�Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las
Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I)
Dr. Juan Carlos Rodríguez
S. Microbiología
Hospital General Universitario de Elche
E-mail: [email protected]
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/
Diagnóstico microbiológico�Pretende detectar e identificar el o los microorganismos responsables del proceso infeccioso y eso es esencial para:• Correcto tratamiento del paciente• Control de la difusión del patógeno
Diagnóstico microbiológico�Métodos directos:
• Detectan al microorganismo de la muestra clínica obtenida del lugar de la infección:
• Examen microscópico• Cultivo• Detección de antígenos• Detección de ácidos nucléicos
�Métodos indirectos: • Permiten detectar la presencia de anticuerpos frente al microorganismo en el suero del paciente
� No se aplican simultanéamente sino en función del microorganismo
Toma de muestras
� La toma de muestras se detallará en un seminario monográfico
� Puedes acceder al manual de toma de muestras en el enlace:
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/docencia/practicas-diagnostico-microbiologico-enfermedades-infecciosas-dmi/manual-muestras-microbiologia/
Diagnóstico de bacterias: Examen microscópico� La muestra clínica se deposita en un portaobjetos
� Puede visualizarse:• Sin teñir (en fresco)• Tras un proceso de tinción
• Gram: Divide a las bacterias en:• Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus)• Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli)
• Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en• Acido-alcohol resistentes: Color rosa (Mycobacterium
tuberculosis)
Examen microscópico en fresco
Trichomonas vaginalis Candida albicans
Examen microscópico: tinciones
Ziehl Neelsen positivo
Gram positivo
Gram negativo
Diagnóstico de bacterias: cultivo� Siembra de la muestra en unos medios de cultivo
con los nutrientes necesarios para que se produzca la proliferación bacteriana.
� Sus principales utilidades son:• Más sensibilidad que la tinción• Permite identificar a los microorganismos• Permite estudiar su sensibilidad antibiótica• Permite estudiar la epidemiología de la infección y el control de posibles brotes
Características del cultivo� Se utilizan diferentes tipos de medios:
�Medios básicos: Agar Mueller Hinton�Medios enriquecidos:• AgarSangre: Streptococcus pneumoniae• AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus• BCYEα (L-cisteina): Legionella
• Medios selectivos: • Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
• Mac Conkey: Bacterias Gram negativas
• TCBS: Vibrio cholerae
• Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar• Medios de enriquecimiento: • Caldo selenito
Tipos de medios de cultivo
Agar sangre
Hemocultivos Agar chocolate
TCBS
Procesamiento de los cultivos� Temperatura de incubación:
• Habitualmente se incuba a 35-37ºC• Campylobacter en heces: 42ºC
� Tiempo de incubación� El tiempo habitual es 24-48 h� Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella
� Atmósferas de incubación� Bacterias aerobias o anaerobias facultativas: Escherichia coli,
Staphylococcus aureus.� Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides� Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter� Necesitan 5-10% CO2: Neisseria gonorroheae
Incubación de los medios
Incubador de hemocultivos
Atmósfera de incubación
Identificación bacteriana
� Definición: • Se basa en el estudio de la actividad bioquímica, sensibilidad a determinadas sustancias y crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno
�Métodos: • Pruebas bioquímicas clásicas• Pruebas en microplaca
Identificación bacteriana
Detección de antígenos
� Definición: • Permite demostrar la presencia de un microorganismo en una muestra clínica a través de la detección de sus antígenos específicos
� Patógenos en los que se utiliza: • Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
� Definición: • Estos dos genes están presentes en todas las bacterias (16S rRNA) y hongos (ITS) pero su secuencia es diferente en función de la especie
� Procedimiento: • Secuenciación de estos genes y comparación con bases de datos internacionales (Gen Bank u otros)
• Útil para identificar microorganismos con identificación clásica compleja
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
Espectrometría de masas (malditof)Definición:
• Estudia el perfil proteico del microorganismo (proteoma) mediante la comparación del perfil con una base de datos de los microrganismos más frecuentemente aislados
• Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y son aceleradas por un campo electromagnético.
