PROSES PEMERIKSAAN UJI SILANG SERASI
dr. J Nethasiadr.Irene Ratna. Sdr. Ricky Julian
HAL-HAL PENTING YANG HARUS DIPERHATIKAN SEBELUM MELAKUKAN UJI SILANG SERASI :
1. Periksa identitas pasien dan contoh darah pasien2. Periksa golongan darah ABO dan Rhesus pasien dengan
benar3. Cari darah donor yang sesuai dengan golongan darah
pasien4. Periksa ulang golongan ABO dan Rhesus donor dengan
benar5. Apabila semua golongan ABO dan Rhesus antara pasien
dan donor sama, baru dilakukan uji silang serasi.
• Bertujuan untuk memastikan bahwa darah yang diberikan adalah sesuai/kompatibel, dan tidak akan menimbulkan reaksi serta bermanfaat
• Untuk mengetahui apakah penderita tidak mengandung antibodi yang reaktif terhadap eritrosit donor
• Harus dilakukan 3 fase, mayor, minor dan auto• Untuk permintaan lebih dari satu kantong, tidak boleh
dilakukan metoda pooling, baik pada uji silang serasi mayor maupun minor.
UJI SILANG SERASI
• Uji Silang Serasi - Mayor• Memeriksa ketidak cocokan oleh karena adanya
antibodi dalam serum pasien terhadap antigen sel darah merah donor
• Uji Silang Serasi - Minor• Memeriksa ketidak cocokan oleh karena adanya
antibodi dalam serum donor terhadap antigen sel darah merah pasien
Uji Silang Serasi
T u b e Te s t
Pemeriksaan uji silang serasi :
Minor Test
May
or T
est
DarahDonor
SuspensiSel Donor 5%
SuspensiSel Pasien 5%
Plasma Donor Serum Pasien
DarahPasien
AutoKontrol
7
UJI SILANG SERASI
• phase I putar,1000 rpm 1’ ,baca
• phase II tambah 2 drops bovine albumin 22% ,campur,inkubasi 15’,37oC,putar 1000 rpm 1’,baca,cuci 3X
• phase III tambah 2 drops antihuman globulin serum,putar 1000 rpm 1’ baca,bila neg,+ IgG coated cells(Coombs control sel),putar 1000 rpm ’,positip .
mayor
2 drops patient serum+1 drop 3-5%Suspensi selDonor
2 dropsDonor serum+1 drop3-5%Suspensi selpasien
minor
Pemeriksaan uji silang serasi terdiri atas 3 fase
Fase I : Fase Medium saline Mayor test : 2 tetes serum pasien + 1 tetes
suspensi sel donor 5 %
Minor test : 2 tetes plasma donor + 1 tetes suspensi sel pasien 5%
Auto kontrol : 2 tetes serum pasien + 1 tetes suspensi sel pasien 5% Kocok perlahan-lahan agar homogen
Putar semua tabung pada 3000 rpm selama 15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi
Fase II : Fase Bovine albumin 22% Pada semua tabung : tambahkan 2 tetes Bovine Albumin 22%
Kocok perlahan-lahan agar homogenInkubasi pada suhu 37C selama 15 menitPutar semua tabung pada 3000 rpm selama
15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi
Fase III: Fase Anti Globulin Test (Coombs Test)
Pada semua tabung : Cuci semua tabung 3 x dengan Saline (NaCl 0.9%)
Tambahkan pada semua tabung 2 tetes AntiglobulinTest (AHG). Kocok perlahan-lahan agar homogen .Putar semua tabung pada 3000 rpm selama 15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi
Fase Coombs Control Cells (CCC) : Kontrol semua tabung dengan menambahkan 1 tetes Coombs Control Cells (CCC) bila hasil reaksi fase III negatip. Setelah penambahan CCC reaksi harus positip. Bila hasil reaksi tetap negatip → Pemeriksaan uji silang serasi harus diulang
• Sel darah merah donor diambil dari selang kantong darah• Sel darah merah harus dicuci dan dibuat suspensi 2-5% dalam
saline,apabila terlalu banyak sel , antibodi yang lemah akan tidak terdeteksi karena terlalu sedikit antibodi yang mengadakan ikatan dengan sel darah merah .
• Pencucian sel darah merah donor akan menghilangkan bekuan fibrin yang dapat mengganggu interpretasi pembacaan
• Apabila pemeriksaan memakai metode lain (bukan tube test) harap mengikuti prosedur dari pabriknya.
Prosedur untuk uji silang serasi rutin
Hasil pemeriksaan uji silang serasi diinterpretasikan sbb :
Kompatibel (cocok), bila pada semua fase baik major maupun minor tidak ada reaksi
Inkompatibel (tidak cocok), bila ada reaksi agglutinasi/ hemolisis pada fase manapun baik di mayor test maupun minor test atau pada kedua-duanya.
