Validasi Metode Analisis
Pratiwi Apridamyanti, M.Sc., Apt
Validasi Metode Analisis
Kenapa perlu dilakukan
VALIDASI
Tindakan dalam pembuatan dengan carayang sesuai (bahwa tiap bahan, prosedur, kegiatan, perlengkapan atau mekanismeyang digunakan dalam proses akansenantiasa mencapai hasil yang sesuaidengan yang diinginkan)
Maksud dan t7an validasi
Mengidentifikasi parameter metode yang kritis
Menetapkan batas toleransi yang dapatditerima pada masing2 parameter proseskritis
Memberikan cara/metode pengawasanterhadap parameter proses kritis
VALIDASI METODE ANALISIS
Menurut USP dilakukan untuk menjaminbahwa analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan terhadap kisarananalisis
Menurut ISO/IEC:17025(2005) dilakukanuntuk menjamin metode analisis memenuhispesifikasi yang dapat diterima sesuai dengantujuan yang dicapai.
6 VMA-2013 [ A ]
Kapan Suatu Metode Analisis Perlu
divalidasi atau revalidasi ?
Sebelum metode diterapkan atau diberlakukanuntuk penggunaan rutin
Bila kondisi berubah dilihat dari tujuan metodetersebut divalidasi [misal: instrumen dengankarakteristik yang berbeda]
Bila metode tersebut berubah dan perubahantersebut diluar lingkup awal metode tersebutsaat divalidasi
[ Huber, in: Nash and Wachter, 2003 ]
7lanjutan.
Bila kontrol kualitas mengindikasikan bahwa metode baku tersebut berubah dengan
berubahnya waktu
Ada maksud untuk membuktikan kesetaraan antara dua metode (metode baru dan metode
baku)
8Metode Compendial/Farmakope
Metode yang termuat di dalam farmakope
sudah divalidasi
Jadi tidak perlu dilakukan validasi lagi
namun
diperlukan verifikasi
Kazakevich, Y. and LoBrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, Chpt. 9
9 VMA-2013 [ A ]
Bukti Bahwa Metode Analisis yang diFarmakope/Compendia
Sudah di Validasi
11 VMA-2013 [ A ]
12 VMA-2013 [ A ]
13
1. Pendekatan validasi metode
a. Metode Spiking
i. Metode spiking buta nol
ii. Metode spiking buta tunggal
iii. Metode spiking buta ganda
b. Metode dengan menggunakan CRM (certified reference material)
Menggunakan bahan referens baku atau sampelautentik yang pendekatan validasinya sudahditerima secara global.
Mis. USP, NIST etc yang telah menyiapkan, menjamin, dan memasarkan berbagai spesiesanalit.
c. Pendekatan kolaboratif antar laboratorium
Uji banding antar laboratorium.
d. Pendekatan dengan membandingkan metodebaru yang diterima.
Membandingkan metode yang telah diterimadengan pendekatan untuk mengembangkanmetode analisis yang baru.
2. Parameter validasi metode analisis
a. Presisi
Menurut ICH-Q2A [1995] (3) dan Eurachem [1993] (2):
Ketelitian suatu metode analisis merupakan kesesuaian/kedekatan hasil tes individual beberapa
penginjeksian/pengukuran suatu seri standar
Ketelitian suatu metode analisis merupakanukuran kemampuan suatu metode untuk
mendapatkan hasil yang mirip (memiliki kedekatan)
satu dengan yang lain
Sebagai ukuran kedekatan tersebut adalah nilai
Per cent Relative Standard Deviation
[ % RSD ]
Bagaimana Menentukan KriteriaKeberterimaan Presisi[ Acceptance Criteria ]
Presisi RSD [ Horwitz vs AOAC ]
20 VMA-2013 [ A ]
Presisi
Standard Deviation (SD) yang terukur dapatdibagi menjadi tiga (3) kategori, yaitu:
1. repeatability (keterulangan)
2. intermediate precision (presisi antara)
3. reproducibility (ketertiruan)
Ruggedness = Intermediate Precision
21 VMA-2013 [ A ]
1.Ripitabilitas
Ripitabilitas diperoleh apabila analisis dilaku-kan:
- di satu laboratorium
- oleh satu analis (operator)
- dengan satu alat
- pada rentang waktu singkat
Analisis tersebut dilakukan paling tidak :
22 VMA-2013 [ A ]
lanjutan
Analisis tersebut dilakukan paling tidak:
- lima (5) atau enam (6) kali penetapan, dari
- tiga matrik yang berbeda, pada
- dua (2) atau tiga (3) macam konsentrasi
yang berbeda
Relative Standard Deviation-nya (RSD)
23 VMA-2013 [ A ]
Repeatability
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12
24 VMA-2013 [ A ]
2. Presisi antara
Menurut ICH-Q2A, 1995 (3):
Presisi antara:
- merupakan variabilitas jangka panjang
suatu proses pengukuran dan ditentukan
dengan membandingkan hasil-hasil suatu
metode yang dikerjakan dalam satu labora-
torium selama beberapa minggu
25 VMA-2013 [ A ]
lanjutan
Metode presisi antara dapat menggambarkanketidaksesuaian hasil yang diperoleh akibat:
- analis yang berbeda
- alat yang berbeda
- standar dan reagen dari supplier yang
berbeda
- penggunaan kolom dari batch yang
berbeda
[ atau kombinasi hal-hal yang tersebut di atas ]
26 VMA-2013 [ A ]
Tujuan
Tujuan validasi presisi antara adalah:
- untuk memverifikasi (to verify) dalam labo-
ratorium yang sama, suatu metode analisis
akan memberikan hasil yang sama setelah
fase/tahap pengembangan (metode) selesai.
