変異原性QSAR
本間 正充
国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部
何故今、変異原性QSARなのか?
医薬品の遺伝毒性不純物のリスク評価と管理への利用 QSARによる変異原性の評価と、TTCによる包括的管理
ICH-M7ガイドライン化(Step2)
化学物質の安全性評価への利用 スクリーニング評価
優先付け
動物愛護(3R)の促進
Base
+
toluene
Pd catalyst/ Ligand 1) conc H2SO4
LiOt-Bu THF
1) NaBH4 / MgCl2 /MeOH
F3C
XCN
NH2
F3C
NH
CN F3C
NH
O
NH2
F3C
NH
O
NH
O
O
2) aqHCl
F3C
NH
HN O
O
F3C
N
HN O
O
OO
Sodium carbonate Tetrahydrofuran
Cl
O
O
F3C
N
N
O
O
O O
F3C CF3
Br
F3C CF3
Methylene chlorideNaOH/TBAB
1)
2) Ethanol/water
2) Ethanol/water
1)
Step 1 Step 2
Step 3 Step 4 Step 5
Step 6
Cl
O
O
X=Cl, Br
3) Ethanol/water
2) toluene/heptane(1) (2)
(3) (4)
(5)
合成過程の合成過程の試薬、反応中間体、副産物
医薬品の分解物
医薬品中に含まれる遺伝毒性不純物とは?
不純物 遺伝毒性?
医薬品の不純物に関するICH品質ガイドライン
ICH Q3A: 原薬の不純物に関するガイドライン ICH Q3B: 製剤の不純物に関するガイドライン
最大一日投与量 構造決定が必要な閾値 安全性確認が必要な閾値 原薬 ≦2 g 0.10% 又は 1 mg/日の低い方 0.15% 又は 1 mgの低い方 >2 g 0.05% 0.05% <1 mg 1.0% 又は 5 μg/日の低い方 1 mg ~10 mg 0.5% 又は 20 μg/日の低い方 10 mg~2 g 0.2%又は2 mg/日の低い方 >2 g 0.10% 製剤 <10 mg 1.0% 又は 5 0 μg/日の低い方 10 mg ~ 100mg 0.5%又は200 μg /日の低い方 100 mg ~ 2 g 0.2%又は3 mg/日の低い方 >2 g 0.15%
直接遺伝毒性 発がん物質
間接遺伝毒性 発がん物質
非遺伝毒性 発がん物質
遺伝毒性からみた発がん物質の特徴
•DNAへ直接作用 •DNA損傷あり •突然変異の誘発あり •閾値なし •不可逆的変化
•DNAへ間接作用 •DNA損傷なし •突然変異の誘発あり •閾値あり •不可逆的変化
•DNAへ間接作用 •DNA損傷なし •突然変異の誘発なし •閾値あり •可逆的変化
放射線 紫外線 アルキル化剤 多環芳香族炭化水素 アフラトキシン 等
塩素化合物 ペルオキシゾーム増殖剤 ホルボールエステル ホルモン類 催眠薬(フェノバルビタール) 等
DNA合成阻害剤 トポイソメラーゼ阻害剤 細胞分裂阻害剤 等
エームス試験
染色体異常試験、小核試験、MLA
(変異原性)
遺伝毒性閾値とTTC
用量
反応
用量
反応
閾値あり化合物 (非遺伝毒性物質)
閾値なし化合物 (遺伝毒性物質)
閾値 閾値なし
用量
反応
閾値を問わない化合物 (遺伝毒性物質)
安全性量 実質安全性量(VSD) 安全性量?