HASIL POSITIP PADA MAJOR TEST
1. Golongan darah ABO pasien atau donor tidak benar, pemeriksaangolongan darah ABO harus segera diulang.
2. Adanya allo antibodi dalam serum pasien yang bereaksi dengan
antigen yang ada pada sel darah merah donor. Hasil auto kontrol harus negatip, kecuali pada pasien yang baru ditransfusi dengan sel yang inkompatibel.
3. Adanya autoantibodi dalam serum pasien yang juga bereaksi dengan sel darah merah donor.
HASIL POSITIP PADA MAJOR TEST
4. Penyelubungan sel darah donor oleh protein, sehingga antiglobulin test positip. Perlu dilakukan pemeriksaan Direkt Coombs Test (DCT), bila sel donor positip (DCT pos), maka darah donor akan inkompatibel dengan semua serum pasien pada fase antiglobulin, karena SDM telah terselubung dengan immunoglobulin dan atau komplemen.
5. Kelainan dalam serum pasien, misalnya adanya dextran dengan berat molekul yang tinggi atau plasma expander lainnya, sehingga menyebabkan terjadinya false positip (rouleaux formasi). Semua test termasuk auto kontrol akan menunjukkan hasil yang sama.
6. Kontaminasi pada test, misalnya tabung yang kotor, kontaminasi sampel oleh bakteri
HASIL POSITIP PADA MINOR TEST :
1. Golongan darah ABO pasien atau donor tidak benar
2. Adanya antibodi dalam plasma donor yang bereaksi dengan antigen yang sesuai dengan SDM pasien.
3. Penyelubungan SDM pasien oleh protein, sehingga hasil antiglobulin test positip
4. Kontaminasi
WASPADA TERHADAP KEMUNGKINAN HASIL UJI SILANG SERASI FALSE COMPATIBLE :
Adanya allo antibodi yang sangat lemah dalam serum pasien, sehingga tidak terdeteksi (primary response), sehingga hasil uji silang serasi tampak kompatibel. Pada saat transfusi terjadi secondary response, sehingga immun antibodi yang ada akan menimbulkan reaksi transfusi. Bila contoh darah donor dalam selang kantong darah tidak tercampur baik dengan anticoagulant nya, sehingga kemungkinan terjadi kerusakan dari SDM, sehingga antigen yang ada pada SDM menjadi lemah.
Bila prosedur uji silang serasi tidak dilakukan sebagaimana mestinya, misalnya tidak melakukan inkubasi pada suhu dan waktu yang seharusnya.
KARAKTERISTIK DAN JENIS-JENIS ANTIBODI :
Antibodi yang bereaksi pada saline medium : anti-M, anti-P1, anti-I, anti-N, anti-Lea, anti-Leb
Antibodi yang bereaksi pada Bovine albumin medium :antibodi sistem Rhesus, anti-M, anti-Lea, anti-Leb, anti-I
Antibodi yang bereaksi dengan Coombs serum : anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, anti-S, antibodi sistem Rhesus
UJI SILANG SERASI DENGAN GEL TEST
Sejarah gel test
Pertama kali ditemukan oleh Dr. Yves Lapierre dari Perancis
Pertama kali digunakan secara rutin pada tahun 1988
Prinsip teknologi gel testMaterial gel dari SephadexAglutinasi dengan ukuran besar berada pada
permukaan gelAglutinasi yang lebih kecil ukurannya dapat
melewati pori-pori gel, tergantung ukurannyaSel yang tidak beraglutinasi akan langsung
mengendap kedasar tabung
Prinsip kerja gel test
Uji silang serasi dengan gel test
Masukkan suspensi sel 1% 50 ulTambahkan serum/plasma 25 ulInkubasi 15 menitPutar baca
Reaksi positip kuat
Reaksi positip lemah
Reaksi negatip
Skor kekuatan reaksi
Skor kekuatan reaksi
Bahan yang dibutuhkan
1. DG Dispenser2. Mikropipet 5, 25 dan 50 ul3. Yellow tip4. Tabung reaksi5. Working table6. Digital incubator 37C 7. Card centrifuge8. Spidol
Reagen yang dibutuhkan
Coombs CardLISS Solution
coombs card
working table
Cara mengencerkan sel darah merah
Ambil LISS Solution sebanyak 0,5 ml atau 500 ul
Ambil 5 ul sel darah merah pekat, kemudian masukkan kedalam LISS Solution
Cara mengencerkan sel darah merah
Cara melakukan uji silang serasi
Campur hingga merata, kemudian ambil sebanyak 50 ul suspensi sel dan masukkan kedalam micro tube gel test (Coombs)
Tambahkan 25 ul serum/plasma kedalam card Coombs
digital incubator
Fase inkubasiInkubasi pada 37C selama 15 menit dalam inkubator
fase pemutaran
Setelah fase inkubasi, putar Coombs card dalam card centrifuge selama 10 menit
