Temel Kromatografi ve Separasyon Teknikleri ile
Uygulamalı Gaz Kromatografi Kursu
23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
T.C.ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ
VETERİNER FAKÜLTESİ FARMAKOLOJİ-TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI
Yrd.Doç.Dr. Y.Kürşad DAŞ
TEMEL KROMATOGRAFİ
TÜRLERİ ve
PRENSİPLERİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
3-128
Kromatografi Nedir?
Kromatografi karışım halindeki maddeleri analiz etmek, tanımlamak, saflaştırmak ve karışım içerisindeki miktarını ölçmek amacı ile bileşenlerine ayırmak için kullanılan bir tekniktir.
Ayırma
• Analiz
• Tanımlama
• Saflaştırma
• HesaplamaBileşenlerKarışım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
4-128
Kromatografinin Detaylı Tanımı
Kromatografi bir karışım içerisindeki bileşenleri hareketli ve sabit faz içinden geçirirken bu fazlara değişik ilgilerinden yararlanarak ayrımlarını sağlayan bir laboratuvar tekniğidir.
Diğer bir ifade ile kromatografi karışımı oluşturan bileşenleri hareketli faz veya sabit faza olan ilgilerinin farkı dolayısı ile ayrımını sağlayan bir yöntemdir.
Açıklamak gerekirse:• Bileşikler öncelikle sabit fazda tutulur.• Hareketli faz sabit faz boyunca geçirilir.• Hareketli faz sabit fazdan geçerken bileşikleri çözer.• Hareketli faz her bileşiği sabit fazdan alarak belli aralıklarla ilgisi dolayısı ile taşır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
5-128
Kromatografinin Detaylı Tanımı
Kromatografi türüne göre hareketli faz:
• Gaz kromatografide: Azot, helyum vb gazlar.
• Likit kromatografide: Su, Metanol, Asetonitril vb çözücülerdir.
Kromatografi türüne göre değişmekle beraber sabit fazlar kolon iç kaplama maddesidir. Bu da
• Fenil metil silikon (GC),
• Oktadesil, n-desil (HPLC)
• İnce tabaka kromatografisinde silika-jel gibi maddelerdir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
6-128
Kromatografinin tarihçesi
• Geleneksel anlamda kromatografi ilk defa 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail S. Tswett (1872-1919) tarafından uygulanmıştır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
7-128
Kromatografinin tarihçesi
• 1850’li yıllarda Schönbein ilk defa kağıt kromatografisini uygulamıştır.• 1903 yılında Goppelsroeder kağıt parçacıklarını kullanarak alkaloid, boya, süt, yağ ve şarapta analizler yapmıştır.• 1906 yılında Rus botanikçi M.Tswett bitki ekstraklarından klorofili saflaştırarak kromatografiyi ilk defa bilimsel olarak kullanan kişi olarak tarihe geçmiştir.• 1913 yılında zeolitler ilk defa suyun yumuşatılması amacı ile kullanılmıştır.• 1922 yılında Palmer karotenoidleri yağlardan ayırmayı başarmıştır.• 1937 yılında Taylor ve Urey lityum izotoplarını iyon değişim kromatografisi ile ayrımını sağlamışlardır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
8-128
Kromatografinin tarihçesi
• 1938 yılında Izmailov ve Sharaiber ince tabaka kromatografisine temel oluşturan, yatay ince kağıtlara damla kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1941 yılında Martin ve Synge aminoasitleri silika-jelden geçirirken sıvı-sıvı dağılım kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1945 yılında Gaz-katı adsorbsiyon kromatografisi kömür kolon kullanılarak oksijen ve karbondioksitin ayrımı yapılarak tanımlanmıştır.• 1948 yılında Boldingh uzun zincirli yağ asitlerinin ayrımını yaparken ters (reverse) faz kromatografisini keşfetmiştir.• 1953 yılında Wheaton ve Baurman iyon-çıkarma kromatografisini keşfetmiştir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
9-128
Kromatografinin tarihçesi
• 1955 yılında ABD’de Burrel Corp., Perkin-Elmer ve Podbielniak Şirketleri tarafından gaz kromatografi ilk kez tanıtılmıştır.• 1958 yılında Stein, Moore ve Spackma iyon değişim kromatografisinde otomize aminoasit analizlerini gerçekleştirmişlerdir.• 1960 yılında Desty ilk kez kapillar kolonu gaz kromatografide kullanmıştır.• 1966 yılında Green iyon değişim kromatografisinde otomize karbonhidrat analizlerini gerçekleştirmiştir.• 1966 yılında Horvath ve Lipsky Yale Üniversitesinde Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisini (HPLC) keşfetmişlerdir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
10-128
Kromatografinin tarihçesi
• 1974 yılında Virtanen ticari kapillar elektroforezi geliştirmiştir.• 1975 yılında Small, Stevens ve Bauman katyon değişimli iyon kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1981 yılında Novotny ve Lee kapillar süper krtik kromatografi içeren mikrokolon likit kromatografi yöntemini keşfetmilerdir.• 1985 yılında Dionex Şirketinde araştırmacı olan Pohl iyon kromatografide kullanılan mikromembran supressorları keşfetmiştir.• 1990 yılında Perkin-Elmer Şirketi perfüzyon kromatografisini tanıtmıştır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
11-128
Kromatografinin kullanım alanları
Kromatografinin Bilimsel amaçlarla kullanıldığı alanlar
• Analiz – Bir karışımı, karışımı oluşturan bileşenleri ve birbirlerine oranını inceleme işidir.
• Tanımlama – Bilinen bileşikler kullanılarak karışım içerisindeki bileşenlerin tanımlanmasıdır.
• Saflaştırma – Karışım içerisindeki bileşenlerden birisini daha ileri araştırmalarda kullanmak amacı ile ayrılmasıdır.
