TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
Huỳnh Duy Thảo, Nguyễn Bảo Tường, Trần Thị Thanh Thủy, Trần Công Toại
Bộ môn Mô – Phôi, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch Khoa Bỏng, BV. Nhi Đồng I
NỘI DUNG
ĐẶT VẤN ĐỀ1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3
KẾT QUẢ4
KẾT LUẬN5
ĐẶT VẤN ĐỀ
SỐ LIỆU BV. NHI ĐỒNG I
• Mỗi năm có khoảng 2000 bệnh nhi khám và điều trị tại khoa bỏng
• 1/3 bỏng < 10% diện tích cơ thể• 1/3 bỏng rộng > 30% (80 – 90%)=> nhóm bệnh có nguy cơ tử vong cao, nguy cơ
tàn tật cao và mang di chứng ảnh hưởng nặng nề đến thẩm mỹ
CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ
• Vài trăm ngàn => vài chục triệu• Cá biệt : 120.000.000 đồng=> thực hành giảm chi phí kháng sinh/ngày điều
trị
GIẢI PHÁP ĐIỀU TRỊ BỎNG NẶNG Ở TRẺ EM
• 1/3 bỏng rộng > 30% diện tích cơ thểÞ Tìm được nguồn da ghép để ghép sớmÞ Khó khăn: + Không ghép được nguồn da đồng loại, dị
loại + Chỉ sử dụng được vật liệu che phủ: màng
trung bì, màng ối, màng collagen nhận tạo …
ĐÂY LÀ NHÓM CẦN THIẾT PHẢI ĐƯỢC GHÉP DA
• VÌ:Þ Có nguy cơ tử vong caoÞ Cần nhiều da để ghépÞ Chi phí điều trị cao: nằm viện lâu, dùng nhiều
kháng sinh …
MỤC TIÊU CUỐI• Trẻ hòa nhập hoàn toàn với xã hộiÞ Không tàn tậtÞ Không tự ti, mặc cảm về ngoại hìnhÞ Nâng cao chất lượng cuộc sống
BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
ẢNH HƯỞNG RẤT NẶNG NỀ ĐẾN BẢN THÂN, GIA ĐÌNH VÀ XÃ HỘI
BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP GHÉP DA TỰ THÂN
BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP HẠN CHẾ
BỎNG SÂU Ở TRẺ EM
TH1 TH2 TH3
GIẢI PHÁP TẤM TẾ BÀO SỪNG
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CẤU TẠO MÀNG ỐI
CẤU TẠO MÀNG ỐI
THU NHẬN MÀNG ỐI
CẤU TẠO MÔ DA
Tế bào lớp đáy
Tế bào lớp gai
Tế bào lớp hạt
Phóng thích thể mỏng
Thể mỏng
Hạt keratohyalin
Bộ máy Golgi
Thể mỏng
Ty thể
Ribosom
Màng cơ bản
Tế bào hóa sừng
Vỏ tế bào
Lớp sừng
Lớp gai
Lớp hạt
Lớp đáy
CƠ CHẾ TỰ ĐỔI MỚI
CƠ CHẾ BIỆT HÓA
Tế bào gốc biểu mô
Tế bào khuếch đại chuyển
Tế bào gốc
biểu mô
Các tế bào biểu bì đã biệt hóa
Tế bào gốcBiểu mô
Tế bào khuếch đại chuyển
ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG
Tế bào gốc
Tự làm mới
Tế bào khuếch đại chuyển
Biệt hóa Tế bào đang biệt hóa ở hậu kỳ của gián phân
Tế bào lớp gai
Tế bào lớp hạt
Tế bào lớp vảy sừng
ĐỊNH DANH TẾ BÀO SỪNG
- Nhuộm p63: đỏ - Nhuộm involucrin: xanh lá cây
Màng lọc của đĩa lồng
Tế bào sừng
Môi trường nuôi tế bào sừng
Màng collagen
MÔ HÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG
Đĩa lồng
Mẫu da người
Nuôi, nhân tế bào sừng
Cấy tế bào sừng lên màng collagen
Tạo nhiều lớp tế bào sừng trên màng
collagen
Đánh giá
Phân lập tế bào
Màng collagen
Loại biểu mô
Màng ối người
Theo dõi, đánh giá sản phẩm
Ghép tự thân trên bệnh nhân
TẠO MÀNG COLLAGEN TỪ MÀNG ỐI
-Hóa chất: + Nước cất + Dung dịch PBS + Nước muối sinh lý + Trypsin 0.25%
ĐÁNH GIÁ MÀNG ỐI
BA
Kết quả nhuộm trichrom (A) và nhuộm PAS (B) của màng ối đã loại biểu mô
Màng ối được thu nhận trong DPBS – kháng sinh
Rửa, lắc trong DPBS cho sạch máu
Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô
Đóng gói
Lắc trong trypsin/EDTA 30 phút, 37oC
Để khô tự nhiên trong tủ cấy khoảng 2 giờ
Chiếu xạ bằng tia , suất liều 25kGy
Bảo quản ở nhiệt độ phòng
GIÁ TH NUÔI C Y T BÀO S NGỂ Ấ Ế Ừ