TTC
1.5μg/人/日 ≒0.025μg/kg・bw/day ≒0.5 ppb 未知の化学物質の10%が発がん物質と仮定して、その99%が10-5の発が
んリスクで担保される設定閾値 医薬品に含まれる遺伝毒性/要注意構造を持つ発がん物質(COCは除く)
すべての化学物質について、その値以下では明らかな健康被害がないとするヒトでの包括的な実質安全性閾値(Virtual Safety Dose; VSD)の設定について述べた概念。
毒性学的懸念の閾値 (Thresholds of Toxicological Concern ;TTC)
医薬品遺伝毒性不純物ガイドライン(M7) 一般原則
対象は低レベルでDNAに直接損傷を与える変異原物質のみ
変異原物質はエームス試験で検出できる
エームス試験の結果は(Q)SARによって予測可能である
変異原性が確認された場合はそのレベルを許容水準(TTC
等)以下にしなければならない
ハザード評価
I. 不純物の分類
II. 構造活性相関(SAR) 解析
III. エームス試験
IV. In vivo 試験によるフォローアップ
不純物分類 定義 予想される 管理方法
カテゴリー 1 既知の変異原性発がん物質
カテゴリー 2
原薬の構造に関連しないアラート構造を有する。変異原性データはない。
カテゴリー 3
変異原性を有するが発がん性不明
カテゴリー 4 原薬と類似したアラート構造を有する。原薬の変異原性は試験データは陰性。
カテゴリー 5 構造アラートの特徴なし
TCC or
他の方法
非変異原物質として評価
遺伝毒性不純物の分類と管理方法
構造活性相関((Q)SAR) 解析
互いに相補的な2種類の(Q)SAR予測モデルを用いるべきである。1つは専門的な経験に基づくルールベースの方法、2つ目は統計ベースの手法である。用いられる(Q)SARモデルはOECD原則に従い、バリデーションされるべきである。コンピュー
タシステムに基づいた解析の最終結果は、専門的知識を利用し判断されるべきである。これは、陽性か陰性かの予測結果を支持する追加の証拠を提供すること、および矛盾する結果が生じた場合の原因を理解することに重要である。 2つの相補的な(Q)SAR(ルールベース、統計ベース)により警告構造が無いことが指
摘された場合は不純物に変異原性の懸念は無いと結論するのに十分であり、それ以上、試験は必要ない。
DEREK Oncologic HazardExpert Toxtree
MCASE SciQSAR (MDL-QSAR) TOPKAT ADMEWORKS
ルールベース 統計ベース
DNA反応性不純物の安全性確認のためのフローチャート
不純物含量はTTCレベルを超えているか ?
(Q)SAR?
エームス?
不純物の含量をTTC以下に減らす。もしくはin vivo遺伝子突然変異試験を行い、生体影響を評価する。
はい
はい
陽性
いいえ
いいえ
いいえ
更なる検討は不要
更なる検討は不要
更なる検討は不要
不純物の分類 クラス 4, 5 クラス 1,2
クラス3
TTCもしくは個別管理 非変異原物質として評価
Expert RULE-BASED
Hybrid
Statistical QSAR-BASED
MDL-QSAR,ADME-WORKS,TOPKAT 化学物質の構造を多数のパラメータ (数値データ) に変換し、毒性と相関性の高いパラメータを用い、多変量解析、パターン認識により毒性を予測する。
Derek,OncoLogic,HazardExpert,Toxtree 化合物の構造からその毒性を予測する知識ベース (Knowledge Base) のエキスパートシステム。多くの知見から得られた部分構造活性相関(SAR) の経験則をルール化した知識ベースにより, 定性的毒性予測を行う。
OASIS-TIMES 化合物の構造からその毒性を予測する知識ベース (Knowledge Base) と統計を組み合わせもの。代謝予測機能を持つ。
Multi-Case 化学物質の構造と特徴を表す構造記述子と多数の部分構造 (Biophore) を機械的に検出し、ベイズ統計理論を用いて毒性に関与する構造記述子を選別し、 毒性を予測する。
変異原性(Q)SARツール
医薬品中変異原性不純物評価に推奨される(Q)SAR
EU
USA
Japan, ICH
Complement?
国内製薬企業の利用状況(日本製薬協調査)
“遺伝毒性不純物”の評価には何を使っているか?
DEREK
DEREK or MCASE DEREK + Others
Derek vs. Multi-CASE
購入実績: 41社 (国内4社)、コンサルタント
39件世界のメガファーマ90%以上
使用感 <プラス>
◇ ユーザー独自のDBの作成・編集が容易である。
◇DB間の比較ができる。
使用感 <マイナス>
◇リスクの根拠が分かりづらい。
◇Smiles記法に変換する必要がある。
◇扱える原子種,数が制限される。
購入実績: 03年 = 70社以上 (国内16社)
現在 = 225 sites (国内25sites)
使用感 <プラス>
◇すべての化合物が検索できる。
◇リスクの根拠が明らかである。
◇操作が簡単である。
◇ユーザーの要望に沿い,プログラムが改善される (ユーザー会議)。
使用感 <マイナス>
◇ ユーザー独自のDBの作成・編集が複雑である。
化学物質の安全性評価へのQSAR等の利用の背景
改正化審法(H23年4月施行) ハザード評価からリスク評価へ
既存化学物質を含む全ての化学物質(一般化
学物質:約2万)のスクリーニング評価
優先評価化学物質の絞り込み
(Q)SARの利用 カテゴリーアプローチの利用
国立衛研で化学物質の変異原性評価に利用してい
る(Q)SARツール
DEREK
Multi-Case(MCPC4)
ADMEWorks
(TIMES)
In silico
Ames
+ -
+
-
19
21
7
159
Total
26
180
206 40 166
Sensitivity 73.1 % Specificity 88.3 % Concordance 86.4 %
Applicability: 100.0% (206/206)
159
DEREK
In silico
Ames
+ -
+
-
13
13
7
159
Total
20
146
166 40 140
Sensitivity 65.0 % Specificity 91.1 % Concordance 88.0 %
Applicability: 80.6% (166/206)
133
MCASE In silico
Ames
+ -
+
-
19
54
7
159
Total
26
178
204 73 131
Sensitivity 73.1 % Specificity 69.7 % Concordance 70.1 %
Applicability: 99.0% (204/206)
124
AWORKS
