CHƯƠNG 1:
LỜI MỞ ĐẦU
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 1
1.1. Đặt vấn đề
Theo xu hướng toàn cầu hội nhập kinh tế, hàng hóa được tăng cường
lưu thông giữa các nơi trên thế giới. Sản phẩm không chỉ được sản xuất ở
một nơi mà có thể chế tạo, lắp đặt qua nhiều công đoạn tại nhiều quốc gia
khác nhau. Tự do hóa thương mại, hàng rào thuế quan bị xóa bỏ, thị
trường mở rộng trong và ngoài nước cộng thêm khoa học công nghệ ngày
càng phát triển giúp các doanh nghiệp tăng năng suất, giảm chi phí,
những điều này gây áp lực cạnh tranh lớn cho hầu hết các công ty. Trong
điều kiện đó, chất lượng sản phẩm trở thành một nhân tố quan trọng, giúp
thu hút khách hàng và là vấn đề được các doanh nghiệp quan tâm cải tiến
nhằm phát triển bền vững.
Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức
độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học,
thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp như: trồng lúa 3
vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy
theo năng suất và sản lượng. Chính vì vậy, với sự canh tác trên đã làm
cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng
hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất
độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều
dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước. Chính vì vậy, xu
hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng
chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu
hướng của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hiện các chế phẩm
đang được sử dụng nhiều tại các vùng trồng rau sạch như ở Đà Lạt, Vĩnh
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 2
Phúc, Thanh Trì, Hải Dương, Hà Tây, Đông Anh... của Việt Nam. Nhiều
thập kỉ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) đã phát huy được tác
dụng tích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên
nó cũng gây ra những tácdụng không mong muốn như ảnh hưởng xấu đến
môi trường sống, ô nhiễm lương thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết
người... Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh học như virut, vi khuẩn,
vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ
sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu
vi sinh đã và đang được lựa chọn. Trong đó thuốc trừ sâu sinh học
Bacillus thuringiensis (Bt) thuộc nhóm thuốc trừ sâu vi sinh nó có nhiều
ưu điểm đối với cây trồng và an toàn đối với môi trường được nhiều
người lựa chọn.
Nhận thấy vai trò quan trọng của thuốc trừ sâu sinh học Bt nên việc
đảm bảo chất lượng chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringiensis (Bt) là hết sức quan trọng, tuy nhiên việc kiểm tra chất
lượng hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn về phương pháp thực hiện.
Vì vậy chuyên đề “phân tích chế phẩm Bacillus thuringiensis” được
thực hiện nhằm xây dựng được qui trình kiểm tra chất lượng và phương
pháp tiến hành kiểm tra chế phẩm.
1.2. Mục đích
Xây dựng phương pháp xác định chất lượng sản phẩm của thuốc trừ
sâu sinh học Bt có đạt yêu cầu chỉ tiêu chất lượng của nhà nước đưa ra
hay không gồm:
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 3
+ Phân tích định lượng tổng số bào tử Bacillus thuringiensis trong chế
phẩm.
+ Xác định hiệu quả tiêu diệt sâu hại của chế phẩm Bt.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 4
CHƯƠNG 2:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Thuốc trừ sâu sinh học Bt
2.1.1. Lịch sử
Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát
hiện một loài vi khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus
bombycis. Sau đó vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức là Berline
đã phát hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở Thuringia vùng Địa
Trung Hải và đặt tên là Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt). Sau đó đến
khoảng giữa thế ky XX, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt ky sinh trên
nhiều loài sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông. Từ đó vi
khuẩn Bt đã được chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp
ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học. Bt lần đầu
tiên được phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học
ShigenteIshiwarti, khi ông tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột
của một số sâu tơ. ShigenteIshiwarti đầu tiên phân lập vi khuẩn Bacillus
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 5
thuringiensis, gọi đó là Bacillus sotto. Năm 1911, Bernard - người Đức,
tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi khuẩn ky sinh
trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring.
Năm 1971, chế phẩm Bt đã được nghiên cứu. Với những thành tựu của di
truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt
có khả năng ky sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm có hàm lượng độc
tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ tác dụng
trên nhiều loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu
khác nhau. Đã xác định có tới trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng
Bt, trong đó bao gồm hầu như toàn bộ các loài sâu hại có ở Việt Nam.
Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc
trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta. Ngoài việc dùng làm
thuốc trừ sâu, hiện nay người ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt
ghep vào hệ thống gen của cây để tạo ra các giống cây kháng sâu như
giống bông kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu cuốn lá,
giống ngô kháng sâu… Ở Việt Nam, chế phẩm Bt ( Bacillus
thuringiensis) đã được nghiên cứu từ năm 1971. Hơn 20 chế phẩm Bt
nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài
đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh, bướm
trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo. Các lọai sản phẩm thương
mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-Bt 32000WP,16000WP; BT
Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột, Firibiotox C dạng dịch cô đặc ...
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 6
Hình 2.1. Sản phẩm Bt trên thị trường
2.1.2. Phân loại
Thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi sinh vật ( Bacillus
thuringiensis), phổ diệt rộng và hữu hiệu với các loại sâu như sâu cuốn lá,
sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp …Có nhiều loại thuốc Bacillus
thuringiensis trên thị trường thế giới như:- Bacilus thuringiensis var
aizawai kiểu serotype, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể, chế biến thành
dung dịch đặc, dùng trừ ấu trùng mọt hại kho tàng. Bacillus thuringiensis
var. israelensis (tên khác: Teknar) hoạt chất ở dạng tinh thể ô-endotoxin
tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis,
Serotuper (H-14). Thuốc được gia công ở nhiều dạng như dịch, bột thấm
nước… dùng trừ muỗi, ấu trùng ruồi.