27 VMA-2013 [ A ]
Intermediate Precision
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12
28 VMA-2013 [ A ]
3. Reprodusibilitas
Menurut ICH (1993; 1995):
Reprodusibilitas menggambarkan presisi yang diperoleh antar laboratorium (lihat Tabel 5).
Tujuan dilakukannya validasi reprodusibilitas:
- untuk memverifikasi bahwa metode akan
memberikan hasil yang sama bila metode
tersebut digunakan pada laboratorium yang
berbeda
29 VMA-2013 [ A ]
lanjutan
Reprodusibilitas ditentukan dengan cara:
Menganalisis aliquot sampel yang homogen:
- di laboratorium yang berbeda
- oleh analis yang berbeda
- pada kondisi operasional dan lingkungan
yang mungkin berbeda (tetapi masih
dalam kisaran parameter yang ditentukan
30 VMA-2013 [ A ]
Validasi Reprodusibilitas
Validasi reprodusibilitas penting apabila metode tersebut akan digunakan di labora-
torium yang berbeda
31 VMA-2013 [ A ]
Faktor-faktor yang mempengaruhi
Reprodusibilitas
Perbedaan temperatur dan kelembaban
Operator dengan pengalaman yang berbeda
Peralatan dengan karakteristik yang berbeda
Variasi bahan dan kondisi instrumen
32 VMA-2013 [ A ]
Lanjutan (Faktor-faktor)
Peralatan dan bahan habis pakai dengan usiayang berbeda
Kolom dari suplier yang berbeda dan batchyang berbeda
Pelarut dan pereaksi dengan kualitas yangberbeda
33 VMA-2013 [ A ]
Reproducibility
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12
34 VMA-2013 [ A ]
Kriteria Penerimaan Presisi
Sampel Presisi[ % RSD ]
Sediaan obat 1
Biologis 10 - 15 %
Lingkungan dan Makanan 2 - 20 %
Sangat tergantung pada:
Matriks sampelKonsentrasi analit
Teknik analisis
Huber, in: Nash and Wachter, 2003
35 VMA-2013 [ A ]
Validasi Presisi Metode Kromatografi
Buat larutan uji (obat) dengan konsentrasitertentu ( larutan A ).
Lakukan penginjek-an berulang larutan A.
Pada validasi metode analisis:
- minimum 10 kali injek ke sistem HPLC
- RSD < 1,0 % [direkomendasikan]
- untuk keperluan SST (UKS):
- RSD < 1,0 % untuk 3-5 kali injek
diperlukan.
Beberapa metode mempersyaratkan nilai RSD< 2,0 %.
Ahuja dan Dong , 2005, p.278
36 VMA-2013 [ A ]
Peningkatan Presisi HPLC
Ahuja dan Dong , 2005, p.265
2. Akurasi
Accuracy = Ketepatan
Ketepatan suatu metode analisis
adalah kesesuaian antara hasil uji yang
diperoleh dan nilai sebenarnya yang
diterima
Penentuan Akurasi Metode Analisisdengan cara:
1. Dengan cara membandingkan hasil analisis metodeyang divalidasi dengan hasil analisis yang diperolehmenggunakan metode baku (established reference method)
2. Dengan menganalisis sampel yang diketahuikonsentrasinya (certified reference material, CRM) danmembandingkan hasil analisis terhadap nilaisebenarnya yang dinyatakan dalam CRM
3. Tambahkan (spiking) zat baku dengan konsen-trasiyang diketahui (by weight or by volume) ke dalam, matrik* kemudian:
- lakukan ekstraksi analit injekkan kealat analisis dan hasil yang diperoleh
ditentukan recoverinya (%)
39 VMA-2013 [ B ]
Persyaratan Akurasi
Konsentrasi harus mencakup rentang zat yang dianalisis dan salah satunya adalah
konsentrasi yang dekat dengan nilai limit of
quantitaion (LoQ)
Perkiraan rekoveri tergantung pada:
- matrik sampel
- prosedur penyiapan sampel, dan
- konsentrasi sampel
[ Lihat Tabel AOAC / HORWITZ ]
40 VMA-2013 [ B ]
Akurasi
Misal:
Tiga (3) macam konsentrasi yang mencakup
80, 100, dan 120 %
dari nilai kadar sampel
dan masing-masing konsentrasi direplikasi 3 kali
Accuracy should be reported as % recovery
41 VMA-2013 [ B ]
Rekoveri
Rekoveri =Respon hasil ekstraksi
Respon zat baku*X 100 %
* : yang dilarutkan dalam pelarut murni
42 VMA-2013 [ B ]
Kriteria Penerimaan
43 VMA-2013 [ B ]
Accuracy and Precision
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12
44 VMA-2013 [ B ]
Recovery Results for C.U.
