แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร
มกษ. 10455 (G)-2559
GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD
TAS 10455 (G)-2016
การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง
DIAGNOSIS OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND
HEMATOPOIETIC NECROSIS DISEASE IN SHRIMP
ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต
กระทรวงเกษตรและสหกรณ
ICS 11.220. ISBN XXX-XXX-XXX-X
รางZ
(ราง)
แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร
มกษ. 10455 (G)-2559
GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD
TAS 10455 (G)-2016
การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง
DIAGNOSIS OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND
HEMATOPOIETIC NECROSIS DISEASE IN SHRIMP
ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต
กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900
โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357
www.acfs.go.th
ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 134 ตอนพเศษ 35 ง
วนท 2 กมภาพนธ พทธศกราช 2560
(2)
คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร
เรอง การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนวในกง
1. นางสปราณ ชนบตร ประธานกรรมการ
2. ผแทนกรมปศสตว กรรมการ
นายทววฒน ดมะการ
นายนพพร โตะม
นางตวงทอง ปจฉมะศร
3. ผแทนส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กรรมการ
นางอษา บ ารงพช
นายชยศร มหนตชยสกล
4. ผแทนสถาบนวจยสขภาพสตวน าจด กรมประมง กรรมการ
นางสาวพทธรตน เบาประเสรฐกล
5. ผแทนสถาบนวจยสขภาพสตวน าชายฝง กรมประมง กรรมการ
นางจ าเรญศร ถาวรสวรรณ
นางสาวอรอนงค คงทว
6. ผแทนสวนควบคมการคาสตวน าและปจจยการผลต กรรมการ
ส านกบรหารจดการดานการประมง กรมประมง
นายไกสฤษด พนพาณชย
นายจตวฒนา เหลงบ ารง
7. ผแทนคณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ
นายประพนธศกด ศรษะภม
8. ผแทนคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล กรรมการ
นายสรพงษ ฐตะมาด
นางสาวแสงจนทร เสนาปน
นางสาวรพพรรณ วนชวรยกจ
9. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ
ผชวยศาสตราจารยวศณ บญญาววฒน
นายณฎฐธน ฐตชญาพงษ
10. ผแทนสมาคมกงไทย กรรมการ
11. ผแทนสมาคมผเล ยงกงทะเลไทย กรรมการ
นายสรศกด ดลกเกยรต
(3)
12. ผแทนสมาคมเพาะเล ยงสตวน าไทย กรรมการ
นายพรศกด ลาโภดม
นางวมลมาศ เปยมสมบรณ
13. ผแทนสมาคมอาหารแชเยอกแขง กรรมการ
นายชพงษ ลอสขประเสรฐ
นางสาววาสนา ตรงใจจรง
14. รองศาสตราจารยเจนนช วองธวชชย กรรมการ
ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรค
15. ผแทนส านกก าหนดมาตรฐาน กรรมการและเลขานการ
ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต
นางสาวมนตรา ลกขณา
นางสาวขวญหทย ทองปลาด
(4)
กระทรวงเกษตรและสหกรณไดประกาศมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง
(มกษ. 10455 – 2559) ส าหรบใชเปนหลกการของหองปฏบตการเพอการชนสตรโรค IHHN ในกงให
สอดคลองกบขอก าหนดขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ เพอสงเสรมใหเกดการควบคมโรคกง
ในฟารมอยางมประสทธภาพ ถกตองตามหลกวชาการและสามารถน าไปปฏบตไดจรง คณะกรรมการ
มาตรฐานสนคาเกษตรจงก าหนดมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร
การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง เพอใชเปนแนวทางในการน ามาตรฐานดงกลาวไปปฏบต
มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง
ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต. 2556. รายงานโครงการศกษาขอมลเพอจดท าวธการ
ชนสตรโรคไอเอชเอชเอนว
World Organisation for Animal Health (OIE). 2015. Chapter 2.2.2. Infectious Hypodermal and
Haematopoietic Necrosis. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Paris, France.
มกษ. 10455 (G)-2559
แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร
การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง
แนวปฏบตน ใหค ำอธบำยควำมทำงวชำกำรของกำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง
(ภำคผนวก ก) กำรชนสตรดวยวธทดสอบโรคเบองตน และกำรชนสตรดวยวธทดสอบยนยนโรคใน
มำตรฐำนสนคำเกษตร เรอง กำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง (มกษ. 10455-2559) เพอเปน
ขอแนะน ำในกำรน ำมำตรฐำนดงกลำวไปปฏบต
ค าอธบาย มกษ. 10455-2559 มรายละเอยดดงน
ขอก ำหนด มกษ. 10455 พมพอยในกรอบและมค ำอธบำยขอก ำหนดอยใตกรอบ
1. ขอบขาย
มำตรฐำนสนคำเกษตรน ก ำหนดกำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกงทำงหองปฏบตกำร ครอบคลมตงแต
ตวอยำงเพอกำรชนสตร กำรตรวจรอยโรคภำยนอก (gross lesion) วธจลพยำธวทยำ (histopathological