GIÁ TH Ể = Màng collagen (t màng i ng i)ừ ố ườ
TH1 TH2 TH3
PHÂN LẬP, NUÔI CẤY, NHÂN KHỐI TẾ BÀO SỪNG
TH1 TH2 TH3
MẪU DA
A B
QUY TRÌNHMẫu da được thu nhận trong
DPBS – kháng sinh
Rửa trong DPBS, loại bỏ lông, mỡ, một phần lớp trung bì
Cắt thành từng mảnh nhỏ
Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì
Thay môi trường sơ cấp bằng môi trường không huyết thanh
Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA 0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 18 giờ, 4oC
Huyền phù để thu nhận tế bào sừng rời
Nuôi tế bào trong môi trường sơ cấp ở 37oC, 5% CO2 với mật độ 3 x 105 tế
bào/cm2 bề mặt chai nuôi trong 2 ngày
Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2, thay môi trường 2 ngày/lần
Biểu bìTrung bì
Biểu bìTrung bì
Biểu bìTrung bì
ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG
0.959
0.721
0.565
0.419
0.321
0.2
0.4
0.6
0.8
1
2 3 4 5 6
Ngày
M?t
đ? q
uang
ĐÁNH GIÁ NST ĐỒ
KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GIEN M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300bp
600bp
500bp
400bp
+ M - Thang+ 1, 3, 5, 7, 9 - Sản phẩm khuếch đại các gen tương ứng p63 (440bp), K14 (390bp), K5 (475bp), involucrin (373bp), -actin (587bp)+ 2, 4, 6, 8, 10 - Sản phẩm khuếch đại gen của mẫu da bình thường đối chứng tương ứng p63, K14, K5, involucrin, -actin
TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG
ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
A B
Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen
ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
Kết quả tạo tấm tế bào sừng. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí (A Kính hiển vi đảo ngược, 100X) và (B, H&E).
A B
ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
AMàng collagen B
Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho tấm tế bào sừng. Sau 7 ngày các tế bào bắt màu nâu: dương tính p63.A: Mẫu nghiên cứuB: Mẫu da người
ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
Màng collagen
ĐÁNH GIÁ MẢNH GHÉP
BÁO CÁO S B NH NG TR NG H P Ơ Ộ Ữ ƯỜ ỢNUÔI C Y DA ĐÃ TH C HI NẤ Ự Ệ
BÁO CÁO S B NH NG TR NG H P Ơ Ộ Ữ ƯỜ ỢNUÔI C Y DA ĐÃ TH C HI NẤ Ự Ệ
BÁO CÁO S B NH NG TR NG H P Ơ Ộ Ữ ƯỜ ỢNUÔI C Y DA ĐÃ TH C HI NẤ Ự Ệ
KẾT LUẬN
KẾT LUẬN• Thứ nhất, tấm tế bào sừng có thể dùng điều trị tổn thương mất da ở trẻ em
=> giảm diện tích da cho để ghép, giảm đau hậu phẫu và cho sẹo mềm mại
hơn so với kỹ thuật ghép da mỏng hiện đang sử dụng.
• Thứ hai, việc sử dụng tấm tế bào sừng vẫn còn những khó khăn như diện
tích da nuôi cấy chưa đủ che phủ toàn bộ thương tổn, khó đánh giá độ bám
dính, sẹo vẫn phì đại, đỏ và ngứa nhưng tốt hơn sẹo do ghép da mỏng hoặc
để lành tự nhiên.
• Thứ ba, cần nghiên cứu thêm để giải quyết những tồn tại trên và nghiên cứu
thêm để nhuộm màu cho tấm tế bào sừng để đáp ứng nhu cầu thẩm mỹ, ghép
thêm tấm lưới sợi trên bề mặt tấm tế bào sừng để cố định mảnh ghép tốt hơn,
gửi mẫu nuôi cấy nhiền đợt để có thể che phủ toàn bộ vết thương …
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO• Thứ nhất, đồng nuôi cấy tế bào sắc tố để tạo màu sắc cho mảnh ghép.
• Thứ hai, thử nghiệm nuôi trực tiếp không qua nhân khối để rút ngắn thời
gian ghép cho bệnh nhi.
• Thứ ba, ghép thành nhiều đợt để gia tăng thể tích ghép cho bệnh nhi.
Top Related