• Miktar tayini – Karışımda bulunan bileşenlerin ayrımından sonra referans standartlar kullanarak miktarlarının belirlenmesidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
12-128
Kromatografinin kullanım alanları
Kromatografinin Günlük Yaşamda Kullanımı
• İlaç Şirketleri – Yeni geliştirilen ilaçlarda her bir kimyasal maddenin miktarını belirlemek
• Hastaneler – Hastalardan elde edilen biyolojik örneklerde ilaç seviyelerinin belirlenmesi ve zehirlenmelerin teşhisi
• Hukuki Uygulamalar – Elde edilen delillerden suç teşkil edilecek şüpheli materyalin tespit edilmesi
• Çevre Uygulamaları – Su, hava, toprak ve bitki örneklerinden kirletici maddelerin belirlenmesi
• Bitkisel Özütleme – Bitkisel üründen elde edilecek maddenin saflaştırılması
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
13-128
Kromatografide Yöntem Seçimi
• Karışım içerisinde kromatografik analizi hedeflenen bileşiğe göre ve kromatografik yöntemler seçilir.
• Modern kromatografilerden gaz ve sıvı kromatografiler analiz edilecek bileşiğin özelliğine göre seçilir.
• Gaz kromatografide maddenin analiz sıcaklık derecelerinde uçucu olması istenir. Pratik olarak 500 amu’dan daha az atom ağırlığına sahip maddelerin gaz kromatografiye uygulanması uygundur.
• Sıvı kromatografide ise bileşiğin uçucu olması gerekmez, ancak hareketli fazda çözünmesi istenir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
14-128
Kromatografide Yöntem Seçimi
• Sıvı kromatografi uygulamalarında bileşiğin atom ağırlığı ve polaritesine göre yöntem seçimi şekilde gösterilmiştir.
KAĞIT KROMATOGRAFİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
16-128
Kağıt Kromatografi Prensibi
• Kılcal etki
• Delikli bir materyal içindeki sıvının hareketi yapışma, tutunma ve yüzey gerilimine bağlı olarak şekillenir.
• Sıvı filtre kağıdının çekimi yer çekiminden fazla olduğu için yukarı doğru hareket eder.
• Çözünme özelliği
• Bu değer bir maddenin bir çözücü içerisinde çözünme derecesini ifade eder.
• Çözücü içerisinde çözünen maddeler benzer özelliklere sahiptirler. Bu da farklı çözünme özelliği olan maddelerin değişik çözücü bileşimleri kullanarak ayrılmalarına olanak sağlar.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
17-128
Kağıt Kromatografi Prensibi
• Kağıt kromatografisinde bileşiklerin ayrımı (separasyonu) hareketli fazda çözünme ile hareketli faza ve sabit faza olan farklı ilgileri ile sağlanır.
• Kağıt kromatografisi daha çok bir sıvı-sıvı kromatografisi olarak adlandırılır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
18-128
Bileşikler Sabit faza ilgi derecesi Hareketli faza ilgi derecesi
Mavi ---------------- Hareketli fazda çözünmez
Siyah
Kırmızı
Sarı
Mixture Components
Ayrım
Sabit faz
Hareketli faz
Kağıt Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
19-128
Kağıt Kromatografide Ayrım
İNCE TABAKA
KROMATOGRAFİSİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
21-128
İnce Tabaka Kromatografi Prensibi
• Kağıt kromatografisine benzer olarak uygulanan ince tabaka kromatografisi ise bir sıvı-katı kromatografisidir.
• Bu yöntemde sabit faz, cam plaka üzerine sıvanmış bir katıdır.
• Sabit faz olarak,
• Silikajel,
• Talk,
• Alüminyum oksit,
• Toz selüloz,
• Diatomeli toprak gibi maddeler kullanılır.
• Bunlar suyla bulamaç haline getirilerek özel olarak hazırlanmış genellikle 20 x 20 cm boyutlarında cam yada alüminyum levhalar üzerine ince bir tabaka halinde yayılıp kurutulurlar.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
22-128
İnce Tabaka Kromatografi Prensibi
• Hazırlanan plakalar örnek karışımı uygulandıktan sonra çözücü buharı ile doyurulmuş tanka hazırlanmış ince tabaka dik olarak yerleştirilip ağzı kapatılır.
• Karışımdaki bileşenlerin hareketli faz ile birlikte sürüklenmesi beklenir.
• Karışımdaki bileşenlerin moleküler yapılarının farklılığı sürüklenme hızlarının da farklı olmasını gerektirir.
• Böylece sürüklenme hızları birbirinden farklı olan maddeler tabakada farklı bölgelerde lekeler oluşturur.
• Bu lekelerin rengi normal ışıkta görünemiyorsa özel lambalar altında da gözlenebilir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
23-128
İnce Tabaka Kromatografi Prensibi
• İnce tabaka plakasında belli bir süre sonra, bileşenlerin yol aldığı uzaklık ile çözücünün ulaştığı uzaklığın oranı alıkonma faktörü (Retardation factor, Rf) olarak bilinir.
• Bu değerler kalitatif analizde kullanılır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
24-128
İnce Tabaka Kromatografisinde Ayrım
KOLON KROMATOGRAFİSİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
26-128
Kolon Kromatografi Prensibi
• Kolon kromatografisinde karışımdaki maddelerin ayrımı (separasyonu) belli uzunluktaki cam veya metal kolonlar (borular) içinde gerçekleştirilir.
• Bu kolonlar dolgu maddesi (gözenekli bir katı) ile iyice doldurulurlar.
• Böyle bir dolguya "sabit faz" veya "kolon" denir.
• Sistem ya bu haliyle kullanılır veya bu katıya bir sıvı emdirilir ve bu sıvı bir sabit sıvı faz gibi işlem görür.