method) และวธชววทยำระดบโมเลกล (molecular biology method)
2. นยาม
ควำมหมำยของค ำทใชในมำตรฐำนสนคำเกษตรน มดงตอไปน
2.1 โรคไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis disease; IHHN disease)
หมำยถง โรคในกงทเกดจำกกำรตดเชอไวรสไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic
necrosis virus; IHHNV) กงทไวตอกำรตดเชอ IHHNV เชน กงขำว (Litopenaeus vannamei) กงกลำด ำ
(Penaeus monodon) และกงฟำ (Penaeus stylirostris) ตรวจพบเชอไดในกงทกวยตงแตไข กงวยออน
กงหลงวยออน กงวยรน และกงตวเตมวย
2.2 กง (shrimp and prawns) หมำยถง สตวไมมกระดกสนหลง ไดแก กงในวงศ Penaeidae และ
Palaemonidae
2.3 กำรชนสตรโรค (diagnosis) หมำยถง กำรตรวจสอบเพอกำรวนจฉยโรค
2.4 กงวยออน (larva) หมำยถง ลกกงทเพงออกจำกไขและมกำรเปลยนรปรำง 3 ระยะ คอ นอเพลยส
(nauplius) โซเอย (zoea) และไมซส (mysis) รวมใชเวลำประมำณ 8 วน ถง 11 วน
มกษ. 10455 (G)-2559
2
2.5 กงหลงวยออน (postlarva; PL) หมำยถง กงทเจรญหลงจำกระยะไมซสจนถงระยะวยรน มรยำงค
เหมอนกงตวเตมวย นยมเขยนยอวำ PL แลวตำมดวยจ ำนวนวนทกงเขำสระยะหลงวยออน
2.6 กงวยรน (juvenile) หมำยถง กงหลงระยะหลงวยออนทมลกษณะเหมอนตวเตมวยแตอวยวะสบพนธ
ยงพฒนำไมเตมท
2.7 กงตวเตมวย (adult) หมำยถง กงโตเตมท อวยวะสบพนธพฒนำเตมทแลวและสบพนธได
2.8 เลอด (haemolymph) หมำยถง องคประกอบของน ำเลอดและเมดเลอดทอยในระบบไหลเวยนเลอด
ของกง
2.9 วธทดสอบโรคเบองตน (presumptive diagnosis) หมำยถง วธกำรตรวจทำงหองปฏบตกำรเพอใช
เปนแนวทำงในกำรชนสตรโรค
2.10 วธทดสอบยนยนโรค (confirmatory diagnosis) หมำยถง วธกำรตรวจทำงหองปฏบตกำรทใชในกำร
ยนยนผลกำรชนสตรโรคและเปนวธทยอมรบวำมควำมจ ำเพำะและควำมไวสงกวำวธทดสอบโรคเบองตน
2.11 ควำมจ ำเพำะ (specificity) ของวธกำรชนสตร หมำยถง ควำมสำมำรถของวธทดสอบทใหผลกำร
ทดสอบเปนลบในกลมตวอยำงจำกตวอยำงทไมตดเชอ
2.12 ควำมไว (sensitivity) ของวธกำรชนสตร หมำยถง ควำมสำมำรถของวธทดสอบทใหผลกำรทดสอบ
เปนบวกในกลมตวอยำงจำกตวอยำงทตดเชอ
2.13 ตวอยำงควบคมผลบวก (positive control sample) หมำยถง ตวอยำงทมเชอหรอสวนประกอบของ
เชอ IHHNV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบตวอยำงทตองกำร
ทดสอบแลว ใหผลบวก
2.14 ตวอยำงควบคมผลลบ (negative control sample) หมำยถง ตวอยำงทไมมเชอหรอสวนประกอบ
ของเชอ IHHNV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบตวอยำงทตองกำร
ทดสอบแลว ใหผลลบ
รำยกำรท 1 กำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตร
ขอก ำหนดท 1.1 ตวอยำงเพอตรวจรอยโรคภำยนอกหรอตรวจดวยวธจลพยำธวทยำ
ขอก ำหนดท 1.1.1 ตองเปนตวอยำงกงมชวตหรอกงปวยใกลตำย และรกษำสภำพตวอยำงไวในสำรละลำย
คงสภำพเดวดสน (Davidson’s fixative)
ค าอธบาย
การเกบตวอยางกงมชวตหรอกงปวยใกลตาย มขนตอนดงน
(1) น ำกงมชวตพรอมน ำจำกบอเลยงใสถงพลำสตกหรอภำชนะอนทใหม สะอำด และเหมำะสม แยกแต
ละบอไมปะปนกน จ ำนวนตวอยำงกงขนกบขนำดของตวอยำงและภำชนะทขนสงตำมควำมเหมำะสม
มกษ. 10455 (G)-2559
3
(2) บนทกขอมล (ภำคผนวก ช) และท ำเครองหมำยตวอยำงใหครบถวนและชดเจน เชน วนเดอนปทเกบ
ตวอยำง รหสตวอยำง ชอฟำรม และขอมลสตวน ำ
(3) ในกรณทตองกำรขนสงตวอยำงมชวตไปยงหองปฏบตกำร ตองใหออกซเจนระหวำงกำรขนสงหรอม
วธกำรรกษำปรมำณออกซเจนในน ำระหวำงกำรขนสง เพอใหกงมชวตจนถงหองปฏบตกำร
การรกษาสภาพตวอยางดวยสารละลายคงสภาพเดวดสน (ภำคผนวก ค ขอ ค.1) มขนตอนดงน
(1) น ำตวอยำงกงทมชวตมำท ำกำรณยฆำต (ภำคผนวก ง)
(2) รกษำสภำพตวอยำงในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนปรมำตรประมำณ 10 เทำของปรมำตรตวอยำงเพอ
ปองกนกระบวนกำรยอยสลำยตวเอง (autolysis) ของเนอเยอกงซงเกดขนเรวมำก ทงน
- กงวยออนระยะนอเพลยสถงกงหลงวยออน 20 วน (PL20) สำมำรถเกบรกษำสภำพทงตวได โดยแชใน
สำรละลำยคงสภำพเดวดสน
- กงหลงวยออน 21 วน (PL21) จนถงกงทมน ำหนกไมเกน 3 g ใหเปดเปลอกสวนหวขนและแชใน
สำรละลำยคงสภำพเดวดสนเพอใหสำรละลำยเขำไปทตบ-ตบออนไดดยงขน
- กงทมน ำหนกมำกกวำ 3 g ขนไปใหฉดสำรละลำยคงสภำพเดวดสนใหทวตวอยำง โดยเรมจำกตบ-ตบออนทง
พซำยและพขวำ กลำมเนอล ำตวปลองท 2-3 ดำนซำยและขวำ และล ำตวดำนทองปลองท 6 จนทงตว
อยำงเปลยนเปนสสม และน ำไปแชในสำรละลำยคงสภำพเดวดสน
-ในกรณทกงมขนำดใหญ เชน พอแมพนธกง หลงจำกฉดสำรละลำยคงสภำพเดวดสนแลวใหตดเปลอกกง
บรเวณดำนขำงล ำตว ตงแตกลำมเนอล ำตวปลองท 6 ผำนเปลอกคลมหวและอก (carapace) จนถงฐำนกร
เพอใหสำรละลำยคงสภำพเดวดสนซมเขำไปในเนอเยอสวนตำงๆ ไดดขน หลงจำกนนใหตดตำมขวำง
บรเวณหลงเปลอกคลมหวและอกกอนน ำไปแชในสำรละลำยคงสภำพเดวดสน
(3) ท ำเครองหมำยตวอยำงใหชดเจนแลวใสลงไปในภำชนะทเกบตวอยำง
(4) หลงจำกแชตวอยำงในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนนำน 24 h ถง 48 h ระยะเวลำในกำรแชขนอยกบ
ขนำดของกง แลวน ำไปผำนกระบวนกำรเตรยมเนอเยอตอไป ในกรณทตองกำรเกบตวอยำงใหนำนขนให
