规 PCR 反应所
需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是 -肌球蛋白基因
绝对定量 PCR
1.外参照系统的设置
2.内参照系统的设置
实时定量 PCR
对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析
荧光定量 PCR （ fluorescence quantitative
PCR,FQ-PCR ），又称实时 PCR ，是目前较精确
的进行定量检测 PCR 的方法
FQ-PCR通过荧光信号对 PCR 过程中产物量进行
实时监测，精确计算出 PCR 的初始模板量
荧光信号的检测方法：
1 、 DNA 结合染料技术
2 、水解探针技术（ TaqMan probe ）技术
3 、杂交探针技术
TaqManTM
5’5’3’
3’
d.NTPs
Thermal Stable DNA Polymerase
Primers5’
3’5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’5’
3’
Add Master Mix and Sample
Denaturation
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’5’
3’
Annealing
Reaction Tube
Taq
5’ 3’R Q
Probe
5’ 3’R Q
5’ 3’5’3’
TaqManTM
Extension Step
5’ 3’1. Strand DisplacementTaq
3’
Q
R
5’
5’ 3’3’
Q Taq
R
5’ 2. Cleavage
3. PolymerizationComplete5’ 3’
QTaqR
3’ 5’
4. Detection5’ 3’3’
QTaqR
5’
R
5’3’RQ
实时定量 RT-PCR 检测 CEA 基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用
CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。
正常成人体内 CEA 基因表达
胃肠癌肿瘤组织中 CEA 基因的表达
在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中 CEA 基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。
胃肠癌患者外周血中 CEA 基因的表达
三、多重 PCR• 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增
一份 DNA 样本中多个不同序列的靶片段。
DMD基因外显子缺失的检测
四、差异显示 PCR （ differential display PCR,DD-PCR ）
一种以逆转录 PCR 为基础的研究基因表达差异的技术。
DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。
差异显示 RT-PCR(Differential display RT-PCR)
第三节 点突变的检测技术
PCR-限制性片段长度多态性（ PCR-RFLP ） 等位基因特异性寡核苷酸
（ allele specific oligonucleotide, ASO ） 单链构象多态性（ single strand conformation
polymorphism, SSCP ） 变性梯度凝胶电泳（ DGGE ） 融点曲线分析（ melting curve analysis ） PCR 产物的序列分析
点突变一、 已知点突变的检测方法 1.PCR-RFLP
利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使 PCR 产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。
Bcl I RFLP （血友病 A）
2. 等位基因特异性寡核苷酸杂交 被检基因经 PCR 扩增后转移到膜上，分
别与长度为 15~20bp 、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使 DNA分子的 Tm 值下降 5~7.5℃ ，因此通过严格控制杂交条件，可使 PCR 产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。
3.DNA芯片技术（ DNA chip ）
在固相支持物 (硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。
s
4. Southern印迹杂交
二、未知点突变的检测方法
1. 单链构象多态性（ single-strand conformational polymorphism ， SSCP ）
突变 DNA 的 PCR 产物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从 而能区别正常与突变的 DNA 。 SSCP只适用于检测 150~200bp 长度的 DNA 片段。
2. 变性梯度凝胶电泳（ DGGE ） 利用不同序列的 DNA 分子具有不同的融点温度
(Tm) 的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有 2个不同的区域，一个 Tm较高，另一个较低，将该 PCR 产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的 PCR 产物与突变的 PCR 产物的 Tm不同，在电泳过程中 Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。
3. 异源双链分析（ heteroduplex analysis ， HA ）
正常 DNA 和突变 DNA 在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。
4. 熔点曲线分析 (melting curve analysis ）
DNA 片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的 Tm较完全配对的同源双链的 Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC) 、 WAVE DNA 片段分析系统、 LightCycler 等。
5.DNA 序列分析（ DNA sequencing ） Sanger 测序技术： 以待测序列的单链 DNA 作为模板，加入一个引物和 dNTP 作为底物，并加入一定比例的 2’ ， 3’-ddNTP ，在 DNA聚合酶的作用过程中，正常 dNTP 的掺入使链延伸，若 ddNTP 的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种 ddNTP 结尾的 DNA 片段，经电泳后可直接读出碱基序列。
PCR测序演示版
1 2
第四节 PCR技术在分子诊断中的应用
PCR 技术在分子诊断中的应用
感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测 肿瘤相关基因的检测 移植配型和法医学上的应用
