Problemas de calidad en inmunohistoquímica
en patología mamaria
Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz
Curso largo de diagnóstico de cáncer de mama
XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Española de Anatomía Patológica Madrid, 7 de febrero de 2014
Quimioterapia + anti-HER2
Hormonoterapia Quimioterapia +/- anti-angiogénesis
Quimioterapia +/- anti-angiogénesis
HER2+
RH+
RH- y HER2 -
“The public inquiry is charged with investigating events that led to a breakdown of estrogen receptor (ER) testing at a laboratory run by Eastern Health, the provincial
health care delivery system in Newfoundland and Labrador. Through the inquiry, the public learned that between 1997 and 2005 nearly 400 of about 1,000 breast cancer patients received incorrect test results of the ER status of their breast
tumors. “
HER
2 IH
Q
Programa de Garantía de Calidad de la SEAP Resultados de HER2 por inmunohistoquímica
Porc
enta
je d
e ce
ntr
os
27,3 26
16,1
11,1
31,1
22,8
16,4
25
30
24,7
20 20 18,2 16,518,5 17,2
22,2
15,613,7
38
32,1
19
43,1
37,2
56,7
42,2
32,929,9
34,130
20,5
36,8
29,332,2
35,2
44,3
59
36
51,8
69,9
25,8
40
26,9
32,837,1
45,4 45,950
61,3
46,7
52,2 50,6
42,640,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
No participantes
44 56 56 64 60 73 68 77 71 79 86 92 94 95 96 94 92 98
Ronda
20/20 12/20 6/20 4/20
40
12 1215
6
1510
13 1520 22
36
59
6966
76 74
68
57
65,5
59,557
2429
19 19 18
11
22
30
19,5 20,5 21
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
<12
12-16
≥17
Inadecuado (puntuación <12)
Aceptable (puntuación 12-16)
Óptimo (puntuación >16)
Barlett, JM et al. Am J Clin Pathol 2009
NordiQC and UK-NEQAS HER2 IHC control results
45
57
94
75
84 79
91
74
57
80
65 70
74
66 68 74
80 82 77
68 68 65
75 70
88
68 72 72
65
85
0
20
40
60
80
100
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
ER
PR
HER2
Sufficient results
% d
e c
entr
os
~ 20% of HER2 testing may be
inaccurate
Significant rates of discordance between local and central testing in NSABP B-31 and NCCTG 9831 trials
Study
No. of cases
retested
Method of
retesting Concordant cases, n (%)
Discordant cases, n (%)
Net change in cases, n
(%)
NSABP B-31 1040 IHC 838 (81) 202 (19)
74 (7.1) FISH 819 (79) 221 (21)
BCIRG-005 BCIRG-006
1190 IHC, FISH 877 (74) 313(26) 161 (13.5)
NCCTG 9831
1063 IHC, FISH 867 (81.6) 196 (18.4) 120 (11.2)
Perez, EA, et al. Breast Cancer Res Treat 2013 Perez, EA, et al. J Clin Oncol 2006 Paik S, et al. J Natl Cancer Inst. 2002 Roche PC, et al. J Natl Cancer Inst. 2002
~10% of HER2 classification
may be inaccurate
Consecuencias de un falso negativo (no usar trastuzumab)
1. Negación de una terapia que reduce el riesgo de recaída a la mitad
2. Negación de una terapia potencialmente curativa (y todo lo que conlleva una recaída y eventual fallecimiento)
3. Negación de una terapia que aumenta probabilidad de cirugía conservadora
4. Negación de una terapia que prolonga supervivencia en cáncer de mama metastásico
Simulación de los errores en HER2 en la clasificación de las pacientes con cáncer de mama
Consecuencias de un falso positivo (uso de trastuzumab)
1. Efectos secundarios 2. Cardiotoxicidad 3. Consumo de recursos hospitalarios 4. Consumo de recursos humanos
(paciente, trabajo) 5. Efectos psicológicos sobre la paciente y
familia 6. Coste económico directo 7. Manejo terapéutico en caso de recaída
Error 10%: repartido en FN y FP
100 pacientes 10 mal clasificadas; de éstas:
- 8 FN: pacientes HER2+ que no reciben trastuzumab
- 2 FP: pacientes HER2- que reciben trastuzumab
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad de la muestra
• Goldstein NS, et al.: Recommendations for improved standardization of immunohistochemistry. Appl
Immunohistochem Mol Morphol 2007. “Tissue should be fixed in 10% neutral-buffered formalin.”
• Engel KB and Moore HM: Effects of preanalytical variables on the detection of proteins by IHC in FFPE tissue. Arch
Pathol Lab Med 2011. “… 15 preanalytical variables were capable of impacting IHC (including fixation delay; fixative type; time in fixation; reagents and conditions of dehydration, clearing, and paraffin impregnation; slide drying and conditions of storage.”