既存化学物質(206)の(Q)SAR予測
Hayashi et al., Mutat Res, 588, 129-135 (2005)
3つの結果の組合せによる評価
DEREK
MCASE
AWORKS
+ + + - - + - - + - + + - - - + + + - + + - - -
Positive Negative Combination 1
DEREK
MCASE
AWORKS
+ + + - - + - - + - + + - - - + + + - + + - - -
Pos. Neg. Combination 2
Inconclusive
Positive Negative
<MW 3,000 Epoxide N
Y Y
N
MCASE DEREK AWORKS
≧2: +ve ≧2: -ve
Positive
Negative
決定樹 (Combination 1)
In silico >++ > --
+ -
19
23
7
147
Total
26 170
196 42 154
Sensitivity 73.1 %
Specificity 86.5 %
Concordance 84.7 %
Applicability 95.1% (196/206)
Am
es
+ -
19
23
7
147
決定樹 (Combination 2)
Positive Negative
<MW 3,000 Epoxide N
Y Y
N
MCASE DEREK AWORKS
=3: +ve =3: -ve
Positive
Negative
Gray
≤2: +ve or
≤2:-ve
In silico +++ ---
+ -
19
23
7
147
Total
15 99
114 18 96
Sensitivity 86.7 %
Specificity 94.9 %
Concordance 93.9 %
Applicability 55.3 % (114/206)
Am
es
+ -
13
5
2
94
DEREKとMCASEによるエームス陽性物質の検出力
DEREK (%)
73.1% (19/26)
61.5% (23/38)
MCASE (%)
65.0% (13/20)
44.7% (18/38)
Snyder, Environ Mol Mutagen 50, 435 (2009)
Hayashi et al., Mutat Res, 588, 129-135 (2005) 一般化学物質
医薬品
Hillebrecht A et al., Comparative Evaluation of in Silico Systems for Ames Test Mutagenicity Prediction: Scope and Limitations., Chem Res Toxicol, 24, 843-853, 2011)
4つの(Q)SARモデルのエームス陽性物質の検出力
香料の変異原性評価
367種類の香料の変異原性評価
偽陰性
367種類の香料の変異原性評価
• エームス陽性の確認(WOE) • 新しいアラートの開発
新しいデータベースの構築
AmesPositive
(189) + judge Sensitivity Applicability
AmesNegative
(709) - judge Specificity Applicability
DEREK Ver.13 188 133 70.7 99.5 707 649 91.8 99.7
Mcase AZ2 158 92 58.2 83.6 656 631 96.2 92.5
ADMEWORKSVer.4 with Ames-Proto1-
5000180 128 71.1 95.2 670 581 86.7 94.5
Ver 2.26.3 In domain 93 81 87.1 49.2 231 207 89.6 32.6
Ver. 2.26.3 in/out of domain 176 125 71.0 93.1 635 489 77.0 89.6
TIMES
一般化学物質+医薬品899化合物からなる新しいデータベースの予測結果
*判定不能もしくは疑陽性を除外した
MOL_NAME_J DEREK MCASE AWORKS 2-ビニルピリジン - Inactive Negative 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸 - Inactive Negative アセトアセトアニリド - Inactive Negative ペロスピロン塩酸塩 - Active Negative ジエチレントリアミン - Inactive Negative 4,4'-ジアミノベンズアニリド - Inactive Positive N-アセトアセチル-p-トルイジン - Inactive Negative 2-アミノ-4-クロロフェ ノール - Active Negative リボフラビン5'-モノホスファートナトリウム - Borderline Positive D-アラボアスコルビン酸 - Inactive Negative 8-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive p,p'-ジベンゾイルキノンジオキシム - Inactive Positive 2,4,6-トリニトロフェ ノール - Active Positive p-アニシジン - Borderline Positive アントラキノン - Active Positive アントラセン - Inactive Positive アセチルアセトン - Inactive Negative チオフェ ノール - Inactive Negative 2-アミノベンゼンチオール - Inactive Negative 2,6-ジアミノピリジン - Active Negative ホスホロクロリドチオ酸O,O-ジメチル - Prob.Inactiv Negative アセト酢酸メチル - Inactive Negative 二酸化チオ尿素 - Prob.Inactiv Positive m-アニシジン - Active Negative o-アニシジン - Borderline Negative L-システイン塩酸塩一水和物 - Inactive Positive 乳酸第1鉄三水和物 - Inactive Negative 2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive アクリル酸2-(ジメチルアミノ)エチルエステル - Inactive Negative 4-(1-メチルエチル)アニリン - Inactive Positive N-フェ ニルマレイミド - Inactive Negative シクロヘキセン - Inactive Negative 