LoBrutto and Patel, 2007
3. Linieritas
Linearitas suatu metode analisis adalah:
kemampuan metode untuk mendapatkan
hasil uji (respon) yang (secara langsung
atau dengan bantuan perubahan
matematik) proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel pada
suatu rentang tertentu
Dipersiapkan dengan:
minimum lima (5) level konsentrasi dengan
tiga ( 3 ) replikasi
VMA-2013 [ B ]
Kurva Baku [ 3 replikasi ]
46
Lakukan replikasi !
47 VMA-2013 [ B ]
Linearitas ditentukan dengan menganalisis:
tiga hingga enam kali penginjeksian dari
lima atau lebih konsentrasi zat standar
yang terletak antara
80 - 120 %
rentang
konsentrasi yang diperkirakan
48 VMA-2013 [ B ]
Linearitas dapat disiapkan dengan cara:
1. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari
pengenceran larutan induk)
atau
2. Minimum 5 konsentrasi zat standar (dari
masing-masing penimbangan zat standar)
Mana yang direkomendasikan ?
Mengapa ?
49 VMA-2013 [ B ]
Linearity = Linieritas
- hasil pengukuran menggunakan suatumetode analisis yang berupa: abs, luas area,
atau tinggi puncak menunjukkan proporsio-
nalitas dengan kadar zat yang dianalisis
Syarat:
Y = bX + a
Koefisien korelasi [ r ] 0,999
Kazakevich and LoBrutto, 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292;
Snyder dkk., 1997, p. 691 dan Chan dkk., 2004, p.16.
50 VMA-2013 [ B ]
51 VMA-2013 [ B ]
Linearity Assay & C.U.
52 VMA-2013 [ B ]
Low-Level Linearity
4. Rentang
Rentang suatu metode analisis adalahinterval antara tingkat paling atas danpaling bawah yang sudah terbukti dapatditentukan dengan akurasi, presisi, danlinearitas menggunakan metode sepertiyang ditulis
Rentang biasanyadigambarkan/dinyatakan dalam unit (%, ppm) yang diperoleh dengan metodeanalitik tersebut.
54 VMA-2013 [ B ]
Rentang Minimum
Jenis analisis Rentang [ % ]
PK. Kadar Obat atau SediaanObat
80 - 120
Keragaman kandungan 70 - 130[ atau lebih lebar ]
Uji disolusi +/- 20
ICH, Q 2A and 2B, 2005 / ICH Q2 (R1)
5. LoD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantification)
LoD adalah konsentrasi analitterrendah dalam sampel yang masih
dapat dideteksi tetapi tidak diperlukan
secara kuantitatif
Pada HPLC, LoD adalah jumlah zatyang diinjeksikan untuk menghasilkan
tinggi puncak paling tidak 2 atau 3 kali
tinggi puncak baseline noise level
56 VMA-2013 [ B ]
Limit of Quantitation
LoQ adalah jumlah zat minimum yang diinjeksikan untuk memberikan hasil pengukur-
an secara teliti
Pada HPLC, biasanya tinggi puncak 10 hingga20 kali lebih tinggi dibanding baseline noise
Sejumlah sampel dengan konsentrasi analitmenurun (semakin kecil) diinjeksikan 6 kali,
Hitunglah nilai RSD-nya
57 VMA-2013 [ B ]
6. Ketahanan (Robutness)
Robustness adalah ukuran kinerja(performance) suatu metode analisis
apabila perubahan kecil yang disengaja
diterapkan pada kondisi metode tersebut
Tujuan validasi parameter ini untukmengiden-tifikasi (bila ada) kondisi
metode mana yang paling kritis untuk
menampilkan kinerja metode dengan baik
Mis. Parameter yang dievaluasi
% pelarut organik, pH, kekuatan ionik,
suhu
7. Kekasaran (Ruggedness)
merupakan tingkat reprodusibilitas hasilyang diperoleh dibawah kondisi yang bermacam-macam. Dinyatakan dalam %RSD
kekasaran dalam metode dapat terlihatketika metode tersebut sering digunakan
Mis. Pengecekan terhadap kolom kromatografiberbeda pabrik dgn jenis yang sama, dimanasemua faktor dijaga konstan seperti fase gerakdan reagen yang digunakan.
8. Uji Kesesuaian sistem
Serangkaian uji untuk menjamin bahwametode dapat menghasilkan akurasi danpresisi yang dapat diterima. Persyaratankesesuaian sistem biasana dilakukan setelahdilakukan pengembangan metoe dan validasimetode.
61 VMA-2013 [ B ]
System Suitability Test [ FDA ]
Snyder dkk., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Chpt. 12
62 VMA-2013 [ B ]
System Suitability Test
Ermer dan Miller, 2005, p.338.
Top Related