digital centrifuge
digital centrifuge
Pembacaan hasil uji silang serasi
• 1.lebih mudah• 2.sensitivitas dalam mendeteksi antibodi yg
lemah• 3.stabil• 4.titik akhir aglutinasi jelas• 5.interpretasi hasil objektif• 6.konsisten dan dapat diamati jangka lama• 7.vol sampel sedikit
KEUNTUNGAN:
• 1.banyak alat penunjang• 2.biaya
KELEMAHAN
No Perbedaan Metode salin Metode gel
1 Medium Lar Nacl 0,9% Partikel gel (dextran acrylamid gel
2 Reagensia Bovine albumine AHG
AHG,LISS3
3 Proses pencucian dengan Nacl 0,9%
ada Tidak ada
4 Suspensi sel 2-3% 1%
5 Intepretasi hasil Makroskopik dan mikroskopik
Makroskopik
6 Sel kontrol ada Tidak ada
PERBANDINGAN METODE SALIN DAN GEL:
E.M.® TechnologyErythrocytes Magnetised Technology
Teknologi Magnet
Tahapan sentrifugasi digantikan dengan magnet
Teknologi lamaTeknologi baru
PRINSIP EMT
• Teknologi yang berdasarkan pada magnetisasi terhadap sel darah merah
• EMT menggantikan sistem centrifugasi.• EMT Diagast menggunakan 96 U shaped wells Microplates• Bagaimana partikel magnet melekat pada sel darah merah?
-Panel : sel darah merah termagnesasi selama proses produksi-Sel darah merah : termagnesisasi pada saat tes berlangsung
Erythrocyte
Magnetic Particles
Magnetic particles
Erythrocyte Magnetized Technology
• IgM (reagent) + antigen sel darah merah = aglutinasi• Partikel - partikel magnet menarik sel – sel darah ke
dasar well • Magnetisasi
selama4 menit
Magnetic plate
Sel darah merah
Magnetised solution
Prinsip Teknologi Magnet
Magnetic plate
Prinsip Teknologi Magnet
Magnetic plate
Prinsip Teknologi Magnet
Magnetic plate
Prinsip Teknologi Magnet
Kelebihan Teknologi Magnet
1. Tidak digunakannya protokol sentrifugasi .
2. Cost lebih efektif.
3. Maintenance lebih mudah.
4. Kapasitas sample lebih besar
5. Continues loading of sample
Karakteristik Metode Gel Metode Magnet
Teknologi yang digunakan Gel
EM Teknologi - Teknologi yang berdasarkan pada sel darah merah yang termagnetisasi, menghilangkan tahapan centrifugasi yang masih digunakan pada test tube maupun gel card
Inovasi Inovasi kedua setelah test tube Inovasi terbaru setelah 20 tahun menggunakan gel cardSistem manual Ya Ya
Menghemat tempatTidak ( terdiri dari 2 alat yaitu centrifuge dan Inkubator) Ya (semua alat terintegrasi dalam 1 alat)
PerawatanMemerlukan perawatan lebih karena adanya centrifuge Perawatan minimum karena tidak adanya centrifuge
Maksimum sampel yang dapat ditest untuk Grouping 24 test 32 testMaksimum sampel yang dapat di test untuk Antibody screening (3 well) 48 test 64 test
Maksmimum sampel yang dapat ditest untuk Cross matching (3 well) 48 test 64 test
Waktu yang diperlukan untuk Grouping 15 menit untuk 12 sampel 15 menit untuk 16 sampel
Waktu yang diperlukan untuk Antibody screening 31 menit untuk 24 sampel 30 menit untuk 32 sampel
Waktu yang diperlukan untuk Cross matching 31 menit untuk 24 sampel 45 menit untuk 32 sampel
Masa kadaluarsa Card / microplate setelah dibuka pertama kali 2 jam setelah dibuka pertama kali 20 hari setelah dibuka pertama kaliPembacaan sampel 16 card dibaca terpisah 16 sampel dapat dibaca bersamaan dalam 1 microplateMasa pakai alat 5 tahun (Centrifuge dan Inkubator) 200 tahun ( permanen magnet )
Perbedaan Teknologi Gel dan Magnet
Crossmatching Test dengan
FREELYS® Nano • Alat : FREELYS® Nano• Reagen :CrossLys Kit
1 kit untuk 576 tes, isinya :
– 6 CrossLys plate
– 12 Mag plate (Mikroplate untuk membuat suspensi sel darah merah)
– 1 Screen Diluent (@100ml) LISS buffer
– 7 NanoLys II (@ 8 ml) high density buffer
– 2 MagLys (@ 8 ml) magnetic solution
– 2 DiluentLys (@ 50ml) dilution buffer
PROTOKOL
CROSSMATCH TEST
• Tahap 1: Pencucian dan magnetisasi sel darah merah, baik sel darah merah donor (major) dan sel darah merah OS (minor)
• Tahap 2 : Proses uji silang antara darah donor dengan plasma OS atau sebaliknya
• Tahap 3: Pembacaan hasil
Protokol Cross Match
Protokol :1) Pencucian
Sel darah merah
Physiologicalwater (utk pencucian sel)
Centrifugasi
tube tube
Protokol :1) Magnetisasi
