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双水相体系是怎样形成的？ 其分配机理是什么？ 什么双水相萃取？ 双水相体系的相图？ 双水相萃取的原理是什么？ 特点是什么？ 影响双水相萃取体系的因 素有哪些？ 其应用范围是什么？

2.3 2.3 双水相萃取双水相萃取

2.3.1双水相体系的形 成与分配2.3.2双水相萃取分离的原理2.3.3 双水相萃取体系的影响因素2.3.4 双水相萃取操作及特点2.3.5 双水相萃取的应用

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本节要点及学习要求本节要点及学习要求

双水相体系的形成与分配机理双水相萃取分离的原理双水相体系中的分配平衡：静电作用、疏水作用。

聚合物的不相溶性、系线、双节线、临界点。 影响物质分配平衡的因素： 双水相中聚合物组成的影响； 双水相系统物理化学性质的影响； 盐和缓冲液的影响；温度的影响。双水相系统的应用。

双水相体系的形成与分配机理，双水相萃取分离的原理和特点。

双水相体系的形成与分配机理。

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双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction,ATPS)

又称水溶液两相分配技术

(1)概述： 基因工程产品如蛋白质和酶的特点 :

传统的溶剂萃取法并不适合。反胶束的办法可克服这些问题，但存在大量使用有机相和相的分离问题。 基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。

2.3.1 双水相体系的形成与分配

活性和功能对 pH 值、温度和离子强度等特别敏感；在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。

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技术诞生技术诞生 18961896 年年 Bei jerinckBei jerinck 观察到观察到 先得到一先得到一浑浊不透明溶液浑浊不透明溶液，随后分为，随后分为两相两相 , , 水相水相也可以也可以

分为分为两相两相，即，即双水相系统 双水相系统 ?? 将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移一个水相转移

到另一个水相到另一个水相中中 ____ 双水相萃取双水相萃取 .. 开始于本世纪开始于本世纪 7070 年代，现已应用到年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、酶、核酸、生长激素、

病毒病毒等分离提纯。等分离提纯。近年来出现的引人注目、极有前途的新型极有前途的新型分离技术。分离技术。

明胶明胶 -- 琼脂水溶液混合琼脂水溶液混合明胶明胶 -- 淀粉水溶液混合淀粉水溶液混合

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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(2)双水相体系

双水相

在一定浓度范围

密度不同两相两相均含有较多的水

明胶 - 琼脂水溶液混合明胶 - 淀粉水溶液混合葡聚糖 - 甲基纤维素

亲水性高分子聚合物

水

水溶液

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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向水相中加入向水相中加入高分子化合物高分子化合物 PEG/PEG/ 葡聚糖葡聚糖或或盐盐，，在一定组成范围内，可以形成在一定组成范围内，可以形成密度不同的两相密度不同的两相。。

轻相轻相富含富含高分子化合物高分子化合物 PEGPEG ，， 重相重相富含富含盐盐或或高分子化合物高分子化合物 DxDx 葡聚糖葡聚糖。。

举 例

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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葡聚糖葡聚糖 -- 甲基纤维素钠两相体系甲基纤维素钠两相体系

2.3.1 双水相体系的形成与分配

0.39% 葡聚糖

0.65% 甲基纤维素钠

98.96% 水

1.58% 葡聚糖

0.15% 甲基纤维素钠

98.27% 水

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聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（ 葡聚糖（ DexDex ） ） 羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖

聚乙二醇（ 聚乙二醇（ PEGPEG ）） 聚乙烯醇、 聚乙烯醇、 DexDex

硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基甲基纤钠盐羧甲基甲基纤钠盐

聚乙二醇聚乙二醇 磷酸钾、硫酸铵磷酸钾、硫酸铵硫酸钠、硫酸镁硫酸钠、硫酸镁

几种典型的双水相系统几种典型的双水相系统

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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各种双水相体系

2.3.1 双水相体系的形成与分配聚合物 1 聚合物 2或盐 聚合物 1 聚合物 2或盐

聚丙二醇

甲基聚丙二醇乙基羟乙基纤维素 葡聚糖

聚乙二醇聚乙烯醇

羟丙基葡聚糖 葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮羟丙基葡聚糖

聚蔗糖 葡聚糖葡聚糖

聚乙二醇

聚乙烯醇 聚丙二醇甲氧基聚乙二醇

聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮

磷酸钾聚乙烯吡咯烷酮

葡聚糖聚蔗糖

聚乙烯醇或

聚乙烯吡咯烷酮

甲基纤维素

聚乙二醇

硫酸镁硫酸铵硫酸钠甲酸钠酒石酸钾钠

羟丙基葡聚糖葡聚糖

甲基纤维素羟丙基葡聚糖

葡聚糖

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(3)(3) 双水相体系的类型双水相体系的类型

双聚合物体系双聚合物体系 常用 PEG/Dx

聚合物与无机盐体系 如 PEG/磷酸钾

表面活性剂 -表面活性剂

亲和配基 - 高聚物 , 亲和双水相萃取

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双聚合物体系 聚合物 /盐体系活性损失 小 大

盐浓度 低 高

成本 高 低

粘度 大 小

环境污染 无 废水处理困难其它 分相困难 界面吸附多

比 较

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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4. 4. 聚合物双水相形成机理聚合物双水相形成机理