2-アミノエタンチオール塩酸塩 - Inactive Positive パラジクロロベンゼン (気体) - Inactive Negative アクリル酸2-ヒドロキシエチル - Inactive Negative 1,1,1-トリクロロエタン (気体) - Inactive Positive イソブチロニトリル - Inactive Negative 2-クロロ -4-ヨードアニリン - Inactive Positive 1-ブロモ-2-ヨードテトラフルオロエタン [気体] - Prob.Inactiv Negative ジチオりん酸 O,O-ジエチル - Prob.Inactiv Negative テモゾロミド - Inactive Positive テノホビルジソプロキシルフマル酸塩 - Prob.Inactiv Negative 4トリフルオロメチルアニリン ;4-アミノベンゾトリフルオリド - Inactive Negative 2,6-ジメチルアニリン - Inactive Positive 2-イミダゾリジンチオン - Inactive Negative 2-ペンチルアントラキノン - Inactive Negative o-ジアニシジン + Active Positive p-ニトロアニソール + Active Positive 1-クロロ -2,4-ジニトロベンゼン + Active Positive 1,4-ジクロロ -2-ニトロベンゼン + Active Negative 2-クロロニトロベンゼン + Active Positive マイトマイシンC + Poss.Activ Positive 2-アセトアミドフルオレン + Active Positive 7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン + Active Positive 2-アミノアントラセン + Active Positive メチルイエロー + Active Positive 2-ブロモプロピオン酸 + Inactive Positive 5-クロロ -2-ニトロアニリン + Active Positive 2-メトキシ-4-ニトロアニリン + Active Positive 1-アミノアントラキノン + Active Positive 2-アミノ-5-ニトロベンゾニトリル + Active Positive 2,4-ジクロロニトロベンゼン + Active Positive クロラニル + Borderline Positive 2,3-ジクロロ -1,4-ナフトキノン + Inactive Positive p-クロロベンゾトリクロリド + Active Positive 1,5-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,8-ジニトロナフタレン + Active Positive p-トルエンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative p-フェ ニレンジアミン + Inactive Positive o-フェ ニレンジアミン + Active Positive 1,3-ジブロモプロパン + Active Positive ヒドラジン [無水] + No Test Negative 1,1-ジメチルヒドラジン + Inactive Positive 2,4-ジアミノトルエン + Active Positive スチレンオキシド + Active Positive 硫酸ジエチル + Active Positive 4,4'-ジアミノジフェ ニルエーテル + Active Positive ブロモ酢酸 + Borderline Positive 2-ブロモプロパン + Inactive Negative 4-ニトロアニリン + Active Positive メチルヒドラジン + Active Positive グリオキサール + Borderline Positive trans-クロトンアルデヒド + Active Positive トルエン -2,6-ジイルジイソシアナート + Borderline Positive トルエン -2,4-ジイルジイソシアナート + Active Positive キノリン + Active Negative o-ニトロアニソール + Active Positive 1-クロロ -2,3-エポキシプロパン + Active Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ジアミノビフェ ニル + Active Positive 2-クロロエタノール + Borderline Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ビフェ ニリレンジイソシアナート + Poss.Activ Positive 3,4-キシリジン + Active Positive 1-ブロモ-3-クロロプロパン + Active Positive 1,2-エポキシシクロヘキサン + Inactive Positive ジニトロソペンタメチレンテトラアミン + Active Positive 3'-アミノ-4'-メトキシアセトアニリド + Active Positive 6-クロロ -2,4-ジニトロアニリン + Active Positive ブロモアセチルブロミド + Prob.Inactiv Positive 3-ニトロアニリン + Active Positive 4-ニトロ -1,2-フェ ニレンジアミン 一塩酸塩 + Active Positive ビス(2-クロロエチル)エーテル + Inactive Positive 塩化メチル(気体) + Active Positive ジクロロメタン (気体) + No Test Positive ヨウ化メチル(気体) + No Test Positive 2-メトキシ-5-メチルアニリン + Active Negative 臭化メチル(気体) + Active Positive 1,4-ジヒドロキシアントラキノン + Active Positive ブロモ酢酸エチル + Active Positive グルタルアルデヒド + Inactive Negative 1-ナフチルアミン + Active Positive 1,3-ブタジエン [気体] + Borderline Negative クロロジフルオロメタン [気体] + Inactive Negative 塩化エチル(気体) + Active Positive 1,2-ジブロモプロパン + Active Positive メタリルクロリド + Inactive Negative 1,5-ジブロモペンタン + Active Negative 1,4-ジブロモブタン + Active Positive 1,4-ジアミノアントラキノン + Active Positive ベンジルクロリド + Inactive Positive フェ ニルヒドラジン + Inactive Positive 1,3,5-トリス(オキシラニルメチル)-1,3,5-トリアジン2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン + Active Positive 9-アミノアクリジン・塩酸塩 + Active Positive + Borderline Positive + Active Positive ベンゾ [a]ピレン + Active Positive シンナムアルデヒド + Inactive Negative 1,2-ジクロロエタン + Borderline Positive 1,3-ジクロロプロペン + Active Positive ジメチルニトロソアミン + Active Positive 1,6-ジニトロベンゾ [a]ピレン + Active Positive 3,6‐ジニトロベンゾ [a]ピレン + Active Positive 1,6-ジニトロピレン + Active Positive 1,8-ジニトロピレン + Active Positive 1-エチル-1-ニトロソ-3-ニトログアニジン + Active Positive "ホルムアルデヒド + No Test Positive フリルフラマイド + Active Positive メチルグリオキサール + Prob.Inactiv Positive ニトロソグアニジン + Active Positive + Active Positive + Active Positive 1-ニトロベンゾ (a)ピレン + Active Positive 3-ニトロベンゾ (a)ピレン + Active Positive + Active Positive + Active Positive 2-ニトロフルオレン + Active Positive 2-アミノアゾトルエン + Active Positive m-フェ ニレンジアミン + Active Positive メトキシメタノール + Inactive Negative 7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 + Inactive Positive 3,4-ジクロロ -1-ブテン + Inactive Positive 2,3-ジメチルアニリン + Active Negative 2-メチル-5-ニトロベンゼンスルホン酸 + Active Negative トリレンジイソシアナート + Active Positive CIピグメントレッド22 + Active Positive ディスパーズレッド206 + Prob.Inactiv Positive 1,2-ジクロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 4-ニトロベンゾイルクロリド + Active Positive 塩化アリル + Active Positive 四塩化炭素(気体) + Inactive Negative クロロホルム(気体) + Inactive Positive 1-クロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 3-クロロプロピオン酸 + Inactive Positive グリシドール + Active Positive 1,3-フェ ニレンジアミン二塩酸塩 + Active Positive テトラクロロエチレン (気体) + Inactive Positive 9-(ヒドロキシメチル)アントラセン + Active Positive モキシフロキサシン塩酸塩 + Active Negative + Borderline Positive アムルビシン塩酸塩 + Active Positive 4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン ) + Inactive Positive 4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド) + Prob.Inactiv Negative 1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタン + Inactive Positive
ジアセチル + (EQUIVOCAL) Inactive Positive
"ホルムアルデヒド + No Test Positive 1,1,1-トリクロロエタン (気体) - Inactive Positive 1,1-ジメチルヒドラジン + Inactive Positive 1,2-エポキシシクロヘキサン + Inactive Positive 1,2-ジクロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 1,2-ジクロロエタン + Borderline Positive 1,2-ジブロモプロパン + Active Positive 1,2-ビス(2-クロロエトキシ)エタン + Inactive Positive 1,3,5-トリス(オキシラニルメチル)-1,3,5-トリアジン2,4,6(1H,3H,5H)-トリオン + Active Positive 1,3-ジクロロプロペン + Active Positive 1,3-ジブロモプロパン + Active Positive 1,3-フェ ニレンジアミン二塩酸塩 + Active Positive 1,3-ブタジエン [気体] + Borderline Negative 1,4-ジアミノアントラキノン + Active Positive 1,4-ジクロロ -2-ニトロベンゼン + Active Negative 1,4-ジヒドロキシアントラキノン + Active Positive 1,4-ジブロモブタン + Active Positive 1,5-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,5-ジブロモペンタン + Active Negative 1,6-ジニトロピレン + Active Positive 1,6-ジニトロベンゾ [a]ピレン + Active Positive 1,8-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,8-ジニトロピレン + Active Positive 1-アミノアントラキノン + Active Positive 1-エチル-1-ニトロソ-3-ニトログアニジン + Active