Gisselle C. Gil Z. PhD.
Sección de Inmunogenética - Instituto de Inmunología
Facultad de Medicina – Universidad Central de Venezuela
Sistema HLA y Trasplantes
Tipos de trasplante – Diferencias genéticas
Trasplante
Trasplante:
Donante Receptor
Antígeno Anticuerpo
• Autólogo dentro del mismo individuo
• Xenogénico individuos de diferentes especies
• Singénico individuos isogénicos
• Alogénico individuos de la misma especie
consiste en la transferencia de células, tejidos u órganos de un individuo a otro
Autológos = Singénico > Alogénico > Xenogénicos
Aceptación o rechazo basado en las diferencias genéticas
Tipos de trasplante – Órgano o tejido trasplantado
Trasplante
2005
1968
1987
281
Venezuela
(2013)
7
8
-
-
154
57
148
Venezuela
(2014)
-
-
-
-
63
29
1978
Tipos de trasplante – Barreras y limitaciones
Trasplante
Antígenos de histocompatibilidad
• Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH): Aloantígenos que inducen respuestas más enérgicas de rechazo
• Antígenos de histocompatibilidad secundarios o menores
Respuesta
inmunológica
• Disponibilidad de órganos • Controlar el rechazo • Disparidad genética entre el donante y el receptor
Historia del descubrimiento del HLA
Grupo ABO
•Karl Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos
Premio Nobel 1930
•Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos
Grupo ABO
Historia del descubrimiento del HLA
Antígeno A Antígeno B
Antígeno AB Ausencia de Antígeno
Sangre tipo A Sangre tipo B
Sangre tipo AB Sangre tipo O
Nobel 1930
•Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos
Grupo ABO
Historia del descubrimiento del HLA
Nobel 1930
Antígenos leucocitarios – HLA – MHC
Aglutinación
Historia del descubrimiento del HLA
• André y col. 1954 Leucemia
• Lehndoff, 1951 Neutropenia
• Goudsmit y Van Loghem, 1953 Anemia hemolítica
• Otros
•1950s → Los trabajos de aglutinación con glóbulos rojos
son extrapolados a estudios con leucocitos
Antígenos leucocitarios – HLA – MHC
Aglutinación
Historia del descubrimiento del HLA
•Formación de agregados.
Historia del descubrimiento del HLA
•Miescher y Fauconnet 1954 Primer reporte de presencia de anticuerpos contra leucocitos.
“Se comenzó a usar el término Grupo Leucocitario”
•Dausset 1954 Demuestra que las transfusiones inducen la aglutinación de los leucocitos
•Van Loghem y col 1956 Al retirar la capa de blancos se evita la NHTR “Non-haemolytic
transfusion reactions”
•Van Rood y Payne 1958 Demuestran que mujeres multíparas producen anticuerpos contra
leucocitos
•Van Rood y Van Loghem 1963 Análisis computarizado de patrones de reacción de múltiples
sueros contra un panel de células (Bw4 y Bw6)
•Payne 1964 Descubre otro sistema asociado con el Bw4 y Bw6
Antígenos de Histocompatibilidad
Antígenos leucocitarios – HLA – MHC
Aglutinación •Walford y col., 1964 Citotoxicidad mediada por complemento
•Terasaki y Mc Clelland 1964 Microlinfocitotoxicidad
•1 ml de suero = 1 ensayo por aglutinación
•1 ml de suero = 1000 ensayos
•Bernard Amos 1964 Organiza el 1er Workshop
•Bach y Voynow, 1966 reconocimiento y proliferación de
linfocitos (Cultivo mixto de linfocitos)
•Sood, Pereira y Weissman, 1981 Primer gen HLA clonado
•1990s Desarrollo de tipaje HLA (SSP, SSO)
•2005 Tecnología de secuenciación de próxima generación
Historia del descubrimiento del HLA
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
•Están ubicados en el brazo corto
del cromozoma 6
•Se expresan de forma autosómica
•Son codominantes
•Es un sistema poligénico y
polimórfico
•Se encuentran en desequilibrio de
enlace
•Se heredan en bloque de acuerdo
con un sistema mendeliano simple
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
Wiley J. y Ltd S., Immunology, 150, 127–138 (2016)
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
•La distribución de los genes HLA y las frecuencias de los distintos alelos y haplotipos varía entre los
distintos grupos étnicos.
•Algunos genes HLA están restringidos a poblaciones específicas.