• Ayrılması istenen karışım, kolonun bir ucundan uygulanır ve üzerine dikkatlice sıvı faz eklenir. Kolonun altındaki musluk açıldığında sıvı faz "hareketli faz"ı oluşturur.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
27-128
Kolon Kromatografi Prensibi
• Karışımda bulunan maddeler, kolonun bir ucundan diğer ucuna kadar hareketli faz ile sürüklenerek taşınır.
•Bu taşınma sırasında karışımdaki maddeler, dolgu maddesi ile etkileşmesi nedeniyle sabit faz tarafından bir miktar tutulur.
• Bu tutulma karışımdaki farklı maddeler için farklı miktarlarda olur.
• Karışımdaki maddeler sabit faz ile hareketli faz arasında belli bir dağılım gösterirler.
• Bir A maddesinin sabit faz ile hareketli faz arasındaki dağılımı, AH AS dengesine göre oluşur ve A maddesinin iki fazdaki yoğunluklarının oranına, dağılma katsayısı, K denir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
28-128
Kolon Kromatografi Prensibi
• KA= CS şeklinde verilir.
CH
• CS: A maddesinin sabit fazdaki yoğunluğu
• CH: A maddesinin hareketli fazdaki yoğunluğu
• Karışımdaki A maddesi, kolon boyunca yavaş ilerliyorsa sabit fazda iyi tutulmuş demektir. Bu durumda K değeri büyük olur.
• Tersine A maddesi kolon içersinde hızla ilerliyorsa,hareketli faza ilgisi fazladır ve K değeri küçük olur.
• Bir karışımda bulunan maddelere ait K değerlerinin farklı olması bunların kolon boyunca birbirlerine göre farklı hızlarda ilerlemelerine neden olur.
• Böylece maddeler kolondan farklı zamanlarda ayrılırlar.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
29-128
Kolon Kromatografisinde Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
30-128
Kolon Kromatografisinde Ayrım
GAZ KROMATOGRAFİ
(GC)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
32-128
Gaz Kromatografi Prensibi
• Karışımda bulunan maddeler gaz kromatografi cihazına enjekte edilir.
• Enjekte edildikleri bölgede (enjeksiyon portu) yüksek sıcaklık uygulanarak bileşikler buhar haline getirilir.
• Kolon başlangıç sıcaklık derecesi düşük tutularak bileşikler tekrar katı hale geçer ve sabit fazda tutulurlar.
• Zamana bağlı olarak kolon fırın sıcaklığı artırılır.
• Sıcaklık derecesi arttığında buharlaşma derecesine ulaşan bileşikler dedektöre giderek tespit edilir.
• Her bileşiğin buharlaşma ve sabit faza ilgi derecesinin farklı olması ve ile ayrımları (separasyon) sağlanmış olur.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
33-128
Gaz Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
34-128
Gaz Kromatografide Ayrım
LİKİT KROMATOGRAFİ (LC)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
36-128
Likit Kromatografi Prensibi
• Likit kromatografide hareketli fazda çözünmüş bileşikler, kolon içerisinde sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler.
•Kolonu değişik zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar.
• Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir.
• Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir.
• Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPLC) denir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
37-128
Likit Kromatografi Birimleri
Likit kromatografi aşağıdaki temel birimlerden oluşur:
• Hareketli/Taşıyıcı Faz Deposu
• Taşıyıcı Faz Hareket Birimi; Pompa(lar)
• Enjeksiyon (Örnek Yükleme) Birimi
• Ayırma Birimi ; Kolon(lar)
• Ölçüm Birimi; Dedektör(ler)
• Yazım Birimi; kaydedici, İntegratör
• Atık Deposu
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
38-128
Likit Kromatografi Birimleri
Hareketli faz
• Sıvı kromatografisinde ayırmaya etki eden değişkenlerden bir tanesi hareketli fazdır. İyi bir hareketli faz;
• Sabit fazın özelliklerini değiştirmemeli,
• Örnekteki bileşenlerin hepsini çözmeli,
• Düşük viskozitede olmalı,
• Gerektiğinde ayrılan bileşenlerden kolayca ayrılabilmeli (kolayca buharlaşabilmeli),
• Kullanılan dedektöre uygun olmalı,
• Ekonomik ve istenen saflıkta kolayca bulunabilir olmalıdır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
39-128
Likit Kromatografi Birimleri
Hareketli faz
• Yüksek basınçta yapılan kromatografide, sisteme verilmeden önce, hareketli fazın içerisindeki çözünmüş gazlar uzaklaştırılmalıdır (Degase);
• Aksi takdirde sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörde, çözünmüş gazlar (özellikle hava) kabarcık oluşturur.
• Bu durum, dedektörden hatalı değerler alınmasına neden olur.
• Hareketli fazdan gaz uzaklaştırma işlemi (degase) ısıtma, vakum uygulama yada Ultrasonik banyoda bekletme ile sağlanır.
• Ayrıca hareketli faz hazırlanırken filtre kağıdından süzülmelidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
40-128
Likit Kromatografi Birimleri
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
41-128
Likit Kromatografi Birimleri
Pompa
• Hareketli fazı kolona gönderen pompadır. Hareketli faz pompalama sistemi, vuruntusuz akış oluşturmak üzere çift pistonlu bir pompa içerir. Pistonların biri emerken diğeri bastığından LC için çok önemli olan düzgün akış elde edilir.
• Pompa debisi 0.1 ml/dk hassasiyetle ayarlanabilir.