• Las proteinas se separan en función del tamaño y la carga
� Utilidad: • Identificación rápida de los microorganismos más habituales
Espectrometría de masas (malditof)
Diagnóstico de la infección urinaria
�Muestras:
• Muestra: Frasco estéril con orina recién recogida o mantenida a 4ºC
• Adultos: Segunda parte de la micción tras limpieza de los genitales externos
• Pacientes sondados: Pinchar la sonda con jeringa en el lugar establecido para ello
• Niños pequeños: Bolsa colectora que debe retirarse cada 30 minutos
Diagnóstico de la infección urinaria
�Métodos diagnósticos:
• Sedimento urinario
• Sistemas de cribado rápido: • Tiras reactivas• Citometría de flujo
• Cultivo cuantitativo de las muestras
Diagnóstico de la infección urinaria
�Métodos diagnósticos:
• Cultivo: • La orina se siembra de forma cuantitativa en agar CLED (número de microorganismos/mililitro de orina)
• Agar sangre: Medio enriquecido para el aislamiento de los patógenos más frecuentes
• Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio diferencial que ayuda a la identificación preliminar
Diagnóstico de la infección urinaria
� Interpretación del recuento en el cultivo: • Debe hacerse en función de:
• Forma de recogida de la muestra• Clínica del paciente• Presencia de piuria• Microorganismo aislado
• En muestras tras punción suprapúbica o directamente del riñón: Cualquier recuento es significativo
• Sondaje vesical: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria con piuria: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria asintomática: 105 bacterias/mililitro
Diagnóstico de la infección urinaria
Medios de cultivo
Diagnóstico de la infección urinaria
Sedimento urinario
Tiras reactivas
Citometría de flujo
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
• Definición: Infección del parénquima pulmonar• Tienen etiología muy variada en función de la edad, del estado inmunológicos y de otros factores
• En personas previamente sanas es frecuente:• Streptococcus pneumoniae• Micoplasma pneumoniae
• En personas con factores predisponentes• Pseudomonas aeruginosa• Staphylococcus aureus• Enterobacterias
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
� Cultivo: • Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con
presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL, cepillado bronquial)
• Cultivo en:• Agar sangre. Aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis
• Agar Mac Conkey: Enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter
• Agar chocolate:Haemophilus influenzae• Medio BCYEα: Legionella pneumophila.• BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en
Agar chocolate
Diagnóstico de la neumonía� Detección de antígenos:
�Muestra a procesar:
�Muestras respiratorias:
�Virus respiratorio sincitial
�Gripe A, gripe B
�Pneumocystis carinii
�Aspergillus
�Orina:
�Streptococcus pneumoniae
�Legionella pneumophila
Diagnóstico de la neumonía� Detección de anticuerpos:
� Muestra a procesar:�Suero del paciente
� Estudios a realizar:�Detección de IgM�Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad de anticuerpos (al menos 4 veces) al estudiar dos sueros del enfermo separados 3-4 semanas�De positivo bajo a positivo alto: Ej: De 1/16 a 1/512
�De negativo a positivo alto� Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella
pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae
Diagnóstico de la neumonía� Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
� Muestra a procesar:�Muestras respiratorias
� Estudios a realizar:�Detección del genoma del microorganismo en la muestra
� Microorganismos: �Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos patógenos
�Mycobacterium tuberculosis�Gripe�Citomegalovirus
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Procesos más frecuentes:�Meningitis/encefalitis�Abscesos cerebrales
� La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser muy variada:�Bacterias: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae
�Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus�Hongos: Cryptococcus neoformans�Parásitos: Amebas de vida libre
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Diagnóstico de las infecciones bacterianas:• Tinción de Gram del LCR:
• Método rápido y orientativo de la etiología• Cultivo del LCR:
• Confirmación de la tinción y estudio de la sensibilidad antibiótica
• Agar sangre, chocolate y Thayer Martin (incubación en CO2)
• Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus pneumoniae
• Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis
• HEMOCULTIVO
Diagnóstico de la meningitis bacteriana
Listeria monocytogenes
Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis)• Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum (chancro):IFD ,tinción con plata ,Campo oscuro
• Diagnóstico serológico:• Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL• Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación) , FTA (inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM
• Criterios:• Todos los resultados positivos de pruebas no treponémicas deben ser confirmados por pruebas treponémicas
• En caso de sospecha de sífilis primaria o terciaria, hay que hacer siempre una prueba treponémica
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)• Cultivo en agar Thayer Martin • Tinción de Gram: en el hombre la presencia de diplococos gramnegativos es diagnostica (95%)
• Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en atmósfera con CO2
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
• Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no gonocócica)
• Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se hace habitualmente
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
Diagnóstico de las enteritis bacterianas
� Salmonella� Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito� Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples
serotipos� Campylobacter
� Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en atmósfera microaerófila
� Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS)� Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN)� Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma
de los serotipos patógenos por PCR� Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)
Diagnóstico de bacteriemia• Presencia de bacterias en sangre de forma persistente
• Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de hemocultivos (aerobias y anaerobias)
• Es muy importante descontaminar la piel ante de las extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los frascos con flora bacteriana de la piel
• Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos que detectan crecimiento microbiano.
• En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.
Diagnóstico de bacteriemia
Top Related