Positive 1-クロロ -2,3-エポキシプロパン + Active Positive 1-クロロ -2,4-ジニトロベンゼン + Active Positive 1-クロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 1-ナフチルアミン + Active Positive 1-ニトロベンゾ (a)ピレン + Active Positive 1-ブロモ-2-ヨードテトラフルオロエタン [気体] - Prob.Inactiv Negative 1-ブロモ-3-クロロプロパン + Active Positive 2,3-ジクロロ -1,4-ナフトキノン + Inactive Positive 2,3-ジメチルアニリン + Active Negative 2,4,6-トリニトロフェ ノール - Active Positive 2,4-ジアミノトルエン + Active Positive 2,4-ジクロロニトロベンゼン + Active Positive 2,6-ジアミノピリジン - Active Negative 2,6-ジメチルアニリン - Inactive Positive 2-アセトアミドフルオレン + Active Positive 2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive 2-アミノ-4-クロロフェ ノール - Active Negative 2-アミノ-5-ニトロベンゾニトリル + Active Positive 2-アミノアゾトルエン + Active Positive 2-アミノアントラセン + Active Positive 2-アミノエタンチオール塩酸塩 - Inactive Positive 2-アミノベンゼンチオール - Inactive Negative 2-イミダゾリジンチオン - Inactive Negative 2-クロロ -4-ヨードアニリン - Inactive Positive 2-クロロエタノール + Borderline Positive 2-クロロニトロベンゼン + Active Positive 2-ニトロフルオレン + Active Positive 2-ビニルピリジン - Inactive Negative 2-ブロモプロパン + Inactive Negative 2-ブロモプロピオン酸 + Inactive Positive 2-ペンチルアントラキノン - Inactive Negative 2-メチル-5-ニトロベンゼンスルホン酸 + Active Negative 2-メトキシ-4-ニトロアニリン + Active Positive 2-メトキシ-5-メチルアニリン + Active Negative 3,3'-ジメチル-4,4'-ジアミノビフェ ニル + Active Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ビフェ ニリレンジイソシアナート + Poss.Activ Positive 3,4-キシリジン + Active Positive 3,4-ジクロロ -1-ブテン + Inactive Positive 3,6‐ジニトロベンゾ [a]ピレン + Active Positive 3'-アミノ-4'-メトキシアセトアニリド + Active Positive 3-クロロプロピオン酸 + Inactive Positive 3-ニトロアニリン + Active Positive 3-ニトロベンゾ (a)ピレン + Active Positive 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸 - Inactive Negative 4-(1-メチルエチル)アニリン - Inactive Positive 4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド) + Prob.Inactiv Negative 4,4'-ジアミノジフェ ニルエーテル + Active Positive 4,4'-ジアミノベンズアニリド - Inactive Positive 4,4'-メチレンビス(2-クロロアニリン ) + Inactive Positive 4トリフルオロメチルアニリン ;4-アミノベンゾトリフルオリド - Inactive Negative 4-ニトロ -1,2-フェ ニレンジアミン 一塩酸塩 + Active Positive 4-ニトロアニリン + Active Positive 4-ニトロベンゾイルクロリド + Active Positive 5-クロロ -2-ニトロアニリン + Active Positive 6-クロロ -2,4-ジニトロアニリン + Active Positive 7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン + Active Positive 7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 + Inactive Positive 8-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive 9-(ヒドロキシメチル)アントラセン + Active Positive 9-アミノアクリジン・塩酸塩 + Active Positive CIピグメントレッド22 + Active Positive D-アラボアスコルビン酸 - Inactive Negative L-システイン塩酸塩一水和物 - Inactive Positive m-アニシジン - Active Negative m-フェ ニレンジアミン + Active Positive N-アセトアセチル-p-トルイジン - Inactive Negative N-フェ ニルマレイミド - Inactive Negative o-アニシジン - Borderline Negative o-ジアニシジン + Active Positive o-ニトロアニソール + Active Positive o-フェ ニレンジアミン + Active Positive p,p'-ジベンゾイルキノンジオキシム - Inactive Positive p-アニシジン - Borderline Positive p-クロロベンゾトリクロリド + Active Positive p-トルエンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative p-ニトロアニソール + Active Positive p-フェ ニレンジアミン + Inactive Positive trans-クロトンアルデヒド + Active