Mag plate Mag plate
90 µl DiluentLys
135 µl DiluentLys 15 µl
suspensi
10 µl sel drh merah
Well n°1 Well n°2Well n°1 Well n°2
Dilution plate15 µl
MagLys
Protokol :1) Magnetisasi
Mag plate
Magnetisasi : 10 menit dlm incubator suhu 37°C
Protocol :2) Proses Uji Silang pada CrossLys plate
AHG (Anti Human Globulin / IgG, IgM)
50 µl Nanolys II
50 µl Screen Diluent
15 µl Plasma / Serum
15 µl Sel darah merah yg sudah dimagnetisasi
1
2
3
4
CrossLys plate
Tahap 1 : Pemipetan
Protokol :2) Proses Uji Silang Pada CrossLys plate
Mag plate CrossLys plate
50 µl Nanolys
50 µl Screen Diluent
15 µl Plasma / Serum
15 µl Sel drh merah yg sdh dimagnetisasi
1
2
3
4
Tahap 2 : Inkubasi
Tutup plate dan letakkan pada incubator suhu 37°CSelama 15 menit
Tahap 3 : Proses
Letakkan magnetik plate (magnet khusus) pada shaker
Letakkan microplate pada magnetic plate
Tekan P3
Protocol :
Positive Reaction
The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.
Positive reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
37°C
The alloantibodies bind to the red cells during the incubation at 37°C
Positive Reaction
The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.
Positive reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
The magnetic shaking attracts the red cells-alloantibodies to the bottom. The alloantibodies are caught by the AHG
Positive Reaction
The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.
Positive reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
Positive reaction: layer in the well
Schematic viewView of
a positive reactionin a microplate well
Negative Reaction
There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.
Negative reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
37°C
No alloantibodies bind to the red cells during the incubation at 37°C
Negative Reaction
There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.
Negative reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
The magnetic shaking attracts the red cells to the bottom. There is no interaction with the AHG
Negative Reaction
There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.
Negative reaction
E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test
Negative reaction: dot in the center of the well
Schematic viewView of
a negative reactionin a microplate well
Hasil Pembacaan
Positive Negative
COMPATIBLE UNCOMPATIBLE
FREELYS® Nano
Laboratorium mini pertama dibidang Imunohematologi:
Untuk test :
Blood groupingPhenotypingAntibody screening
Cross-matchingIdentificationDetection of weak DDirect Coombs
ReagentsPre-filled reagents
Magnetic plate
Control panelIncubator
Integrated timer
Automatic shaker
1 or 2 automatic shakers
1 incubator of 37 °C
2 magnetic plates
Weight : 9,4 kilos
Length : 578 mm
Depth : 330 mm
Height : 125.5 mm
Rack for reagents Timer integrated Control panel
Microplate support
FREELYS® Nano
FREELYS® Reader
FREELYS® Reader
FREELYS® Reader
Reagents
384 samples
DiluentLys(ref: 69301)
Mag-Plate (ref: 69302)
NanoLys x4 CrossLys x4
x 4
-IAT Kit (IgG/IgM)(ref. 20200)
Preparing donors’ samples
1- Collect the donors blood from the segment in a labelled tube 2- Centrifuge 5 minutes at 2500g3- load on QWALYS
++
IRONMAG
+
DiluentLys
1. On board magnetization of donors red blood cells in the Mag-Plate
2. In the CrossLys microplate: Mixing of magnetized donor’s RBC with patient’s plasma or serum
Microplate reading
Incompatible Compatible
Protocol on Qwalys
Protocol on Qwalys1. On board magnetization of donors red blood cells in a Magplate:
1. 1st well: 7 µL RBC + 153 µL DiluentLys2. 2nd well: 7 µL of diluted RBC + 28 µL DiluentLys + 70 µL IRONMAG
2. In the CrossLys microplate: Mixing of magnetized donor’s RBC with patient’s plasma or serum
1. 50 µL of Nanolys in the CrossLys2. 55 µL of magnetized RBC (prepared on the first step)3. 25 µL of plasma4. Incubation: 5 minutes RT + 15 minutes at 37°C5. Shaking: 3 minutes at 500 rpm + 2 minutes at 600 rpm
Protocol details
THANK YOU