Pneumocistosi
Prof. Guglielmo Gargani
Dr. Gabriella PiniDipartimento di Sanità Pubblica
sez. Microbiologia
Università degli Studi di Firenze
Corso di Perfezionamento
NUOVI SVILUPPI NELLA DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA E VIROLOGICA (II edizione)
3° modulo: Micologia e Parassitologia
5-6 Novembre 2004
Pneumocystis carinii : La storia
1909 Chagas In polmoni umani e di cavia un tripanosoma
1910 Carini In polmoni ratti
1912 Delanoe e Delanoe
Non è un tripanosoma Pneumocystis carinii
1951 Vanek, Jirovec, Lukes
Polmonite a plasmacellule
Attuale posizione tassonomica
• Phylum Ascomycota
• Classe Archiascomycetes
• Ordine Pneumocystidales
• Famiglia Pneumocystudiaceae
• Genere Pneumocystis
• Specie Pn carinii (ratto) Pn jiroveci (uomo)
Ciclo vitale
• Trofozoita ameboide negli alveoli con filopodi
• Moltiplicazione per scissione binaria• Cellule aploidi che evolvono in
sporoblasti• Sporoblasti o cisti producono all’interno
8 sporozoiti • Sporozoiti si liberano e ricomincia il ciclo
Ciclo Vitale
Mayor Surface Glicoprotein(MSG)
• P.m. 95-160 kDa
Nucleo centraleproteico
Catene laterali carboidrati azotati
glucosio mannosio
n-acetil glicosamina
Determinanti Antigeni Special form
Adesione agli pneumociti
“Special form”
• carinii• rattus• muris • equi• harictologi• mustelae• suis• homini o Pn.jiroveci
• ratto• ratto• topo• cavallo• coniglio• furetto• maiale• uomo
Classi di eterogeneità
Fra special form da specie animali diverse
Fra special form della stessa specie animale
Fra ceppi della stessa specie animale
Pneumocystis organisms :
Pneumocistosi
• A partire dal 1920 compare in bambini istituzionalizzati in Europa occidentale.
• Dopo la II guerra mondiale è nei bambini denutriti in Europa orientale e M.O.
• Dopo gli anni ‘50 in immunodepressi
• Dopo il 1985 è causa frequente di morte in HIV positivi
Human Pneumocysti
s Infection
Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38
Forme clinico-epidemiologiche
• Infezione asintomatica o non diagnosticata• Forma epidemica :dispnea progressiva,
cianosi, perdita di peso diarrea. Febbre e tosse possono mancare
• Forma sporadica in immunodepressi: prevalentemente polmonare
altre localizzazioni possibili
Potential implication of Pneumocystis in SIDS
• PneumocystisPneumocystis cysts were detected in lungs from : cysts were detected in lungs from :
– 31% of 134 cases of Sudden Infant Death Syndrome (SIDS) in Chile
– 15% of 27 SIDS patients in Oxford (UK)
– 3% of 342 infants deceased from other
causes Vargas et al, Clin Infect Dis
1999
Polmonite da P. jiroveci Sintomatologia
Dispnea, tosse non produttiva Cianosi, febbre Reperti radiologici infiltrati polmonari
Evololuzione più rapida in HIV positivi
Immagini radiologiche
Infiltrati interstizio-alveoloari prevalentemte nei lobi inferiori
Possibile reperto negativo fino a poche ore prima dell’exitus
Polmonite da P. jiroveci
Polmonite da P. jiroveci
• Polmonite interstiziale plasmacellulare
• Ispessimento spazi interalveolari
• Alveoli ripieni di sostanza amorfa con ammassi di parassiti
Polmone in pneumocistosi
Le frecce indicano zone confluenti grigio pallido
Cisti negli spazi alveolari
Pneumocistosi
Pneumocystis carinii
Corpi intracistici
P.jiroveci: cisti al microscopio elettronico a trasmissione. Sono visibili corpi intracistici e una spessa parete
Altri fattori di rischio
• Tutte le emopatie
• Tumori solidi
• Adenocarcinoma mammario
• Tumori cerebrali• Immunosoppressione per trapianti
Tipologia di campioni clinici
Materiale
Biopsia aperta del polmone
Biopsia transbronchiale
Lavaggio broncoalveolare (BAL)
Sputo indotto (IS)
Risciacquo orale (OW)
Brushing orale
Sensibilità tecniche di colorazione
>95%
>90%
50-95%
50-85%
Bassa
Bassa
PneumocistosiDiagnostica di Laboratorio
Nebulized saline inhaled by patient to promote deep cough Inexpensive; noninvasive Specimen processing more complex, may delay diagnosis of another pathogen Less sensitive