Positive アクリル酸2-(ジメチルアミノ)エチルエステル - Inactive Negative アクリル酸2-ヒドロキシエチル - Inactive Negative アセチルアセトン - Inactive Negative アセトアセトアニリド - Inactive Negative アセト酢酸メチル - Inactive Negative アムルビシン塩酸塩 + Active Positive アントラキノン - Active Positive アントラセン - Inactive Positive イソブチロニトリル - Inactive Negative キノリン + Active Negative グリオキサール + Borderline Positive グリシドール + Active Positive グルタルアルデヒド + Inactive Negative クロラニル + Borderline Positive クロロジフルオロメタン [気体] + Inactive Negative クロロホルム(気体) + Inactive Positive
ジアセチル + (EQUIVOCAL) Inactive Positive
ジエチレントリアミン - Inactive Negative シクロヘキセン - Inactive Negative ジクロロメタン (気体) + No Test Positive ジチオりん酸 O,O-ジエチル - Prob.Inactiv Negative ジニトロソペンタメチレンテトラアミン + Active Positive ジメチルニトロソアミン + Active Positive シンナムアルデヒド + Inactive Negative スチレンオキシド + Active Positive チオフェ ノール - Inactive Negative ディスパーズレッド206 + Prob.Inactiv Positive テトラクロロエチレン (気体) + Inactive Positive テノホビルジソプロキシルフマル酸塩 - Prob.Inactiv Negative テモゾロミド - Inactive Positive トリレンジイソシアナート + Active Positive トルエン -2,4-ジイルジイソシアナート + Active Positive トルエン -2,6-ジイルジイソシアナート + Borderline Positive ニトロソグアニジン + Active Positive パラジクロロベンゼン (気体) - Inactive Negative ビス(2-クロロエチル)エーテル + Inactive Positive ヒドラジン [無水] + No Test Negative フェ ニルヒドラジン + Inactive Positive フリルフラマイド + Active Positive ブロモアセチルブロミド + Prob.Inactiv Positive ブロモ酢酸 + Borderline Positive ブロモ酢酸エチル + Active Positive ペロスピロン塩酸塩 - Active Negative ベンジルクロリド + Inactive Positive ベンゾ [a]ピレン + Active Positive ホスホロクロリドチオ酸O,O-ジメチル - Prob.Inactiv Negative マイトマイシンC + Poss.Activ Positive メタリルクロリド + Inactive Negative メチルイエロー + Active Positive メチルグリオキサール + Prob.Inactiv Positive メチルヒドラジン + Active Positive メトキシメタノール + Inactive Negative モキシフロキサシン塩酸塩 + Active Negative ヨウ化メチル(気体) + No Test Positive リボフラビン5'-モノホスファートナトリウム - Borderline Positive 塩化アリル + Active Positive 塩化エチル(気体) + Active Positive 塩化メチル(気体) + Active Positive 四塩化炭素(気体) + Inactive Negative 臭化メチル(気体) + Active Positive 二酸化チオ尿素 - Prob.Inactiv Positive 乳酸第1鉄三水和物 - Inactive Negative 硫酸ジエチル + Active Positive + Borderline Positive + Active Positive + Active Positive + Active Positive + Active Positive + Active Positive
相補性? ルールベース vs. 統計ベース
169エームス 陽性物質
物質名 DEREK MCASE AWORKS 物質名 DEREK MCASE AWORKS
DEREK(-)
DEREK(+)
46物質 M(-)/A(-): 24 (52%) M(+)/A(+): 4 (9%) M(+)/A(-): 5 (11%) M(-)/A(+): 13 (28%)
M: MCASE A: AWORKS
M(-)/A(-): 8 (7%) M(+)/A(+): 89 (72%) M(+)/A(-): 8 (7%) M(-)/A(+): 18 (15%) 123物質
エームス試験以外の遺伝毒性QSAR
In vitro染色体異常試験の予測 DEREK MCASE AWORKS TIMES
In vivo遺伝毒性試験の予測 DEREK TIMES
既存化学物質の染色体異常試験結果の予測
In silico
Chr
om. a
b.
+ -
+
-
60
29
34
159
Total
94
115
209 89 120
Sensitivity 63.8 % Specificity 74.8 % Concordance 69.9 %
Applicability: 95.4 % (209/219)
86
DEREK
In silico + -
+
-
55
10
30
159
Total
85
92
177 65 112
Sensitivity 64.7 % Specificity 89.1 % Concordance 77.4 %
Applicability: 80.8 % (177/219)
82
MCASE In silico
+ -
+
-
71
46
27
1
Total
98
115
213 117 96
Sensitivity 72.4 % Specificity 60.0 % Concordance 65.7 %
Applicability: 97.3 % (213/219)
69
AWORKS
Chr
om. a
b.
Chr
om. a
b.