• Khoury T, et al.: Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers. Mod Pathol 2009. “We recommend not to delay formalin fixation for more than 1 hour and do not store specimens overnight at 4ºC.”
• Arber D: Effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical reactivity of breast markers. Appl
Immunohistochem Mol Morphol 2002. “The IHC reactivity of some breast prognostic markers is reduced, but only after extensive fixation that may not be clinically relevant.”
• Ibarra JA, Rogers LW: Fixation time does not affect expression of HER2/neu. Am J Clin Pathol 2010. “Fixation times between 3 and 120 hours in 10% buffered formalin do not appear to have an impact on the expression of HER2/neu by IHC analysis.”
• Xie R, et al.: Factors influencing the degradation of archival FFPE tissue sections. J Histochem Cytochem 2011. “… the presence of water, both endogenously and exogenously, plays a central role in antigenicity loss.”
Sources of variability in molecular testing
Khoury, T et al. Mod Pathol 2009 Yildiz-Aktas, IZ et al. Mod Pathol 2012
El retraso en la fijación (isquemia fría) modifica la expresión de biomarcadores en cáncer de mama
Lab A Lab B Lab C Lab D Lab E
Preservation of DNA in FFPE archieval tissue samples
Rojo, F. SPMM 2011
• Buffered 4% Formaldehyde / 10% Formalin – minimal prefixation time lag, 2 hours – duration of fixation (3 to 6 hours) – absolutely avoid low pH • No Bouin, No Acid Formaline, No B5, No AZF, No decalcified samples (bone biopsies)
DNA sequence alterations due to formalin fixation in archival specimens
Williams, C et al. Am J Pathol 1999
FFPE tissues exhibit a high frequency of nonreproducible sequence alteration because of formalin cross-linking cytosine nucleotides on DNA strands. Taq-DNA polymerase fails to recognize the cytosine and incorporates an adenine in the place of a guanosine, creating an artificial C-T or G-A mutation.
Calidad en inmunohistoquímica: Estandarización pre-analítica
• Reducir o minimizar el tiempo de isquemia fría: menos de 1h • No deshidratar las muestras • Fijar en solución tamponada de formol al 10%, en volumen suficiente • Preparar las muestras para garantizar una buena fijación, en especial las piezas quirúrgicas • Fijación 6-72 horas • Secciones de tejido 2-3mm • Procesadores automáticos con presión, sin aceleración por calor • Documentar los tiempos de isquemia fría, fijación y procesamiento
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad de la técnica
Desenmascaramiento antigénico: temperatura,
enzima, pH, tiempo, presión
Sensibilidad anticuerpo
Especificidad anticuerpo
Sistema de detección
Tiempo de incubación
Temperatura y humedad
Sistema de revelado
Automatización
Competencia personal técnico
Concentración anticuerpo
Calidad de la técnica inmunohistoquímica
¡Más de 8000 condiciones experimentales diferentes!
Modificaciones del desenmascaramiento antigénico
Artefactos técnicos
Calidad de la técnica inmunohistoquímica
Anticuerpo
Precisión = reproducibilidad + repetibilidad Sensibilidad Especificidad
• Reproducibilidad: diferentes laboratorios diferentes instrumentos diferentes reactivos (anticuerpos) diferentes técnicos de laboratorio
• Repetibilidad: mismo laboratorio mismos instrumento mismo reactivo (anticuerpo) mismo técnico de laboratorio
• Sensibilidad diagnóstica Capacidad de determinar un VP vs FN: requiere comparación
• Sensibilidad inmunohistoquímica Capacidad de reconocer la diana por el ensayo
• Especificidad diagnóstica Capacidad de determinar un VN vs FP: requiere comparación
• Especificidad inmunohistoquímica Capacidad del anticuerpo a unirse exclusivamente a su diana, en ausencia de tinción de otras proteínas o tejidos
Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas mujeres, en distintas localizaciones y variabilidad intratumoral
Chung, GC et al. Lab Invest 2007
ER h
eter
oge
nei
ty in
bre
ast
can
cer
ER DAPI
Heterogeneidad en cáncer de mama: variabilidad intratumoral
Falck, AK et al. BMC Cancer 2013 Martinez de Dueñas, E et al. Breast Cancer Res Treat 2013
Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas localizaciones
Tumor primario
Falk, AK. 2013 Metástasis ganglionar
Luminal A (%)
Luminal B (%)
HER2 (%) TN (%)
Luminal A 85 0 9 0
Luminal B 11 100 91 0
HER2 0 0 0 8
TN 4 0 0 92
Martinez de Dueñas, E.