•Estas variaciones podrían ser el resultado de procesos adaptativos a presiones ambientales.
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Tomado de: http://hla.alleles.org/
•1990
•1986
Proyecto Genoma
PCR (Kary Mullis)
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
HLA Gen Alelos Proteínas Nulos
Clase I
A 5.266 3.552 286
B 6.537 4.494 232
C 5.140 3.359 236
Clase II
DRA 7 2 0
DRB 3.171 2.266 124
DQB1 1.718 1.151 72
DPB1 1.449 960 75
DRB1 2.581 1.834 78
DRB3 304 233 15
Clase III MICA 109 82 3
MICB 47 30 2
Alelos HLA Totales (2019) 26.329 (2019)
26.889 (2020)
Tomado de: http://hla.alleles.org/
Características del MHC - Nomenclatura
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Prefijo HLA
Gen
Separador
(Biología Molecular)
Grupo
alélico
Proteína HLA
especifica
Sustitución en región
no codificante
Codón sinónimo
(Sustitución en la región
codificante del ADN)
HLA-A A * 24: 02: 01: 02 L Sufijo que indica
cambio de expresión
MHC
•Son el objetivo principal de las respuestas inmunes a los Trasplantes alogénicos
•Son elementos esenciales para las respuestas a estímulos antigénicos
•Se les implica en la susceptibilidad genética a padecer enfermedades
El rechazo – Papel de las células T
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
•Moléculas MHC alogénicas
•Péptidos alogénicas
•Molécula MHC propia
•Péptidos alogénicas
Complejo Mayor de Histocompatibilidad y Trasplante
Rechazo
•Moléculas MHC alogénicas
•Péptidos propio
•Molécula MHC propia
•Péptidos alogénicos
Complejo Mayor de Histocompatibilidad y Trasplante
Rechazo
Rechazo mediado por mHAgs
Antígenos menores de histocompatibilidad
Descubrimiento
Antígenos menores de histocompatibilidad
Spierings, E. (2014). Tissue Antigens, 84(4), 374–360
1976
•Problemas clínicos posteriores
a trasplantes de MO entre
hermanos HLA-idénticos
•Experimentos in vitro mostraron distintos
grados de actividad celular entre donante y el
receptor
•20 años después se caracterizo el primer
antígenos menores de histocompatibilidad
(mHAgs)
Spierings, E. (2014). Tissue Antigens, 84(4), 374–360
•Son epítopos de células T derivados de
proteínas polimórficas
•Los péptidos menores de
histocompatibilidad son presentados por
varias moléculas MHC clase I y clase II
•El complejo MHC/mHAgs puede actuar
como un barrera en el trasplante alogénico
HLA/idéntico de células madre
hematopoyéticas y en trasplante de
órganos sólidos
Características antígenos menores de histocompatibilidad
Antígenos menores de histocompatibilidad
Rechazo
Trasplante
Rechazo
Trasplante
Tipos de rechazo
Trasplante
Hiper-agudo Agudo
Crónico Humoral Temprana Tardío
Tiempo 24 horas Días a meses Días a
semanas
Después del
primer año Años
Causa Ac. pre-existentes
contra el donante
Ac. pre-existentes
contra antígenos
leucocitarios (HLA)
Alorespuesta Alorespuesta Inmunológicas y no
inmunológicas
Mecanismo Células B,
complemento y
anticuerpos
Células B Células T Células T y
células B
Células T,
células B, inmunidad
innata, lesiones e
inflamación
Tratamiento
Mejor detección de
anticuerpos
preformados y
mejor
“emparejamiento”
del MHC
Eliminar los anticuerpos
donante específicos
(Inmunoabsorción,
inmunosupresión);
controlar la producción
de aloanticuerpos
Inmunosupresión Re-trasplante; Inducción
de tolerancia
Rechazo hiper-agudo: en las primeras 24 horas
Trasplante
Activación cascada complemento
↓
Necrosis endotelial, depósito de plaquetas
↓
Coagulación local
↓
Pérdida del órgano
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo hiperagudo: en las primeras 24 horas
Trasplante
PM
N -
Glo
méru
lo
PM
N -
Ca
pila
res p
eri
tubu
lare
s
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo hiperagudo: en las primeras 24 horas
Trasplante
C4d -
Glo
méru
lo
C4d -
Capila
res p
eritu
bula
res
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo agudo: días o meses post-trasplante