• Pompa hareketli faz deposundan aldığı çözücüyü önce enjeksiyon sistemine gönderir. Örneğin rahat yüklenmesi ve hareketli faz akışının enjeksiyondan etkilenmemesi için örnek çok uçlu bir vananın içerdiği loop’a verilir. Vananın pozisyonu değiştirilerek hareketli fazın loop’tan geçmesi ile enjeksiyon sağlanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
42-128
Likit Kromatografi Birimleri
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
43-128
Likit Kromatografi Birimleri
Kolon• Çözücü enjeksiyon sisteminden geçtikten sonra, LC sisteminin ayırma birimi olan kolona gelir. LC kolonları paslanmaz çelik veya kartuş şeklindedir. • Analitik ya da preparatif amaçlı olabilirler. Analitik kolonlar, yani kantitatif analiz amaçlı olanlar 2-8 mm iç çaplıdırlar ve uzunlukları içerdikleri dolgu tipine göre 10-100 cm arasında değişir. • Bir karışım içinde istenen bileşenleri ayırarak elde etmeye yönelik olan preparatif kolonlar genellikle 6 mm çaplı 25-100 cm uzunluğunda kolonlardır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
44-128
Likit Kromatografi Birimleri
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
45-128
Likit Kromatografi Birimleri
Kolon
•LC türleri kullanılan kolona göre aşağıdaki gibi sınıflandırılır.
• Adsorpsiyon (Sıvı-Katı) Kromatografi
• Partitisyon (Sıvı-Sıvı) Kromatografi
• İyon Değişimi Kromatografi
• Jel Filtrasyon Kromatografi
• Affinite Kromatografi
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
46-128
Likit Kromatografi Birimleri
Dedektör
• Kolonda birbirinden ayrılan maddeler taşıyıcı faz ile birlikte ölçüm birimi olan dedektöre gelirler.
• Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. Bu amaçla;
• Absorbans Dedektörü (UV),
• Floresans Dedektörü (FLD),
• Kırılma İndisi Dedektörü (RI),
• Elektrokimyasal Dedektör (ECD) ve
• İletkenlik Dedektörü (TCD) kullanılabilir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
47-128
Likit Kromatografi Birimleri
Dedektör
• Absorbans dedektörlerin (UV): Akış hücrelerinden geçen sıvının sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki ışığı absorpsiyonunu ölçerler.
• Floresans dedektörler (FLD): Belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler.
• Kırılma indisi dedektörleri (RI): Akış hücrelerinden geçen akımın kırılma indisini ölçerler.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
48-128
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
49-128
Ayırma, durgun faz ile hareketli faz arasındaki göçe bağlıdır.
Sabit Faz – Kolon içerisinde sabit duran faz ör. C18, Silica
Hareketli Faz – Numuneyi durgun faz üzerinde taşıyan fazdır.
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Karıştırıcı
Pompalar
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Atık
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
50-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Karıştırıcı
Pompalar
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
51-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Karıştırıcı
Pompalar
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
52-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
53-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
54-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
55-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
56-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
57-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
58-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
59-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
60-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
61-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
62-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
63-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
64-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
65-128
Enjektör
Detektör
Kolon
Solvan
Pompalar
Karıştırıcı
Kromatogram
Enjeksiyon
mAU
zaman
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi
Likit Kromatografide Ayrım
İYON DEĞİŞİMİ
KROMATOGRAFİSİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
67-128
İyon değişimi Kromatografi Prensibi
• Çözeltideki iyonların ters yüklü destek katısı iyonlarına olan ilgisine dayalı bir ayırmadır.
• Durgun faz zayıf ya da kuvvetli, katyon ya da anyon değiştirici bir reçinedir.
• Reçinenin sabit yükü (-) ise buna ‘katyon değiştirici reçine’,
• (+) ise de ‘anyon değiştirici reçine’ adı verilir.
• Analiz sırasında reçinenin tamamen iyonlaşmış durumda olması gerekmektedir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
68-128
İyon değişimi Kromatografi Prensibi
• Hareketli faz genellikle tamponlanmış: istenen iyonların oluşmasına neden olan belli bir pH değerinde sulu çözeltidir ve yükü katının sabit yükünün tersi olan ‘zıt iyonu’ içerir.
• Yükü, hareketli fazın zıt iyonları ile aynı olan iyonik yapıdaki örnek bileşenleri katıya bağlanmak için zıt iyonlarla yarışırlar.
• Zıt iyonu yerinden ederek katıya kuvvetle bağlanan uygun yükte bileşikler kolonda uzun süre kalırken,
• Katıya zayıfça bağlanan, uygun yükte olmayan veya yüksüz olan bileşikler kolonu çabuk terk eder.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
69-128
İyon değişimi Kromatografisinde Ayrım
JEL PERMESYON VE
JEL FİLTRASYON
KROMATOGRAFİSİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
71-128
Jel Permesyon ve Jel Filtrasyon
Kromatografi Prensibi
•Jel permesyon kromatografi (GPC) temeli önek içerisindeki maddelerin son derece poröz yapıdaki sabit faz parçacıklarının içerisine girme eğilimi göstermelerine göre ayrımlarının sağlanmasına dayanır.
•Örnek içerisinde Farklı büyüklüklerdeki madde moleküllerinin sabit fazı oluşturan jel porlarına girişleri de değişiklik gösterecektir.
• Küçük çaplı moleküller sabit fazın içermiş olduğu porlara girerek uzun süre tutu kalacaklardır.
•Dolayısı ile sabit faz tarafından tutulamayan büyük moleküllerin kolondan geliş zamanı daha önce olacaktır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
72-128
Jel Permesyon ve Jel Filtrasyon
Kromatografi Prensibi
• Jel permesyon kromatografisinde hareketli faz hidrofobik bir çözücüden oluşmaktadır.
•Aynı prensibe uyan jel filtrasyon kromatografisinin (GFC) jel permesyon kromatografisinden farkı ise hareketli fazın hidrofilik olmasıdır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
73-128
Jel Permasyon ve Jel Filtrasyon
Kromatografisinde Ayrım
AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
75-128
Affinite Kromatografi Prensibi
•Affinite kromatografide ayrımı sağlayacak kolon özel bağlayıcı uç içeren sabit fazla doldurulmuştur.
• Bu sabit faz bağları kolona yüklenen örnek karışımındaki maddeleri farklı derecelerde bağlarlar.
• Kolon sabit fazına bağlanmayan maddeler ilk yıkama solüsyonu ile kolondan elue edilir.