เปลยนสำรละลำยคงสภำพเดวดสนเปนเอทำนอลควำมเขมขน 70%
(5) ในกรณทสำมำรถเกบรกษำตวอยำง ณ จดเกบตวอยำง ใหด ำเนนกำรรกษำสภำพตวอยำงดวย
สำรละลำยคงสภำพเดวดสน ตำมวธกำรในขอ (1)-(4)
มกษ. 10455 (G)-2559
4
รำยกำรท 1 กำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตร
ขอก ำหนดท 1.2 ตวอยำงเพอตรวจดวยวธชววทยำระดบโมเลกล
ขอก ำหนดท 1.2.1 ตองเปนตวอยำงกงมชวต หรอเปนอวยวะเปำหมำย ไดแก ขำวำยน ำ เหงอก
ตอมแอนเทนนอล (antennal gland) ตอมน ำเหลอง (lymphoid organ) กำนตำโดยไมมลกตำ (1) เกบตวอยำงไวในเอทำนอลควำมเขมขน 90% ถง 95% อณหภมไมเกน 4
๐C สงหองปฏบตกำร และ
ตรวจวเครำะหภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง หรอ (2) แชตวอยำงในน ำแขง สงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h และตรวจวเครำะหทนท หรอเกบตวอยำงไว
ในตแชแขงและวเครำะหภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง
ขอก ำหนดท 1.2.2 ตวอยำงเลอดกง เจำะจำกแองเลอดใตทอง บรเวณขำวำยน ำคแรก หรอจำกแองเลอด
บรเวณขำเดนคท 3 ถงขำเดนคสดทำย โดยใชเขมและกระบอกฉดยำปลอดเชอ ทมสำรละลำยปองกนกำร
แขงตวของเลอดเกบรกษำตวอยำงไวทอณหภมไมเกน 4๐C และด ำเนนกำรตรวจตวอยำงภำยในระยะเวลำ
24 h
ค าอธบาย
กำรชนสตรดวยวธชววทยำระดบโมเลกลจะตรวจหำสำรพนธกรรมของเชอในตวอยำง หำกดเอนเอ
(deoxyribonucleic acid; DNA) ของเชอเสอมสภำพหรอถกท ำลำยจะมผลตอประสทธภำพของกำรตรวจ
ดวยวธชววทยำระดบโมเลกล ตวอยำงทน ำมำชนสตรดวยวธชววทยำระดบโมเลกลสำมำรถใชตวอยำงกงม
ชวต (กำรเกบตวอยำงกงมชวตเพอสงตรวจทำงหองปฏบตกำรใหปฏบตตำมค ำอธบำยในขอก ำหนดท
1.1) หรออวยวะเปำหมำย ไดแก ขำวำยน ำ เหงอก ตอมแอนเทนนอล (antennal gland) ตอมน ำเหลอง
(lymphoid organ) กำนตำโดยไมมลกตำ เนองจำกกำรตดเชอ IHHNV ในกง ไวรสจะเพมจ ำนวนใน
นวเคลยสของเนอเยอผวใตเปลอกชนเอกโทเดรม และเมโซเดรม ดงนน เนอเยอหรออวยวะทเจรญมำจำก
ชนเอกโทเดรมและเมโซเดรมเปนตวอยำงทเหมำะสมส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN
การเกบตวอยางไวในเอทานอลความเขมขน 90% ถง 95%
หำกไมสำมำรถน ำตวอยำงกงมชวตสงตรวจได ใหรกษำสภำพตวอยำงกงมชวต หรออวยวะเปำหมำยไวใน
เอทำนอลโดยน ำตวอยำงแชในเอทำนอลปรมำตรประมำณ 10 เทำของปรมำตรตวอยำง มขนตอนดงน
(1) กงทมขนำดเลกกวำ 3 g ใหรกษำสภำพกงทงตวได
(2) กงทมขนำดตงแต 3 g ขนไปใหเกบตวอยำงขำวำยน ำสงตรวจหรอใหรกษำสภำพกงทงตวได
(3) สำมำรถเกบตวอยำงยอยรวมเปน 1 ตวอยำง (pooled samples) ได โดย 1 ตวอยำงรวมมำจำก
ตวอยำงยอยไมเกน 5 ตวอยำง กรณทเปนตวอยำงไข กงวยออนและกงหลงวยออนซงมขนำดเลกสำมำรถ
รวมกนไดมำกกวำ 5 ตวอยำงยอยเปน 1 ตวอยำงรวม เชน ตวอยำงไขประมำณ 150 ฟองหรอมำกกวำ
มกษ. 10455 (G)-2559
5
ตวอยำงกงวยออนประมำณ 50 ตว ถง 150 ตว ทงนใหพจำรณำขนำดและอำยของตวอยำงตำมควำม
เหมำะสม
(4) บนทกขอมล (ภำคผนวก ช) และท ำเครองหมำยตวอยำงใหครบถวนและชดเจน เชน วนเดอนปทเกบ
ตวอยำง รหสตวอยำง ชอฟำรม และขอมลสตวน ำ
(5) หำกไมสำมำรถสงตวอยำงไดทนท ควรเกบตวอยำงทอณหภมไมเกน 4๐C ทงนใหสงตวอยำงไป
หองปฏบตกำรและตรวจหำ DNA ของเชอไวรสภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง
การแชตวอยางในน าแขง
หำกไมสำมำรถน ำตวอยำงกงมชวตสงตรวจได ใหรกษำสภำพตวอยำงกงมชวต หรออวยวะเปำหมำยแช
ในน ำแขง มขนตอนดงน
(1) น ำตวอยำงกงใสถงพลำสตกทใหม และสะอำด ระบหมำยเลขตวอยำงใหชดเจนไมลบเลอน ปดปำกถง
ใหสนท โดยแยกตวอยำงกงแตละบอไมใหปะปนกน จ ำนวนกงในแตละถงขนกบขนำดของกง และภำชนะ
ทใชขนสง
(2) น ำถงบรรจตวอยำง แชน ำแขงหรอน ำแขงแหงในภำชนะทใชขนสง
(3) บนทกขอมล (ภำคผนวก ช) และท ำเครองหมำยตวอยำงใหครบถวนและชดเจน เชน วนเดอนปทเกบ
ตวอยำง รหสตวอยำง ชอฟำรม และขอมลสตวน ำ
(4) รบน ำสงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h เพอตรวจหำสำรพนธกรรมของเชอไวรสทนท หำกตรวจไมไดทนท
ใหเกบตวอยำงไวในตแชแขงและตรวจภำยใน 1 สปดำหหลงจำกกำรเกบตวอยำงนน
(5) กรณทไมสำมำรถสงตวอยำงภำยใน 24 h ได ใหแชแขง (frozen) ตวอยำง แลวรบน ำสงหองปฏบตกำร
การเกบตวอยางเลอดกง
เกบตวอยำงเลอดกงประมำณ 100 µl โดยใชเขมและกระบอกฉดยำปลอดเชอทมสำรละลำยปองกนกำร
แขงตวของเลอด (ภำคผนวก ค ขอ ค.2) ในอตรำสวนทเทำกนกบเลอด (1 : 1)
รำยกำรท 2 กำรชนสตรดวยวธทดสอบโรคเบองตน (1) วธกำรตรวจรอยโรคภำยนอก (gross lesion)
ขอก ำหนดท 2.1 ตรวจสภำพภำยนอกของตวอยำงกง เพอดรอยโรคอยำงใดอยำงหนงหรอหลำยอยำง
รวมกน ดงตอไปน แคระแกรน (Runt Deformity Syndrome; RDS) มควำมผดปกตของเปลอกท ำใหตว
คดงอหรอสน กรโคงงอหรอบด (bent rostrum) หนวดกงหงกงอ (brittle, wrinkled antenna) หวกงโปง
พอง (bubble head) หรอมกำรผดรปทปลองทองท 6
มกษ. 10455 (G)-2559
6
ค าอธบาย
องคกำรโรคระบำดสตวระหวำงประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) ไดรวบรวมขอมลของ
วธตำงๆ ทใชในกำรชนสตรโรค IHHN ในกง และจดล ำดบวธกำรชนสตรโรค ดงกลำว (ภำคผนวก ข ตำรำงท ข.