More expensive, more invasive, risk of periprocedural sedation, requires skilled personnel Larger samples can be sent for staining and can be used to diagnose other infections (bacterial, fungal, viral and mycobacterial cultures) Saline instilled through bronchoscope wedged in airway and fluid withdrawn To 95 percent sensitive
Induced sputum Bronchoalveolar lavage
Esame diretto
Colorazione metenamina-nitrato di argento Gomori- Groccot Colora l’involucro della cisti in nero su fondo verde
Blu di toluidina Colora selettivamente l’involucro della cisti
Colorazione di Giemsa o sua variante rapida Colora sia cisti che trofozoiti nucleo porpora, citoplasma blu (non colora la parete cistica)
P.carinii: Con alto ingrandimento sono visibili le cisti di 5-8μm di diametro. L’involucro delle cisti è colorato in nero, i corpi intracistici non sono visibili. Biopsia aperta del polmone.
Impregnazione argentica secondo Gomori (GMS)
P.carinii: sedimento di BAL colorato con metenamina-argento (GMS) che colora l’involucro cistico. Sono visibili cisti rotonde, ovali o piatte di circa 4-5 µm di diametro
Tutti i fungi hanno la stessa affinità per metenamina-argento e possono essere confusi con le cisti di P.carinii. Cryptococcus neoformans in un campione di BAL (GMS).
Colorazione con blu di toluidina
Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa. I trofozoiti sono piccoli (1-5 µm) e solo i loro nuclei, colorati in porpora , sono visibili (frecce).
P.carinii: Sono visibili cisti (approx. 5-8 µm di diametro) con corpi intracistici, le cisti mature ne contengono 8. Alcune cisti appaiono vuote. Colorazione di Giemsa.
Fungi-Fluor non colora specificamente P. carinii (Colora chitina e cellulosa). Le cisti appaiono in clusters circondati da essudato
schiumoso, il background di fondo interferisce con la chiarezza dell’immagine
Campione di BAL,
colorazione Fungi-Fluor Kit
Polysciences Europe,
Germany (400X)
cisti che mostrano le strutture caratteristiche a doppia parentesi o virgola
Esame diretto
Immunoflurescenza con anticorpi monoclonali (contro ag di superficie,
forma cistica e trofozoite) aumento sensibilità
Kit commerciali MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories
MeriFluor pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe
Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA Chemicon USA
Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonaliMeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe
Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA, Chemicon USA Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali
Immunofluorescenza indiretta con ac monoclonali
MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories
are less expensive
require less technical expertise and quipment
may allow the identification of other pathogens on the specimen
clearly differentiate the P. carinii organismmay be more sensitive, particularly in specimens with low numbers of organisms false positives are a problem associated with using the monoclonal antibody stains.
TRADITIONAL STAINS MONOCLONAL ANTIBODY STAINS
Esame colturale
Non utilizzabile per la diagnosi di pneumocistosi
ELISA con ac policlonali su Siero Sensibilità 210ng ag (McNabb, 1988) Immunoblotting con ac monoclonali (2G2) su BAL Aumento della sensibilità (Sethi, 1990)
Metodi non utilizzati a scopo diagnostico
Pneumocystis non si sviluppa in sistemi di coltura continua in vitro
Ricerca di anticorpi
Ricerca di antigeni
Metodi biomolecolari
Gene targets Single copy genes Dihydropteroate synthase (DHPS) Tymidylate synthase (TS) Internal trscribed spacer (ITS) 5S rRNA 18S rRNA Multicopy genes Mitochondrial large subunit rRNA (mt LSU rRNA) Mitochondrial small subunit rRNA (mt sSU rRNA) Major surface glycoprotein (MSG)
Scopo: aumentare la resa diagnostica dei campioni clinici meno invasivi (sputo indotto, lavaggio orale….)
1. Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM. Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of rat and human origin. Mol Biochem Parasitol 1990;43:69-76.
2. Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR methods for detection of Pneumocystis carinii. J Clin Microbiol 1995;33:2785-2788.
Lane S: Standard dei pesi molecolari Lane 1: PCR a singolo step con primer pAZ102-E/pAZ102-H, banda di amplificato di 346bp (Wakefield, 1990)
Lane 2: nested PCR con ITS primer 1724F/ITS2R per il primo step ITS1F/ITS2R1 per il secondo step, banda di amplificato di 550bp. (Lu, 1995)
Metodi biomolecolari Significatività della ricerca del DNA nel BAL mediante
PCR
PCP clinicamente
evidente
Assenza di segni clinici evidenti
HIV- HIV+
Valore altamente predittivo
Non predittivo (17% positivi con nested PCR senza sviluppo della malattia, Sing 2000)
Semplice colonizzazione o fase precoce di malattia? Consigliato un attento monitoraggio
Metodi biomolecolariSensibilità delle metodiche di ricerca del DNA con PCR su
altri campioni clinici
IS Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, >95% con mt LS rRNA primers)
OW Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, 56-78%. Fischer 2001, 91% con MSG
primers) Bassa se la colonizzazione polmonare è scarsa (Matos, 2001)
Siero Risultati contraddittori con sensibilità da 0 a 100%
Kit Commerciale per PCR
PNEUMO KIT (AB Analitica)
Kit completo per
Estrazione del DNA da BAL, altri campioni respiratori o tessuti fissati e inclusi in paraffina
Amplificazione (Gene target: rRNA 5S)
Elettroforesi su gel di agarosio: amplificato di 120pb
Controllo interno di amplificabilità (β-globina)
Controllo positivo
M-PCR Kit Maxim Biotech San Francisco USALane M: Standard dei pesi molecolari
Lane 1: Controllo negativo
Lane 2: controllo positivo
Lane 3: Clamydia pneumoniae
Lane 4: Mycoplasma pneumoniae
Lane 5: Pneumocystis carinii
Lane 6: Legionella pneumophyla
Multiplex-PCR
Quantitative Touch-Down Real Time PCR MSG primers
Campioni OW
cut-off a 50 copie DNA per tubo distingue fra infezione e colonizzazione (Larsen 2004) Campioni BAL
cut-off a 103 copie DNA per tubo distingue portatori da pazienti con PCP
(Flori 2004)
Sonde FRET
Metodi biomolecolari
Vantaggi
Aumento della sensibilità
Elevata specificità
Utile per i pazienti che non possono sopportare procedure invasive
Svantaggi
Stadio sperimentale
Mancanza di metodi standard riconosciuti a livello internazionale
Possibili risultati positivi di difficile interpretazione
Metodi di biologia molecolare scopi epidemiologici
Ritrovamento di DNA di P.carinii nelle stanze di pazienti infetti e nell’ambiente esterno ciclo vitale al di fuori dell’ospite?
Studi di tipizzazione genomica
Esiste un genotipo prevalente Diversa virulenza dei genotipi?
E’ possibile la coinfezione con diversi genotipi
Recidiva entro tre mesi Stesso genotipo
Recidiva dopo più di sei mesi Genotipo diverso
Epidemiologia delle infezioni da P. jiroveci
Distribuzione territorialmente differenziata degli stipiti
Stipiti isolati dai pazienti:
Non corrispondono al genotipo prevalente nella regione di nascita
Corrispondono al genotipo prevalente nella regione dove si è manifestata la malattia
Evaluating Pneumocystis airborne transmissibility between hosts with PcP, carriers and susceptible hosts
?
•Pneumocystis DNA was detected in healthcare contacts of PcP patients
Vargas et al, 2000, JCM 38 - 8; Miller et al, 2001, JCM 39
?
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