Trasplante
Célula T
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo agudo: días o meses post-trasplante
Trasplante
Rodamiento o Rolling - Adherencia estable
↓
Diapédesis - Migración
↓
Daño al tejido : Tubulitis
↓
Pérdida del órgano
Infiltra
do inte
rsticia
l de lin
focitos T
Túbulo
s r
enale
s
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo agudo: días o meses post-trasplante
Trasplante
Rodamiento o Rolling - Adherencia estable
↓
Diapédesis - Migración
↓
Daño al tejido : Oclusión vascular
↓
Pérdida del órgano
Célu
las m
onon
ucle
are
s -
A
rterias
Mio
fibro
bla
sto
s
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo crónico: años post-trasplante
Trasplante
Rechazo crónico: años post-trasplante
Trasplante
Hip
ert
rofia c
elu
lar
-
Deposic
ión d
e a
nticuerp
os
Engro
sam
iento
de la
mem
bra
na b
asal glo
meru
lar
C4d
Pérd
ida d
e e
str
uctu
ra
Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62
Rechazo y compatibilidad HLA
Trasplante
https://www.ctstransplant.org/public/newsletters/2002/gif/2002-1.html
Rechazo e Isquemia fría
Trasplante
https://www.ctstransplant.org/public/newsletters/2002/gif/2002-1.html
Rechazo y presencia de Ac anti-HLA
Trasplante
https://www.ctstransplant.org/public/newsletters/2002/gif/2002-1.html
Rechazo y presencia de Ac anti-HLA
Trasplante
https://www.ctstransplant.org/public/newsletters/2002/gif/2002-1.html
Rechazo y presencia de Ac anti-HLA
Trasplante
Sypek, M. y col. American Journal of Kidney Diseases. 7:5, 720-731. 2019.
Trasplante de Médula Ósea
Trasplante
•Mieloablación del sistema hematopoyético
• se eliminan las células malignas
• se realiza una inmunosupresión
Tratamiento estándar de:
•Aplasia Medular Grave (Desarrollo incompleto grave de
la médula)
•Síndrome de Inmunodeficiencia Combinada
Congénito (Síndrome caracterizado por defectos en el
funcionamiento inmunitario de naturaleza congénita)
•Leucemia Aguda (leucemia caracterizada por el
aumento de granulocitos, una de las células que forman
parte de los glóbulos blancos, y que evoluciona
lentamente hasta el momento final)
•Leucemia Mieloide Crónica
•Mucopolisacaridosis
Tratamiento estándar:
Trasplante de Médula Ósea
Trasplante
El Donante:
•Obtención de células madre de medula ósea circulantes
•Movilización - Factores estimulantes (G-CSF)
•Cosecha - Aféresis
•Obtención de células madre de medula ósea por punciones cadera
•Aspirado de medula ósea
El receptor
•Quimioterapia o radio terapia
•Injerto - Infusión intravenosa
•2x106 células madre/Kg
Enfermedad de injerto contra huésped
Trasplante
Enfermedad de injerto contra huésped
Trasplante
•La EICH aguda: ocurre dentro de los primeros 6 meses después de un trasplante
•Dolor o cólicos abdominales, náuseas, vómitos y diarrea
•Ictericia (coloración amarillenta de la piel o los ojos) u otros problemas del hígado
•Erupción cutánea, picazón, enrojecimiento en áreas de la piel
•La EICH crónica: comienza más de 3 meses después de un trasplante y puede durar toda la vida.
•Resequedad en los ojos o cambios en la visión
•Boca seca, parches blancos dentro de la boca y sensibilidad a los alimentos picantes
•Fatiga, debilidad muscular y dolor crónico
•Dolor o rigidez en las articulaciones
•Erupción cutánea con áreas levantadas y decoloradas, así como endurecimiento o
engrosamiento de la piel
•Dificultad para respirar
•Resequedad vaginal
•Pérdida de peso
Trasplante de Médula Ósea – Seguimiento
Trasplante
Quimerismo: presencia de células linfohematopoyéticas que no son propias del receptor. Estas
células pueden derivar de transfusiones accidentales entre el feto y la madre, por transfusiones de
sangre o por transplante de células madre hematopoyéticas.
Quimerismo total: es cuando hay un reemplazo completo de las células linfohematopoyéticas.
Se detecta un 100% de células del donante.