两个因素

体系熵的增加

单一相

富含不同聚合物的两相

聚合物的不相容性

一定浓度范围

空间位阻 , 相互排斥

双 相

两种聚合物

相互混合

分离混合

分相

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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(5)(5) 双水相萃取分离的原理双水相萃取分离的原理

生物分子在双水相体系中的生物分子在双水相体系中的选择性分配选择性分配 分配规律服从分配规律服从能特特分配定律能特特分配定律 ..

与溶剂萃取比与溶剂萃取比 ,,表现出更大或更小的表现出更大或更小的分配系数分配系数 .→.→

相相图图

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双水相体系的相图双水相体系的相图a

系线

双节线

均相区

两相区

临界点

T

B

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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K 临界点

TKB 双节线

双水相体系的相图

•N

节线

M’

B’

T’

单相

双相

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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M 点 , 两相 T 和 B 的量之间的关系 ( 体积 ) 服从杠杆规则，即

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图 b 的双节线上 K 点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为 1 ，因此 K 点称为临界点 (critical point) 。

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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2.3.2.1 双水相分配系数 分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互

作用。包括：静电作用 疏水作用 生物亲和作用。 分配系数是各种相互作用力的和。

lnm=lnme+lnmh+lnml

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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2.3.2.2 影响分配系数的因素分析11 ）成相聚合物）成相聚合物   ------相对分子质量和浓度影响分配平衡相对分子质量和浓度影响分配平衡 ..

对于成相聚合物系统和生物大分子来说： 对于成相聚合物系统和生物大分子来说：

A 聚合物的分子量降低

上相分子量降低 下相分子量降低

生物大分子该相溶解度增大

形成双水相所需的浓度越高

分配系数增大

分配系数降低

B 成相聚合物的浓度越高两相体系距离临界越远分配系数增大。

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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22 ）盐的种类和浓度）盐的种类和浓度 ------主要影响主要影响相间电位相间电位和和蛋白质疏水性蛋白质疏水性。。

在双聚合物在双聚合物双水相系统双水相系统中

无机离子分配系无机离子分配系数

相间电位不同相间电位不同

影响带电蛋白质、核酸生影响带电蛋白质、核酸生物大分 子的分配系数物大分 子的分配系数

盐种类盐种类

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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影响蛋白质的表面疏水性，改变各相成相物质组成和相体积比 .分配系数随盐浓度增加而增加 ,不同蛋白质增加不同 .

盐浓度

调节双水相系统的盐浓度，可

有效萃取分离不同的蛋白质

PEG/KPi 系统中上、下相 ( 或称轻重相 ) 的 PEG 和磷酸钾浓度以及 Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加 NaCl 浓度的增大而改变。

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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33 ）） pHpH 值值

44 ）温度）温度温度影响相图 , 规模化操作采用常温 , 一般双水相系统来说，温度的影响很小。

蛋白质的表面电荷数 磷酸盐的解离

改变 影响pH值

分配系数 系统的相间电位和蛋白质的分配系数。

影响改变

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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温度的影响 温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小， 1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因： (1)成相聚合物 PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性； (2)常温下溶液粘度较低，容易相分离； (3)常温操作节省冷却费用。

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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6)6) 双水相体系物理化学性质的影响：双水相体系物理化学性质的影响： 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数： 密度密度 ((ρρ)) 和两相间的密度差和两相间的密度差 黏度黏度 ((μμ)) 和两相间的黏度差以及表面张力和两相间的黏度差以及表面张力 ((σσ))

相间电势差相间电势差 ,, 相分离时间等。相分离时间等。

5)5) 低分子量化合物低分子量化合物 ::高浓度时起作用。

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此 ,分配系数应该是 1。

界面张力增加→系线的长度增加 ,上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶分配系数，使酶富集于上相。

2.3.2 双水相萃取体系的影响因素

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2.3.3.1 2.3.3.1 双水相系统的选择双水相系统的选择