in vivo liver genotoxicity
in vivo MN genotoxicity
not active
Level I Level II Level III
in vitro mutagenicity
not active not active
active
not active not active
(detoxification)
active
not active
(bio-exhausting)
active
chemical
In vivo遺伝毒性予測のためのフロー(1)
Mekenyan et al. Investigating the relationship between in vitro - in vivo genotoxicity: Derivation of mechanistic QSAR models for in vivo liver genotoxicity and in vivo bone marrow micronucleus formation which encompass metabolism. Chem Res Toxicol. 25, 277-296 (2012)
in vivo liver Genotoxicity Comet, UDS,
TRMA
in vivo MN bone marrow genotoxicity
Level I Level II Level III in vitro
Mutagenicity AMES (with S9),
CA, MLA
33 negative 31 negative 30 negative
125 positive 40 negative 34 negative
85 positive 32 negative
53 positive
162 chemical 2 positive
1 positive
2 negative
6 positive
In vivo遺伝毒性予測のためのフロー(2)
in vivo liver Genotoxicity Comet, UDS,
TRMA
in vivo MN bone marrow genotoxicity
Level I Level II Level III in vitro
Mutagenicity AMES (with S9),
CA, MLA
33 negative 31 negative 30 negative
125 positive 40 negative 34 negative
85 positive 32 negative
53 positive
2 positive
1 positive
2 negative
6 positive
Cl
CH3
O
CH3
CH3O
O
CH3
O
H
H
H
HH
Level II
Liver bioactivation
Cyproterone acetate
In vivo遺伝毒性予測のためのフロー(3)
Cyproterone acetateの遺伝毒性発現経路
Cyproterone acetate
TIMESの遺伝毒性予測能力
in vivo liver genotoxicity
in vivo MN genotoxicity
Level I Level II Level III
in vitro mutagenicity
Sensitivity: 85% Specificity: 49%
Sensitivity: 82% Specificity: 61%
Sensitivity 73% Specificity 78%
Sensitivity 75% Specificity 56%
<Ames with metabolic activation>
<CA with metabolic activation>
<Liver UDS, Comet, TGR> <Bone marrow MN>
変異原性・遺伝毒性予測の問題点
遺伝毒性試験は発がん性を予測できるのか?
・遺伝毒性試験結果は発がん性試験結果と一致するか?(定性的予測)
・遺伝毒性の程度は発がん性の程度と相関するか?(定量的予測)
・げっ歯類の発がん性はヒトでの発がん性と相関するのか?
遺伝毒性試験
げっ歯類発がん性試験
ヒト発がん性
遺伝毒性QSAR
ラットとマウスによる発がん性試験の相関性
ラット
+ + - -
マウス + - + -
1989*1
67 32 36 131
74%(198/266)
1999*2
111 47 54 180
74%(291/392)
発がん性
一致率
*1 Haseman, JK et al., Environ Health Perspect., 74, 229-235, 1987 *2 NTP, January 1999
エームス
58.8
73.9
54.0
79.0
MLA
73.1
39.0
74.0
32.0
染色体 異常
65.6
44.9
52.0
68.0
小核 (Vitro)
78.7
30.8
小核 (Vivo)
28.0
82.0
感度 特異性 感度 特異性
Krikland et al., Mutat. Res. 584, 1, 2005
Zeiger Reg. Tox. Pharm. 28, 85, 1998
報告
遺伝毒性試験とげっ歯類発がん性試験の相関性
エームス試験の強さは発がん性の強さと相関するか?
リスクの緩和
一般化学物質と医薬品不純物の化学物質構造の比較
一般化学物質 医薬品中不純物して検出しうる化合物
(Galloway et al, in preparation)
Alert Name
Number in
CPDB % in CPDB
Number in Synthetic Routes
% in Synthetic Routes
Daily dose Resulting in a 1 in 100,000 Excess Cancer Risk (µg)
Min. 10% 25% Med. 75% 90% Max.
Aromatic amine or amide, N hydroxylamine 43 21.6 125 20.8 0.40 0.824 2.30 14.94 67.71 279.24 3636
N-Nitro or N-nitroso compound 34 17.1 0 0.0 0.009 0.04 0.098 0.35 2.81 8.98 38.52 Aromatic nitro compound 33 16.6 88 14.6 0.017 0.77 4.95 13.68 139.80 296.88 793.20
Alkylating agent 19 9.5 156 25.9 2.94 3.65 6.65 45.36 79.95 1149 1656
Aromatic azo compound 9 4.5 8 1.3 1.13 1.13 1.95 4.62 73.02 844.80 844.80
Epoxide 5 2.5 13 2.2 1.79 1.79 5.355 36.84 36.84 36.84 36.84
Halogenated alkene 5 2.5 0 0.0 0.44 0.44 2.865 12.24 20.1 21.48 21.48
構造クラス別の許容レベル(10-5リスク)とその分布
(Galloway et al, in preparation)
まとめと展望
医薬品不純物の変異原性の評価に(Q)SARを用いることが国際ガイドラインに組み入れられた。この流れは(Q)SARの利用、研究の追い風となる。
(Q)SARによる予測率の向上は、試験データの量と質が重
要である。産官の協力により大量化学物質データベースの構築が望まれる。
遺伝毒性(Q)SAR結果は遺伝毒性の有無だけでなく、構造
に依存した遺伝毒性や、発がん性の程度を提供することにより、リスク評価、管理に利用できる。
遺伝毒性メカニズムに基づく(Q)SARモデルにより、特定のエンドポイントの予測を超えた遺伝毒性の予測が可能となる。
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