2013 (ConvertHER)
Metástasis visceral
(lab. central)
Luminal 74 (90) 21 (0) 22 (18)
HER2 16 (3) 76 (100) 7 (6)
TN 10 (7) 3 (0) 71 (76)
Niikura, N. et al. J Clin Oncol 2012
Heterogeneidad en cáncer de mama: distinta enfermedad en distintas localizaciones
Precisión = reproducibilidad + repetibilidad Sensibilidad, Especificidad
• Determinación de ER, PR, HER2 (y Ki67) en todas las pacientes con cáncer de mama • Uso de la muestra más reciente en la historia de la enfermedad • Evitar las muestras artefactadas, con dudas en su fase pre-analítica, uso de secciones recientes • Estandarización de los procesos • Detectar fallos técnicos y descartar el ensayo • Mantenimiento de los equipos • Uso de controles positivos (y negativos) • Utilización de kits con aprobación FDA/EMEA (o anticuerpos recomendados por sociedades científicas) • Formación del personal técnico • Programas de control de calidad externo (semestrales) e interno • Validación del procedimiento (comparación con otro método y/o laboratorio de 25-100 muestras) sobre un 90% de concordancia de resultados • Acreditación/certificación de los laboratorios
Varga, Z et al. BMC Cancer 2013
Quality control study: overall positivy rate and accuracy in a single institution
101 hospitales
registrados
Centros Registrados: 101
Nº Casos incluidos: 8.455
Nº Casos HER2-positivos: 1.354
Tasa HER2+: 16,01%
(Operativa desde lanzamiento 20 de Mayo 2013)
Resultados a
31 de Diciembre de 2013
5135
3079
322
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Desconocido No metastásico Metastasicos
60%
36% 4%
Casos con información sobre el estadiaje
HER2+ 15,4%
HER2+ 20,2%
Resultados %HER2+ según estadiaje CM en nuestro entorno sobre casos reales
Información incluida en un 40% de los casos (3.401 casos)
29
163
130
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Desconocido Nuevo diagnóstico Recurrencia/recaida deun estadio nometastásico
13%
47%
40%
HER2+ 17,8%
HER2+ 22,3%
Casos metastásicos
Nú
mer
o d
e ca
sos
95 centros
Baja positividad HER2+( <13%) : 17 centros. Media: 63 centros. Alta positividad HER2+ (>21%) 15 centros
HER2 + media nacional: 16,01% Intervalo HER2 : 7,21% - 29%
Calidad en inmunohistoquímica: Estandarización analítica
Laboratorio A Laboratorio B Laboratorio C Laboratorio D
HER
2 3
+
HER
2 1
+
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad en inmunohistoquímica
Calidad de la muestra
Calidad de la técnica
Calidad de la interpretación
Calidad de la interpretación
Criterios: Factor pronóstico en tumores ER+ En tumores homogéneos, evaluar 3 campos x400 500-1000 células Evaluar el bode infiltrativo del tumor Discrimina bien alta y baja proliferación Incluir los ‘hot-spots’
Problemas: No recomendado como biomarcador por ASCO Tumores heterogéneos Diferentes métodos de evaluación Baja concordancia interobservador (kappa 0.64 > 0.91) Diferentes anticuerpos No existe estándar: proliferación alta entre 10-25%
Dowsett, M et al. JNCI 2011 Polley, M et al. JNCI 2013 De Nielsen, TO et al. SABCS 2013
Calidad en inmunohistoquímica: interpretación de Ki67 en cáncer de mama
Ki67+
Ki67-
Dowsett, M et al. JNCI 2011 Polley, M et al. JNCI 2013 De Nielsen, TO et al. SABCS 2013
Calidad en inmunohistoquímica: interpretación de Ki67 en cáncer de mama
Ki67+
Ki67-
Criterios: Factor pronóstico en tumores ER+ En tumores homogéneos, evaluar 3 campos x400 500-1000 células Evaluar el bode infiltrativo del tumor Discrimina bien alta y baja proliferación Incluir los ‘hot-spots’
Problemas: No recomendado como biomarcador por ASCO Tumores heterogéneos Diferentes métodos de evaluación Baja concordancia interobservador (kappa 0.64 > 0.91) Diferentes anticuerpos No existe estándar: proliferación alta entre 10-25%
Interpretación de los resultados de Herceptest y Pathway (FDA)
HER2 3+ HER2 2+, equivocal HER2 1+ HER2 0
Original FDA Pack Insert
Intense membrane
>10%
Weak/intermediate
complete membrane
>10%
Weak complete
membrane >10%
Weak incomplete membrane
>10%
Any intensity
<10%
ASCO/CAP Guidelines 2007
Uniform intense
complete membrane
>30%
Intense 10-30% or weak/intermediate
complete membrane >10%
Weak incomplete membrane
>10%
Any intensity
<10%
ASCO/CAP Guidelines 2013
Uniform intense
complete membrane
>10%
Intense <10% or weak/intermediate membrane >10%
Faint membrane
>10%
Any intensity
<10%
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