1) เพอควำมเหมำะสมในกำรน ำไปใชวนจฉยโรค IHHN อยำงมประสทธภำพในสภำวกำรณทมขอจ ำกดในกำร
เกบตวอยำง หรอเครองมอส ำหรบตรวจวนจฉยทแตกตำงกนไป
วธกำรตรวจรอยโรคภำยนอกถอเปนวธทดสอบโรคเบองตนส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในกงเพอใหไดขอมล
เพมเตมประกอบกำรชนสตรโรค แตไมเหมำะสมส ำหรบยนยนกำรตดเชอ IHHNV นอกจำกนพฤตกรรมท
เปลยนแปลงในกงทตดเชอ เชน กำรกนอำหำรลดลง เคลอนทชำลง เจรญเตบโตชำ ออนแอ จะไมจ ำเพำะตอกำร
ตดเชอ IHHNV สำมำรถพบกำรตดเชอ IHHNV ไดในกงทกวย ดงนน ในกงทยงไมโตเตมวย หรอกงทไมแสดง
อำกำรภำยนอก เชน กงกลำด ำจะตรวจอำกำรทำงคลนกหรอรอยโรคภำยนอกไดยำก ทงน กำรตรวจอำกำรทำง
คลนกและพฤตกรรมทเปลยนแปลงจงไมเหมำะสมในกำรใชตรวจเพอใหกำรรบรองวำปลอดจำกโรค IHHN
(IHHN disease freedom)
กำรตรวจรอยโรคภำยนอกเปนกำรตรวจสภำพโดยทวไปของตวอยำงกง และเกบขอมลลกษณะทพบ
เปรยบเทยบกบกงทมสภำพปกต ดงนนหำกตวอยำงทน ำมำชนสตรไมสด หรอเสอมสภำพ หรอเกดกำร
ยอยสลำยตวเองจะไมสำมำรถตรวจรอยโรคได กงทตดเชอจะพบรปรำงผดปกต (ภำคผนวก ฉ ภำพท ฉ.1)
รำยกำรท 2 วธทดสอบโรคเบองตน (2) วธจลพยำธวทยำ
ขอก ำหนดท 2.2 น ำตวอยำงเนอเยอทผำนกระบวนกำรรกษำใหคงสภำพและกำรเตรยมเนอเยอมำยอม
ดวยสฮมำทอกซลนและอโอซน (hematoxylin and eosin หรอ H&E)
ขอก ำหนดท 2.3 ตรวจตวอยำงเนอเยอทไดดวยกลองจลทรรศน จะพบรอยโรคทำงจลพยำธวทยำ คอ
อนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลทตดเชอ (Cowdry A type eosinophilic
intranuclear inclusions)
ค าอธบาย
วธจลพยำธวทยำถอเปนวธทดสอบโรคเบองตนส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในตวอยำงเนอเยอกง
เนองจำกเปนวธทมขอจ ำกดหลำยประกำร โดยเฉพำะในกงวยออนทมขนำดเลกมำก หรอกงทไมแสดงอำกำร
ภำยนอก อำจตรวจไมพบรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทชดเจนและรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทตรวจพบไมม
ควำมจ ำเพำะ
การเตรยมเนอเยอมายอมดวยส H&E
1. น ำเนอเยอตวอยำงทผำนกำรรกษำสภำพในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนไปฝงในพำรำฟน (embedding)
มกษ. 10455 (G)-2559
7
ตำมขนตอนดงน
1.1 น ำเนอเยอแชในสำรละลำยเรยงตำมล ำดบ ดงน
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 70% ขวดทหนง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 70% ขวดทสอง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 80% ขวดทหนง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 80% ขวดทสอง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 95% ขวดทหนง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 95% ขวดทสอง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลสมบรณขวดทหนง ไวนำน 1 h
- แชในเอทำนอลสมบรณขวดทสอง ไวนำน 1 h
- แชในไซลนขวดทหนง ไวนำน 1.5 h
- แชในไซลนขวดทสอง ไวนำน 1.5 h
1.2 น ำเนอเยอแชในพำรำฟนเหลวทอนขวดทหนงเปนเวลำ 2 h แลวแชตอในพำรำฟนเหลวทอนขวดทสองอก 2 h
1.3 น ำเนอเยอวำงลงในแมพมพ (embedding mold) ทมพำรำฟนเหลว วำงแทนยด (cassette) บนแมพมพ
แลวเทพำรำฟนเหลวใหทวมแทนยด น ำแมพมพทมตวอยำงวำงบนถำดทเยน (cool tray) ทงไวจนพำรำฟน
แขงตวจงน ำตวอยำงออกจำกแมพมพ แลวเกบไวทอณหภมหอง
1.4 ตดเนอเยอทฝงในแทงพำรำฟนดวยเครองตดชนเนอ (microtome) ใหมควำมหนำ 4 µm ถง 6 µm แลว
จดวำงบนสไลด
2. กำรยอมส H&E มขนตอนดงน
2.1 ละลำยพำรำฟนออกจำกแผนเนอเยอบนสไลดทอณหภม 60 ๐C นำน 30 min แลวน ำไปแชในไซลน
2.2 แชสไลดเนอเยอในเอทำนอลสมบรณ นำน 5 min และเอทำนอลควำมเขมขน 95% นำน 5 min ตำมล ำดบ
2.3 ลำงสไลดเนอเยอดวยน ำไหลผำน นำน 5 min
2.4 จมสไลดเนอเยอลงในสฮมำทอกซลน นำน 5 min ถง 7 min
2.5 ลำงสไลดเนอเยอดวยน ำไหลผำน นำน 15 s ถง 30 s ตรวจสอบขนตอน
2.6 จมสไลดเนอเยอลงในสอโอซน นำน 30 s ถง 60 s
2.7 ขจดน ำออกจำกสไลดเนอเยอดวยเอทำนอลควำมเขมขน 95% และเอทำนอลสมบรณตำมล ำดบ
2.8 แชในไซลนนำน 5 min
มกษ. 10455 (G)-2559
8
2.9 หยดเพอรเมำต (Permount) 1 หยด ปดสไลดดวยกระจกปดสไลด
การตรวจรอยโรคทางจลพยาธวทยา
น ำสไลดเนอเยอตรวจดดวยกลองจลทรรศนทก ำลงขยำย 400 เทำ กงทตดเชอ IHHNV จะพบลกษณะ
รอยโรคทำงจลพยำธวทยำจ ำเพำะ คอ อนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลท
ตดเชอ (ภำคผนวกท ฉ ภำพท ฉ.2) อยำงไรกตำมลกษณะรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทพบอนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยใน
นวเคลยสของเซลลทตดเชอ IHHNV ไมสำมำรถแยกจำกกำรตดเชอ White Spot Syndrome Virus
(WSSV) ได เนองจำกมรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทไมแตกตำงกน
รำยกำรท 3 กำรชนสตรดวยวธทดสอบยนยนโรคโดยวธชววทยำระดบโมเลกล:
: วธปฏกรยำลกโซพอลเมอเรส (Polymerase Chain Reaction; PCR)
ขอก ำหนดท 3.1 วธชววทยำระดบโมเลกลทใชในมำตรฐำนฉบบน คอ วธ PCR เปนวธทดสอบยนยน
ส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในกง (1) กำรสกด DNA
(2) กำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำยแบบทวคณโดยใชไพรเมอรจ ำเพำะจนมจ ำนวนมำกพอทจะตรวจพบได (3) กำรแยกแถบ DNA ดวยวธอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)
(4) กำรตรวจหำล ำดบสำรพนธกรรมเพอยนยนควำมจ ำเพำะของแถบ DNA
ขอก ำหนดท 3.2 ในกำรตรวจวนจฉยโรคทกครงตองมตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบ
ค าอธบาย
วธชววทยำระดบโมเลกลทใชในมำตรฐำนฉบบน คอ วธ PCR เปนวธทดสอบยนยนส ำหรบกำรชนสตร
โรค IHHN ในกง ทงน ในกำรทดสอบยนยนผลบวกและผลลบของเชอ IHHNV โดย OIE แนะน ำให
ยนยนผลกำรทดสอบจำกวธชนสตรทำงชววทยำระดบโมเลกลอยำงนอย 2 วธรวมกน โดย 2 วธดงกลำว
ตองตรวจสอบ DNA ทต ำแหนงตำงกน