• Zayıf bağlanan bileşikler diğer bir yıkama solüsyonu ile elde edilir.
• En son kolona sıkıca bağlanmış olan maddeler çözücü ile yıkanır ve saf olarak elde edilir.
• Affinite kromatografisi genel olarak proteinlerin saflaştırılması amacı ile kullanılır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
76-128
Affinite Kromatografisinde Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
77-128
Affinite Kromatografisinde Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
78-128
Affinite Kromatografisinde Ayrım
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
79-128
Affinite Kromatografisinde Ayrım
KÜTLE SPEKTROMETRESİ
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
81-128
Kütle Spektrometre Prensibi
• Kütle spektrometreleri manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt etme esasına göre çalışmaktadırlar.
• Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir ve kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler.
• Yüklü moleküller stabil değillerdir ve diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve
yüklerini kaybederler.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
82-128
Kütle Spektrometre Prensibi
• M+ e- → M+ + 2e-
• M+ → F1 + F2 + F3 + ……….
• M: Molekül
• M+: Moleküler iyon
• F: Fragment
• Oluşan her bir iyon spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır.
• Her bir iyonun yoğunluu detektöre ulaşan miktarı ile orantılıdır ve her bileşiğin spektrumu kendine özeldir.
• Bilinmeyen bir örneğin analizi sonucu elde edilen spektrum referans spektrumu ile karılaştırılarak tanımlanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
83-128
Kütle Spektrometresinin Bölümleri
• Bütün kütle spektrometreleri;
• Numune girişi,
• İyonlaştırma kaynağı,
• Kütle filtresi,
• Detektör,
• Vakum Sistemi ve
• Data sistemi kısımlarından oluşmaktadır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
84-128
Gaz Kromatografi Kütle
Spektrometresi (GC/MS)
• Gaz kromatografi (GC) yüksek hassasiyette, hızlı analiz yapabilmesi ve çok yönlü olması açısından kompleks karışımların ayırımında kullanılan önemli enstrümental tekniklerden birisidir.
• GC’nin kapiller kolonları ile ayrıştırma işlemi sağlanır ve ayrıştırılan numune kütle spektrometresinde analiz edilir.
• GC ve MS kombinasyonları (GC/MS) ile oluşturulan cihazlar organik bileşiklerin tanımlanmasında kullanılan son derece hassas ve spesifik cihazlardır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
85-128
Gaz Kromatografi Kütle
Spektrometresi (GC/MS)
Kütle spektrometresi
Gaz kromatografi
Turbomoleküler Vakum pompası
Enjeksiyon ünitesi
Kolon fırını
Interface
Otosampler
Bİlgisayar
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
86-128
Likit Kromatografi Kütle
Spektrometresi (LC/MS)
• Uçucu olmayan ve ısıya karı dayanıksız olan bileşiklerin ayrıştırılması için kullanılır. Sıvı faz kullanıldığı için yüksek ısı gerekmemektedir•“Thermospray”, LC uygulamalarından biri olup yüklü damlacıklar oluşturmak esasına dayanır.
• Yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC)’den gelen kapiller tüpün ucu yüksek voltaj uygulanarak ısıtılır. •Isıyı optimize etmek için de tüpün ucundan numune iyon kaynağına püskürtülerek gönderilir.•Thermospray, iyonların sıvı halden gaz hale dönüştürüldüğü iyon evaporasyon işlemi esasına dayanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
87-128
Likit Kromatografi Kütle
Spektrometresi (LC/MS)
Kütle spektrometresiSıvı kromatografi
Turbomoleküler pompa
UVDedektör
Otosampler
Kolon
Hareketli faz
İyon kaynağı
Pompa Arafaz
Bilgisayar
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
88-128
Ardışık Kütle Spektrometresi
(Tandem Mass Spectrometry, TMS)
• Seçiciliği yükseltmek ve deteksiyon limitlerini artırmak için MS’den önce numunenin ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ayrıştırmalar gibi bazı ön muamelelerden geçirilmesi gereklidir.
• Bunun için en uygun yöntemlerden birisi iki veya daha fazla analitik tekniğin ard arda (tandem) bağlanmasıdır.
•TMS’nin avantajları:
• Analiz hızını artırmak
• Örnek başına maliyeti düşürmek
• Kompleks karışımlarda tespit limitini artırmak
• Çoğunlukla ön işlemlere gereksinim kalmadan kompleks karışımların hızlı, hassas ve seçici olarak analizini yapmak.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
89-128
Ardışık Kütle Spektrometresi
(Tandem Mass Spectrometry, TMS)
• TMS de karışım birinci MS’nin iyon kaynağına verilir. Burada karışımın iyonizasyonu bileşiğin kendine has karekteristik iyonlarının oluşmasını sağlar. Bunlara “parent” iyonlar denir.• Bilinmeyen örneğin karekteristik “parent” iyonu böylelikle seçilir ve tanımlanır. • Bu incelenecek olan bileşiği karışımın diğer bileşenlerinden ayırır ve GC-MS’deki kromatografik ayrıştırma basamağı gibi düşünülebilir.• Böylece ayrımı yapılan “parent” iyon ikinci MS analizöre gönderilir ve burada ikincil iyon fragmentlerine ayrışır. • Bunlara “doughter” iyon denir. Bununda GC-MS deki MS aşamasındaki iyonizasyon basamağına karşılık geldiği düşünülür.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
90-128
Ardışık Kütle Spektrometresi
(Tandem Mass Spectrometry, TMS)
• “Doughter” iyonun ikinci MS analizör tarafından kütle analizi incelenen “parent” iyonun kendine has ve oldukça yüksek spesifiklikte tanımlanmasını sağlar.
• Özet olarak birinci MS bir karışımdan tek bir bileşiği ayırmak için kullanılır. Bu işlem GC-MS’deki GC nin fonksiyonu yerine geçer ancak arada çok önemli bir hız farkı vardır.