选择原则：选择原则：

根据根据目标蛋白质目标蛋白质和和共存杂质共存杂质的的表面疏水性、相对分子表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷质量、等电点和表面电荷等性质上的差别等性质上的差别

综合利用综合利用静电作用、疏水作用静电作用、疏水作用 ,, 添加适当种类和浓度添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。的盐，可选择性萃取目标产物。

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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目标产物与杂蛋白的目标产物与杂蛋白的等电点等电点不同，不同，

调节系统调节系统 pHpH 值，添加适当盐，产生希望的值，添加适当盐，产生希望的相间电位相间电位。。

目标产物与杂蛋白的目标产物与杂蛋白的疏水性疏水性不同－充分利用不同－充分利用盐析作用盐析作用

增大成相系统增大成相系统浓度浓度－使细胞碎片选择性分配于－使细胞碎片选择性分配于下相下相。。

采用相对分子质量较大的采用相对分子质量较大的 PEGPEG

降低蛋白质的降低蛋白质的分配系数分配系数，提高目标蛋白的，提高目标蛋白的选择性选择性。。

方 法

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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2.3.3.2 双水相萃取过程

包括：

双水相的形成双水相的形成溶质在双水相中的分配溶质在双水相中的分配

双水相的分离。双水相的分离。

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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萃取一般操作

蛋白质在两相中发生物质传递，达到分配平衡；

采用离心沉降进行相分离。

固体聚合物

盐细胞匀浆加入 搅拌

成相物质溶解 形成双水相

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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图 5-19 聚已二醇 (PEG)-磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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两步萃取法连续分离胞内酶的流程图

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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2.3.3.3 2.3.3.3 双水相萃取的特点：双水相萃取的特点：相混合能耗低，相混合能耗低，达到萃取平衡所需的时间短达到萃取平衡所需的时间短易进行工业放大易进行工业放大 (10ml(10ml 离心管的实验结果即可放大）离心管的实验结果即可放大）

适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀）适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀）易实现连续操作－最大特点易实现连续操作－最大特点

蛋白质下游加工中比较独特

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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可用于多种生物活性物质的分离纯化可用于多种生物活性物质的分离纯化

11 ）酶的提取和纯化）酶的提取和纯化

酶主要分配在上相，菌体在下相或界面处酶主要分配在上相，菌体在下相或界面处 ..

2.3.4 双水相萃取的应用

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表 5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例p84

2.3.4 双水相萃取的应用

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22 ）核酸分离纯化）核酸分离纯化

用用 PEG/DextranPEG/Dextran 体系体系萃取核酸时，萃取核酸时，盐组分盐组分的微的微小变化将会引起分配系数的微小变化。小变化将会引起分配系数的微小变化。

33 ）人生长激素的提取）人生长激素的提取

用用 PEG4000 6.6%/PEG4000 6.6%/磷酸盐磷酸盐 1414％％体系从体系从E.coli E.coli 碎片中提取碎片中提取人生长激素（人生长激素（ hGH)hGH)

（（ hGH)hGH) 分配在分配在上相上相，分配系数，分配系数 6.46.4 ，收率，收率6060％％ ..

2.3.4 双水相萃取的应用

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从 E.coli中提取 hGH的三级错流萃取

收率为 81 ％

2.3.4 双水相萃取的应用

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44 ）） ββ干扰素（ 干扰素（ ββ-IFN)-IFN)的提取的提取不用不用 PEG/DextranPEG/Dextran体系体系用用 PEGPEG －磷酸酯－磷酸酯 //盐盐的体系才能使的体系才能使 ββ-IFN-IFN分配在分配在上相上相，，杂蛋白杂蛋白分配在分配在下相下相。。

层析技术双水相萃取

结合

双水相萃取，层析纯化

工业生产

2.3.4 双水相萃取的应用

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55 ）病毒的分离纯化）病毒的分离纯化

66 ）生物活性物质的分析检测）生物活性物质的分析检测

7)7) 在中草药有效成分分离中的应用在中草药有效成分分离中的应用 p85p85

2.3.4 双水相萃取的应用

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双水相体系形成、类型及机理

双水相萃取的应用双水相萃取

双水相萃取分配系数影响因素

成相聚合物盐的种类和浓度pH值温度

双水相萃取操作及特点双水相系统的选择双水相萃取过程双水相萃取的特点

细胞碎片和蛋白质分离纯化

流程

增大收率应考虑的因素双水相组成的选择

双水相萃取与细胞破碎的结合

双水相萃取同其它分离技术结合 ·

双水相体系与生物转化相结合双水相萃取同膜分离技术相结合双水相萃取同亲和层析相结合

总结2.3.4 双水相萃取的应用