Quimerismo mixto: presencia de células del receptor y del donante. Las implicaciones varían
según la enfermedad y la fracción que presente el quimerismo (linfocitos, monocitos)
Quimerismo dividido: cuando una o más líneas celulares proceden en su totalidad del donante
y a su vez una o más líneas celulares proceden totalmente del receptor.
Microquimerismo: cuando tenemos <1% de células del receptor. Sólo se puede definir si se
usan técnicas de alta sensibilidad. Foseph H Antin y otros. 2001.
Tipificación de los antígenos HLA
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
• Serológica (sangre periférica y ganglios linfáticos)
• Biología molecular (sangre periférica, muestra bucal)
• PCR - SSP
Tipificación de los antígenos HLA por Serología
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Distribución tisular de las moléculas de histocompatibilidad
Clase I en casi todas las células, menos en los
glóbulos rojos y las neuronas.
Clase II linfocitos B, monocitos, células dendríticas,
precursores de eritroides, células de Langerhans,
epitelio tímico, células de Kupffer y linfocitos T
activados.
Linfocitotoxicidad
Técnicas para fenotipaje del MHC
Tipificación
•Linfocitos T Clase I
•Linfocitos B Clase II
Sueros
•Sueros de mujeres multíparas
•Anticuerpos monoclonales
Granulocitos y Monocitos Falsos positivos
Linfocitotoxicidad
Técnicas para fenotipaje del MHC
Tipos de muestra:
•Sangre periférica
•Ganglio linfático
•Bazo
Propiedades Extrínsecas:
•Expresión de marcadores en la superficie celular
•Capacidad fagocítica
Propiedades intrínsecas:
• Tamaño
• Densidad
• Viscosidad
• Adhesividad
• Granularidad
Linfocitotoxicidad
Técnicas para fenotipaje del MHC
Linfocitos B
Columna de nylon >Adherencia a 20°C
< Adherencia a 4°C
Linfocitos T
Ficoll- Hypaque Polímero de sacarosa de alto peso molecular +
compuesto orgánico iodinatado. (densidad = 1,077 g/ml)
Plaqueta < Linfocitos = Monocitos < Granulocitos < Eritrocitos
Limpho-Kwik lisis diferencial utilizando anticuerpos monoclonales y complemento
•Limpho-Kwik®MN - Limpho-Kwik ®T/B - Limpho-Kwik ®T - Limpho-Kwik ®B - Limpho-Kwik ®TH
Perlas Magnéticas partículas recubiertas con anticuerpos monoclonales. (1 micra de diámetro)
•Linfocitos T Anti CD2 – receptor de rosetas E. (“Revelador”)
•Linfocitos B Anti CD19. (PBS/citrato)
Técnicas para fenotipaje del MHC
Tipificación de los antígenos HLA por Serología
Montgomery, R.A. y col. Nature Reviews Nephrology. 14:9, 558-570. 2018
Técnicas para fenotipaje del MHC
Tipificación de los antígenos HLA por Serología
Montgomery, R.A. y col. Nature Reviews Nephrology. 14:9, 558-570. 2018
Técnicas para fenotipaje del MHC
Tipificación de los antígenos HLA por Serología
Montgomery, R.A. y col. Nature Reviews Nephrology. 14:9, 558-570. 2018
Linfocitotoxicidad
Técnicas para fenotipaje del MHC
Principios
•Los anticuerpos anti-HLA son muy específicos para las determinaciones estructurales que
caracterizan a los diferentes antígenos del sistema HLA
•Complejo antígeno-anticuerpo - Activación de complemento por la vía clásica
•Colorante vital o fluorocromo. Daño de la membrana
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
A1, A2, B8, B44, DR17, DR4
A1, A29, B8, B44, DR17, DR7
A3, A2, B7, B44, DR15, DR4
A3, A29, B7, B44, DR7, DR15
P1
P2
P3
P4
A1
B8
DR17
a
A2
B44
DR4
b
A3
B7
DR15
c
A29
B44
DR7
d
A1
B8
DR17
a
A3
B7
DR15
c
A2
B44
DR4
b
A29
B44
DR7
d
Características del MHC
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
A1, A2, B8, B44, DR17, DR4
A1, A29, B8, B44, DR17, DR7
A3, A2, B7, B44, DR15, DR4
A3, A29, B7, B44, DR7, DR15
P1
P2
P3
P4
A1
B8
DR17
a
A3
B7
DR15
c
A2
B44
DR4
b
A29
B44
DR7
d
A2, A24, B44, B46, DR4, DR11
A1, A2, B7, B44, DR4, DR15
P5
P6
A1
B8
DR17
a
A2
B44
DR4
b
A3
B7
DR15
c
A29
B44
DR7
d
Cultivos Mixtos
Técnicas para fenotipaje del MHC