• GC-MS ile saatte 4-6 örnek çalışılırken, TMS de saatte 60 örneğe kadar çıkılabilir. Böylece ekstra zaman kayıpları önlenir.
• Örnek ekstraksiyonu ve türevlendirilmesi (derivatizasyonu) son derece azaltılmış ve hatta bazen gerekmemektedir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
91-128
Ardışık Kütle Spektrometresi
(Tandem Mass Spectrometry, TMS)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
92-128
Ardışık Kütle Spektrometresi
(Tandem Mass Spectrometry, TMS)
KROMATOGRAFİK
ANALİZLERDE KULLANILAN
ÇEŞİTLİ PARAMETRELER
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
94-128
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
• Alıkonma zamanı (Retention time): Yöntemin analiz zamanı dikkate alınarak karışışım içerisindeki maddelerin cihazın dedektörü ile tespit edildiği anı ifade eder.
• Gaz kromatografi cihazında sıcaklık programına bağlı olarak düşük buharlaşma derecelerine sahip bileşikler cihaz dedektörü tarafından erken tespit edilir.
• Genellikle final solüsyonu oluşturan çözücüler düşük buharlaşma derecelerine sahiptirler. Bu nedenle ilk gelen pikler çözücü pikleridir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
95-128
• Her ne kadar düşük buharlaşma sıcaklığına sahip olsalar da bileşikler buharlaşma derecesine ulaşıldığında dedektöre bir bütün olarak giderler. Bu nedenle final solüsyonun büyük kısmını oluşturan çözücü piki en büyük piki oluşturur.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
96-128
• Gaz kromatografi (GC) ve yüksek basınçlı likit kromatografi (HPLC) cihazlarında öncelikle hedef maddelerin standart solüsyonları verilerek alıkonma zamanı belirlenir.
• Bir madde için gaz veya likit kromatografide bazen bir pik elde edilirken, bazen birden fazla pik elde edilir. Birden fazla pik elde edilmesi durumunda o maddenin alı konma zamanı için bütün pikler dikkate alınmalıdır.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
97-128
• Böyle bir durumda miktar hesabı yapılırken bütün piklerin oluşturduğu alanların toplamı dikkate alınmalıdır.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
98-128
• GC ve HPLC cihazlarında alıkonma zamanı belirlenen bileşiklerin ayrımı (separasyonu) sağlanmış olur.
• Ancak GC cihazında buharlaşma dereceleri; yada HPLC cihazında hareketli faz ve mobil faza ilgi oranı aynı olan bileşikler aynı alıkonma sürelerine sahip olabilirler.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
99-128
• Şekilde paratiyon-metil (23.292) ve klorprifos-metil (23.281) bileşiklerinin aynı alıkonma sürelerine sahip oldukları görülmektedir.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
100-128
• Bu nedenden dolayı GC ve HPLC cihaz teknikleri ayırma (separasyon) teknikleri olarak adlandırılır.
• Aynı alıkonma sürelerine sahip iki bileşiğin tanımlanması için kütle spektrometresi (mass spectrometry, MS) cihazlarına ihtiyaç duyulmaktadır.
• Gaz kromatografi (GC) cihazında ayrımları sağlanan bileşiklerin Gaz kromatografi kütle spektrometresi (GC-MS) cihazında tanımlanmaları gereklidir.
• Aynı şekilde HPLC cihazında tespit edilen bileşiklerin de LC-MS/MS cihazında tanımlanmaları sağlanmalıdır.
Alıkonma Zamanı (Retention Time)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
101-128
Hesaplama (Quantification)
Ekstraksiyon
• Miktar tayini yapılacak madde öncelikle analizi yapılacak cihaza uygun hale getirilmelidir.
• Bu amaçla karışımın içerisindeki madde ekstraksiyon yöntemleri (sıvı-sıvı, katı-sıvı) ile istenmeyen bileşiklerden ayrılarak (separasyon) final solüsyona alınır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
102-128
Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ve korelasyon katsayısının hesaplanması
• Miktar tayini yapılacak maddenin referans standartlarından farklı miktarlarda dilüsyonları hazırlanır.
• Bu amaçla en az 5 noktalı standart dilüsyonları hazırlanmalıdır.
• Hazırlanacak standart dilüsyonların miktarı final solüsyon içerisindeki maddenin yaklaşık olarak tahmin edilen miktarının üzerindeki ve altındaki değerler olmasına dikkat edilmelidir.
• Hazırlanan standart dilüsyonlar kromatografi cihazına tanıtıldıktan sonra elde edilen standart pik alanlarına göre ya cihazda otomatik olarak yada excell programında elde edilen değerler girilerek kalibrasyon eğrisi çizilmelidir.
Hesaplama (Quantification)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
103-128
Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ve korelasyon katsayısının hesaplanması
0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500 25000 27500 30000 32500 35000 37500 Height0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
Conc.(x100)
1 2
3
4
5
R2: 9976
Y = (2.626058e-002)X + (-4.790409)
Hesaplama (Quantification)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
104-128
Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ve korelasyon katsayısının hesaplanması
• Kalibrasyon eğrisi çizildikten sonra elde edilen korelasyon katsayısı sıfırdan sonra en az iki 9 (0.99…) içermelidir.
• Korelasyon katsayısı 1’e ne kadar yakınsa yapılacak hesaplamada o ölçüde doğru sonuç elde edilir.
• Hesaplama cihaza otomatik olarak yaptırılabildiği gibi, excell programında, elde edilen formülde Y değeri çekilerek de yapılabilir.
Hesaplama (Quantification)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
105-128
Geri Alım (Recovery)
• Herhangi bir matrikste (su, toprak, biyolojik örnekler, gıda örnekleri gibi) bir madde kromatografik tekniklerle aranırken hedef maddenin olabildiğince saf olarak elde edilmesine çalışılır.