กำรตดเชอ IHHNV พบไดในกงทกวย และวธ PCR สำมำรถใชชนสตรโรค IHHN ไดในกงทกวย
เนองจำกเปนวธทมควำมเหมำะสม มควำมจ ำเพำะและควำมไวของวธกำรชนสตร โดยสำมำรถตรวจหำ
DNA ของเชอไวรสในเนอเยอและอวยวะเปำหมำย
แนวปฏบตทอธบำยสำระส ำคญของกำรชนสตรดวยวธ PCR น น ำมำจำก Manual of Diagnostic Tests for
Aquatic Animals ของ OIE (2015) ซงเปนเพยงตวอยำงเพอใชเปนเอกสำรส ำหรบน ำไปใชท ำควำม
เขำใจ อำจใชวธ PCR อน ไพรเมอร เวลำ อณหภม สำรเคม และเครองมอทแตกตำงจำกทระบได หำกได
มกษ. 10455 (G)-2559
9
ทดสอบแลววำมควำมไวและควำมจ ำเพำะของวธกำรชนสตรเทยบเทำหรอดกวำ และไดรบกำรเผยแพรใน
วำรสำรทำงวชำกำร
1. กำรสกด DNA
OIE เสนอใหใชชดสกดDNA ส ำเรจรปเพอกำรสกดDNA เปำหมำยจำกตวอยำง โดยชดสกด DNA ม
จ ำหนำยจำกหลำยบรษทแตกตำงกน เชน บรษท Roche Diagnostics บรษท Qiagen หรอสำรเคมทใชสกด
จำกบรษท Gibco Life Sciences ส ำหรบแนวปฏบตของกำรสกด DNA ในแนวปฏบตน ยกตวอยำงวธกำร
สกดโดยชดสกด DNA ของบรษท Gibco Life Sciences (DNAzol® Reagent) ในกำรสกด DNA
เปำหมำยจำกตวอยำง โดยระบขนตอนดงน
1.1 กำรบดตวอยำงกงหรอเนอเยอกง
- น ำตวอยำงกงหรอเนอเยอทรกษำสภำพในเอทำนอลควำมเขมขน 90% หรอ 95% มำชงน ำหนกประมำณ
25 mg ถง 50 mg ใน microtubes
- กรณทตองกำรสกด DNA จำกตวอยำงเลอดกงจะใชเลอดกงประมำณ 100 µl ทเกบตำมวธกำรขอ 1.2.2
ใหน ำตวอยำงไปปนตกตะกอนทแรงเหวยง 8,500 g นำน 10 min ถง 15 min เพอแยกสวนใสดำนบนทม
สำรละลำยปองกนกำรแขงตวของเลอดออกจำกตวอยำง
- ใส DNAzol® Reagent ปรมำณ 1 ml แลวท ำตวอยำงใหเปนเนอเดยวกน
- ใช micropipette ดดและปลอย (pipette up and down) เนอเยอทบดใหเปนเนอเดยวกนแลวสำมถงสครง
เพอไมใหเนอเยอทบดจบตวกนเปนกอน
1.2 กำรปนเหวยง
- น ำเนอเยอทบดเปนเนอเดยวกนแลวมำปนเหวยง ทแรงเหวยง 10,000 g นำน 10 min ทอณหภมหอง
หรออณหภม 4 ๐C
- ใช micropipette ดดเฉพำะสวนใส ใสใน microtubes หลอดใหม (ขนตอนนจะแยกเศษเนอเยอ
อำรเอนเอและ polysaccharide ออกจำกสำรละลำยทม DNA )
1.3 กำรตกตะกอน DNA
- เตมเอทำนอลสมบรณ ปรมำณ 0.5 ml จำกนนผสมกบสำรละลำยทม DNA โดยใชวธพลก microtubes
ขนลง หำมใชเครองเขยำ (vortex)
- ทงไวทอณหภมหองเปนเวลำ 1 min ถง 3 min จะเหนตะกอนDNA สขำวขน
- แยกตะกอน DNA ใสใน microtubes หลอดใหม หรอดดสวนใสทงใหหมด (อำจปนเหวยงทแรงเหวยง 4,000 gนำน 1 min ถง 2 min ทอณหภมหอง หรออณหภม 4 ๐C จะชวยแยกตะกอน DNA ไดดขน)
1.4 ลำง DNA
- เตมเอทำนอลควำมเขมขน 75% ปรมำณ 0.8 ml ถง 1.0 ml
- ลำงตะกอน DNA โดยใชวธพลก microtubes ขนลง หำมใชเครองเขยำ แลวดดเอทำนอลควำมเขมขน 75% ทง
- ลำงตะกอน DNA ดวยเอทำนอลควำมเขมขน 75% ซ ำอกครงหนงแลวดดเอทำนอลควำมเขมขน 75% ทง
มกษ. 10455 (G)-2559
10
1.5 ละลำย DNA เปดฝำ microtubes ทงไวประมำณ 5 s ถง 15 s เพอใหเอทำนอลระเหยออกใหหมด (หำก
DNA สมผสอำกำศนำนจะท ำใหกำรละลำย DNA ยำกขน)
- เตมโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ควำมเขมขน 8 mM ปรมำณ 0.2 ml ถง 0.3 ml (เตมอยำงชำๆ)
เพอท ำละลำย DNA
- ไดสำรละลำย DNA เพอน ำไปทดสอบในขนตอไป
- DNA ทละลำยดวย NaOH ควำมเขมขน 8 mM เกบไวทอณหภม 4 ๐C ไดนำนหลำยเดอน หำกเกบ DNA
ทอณหภม -20 ๐C จะเกบไดนำนอยำงนอยหนงป
- ปรบคำ pH ของ DNA ทละลำยดวย NaOH ควำมเขมขน 8 mM โดยเตม 0.1 M หรอ 1 M HEPES
(free acid) ตอ NaOH ควำมเขมขน 8 mM ปรมำณ 1 ml
2. กำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำย
OIE ใหตวอยำงไพรเมอรทใชในกำรตรวจเชอ IHHNV ในกง รำยละเอยดตำมภำคผนวก จ ตำรำงท จ.1 และให
ตวอยำงวธกำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำย โดยระบขนตอนดงน
1.1 ตงสภำวะในขนตอนตำงๆ ของเครอง thermocycler เพอเพมจ ำนวนDNA เปำหมำย ดงน
ขนท ขนตอน อณหภม เวลำ รอบ
1 Hot start 95 ๐C 5 min 1
2 Denaturation 95 ๐C 30 s
Annealing 55 ๐C 30 s 35
Extension 72 ๐C 1 min
3 Final extension 72 ๐C 7 min 1
4 ลดอณหภมของเครอง 4 ๐C
2.2 เตรยมสำรผสม PCR cocktail ในตวอยำง 1 หลอดประกอบดวย
DD H2O 32.5 µl
10X PCR buffer 5 µl
10 mM dTTP 1 µl
10 mM dATP 1 µl
10 mM dCTP 1 µl
10 mM dGTP 1 µl
25 mM MgCl2 4 µl
Forward primer (100 ng/µl) 1.5 µl
Reverse primer (100 ng/µl) 1.5 µl
AmpliTaq Gold 0.5 µl
มกษ. 10455 (G)-2559
11
2.3 จำกนนเตม DNA ตนแบบ (DNA template) ปรมำณ 1 µl ลงในสำรผสม PCR cocktail ทเตรยมไว
ปรมำณ 49 µl แลวผสมใหเขำกน สดทำยจะมปรมำณโดยรวมเทำกบ 50µl โดยใหผสมสำรบนภำชนะทม
อณหภมไมเกน 4 °C
2.4 น ำตวอยำงเขำเครอง thermocycler และใหเครองท ำงำนตำมสภำวะทตงไว
2.5 เมอเครอง thermocycler ท ำงำนเสรจสนแลว น ำ PCR product จำกตวอยำงททดสอบมำแยกแถบ
DNA ดวยวธ agarose gel electrophoresis
3. แยกแถบ DNAดวยวธ agarose gel electrophoresis
3.1 วำงแผน agarose gel ควำมเขมขน 1.5% ในเครอง electrophoresis
3.2 ใสสำรละลำย 1XTBE (Tris, boric acid, EDTA) ลงในเครองใหทวมแผน agarose gel
3.3 ผสมสยอม (6X loading dye) ปรมำณ 1 µl กบ PCR product ปรมำณ 5 µl ใสลงในหลมของ agarose gel
3.4 ใช DNA ladder ขนำด 100 base pairs (bp) เปน marker
3.5 แยก DNA ดวยกระแสไฟฟำท 100 volt เวลำประมำณ 40 min
3.6 กำรอำนผลแถบ DNA ของ PCR product
- น ำแผน agarose gel ไปยอมดวย ethidium bromide ควำมเขมขน 0.5 µg/ml หรอใชสำรยอม DNA ชนด
อนนำนประมำณ 10 min
- ใชน ำกลนลำง ethidium bromide สวนเกนออกจำกแผน agarose gel
- วำงแผน agarose gel บนเครอง UV transilluminator
- อำนผลแถบ DNA ของ PCR product แถบ DNA ทยอมดวยสำรยอม DNA จะเรองแสง
- บนทกภำพ
3.7 กำรแปลผลจะแตกตำงกนขนกบไพรเมอรทใชทดสอบ โดยเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำง
ควบคมผลลบ (ภำคผนวก จ และภำคผนวก ฉ ภำพท ฉ.3) ในกำรตรวจวนจฉยโรคทกครงตองมตวอยำง
ควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบเพอยนยนควำมถกตองของกระบวนกำรตรวจ
4. ตรวจหำล ำดบสำรพนธกรรมจำก PCR product เพอยนยนควำมจ ำเพำะของแถบ DNA
มกษ. 10455 (G)-2559
12
ภาคผนวก ก
โรคไอเอชเอชเอน
(ค ำอธบำยขอก ำหนด 1.1)
โรคไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis disease; IHHN disease) เกด
จำกเชอ IHHNV หรอมชอพองวำ PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus) เปน Parvovirus ทจดอย
ในสกล Brevidensovirus และวงศ Parvoviridae เชอ IHHNV เปนDNA ไวรสสำยเดยว (single-stranded
DNA) รปรำง icosahedral ขนำดเสนผำนศนยกลำง 20 nm และเปนไวรสทมขนำดเลกทสดทพบวำ
กอใหเกดโรคในกงกลมพเนยด (Penaied) ปจจบนมรำยงำนของเชอ IHHNV ทกอใหเกดโรค ไดแก จโน
ไทป 1และจโนไทป 2 สวนจโนไทป 3A และจโนไทป 3B เปนDNA บำงสวนของไวรสทพบแทรกอยใน
DNA (endogenous viral element; EVE) ของกงกลำด ำและไมกอใหเกดโรค
เชอ IHHNV จโนไทป 1 พบไดในสหรฐอเมรกำ เอเชยตะวนออก และพบในประเทศฟลปปนสเปนสวน
ใหญ เชอ IHHNV จโนไทป 2 พบไดในเอเชยตะวนออกเฉยงใต เชอ IHHNV จโนไทป 3A พบไดใน
แอฟรกำตะวนออก อนเดยและออสเตรเลย และเชอ IHHNV จโนไทป 3B พบไดในเขตอนโดแปซฟก
ตะวนตก (the western Indo-Pacific) ไดแก มำดำกสกำร มอรเชยส และแทนซำเนย
กงทไวตอกำรตดเชอ IHHNV คอ กงกลมพเนยด ไดแก กงขำว (Litopenaeus vannamei) กงกลำด ำ
(Penaeus monodon) และกงฟำ (P. stylirostris) โดยกำรตดเชอ IHHNV สำมำรถพบไดในกงทกวย
ตงแตไข กงวยออน กงหลงวยออน กงวยรน และกงตวเตมวย
กำรแพรเชอม 2 แบบ คอ กำรแพรเชอแนวระนำบ (horizontal transmission) สวนใหญเกดจำกกงกน
กนเอง (cannibalism) หรอรบเชอผำนทำงน ำทปนเปอนเชอ (contaminated water) และกำรแพรเชอแบบ
แนวดง (vertical transmission) พบวำเชอ IHHNV สำมำรถผำนจำกพอแมกงไปสลกกงรนตอไปได
โดยทวไปไขจำกแมพนธกงทตดเชอปรมำณสง (high virus load) จะไมสำมำรถพฒนำและฟกได แตใน
กรณทมกำรเจรญและฟกจะพบควำมชกของกำรตดเชอ IHHNV ในลกกงสง กงทตดเชอสำมำรถพบรอย
โรคอยำงใดอยำงหนงหรอหลำยอยำงรวมกน ดงตอไปน แคระแกรน (Runt Deformity Syndrome; RDS)
มควำมผดปกตของเปลอกท ำใหตวคดงอหรอสน กรโคงงอหรอบด (bent rostrum) หนวดกงหงกงอ
(brittle, wrinkled antenna) หวกงโปงพอง (bubble head) หรอมกำรผดรปทปลองทองท 6
มกษ. 10455 (G)-2559
13
ภาคผนวก ข
การจดล าดบวธการชนสตรโรคเพอการเลอกใช
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 2.1)
ตารางท ข.1 การจดล าดบวธการชนสตรโรค IHHN (rating of test)
วธชนสตร
ตรวจเฝาระวง (surveillance) วธทดสอบโรค
เบองตน
(presumptive
diagnosis)
วธทดสอบ
ยนยนโรค
(confirmatory
diagnosis)
กงวยออน
(larvae)
กง
หลงวยออน
(PL)
กงวยรน
(juveniles)
กงโตเตมวย
(adults)
Gross sign d d d d d d
Histopathology d d c c a b
PCR a a a a a a
Sequence d d d d d a
ทมำ: ดดแปลงจำก Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals ของ OIE, 2015 หมำยเหต
a = วธทแนะน ำใหใชในกำรชนสตร เนองจำกมกำรใชอยำงแพรหลำย มประโยชน มควำมจ ำเพำะและ
ควำมไวของวธกำรชนสตร
b = วธมำตรฐำนในกำรชนสตรทมควำมจ ำเพำะและควำมไวของวธกำรชนสตร c = วธทใชไดในบำงกรณเนองจำกมขอจ ำกดบำงประกำร
d = วธทไมแนะน ำเปนวธทไมเหมำะสม
กำรชนสตรโรค IHHN ในกงดวยวธทำงหองปฏบตกำร ไดแก กำรตรวจรอยโรคภำยนอก วธจลพยำธวทยำและ
วธชววทยำระดบโมเลกล เมอไดผลตรวจทำงหองปฏบตก ำรแลวเจำหนำทผ รบผดชอบตำม
พระรำชบญญตโรคระบำดสตว พ.ศ. 2558 ควรพจำรณำวทยำกำรระบำดพยำธก ำเนดและอำกำรของโรค
IHHN รวมดวยเพอใหกำรปองกนและควบคมโรคเปนไปอยำงมประสทธภำพ วตถประสงคของกำร
ชนสตรโรค IHHN คอ เพอยนยนกำรระบำดของโรค ตรวจพสจนกำรตดเชอไวรสในพอแมพนธกงและลก
พนธกงกอนกำรปลอยลงเลยง และกำรเฝำระวงโรค
มกษ. 10455 (G)-2559
14
ภาคผนวก ค
การเตรยมสารเคม
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 1.1 1.2.2 และ 3.1)
ค.1 สำรละลำยคงสภำพเดวดสนปรมำณ 1,000 ml
เอทำนอลควำมเขมขน95% 330 ml
ฟอรมำลน (ฟอรมำลดไฮด 37% ถง 39%) 220 ml
กรดแอซตกเขมขน (glacial acetic acid) 115 ml
น ำกลน 335 ml
ค.2 สำรละลำยปองกนกำรแขงตวของเลอดปรมำณ 1,000 ml โซเดยมคลอไรด (sodium chloride) 26.3 g
ไทรโซเดยมซเทรต (trisodium citrate) 8.8 g
กรดซทรก (citric acid) 5.5 g
EDTA 3.7 g
วธกำรเตรยม
1. ชงสวนประกอบตำงๆ ใหครบ เตมน ำกลนปรมำณ 700 ml แลวปรบ pH ใหได 7.0 ดวย NaOH
2. น ำไปท ำใหปรำศจำกเชอดวยหมอนงอดไอน ำ (autoclave) ทแรงดน 15 ปอนดตอตำรำงนว อณหภม 121°Cนำน 15 min
3. ทงไวใหเยนเตมกลโคสควำมเขมขน 1 mol ปรมำณ 100 ml โดยชงกลโคส 39.6 g ละลำยในน ำกลน 200 ml
4. เตมน ำกลนใหครบ 1,000 ml
ค.3 5XTBE (Stock solution)
tris base 54 g
กรดบอรก (boric acid) 27.5 g
0.5 M EDTA (pH 8) 20 ml
มกษ. 10455 (G)-2559
15
ภาคผนวก ง
การท าการณยฆาตในกง
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 1.1)
กำรท ำกำรณยฆำตในกงทระบในแนวปฏบตฉบบน มจดประสงคเพอลดควำมเจบปวดและทรมำนของกง
ตำมหลกสวสดภำพสตว กอนน ำไปเตรยมตวอยำงเพอกำรชนสตรโรค ซงปจจบนมวธกำรท ำกำรณยฆำต
ในสตวน ำทไมมกระดกสนหลง (aquatic invertebrate) อยหลำยวธ เชน กำรใหยำสลบเกนขนำด กำรใช
สำรเคมหรอกำรท ำลำยสมองและปมประสำททส ำคญ ทงน OIE ยงไมมขอก ำหนดเฉพำะส ำหรบ
กำรท ำกำรณยฆำตในกง จงอำจใชวธอนทแตกตำงจำกทระบไดหำกไดรบกำรทดสอบแลววำเปนวธทม
ประสทธภำพในกำรลดควำมเจบปวดและทรมำนใหกบกงและไดรบกำรเผยแพรในวำรสำรทำงวชำกำร
กำรท ำกำรณยฆำตตองกระท ำอยำงรวดเรวเพอลดควำมเจบปวดทรมำนของกง ไมควรปลอยใหกงตำยจำก