• Cultivo de Mezcla de Linfocitos (CML) Ensayo in
vitro de reconocimiento y proliferación de linfocitos
• Se cultivan linfocitos de dos individuos
• Hay diferencias en el MHC: las células crecen,
sintetizan DNA y proliferan
• NO hay diferencias en el MHC: las células
permanecen en reposo
• Respuesta conformada por las
diferencias de antígenos Clase I y II
• Medida funcional de la inmunidad
celular
Cultivos Mixtos
Técnicas para fenotipaje del MHC
•Células respondedoras Linfocitos T. No tratadas
•Células estimuladoras Monocitos y linfocitos B. Tratadas con un inhibidor de la síntesis de ADN
(Mitomicina C o Radiación)
CFSE
Cultivos Mixtos
Técnicas para fenotipaje del MHC
•Manifestaciones. Las células se dividen y proliferan
•Actividad metabólica Incremento de proteínas y de síntesis de ARN y ADN
•Morfología Transformación de los linfocitos en blastoides “Incorporación de un precursor radioactivo
al ADN (3H)”
Biología Molecular
• Extracción de ADN.
• Determinación de la concentración de ADN.
• Reacción en Cadena de Polimerasa PCR.
• Electroforesis.
Técnicas para fenotipaje del MHC
Biología Molecular
Ventajas y desventajas
Técnicas para fenotipaje del MHC
Método Serología ADN: SSP/SSOP
Número de tipos
identificados.
A:21, B:43, Cw:10
DR:10, DQ:18
A:151, B:301, Cw:83 DR:282,
DQ:43
Muestras. 2 a 3 millones de
linfocitos vivos.
Pequeña cantidad de ADN.
(15-30 µg/ml)
Nivel de Resolución. Baja resolución. Baja y alta resolución.
Tiempo. 3 horas. 4 – 5 horas.
Otros factores. Viabilidad.
Expresión del HLA.
Calidad y cantidad de ADN.
Condiciones de trabajo.
Otras aplicaciones
Medicina forense
• Identificar a una persona. Base de datos de convictos. Virginia (USA) 2003.
• Excluir a sospechosos.1986. Declaran inocente a un sospechoso de homicidio.
• Asociar a víctimas y sospechosos con la escena del crimen.
• http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/clickmap.htm
Diagnóstico e identificación de enfermedades
• Rastreo de Carcinoma. Errores de replicación. Jochen Raedle y otros. 1999.
• Fibrosis Quística. Microsatélites en intrones del gen regulador de la conductancia
transmembrana de la fibrosis quística. Alicia A. Visich y otros. 2001.
Estudios poblacionales
Monitoreo post-trasplante
Estudio de paternidad
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Otras aplicaciones
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Otras aplicaciones
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Hispanos
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Hispanos
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Hispanos
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Hispanos vs Asiático/Islas del Pacífico
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD)
Trasplante
"Esperemos que aquellos que durante años han introducido todo tipo de criterios
políticos, ultra-nacionales y religiosos en el trabajo científico se den cuenta de lo
perjudicial que es su actitud para una ciudad universitaria" (Speiser, 1961).
Enfermedad de injerto contra huésped
Trasplante
Enfermedad de injerto contra huésped
Trasplante
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Características del MHC
A1
B8
DR3
A1, A2, B8, B44, DR17, DR4
A1, A29, B8, B44, DR17, DR7
A3, A2, B7, B44, DR15, DR4
A3, A29, B7, B44, DR7, DR15
Antígenos menores de histocompatibilidad
Características antígenos menores de histocompatibilidad
Antígenos menores de histocompatibilidad
Características antígenos menores de histocompatibilidad
• Peter Goren 1930s y George Snell 1948 → Bases de histocompatibilidad en ratones
MHCa
MHCa
MHCa
MHCb MHCa/b MHCa/b MHCa
No
rechazo Rechazo Rechazo No
rechazo
No
rechazo Rechazo
MHCa
MHCb MHCa MHCb MHCa/b
Premio Nobel 1980: George Snell, Baruj Benacerraf y Jean Dausset
Complejo Mayor de Histocompatibilidad
El rechazo – Papel de las células T
Top Related