• Elde edilen final solüsyon cihaza verildiğinde başka bir madde tarafından maskelenmemesi ve sadece o maddenin alınması amacı ile ekstraksiyon işlemleri uygulanır.
• İngilizce çekip çıkarma anlamına gelen ekstraksiyon işlemlerinde matriks çeşitli çözücüler (asetonirtil, diklorometan, su, metanol, hekzan vb) veya katı maddeler (silika jel, florisil, sodyum sülfat vb) ile muamele edilir.
• Bu işlemlerle aranan madde final solüsyona olabildiğince diğer maddelerden arındırılmış olarak geçirilmesi sağlanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
106-128
Geri Alım (Recovery)
• Başlangıçta herhangi bir matrikste % 100 (kendi miktarınca) bulunan bir madde ekstraksiyon işlemleri sonucu belli oranlarda kayba uğrar.
• Cihaza tanıtılan standart madde aynı zamanda analizi yapılacak olan matrikse deneysel olarak katılır ve ekstraksiyon işlemine tabi tutulur.
• Yapılan işlemler sonucu final solüsyona alınan madde cihaza tanıtılır. Elde edilen pik referans standarda oranlanarak grei alım değeri hesaplanır.
•Bu değer % 70’in üzerinde olduğunda kullanılan analiz yönteminin hedef madde için uygun olduğu kanaatine varılır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
107-128
Geri Alım (Recovery)
• Ancak bazı durumlarda geri alım değeri % 100 değerinin üzerine çıkar.
• Bunun anlamı 1 ppm saf standardın kromatografi cihazına tanıtılması ile elde edilen pik alanı değerinin, 1 ppm matrikse deneysel olarak katılan maddenin ekstraksiyon işlemi sonrası elde edilen pik değerinden yüksek olması durumudur.
• Bazen % 200, % 1000 geri alım değerleri bulunabilir.
• Bu duruma matriks etksi (matrix effect) adı verilmektedir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
108-128
Geri Alım (Recovery)
• Şekilde üstteki kromatogramda metanol (çözücü) pikine ait Y ekseninin mHz değeri 170000; alttaki kromatogramda ise 6000 değerine çıktığı görülecektir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
109-128
Geri Alım (Recovery)
• Matriks etkisi matrikste bulunan bir maddenin hedef madde pikine girerek onu olması gerektiğinden daha yüksek bir değere çıkarması ile meydana gelir.
• Matriks etkisini düzeltmek için standart dilüsyonlarının boş matriks ekstraksiyonundan elde edilen eluat içerisinde hazırlanması gerekir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
110-128
Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)
• Kromatografik analizlerde analizin güvenlik değerlerinden birisi de tekrarlanabilirliliktir (repeatability).
• Tekrarlanabilirlilik aynı final solüsyondan üst üste yapılan enjeksiyonlarda hedef maddenin elde edilen pik değerleri arasında farklılığın birbirine yakın olması durumudur.
• Tekrarlanabilirlilik hesaplanırken ortalamaların % standart sapma (relatif standart sapma) değerleri dikkate alınır.
• Elde edilen değer 1’e ne kadar yakınsa analizin güvenliği o ölçüde fazla olur.
• Ancak 1’değerinden uzaklaşıldıkça cihazla ilgili çeşitli parametreleri gözden geçirmek gereklidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
111-128
Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)
• Genellikle elle (manual) yapılan enjeksiyonlarda GC ve HPLC cihazlarında tekrarlanabilirlilik değeri !’den uzaklaşır. Bu nedenle tekrarlanabilirlilik değeri için otomatik enjeksiyon ünitesi (autosampler) bulunan cihazlar tercih edilmelidir.
• Tekrarlanabilirlilik değeri kullanılan analiz yönteminin güvenliği açısından oldukça önem arz etmektedir.
• Dış faktörlerin en az etkili olduğu aynı final solüsyondan alınan analiz örneğinde bile tekrarlanabilirlilik elde edilemiyorsa, analizin diğer aşamaları olan kalibrasyon eğrisinin çizdirilmesi, geri alım değerlerinin hesaplanması gibi işlemler otomatik olarak değişiklik gösterecektir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
112-128
Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)
• Kromatografi açısından yeniden üretilebilirlilik (reproductivity) değeri aynı analiz metodu (cihaz ve ekstraksiyon) kullanılarak bir laboratuvarda elde edilen değerlerin başka bir laboratuvarda da üretilemesidir.
• Bu durum kullanılacak analiz yönteminin literatürde geçen bir yöntemden kendi laboratuvarımıza uyarlanmasını (application) ifade eder.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
113-128
Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)
• Yapılacak analizlerde verilecek raporların güvenli kılınması için yeniden üretilebilirlilik şartının sağlanması gerekir. Bu amaçla laboratuvara uyarlanacak metodun:
• Alıkonma zamanlarının (retention time)
•Tespit (LOD) ve hesaplama (LOQ) limitlerinin
• Tekrarlanabilirlik (repeatability) değerlerinin
• Geri alım (recovery) değerlerinin hesaplanması gereklidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
114-128
Metot Geliştirme (Method Development)
• Kromatografik çalışmalarda yeni bir metot sunabilmek için bu metodun doğrulama çalışmlarının yapılması gereklidir. Bu çalışmalara validasyon adı verilir.
• Validasyon çalışmalarında cihaz ve ekstraksiyon metotları ayrıntılı olarak yazılmlıdır.
• Bunların yanı sıra yeniden üretilebilirlilik çalışmalarının doğrulaması yapılacak metot için tekrarlanması (örneğin 20 kez) ve bulunan bu değerlerin herbiri arasında % Standart sapma (relatif standart sapma) değerlerinin hesaplanması gereklidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
115-128
Signal to Noise (S/N)
• Kromatografi uygulamalarında S/N değerinin hesaplanması gereklidir.