กำรขำดออกซเจน หรอใชสำรเคมทมฤทธในกำรกดกรอนท ำลำยเนอเยอกงใหกงไดรบบำดเจบและเกด
ควำมเจบปวดทรมำน โดยวธกำรใดวธกำรหนงดงน
1. น ำกงครงละ 1 ตว ใสในถงพลำสตกทบรรจน ำทมควำมเคมเทำกบน ำในบอเลยงกงพอทวมตวแลว
น ำไปฝงในน ำแขงบดทมน ำผสม (ice slurry) ทอณหภมประมำณ 0 °C โดยมสดสวนระหวำงน ำแขง:น ำ
เทำกบ 3:1 จนกงหมดควำมรสก จำกนนใหแชหรอฉดกงดวยสำรเคมทนท เชน สำรละลำยคงสภำพเดวดสน
หรอเอทำนอลควำมเขมขนมำกกวำ 70%
2. น ำกงแชในสำรออกฤทธทท ำใหหมดควำมรสก เชน น ำมนกำนพล (clove oil) หรอยจนอล (eugenol)
โดยควำมเขมขนของน ำมนกำนพลหรอยจนอลทแนะน ำใหใช คอ 0.125 ml/L แตไมแนะน ำใหใช
สำรไอโซยจนอล (isoeugenol) เนองจำกเปนสำรทอำจกอมะเรงได
มกษ. 10455 (G)-2559
16
ภาคผนวก จ
ไพรเมอรทใชในการตรวจเชอ IHHNV
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 3.1)
ตารางท จ.1แสดงล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในการตรวจเชอ IHHNV
ไพรเมอร ล าดบของนวคลโอไทด ขนาดแถบ DNA Annealing
temperature
Accession
number base pairs (bp)
389F 5´-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3´ 389 72°C AF218266
389R 5´-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3´ 71°C
77012F 5´-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3´ 356 68°C AF218266
77353R 5´-TCG-TAC-TGG-CTG-TTC-ATC-3´ 63°C
392F 5´-GGG-CGA-ACC-AGA-ATC-ACT-TA-3´ 392 68°C AF218266
392R 5´-ATC-CGG-AGG-AAT-CTG-ATG-TG-3´ 71°C
309F 5´-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3´ 309 68°C AF218266
309R 5´-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3´ 69°C
MG831F 5´-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3´ 831 58°C DQ228358
MG831R 5´-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT-3´ 62°C
ทมำ: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals ของ OIE, 2015
การแปลผล
1. เมอทดสอบดวยไพรเมอร 389F/389R
หำกพบแถบ DNA ขนำด 389 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก
หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 389 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ
2. เมอทดสอบดวยไพรเมอร 77012F/77353R
หำกพบแถบ DNA ขนำด 356 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก
หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 356 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ
3. เมอทดสอบดวยไพรเมอร 392F/392R
หำกพบแถบ DNA ขนำด 392 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก
หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 392 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ
4. เมอทดสอบดวยไพรเมอร 309F/309R
หำกพบแถบ DNA ขนำด 309 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก
หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 309 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ
5. เมอทดสอบดวยไพรเมอร MG831F/MG831R หำกพบแถบ DNA ขนำด 831 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก
หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 831 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ
มกษ. 10455 (G)-2559
17
ภาคผนวก ฉ
ภาพประกอบการชนสตรโรค IHHN
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 2.1 2.3 และ 3.1)
ฉ.1.1
ฉ.1.2
ฉ.1.3
ภาพท ฉ.1 กงปกต (ฉ.1.1) และ กงทพบลกษณะ Runt Deformity Syndrome (ฉ.1.2-ฉ.1.3)
ทมำ: ผชวยศำสตรำจำรยวศณ บญญำววฒน คณะสตวแพทยศำสตร มหำวทยำลยเกษตรศำสตร (ฉ.1.1)
หนวยวจยเพอควำมเปนเลศเทคโนโลยชวภำพกง มหำวทยำลยมหดล (ฉ.1.2-ฉ.1.3)
มกษ. 10455 (G)-2559
18
ฉ.2.1 ตอม antennal ทตดเชอ IHHNV
ฉ.2.2 ตอม antennal ทตดเชอ IHHNV
ฉ.2.3 เสนประสำททตดเชอ IHHNV
ภาพท ฉ.2 แสดงลกษณะทำงจลพยำธวทยำในเนอเยอกงทตดเชอ IHHNV พบอนภำคฝงใน
รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลทตดเชอ (Cowdry A type eosinophilic
intranuclear inclusions)
ทมำ: หนวยวจยเพอควำมเปนเลศเทคโนโลยชวภำพกง มหำวทยำลยมหดล
มกษ. 10455 (G)-2559
19
ฉ.3.1 ใชไพรเมอร 389F และ 389R ฉ.3.2 ใชไพรเมอร 77012F และ 77353R
ฉ.3.3 ใชไพรเมอร 392F และ 392R ฉ.3.4 ใชไพรเมอร 309F และ 309R
M = 100 bp molecular marker
S1-S3 = Unknown sample 1-3
P = positive control (IHHNV infected sample)
N = negative control (IHHNV negative sample)
ภาพท ฉ.3 แสดงตวอยำงผลกำรชนสตรเชอ IHHNV ดวยวธ PCR โดยใชไพรเมอรแตกตำงกนจะ
พบแถบ DNA ขนำดแตกตำงกน
ทมำ: รองศำสตรำจำรยเจนนช วองธวชชย คณะสตวแพทยศำสตร จฬำลงกรณมหำวทยำลย
300
200
M S1 S2 S3 P N
100
400
1,000
500 389 bp
M S1 S2 S3 P N
200
100
400
1,000
356 bp
500
300
M S1 S2 S3 P N
200
100
400
1,000
392 bp 500
300
M S1 S2 S3 P N
309 bp
1,000
500
300
200
100
400
มกษ. 10455 (G)-2559
20
ภาคผนวก ช
ตวอยางแบบบนทกขอมลเพอประกอบการวนจฉยโรค
(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 1.1 และ 1.2)
ว/ด/ป ทรบตวอยาง....................................... รหสตวอยาง.......................................
1. ขอมลฟารม
1.1 ชอ-สกล ผสงตวอยำง…………………………………………………………โทรศพท………………………………………………
1.2 ชอ-สกลเจำของฟำรม…………………………………………………………โทรศพท………………………………………………
เลขทบตรประชำชน……………………………………………………………………………………………………………………………
ทอยปจจบน………………………………………………………………………………………………………………………….……………
1.3 ชอฟำรม………………………………………………หมำยเลขทะเบยนฟำรม………………………………………………………
ทตงฟำรม เลขท…………หมท………ต ำบล……………………อ ำเภอ…………………จงหวด………………………………
1.4 ประเภทประกอบกำร
โรงเพำะฟก โรงอนบำล ฟำรมเลยง
ทรวบรวม/โรงคดบรรจ กระชง อน.............................
1.5 มำตรฐำนฟำรม
GAP เลขท......................................................................... .......................
CoC เลขท.................................................................................................
อนๆ.................................................................................... .....................
2. ขอมลสตวน า
2.1 ประเภทสตวน ำทสงตรวจ
สตวน ำตรวจสขภำพทวไป สตวน ำปวย สตวน ำน ำเขำ-สงออก
อนๆ......................................................................................... ...................
2.2 ชนดสตวน ำ
ชอสำมญ....................................... ชอวทยำศำสตร.....................................
2.3 จ ำนวนสตวน ำทสงตรวจ
.................................................................................... ..............................ตวตอถง
2.4 อำยสตวน ำ
................................................................................................ ..............................
2.5 อำกำรทวไปทสำมำรถสงเกตเหน……………………………………………………………………………………………..………
มกษ. 10455 (G)-2559
21
2.6 ปรมำณของสตวน ำทปวย
(%).........................................................................................................................
2.7 แหลงทมำของลกพนธสตวน ำ
น ำเขำจำกตำงประเทศ ระบแหลง…………………………………………………………….…………………………
จำกกำรเพำะเลยงเองภำยในประเทศ ระบแหลง……………………………………………………....……...
รวบรวมจำกธรรมชำต ระบแหลงทมำ....................................................................
ลกพนธผำนกำรตรวจเชอ ระบ.............................................................................
2.8 ชนดและขนำดของบอเลยง/รวบรวม
บอซเมนต ขนำด............. บอดน ขนำด.............. ตกระจก ขนำด................
ถงไฟเบอร ขนำด............ กระชง ขนำด.............. อนๆ..............................
2.9 อตรำควำมหนำแนน (ตวตอตำรำงเมตร).........................................................................
3. ขอมลคณภาพน าเลยง
3.1 แหลงน ำทใชเลยงสตวน ำ
น ำทะเล ระบแหลง............................................................................................
น ำประปำ น ำบำดำล แหลงน ำธรรมชำต น ำฝน อนๆ ..................
3.2 คณสมบตน ำ
สน ำ (color).................................................................................... ................
ควำมเคมน ำ.................................... อณหภมน ำ..........................................
ควำมเปนกรด-ดำง (pH).................. คำบโอด..............................................
ปรมำณออกซเจนละลำยน ำ (Dissolved Oxygen หรอ DO).....................................
ควำมเปนดำงทงหมด (total alkalinity)............ ควำมกระดำง (hardness)............
แอมโมเนยทงหมด (NH3)............................. ไนไตรต (NO2) ........................
4. ขอมลดานอาหาร
4.1 ชนดอำหำร
อำหำรส ำเรจรป ระบยหอ..............................................................................
อำหำรมชวต ระบชนด.........................................แหลงทมำ............................
อำหำรสมทบ ระบชนด........................................แหลงทมำ............................
อนๆ ระบ...................................................................................................
4.2 อตรำกำรใหอำหำร (%) และควำมถ (ครงตอวน).........................................................
มกษ. 10455 (G)-2559
22
5. ผลการวนจฉย
5.1 สขภำพทวไป
ผำน
ไมผำน สงทตรวจพบ....................................................................................
5.2 ปรสต
ระบ ชนด............................................. วธตรวจ..........................................
5.3 แบคทเรย
ระบ ชนด............................................. วธตรวจ...........................................
ชนดยำทแนะน ำ...........................................................................................
5.4 ไวรส
ระบ ชนด............................................. วธตรวจ..........................................
5.5 อนๆ ระบ.............................................................................................................
6. ค าแนะน า
............................................................................................................................. .....
................................................................................................................................ ..
............................................................................................................................. .....
ชอผวนจฉยและใหค ำแนะน ำ.............................................
(...................................................)
วนท...............เดอน......................พ.ศ.............
ทมำ: สถำบนวจยสขภำพสตวน ำชำยฝง กองวจยและพฒนำประมงชำยฝง กรมประมง
Top Related