• S/N değerinden yola çıkılarak
• Tespit limiti (Limit of Detection, LOD) ve
• Hesaplama alt limiti (Limit of Quantification, LOQ) belirlenir.
• Tespit limiti analiz edilen karışımda hedef maddenin belirlenebilecek en alt miktarıdır. Bu değer cihaz yönteminin o maddeye ne kadar duyarlı olduğunu ortaya koyar.
• Bunun yanı sıra analiz edilen örneğin miktarına bağlı olarak tespit limiti birim değerde o ölçüde aşağıya iner.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
116-128
Signal to Noise (S/N)
• Tespit limitini hesaplamada öncelikli adım Signal to Noise (S/N) değerinin belirlenmesidir.
• Bu değer cihaza otomatik olarak hesaplattırılır.
• Kromatografi uygulamalarında (GC, LC) elde edilen kromatogramdaki temel çizgi (baseline) düz bir çizgi olmayıp, elektrik sinyaline bağlı olarak aşağı yukarı hareket eder tarzdadır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
117-128
Signal to Noise (S/N)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
118-128
Sİgnal to Noise (S/N)
• Bu aşağı yukarı hareketlerin pik olarak adlandırılabilmesi için temel çizgiden en az üç kat yukarı sıçrama yapması gereklidir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
119-128
Signal to Noise (S/N)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
120-128
Signal to Noise (S/N)
• S/N değeri hesaplatılacak pikin temel çizgi (baseline)’de ön ve arka tarafından referans düz alanlar cihaza tanıtılır.
• Bu değerler baz alınarak pikin temel çizgiden ne kadar bir sıçrama yaptığı cihaz tarafından otomatik olarak hesaplanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
121-128
Signal to Noise (S/N)
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
122-128
Signal to Noise (S/N)
• Elde edilen S/N değeri tespit ve hesaplama alt limitlerinin hesaplanmasında kullanılır.
• Tespit limiti için pikin S/N değeri 3 rakamı ile; hesaplama limiti için 10 rakamı ile düzeltilir.
• Cihaza tanıtılan pikin elde edildiği standart maddenin yoğunluğu ile orantı kurularak o madde için tespit (LOD) ve hesaplama (LOQ) değerleri elde edilmiş olur.
• Hesaplama limiti (LOQ) tespit limiti (LOD) ile aynı prensiple belirlenir. Hesaplama limitinin belirlenmesinde amaç; analiz edilen bir maddenin miktarını bildirirken bu değer için bir güven faktörü elde etmektir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
123-128
Signal to Noise (S/N)
• Örnek:
• 1 g/ml (ppm) yoğunluğunda hazırlanmış bir standart madde için gaz kromatografi cihazında elde edilen S/N değeri 330 olarak ölçülmüştür.
• Bu değerden yola çıkılarak LOD ve LOQ değerleri aşağıdaki eşitlikle hesaplanabilir.
• LOD= 1 ppm standart için S/N değeri 330
1 ppm 330
X 3
X= 3 x 1 ppm X= 0.009 ppm LOD= 0.009 ppm veya 9 ppb
330
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
124-128
Signal to Noise (S/N)
• Örnek:
• Yine aynı değerler baz alınarak
• LOQ= 1 ppm standart için S/N değeri 330
1 ppm 330
X 10
X= 10 x 1 ppm X= 0.03 ppm LOQ= 0.03 ppm veya 30 ppb
330
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
125-128
Signal to Noise (S/N)
• Örnek:
• Bulunan bu değerler kromatografik analizler için yorumlandığında
• LOD= 9 ppb: Bu değer tanıtılan standart maddenin analiz edilen karışım içerisinde 9 ppb düzeyinde bulunması durumunda kullanılan kromatografik yöntemler tarafından tespit edileceği anlamına gelmektedir.
• LOQ= 30 ppb: Bu değer tanıtılan standart maddenin analiz edilen karışım içerisinde hesaplanan miktarının 30 ppb alt sınıra kadar güvenle belirlenebileceği anlamına gelmektedir. Bu değerlerin altında da hesaplama yapılsa da güvenli bir değer olmadığı anlamına gelmektedir.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
126-128
Signal to Noise (S/N)
• LOD ve LOQ değerleri cihaz yöntemine göre yukarıda belirtildiği şekilde hesaplanmaktadır.
• Bunun yanı sıra karışım içerisindeki maddenin analizi yapılırken şayet örnek miktarı fazla tutulmuşsa ve/veya ekstraksiyon aşamalarında örnek seyreltilmişse, hesaplanan LOD ve LOQ değerleri;
• Seyreltme faktörüne yada
• Birim örnek miktarından elde edilecek katsayıya bölünmelidir.
• Elde edilecek son rakam örnek matriksi dikkate alınarak analiz yönteminin tümüne referans değer olarak belirlenmiş olur.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
127-128
Signal to Noise (S/N)
• Örnek: Yüksek performanslı likit kromatografi cihazında yem numunelerinden yapılan aflatoksin B1 analizinde;
• Ekstraksiyon metodunda 50 g yem kullanıldığı varsayılmaktadır.
• Bu analizde cihazdan elde edilen LOD değeri bir önceki önekte olduğu gibi 9 ppb olarak ölçülmüştür.
•Cihaza uygulanan son sıvı (final solüsyon) tüm örneğin seyreltme faktörü kullanılmadan yapılan ekstraksiyon yönteminden elde edilmiştir.
• Buna göre yapılan analiz metodunda yem örneklerinden aflatoksin B1’in tespit limiti (LOD)= 9/50 LOD= 0.18 ppb olarak hesaplanır.
TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN
128-128
Signal to Noise (S/N)
• Örnek: Yüksek performanslı likit kromatografi cihazında yem numunelerinden yapılan aflatoksin B1 analizinde;
• Aynı rakamlar dikkate alındığında hesaplama alt limiti (LOQ)= 30/50 LOQ= 0.6 ppb olarak belirlenir.
Top Related