Bacillus thuringiensis var. kurstaki (tên khác Bakthane, Agritol,
Bactospeine plus, Biotrol...), hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-
endotoxin được tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner ,
var. kurstaki, Serotype H-3a 3b. Thuốc được gia công thành nhiều dạng
như bột thấm nước, sữa huyền phù, dung dịch đặc... dùng trừ ấu trùng bộ
Lepidoptera như sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh và nhiều loại sâu khác hại
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 7
rau, màu và cây ăn trái. Bacillus thuringiensis var. morrisoni, hoạt chất ở
dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxin được tạo thành qua lên men Bacillus
thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8b.Thuốc được gia công
thành dạng bột khô tan trong nước và bột thấm nước, dùng trừ ấu trùng bộ
Lepidoptera hại rau màu, cây ăn trái, cây cảnh, cây công nghiệp. Bacillus
thuringiensis var. San Diego (tên khác: Myx 1850), dùng để trừ bọ cánh
cứng cho khoai tây, cà chua, cây xanh.
2.1.3. Tính an toàn của thuốc sinh học Bt
Các sản phẩm Bt được sử dụng rộng rãi trên thế giới, chiếm 1 đến 2%
tổng sản lượng thịtrường thuốc trừ sâu trên thị trường thế giới vào những
năm 1990. Protein Cry có tính đặchiệu cao tới các loài côn trùng có chủ
đích. Các protein Cry ít hoặc không ảnh hưởng tới các loài sinh vật khác.
Trong gần 40 năm được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới, chúng ta chưa
tìm thấy ảnh hưởng xấu của chúng tới sức khỏe con người hay môi trường
( EPA, 1998a; Mc Clontock et. A;..1995 ). Kể từ năm 1961 đến năm 1998
tại Hoa Kỳ hiện có ít nhất 180 sản phẩm vi sinh Bt đã được đăng ky kiểm
định. Tại châu Âu có hơn 120 sản phẩm. Theo cuộc khảo sát gần đây của
WHO về tính an toàn của sản phẩm vi sinh Bt và đã khẳng định rằng:
“Không tồn tại mối nguy hiểm nào của sản phẩm Bt tới con người, động
vật có xương sống khác hoặc tới các sinh vật không chủ đích khác”
(IPCS, 2000).
2.1.3.1. Sức khỏe con người
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 8
Các nghiên cứu về tính an toàn của thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong hơn
40 năm đã chứng minh rằng không tìm thấy dấu hiệu ảnh hưởng nào tới
việc tăng cân, khám nghiệm lâm sàng hay trên tử thi. (McClintock et al.,
1995). Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Prôtectin
Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các
protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn. Theo Extension Toxicology
Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở một số trường
đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi
ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trong các ngày khác
nhau… không gây ra chứng bệnh gì. Những người ăn 1 gram Bt/ngày
trong 3 ngày liên tục hòan toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”. Hơn
nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày
(trong điều kiện phòng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996).
2.1.3.2. Ảnh hưởng đến môi trường
Nước ngầm và hệ sinh thái đất: Nước ngầm protein Bt tồn tại
tương đối bền trong đất và được phân loại vào dạng bất động vì nó không
có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nước ngầm. Protein này không bền
vững trong điều kiện đất axit, và bị phân hủy nhanh chóng khi phơi dưới
ánh sáng mặt trời, dưới tác động của tia UV. Các chuyên gia đã tiến hành
những nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hưởng của cây trồng Bt
đối với sinh vật đất và các loài côn trùng khác được xem là có ích trong
nông nghiệp. Kết quả cho thấy, chúng không gây ra ảnh hưởng bất lợi đối
với các sinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay
cả khi các sinh vật này được xử ly Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với
thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt tự chothấy không có sự
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 9
thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng có nguyên
liệu thực vật Bt và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống
(Donegan và cộng sự, 1995), cũng như không quan sát thấy sự khác biệt
giữa các cánh đồng trồng cây Bt và cây không chuyển gen Bt (Donegan
và cộng sự, 1996 ).
2.1.3.3. Động vật và côn trùng
Các thử nghiệm tiến hành trên chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ
nhông và chim cho thấy protein Bt không gây ra những ảnh hưởng có hại.
Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng
đến các loài côn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt như một số loài ong và
bọ cánh cứng (Extoxnet, 1996). Năm 1999, có một báo cáo về ảnh hưởng
có hại của hạt phấn từ cây ngô Bt đến ấu trùng của loài bướm Monarch.
Báo cáo này đã gây ra mối quan tâm và lo ngại về những rủi ro mà thực
vật Bt có thể gây ra đối với sinh vật không cần diệt. Tuy nhiên, những
nghiên cứu gần đây cho thấy ngô Bt gây ảnh hưởng không đáng kể đối
với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng. Nỗ lực nghiên cứu hợp tác
giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp những thông tin để
xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh hưởng của ngô Bt
đối với quần thể bướm Monarch. Họ đi đến kết luận rằng, hầu hết các
giống lai thương mại, protein Bt được biểu hiện với nồng độ thấp trong
hạt phấn và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên cánh đồng
cho thấy mọi mật độ hạt phấn đều không gây ảnh hưởng có hại trên đồng
ruộng.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 10
2.1.3.4. Tính an toàn của cây trồng được bảo vệ bởi Bt được chứng
minh nhờ các đặc tính sau
+ Cây trồng được bảo vệ bởi Bt không có độc tố tới con người và
không tìm thấy dấu hiệu của sự dị ứng.
+ Dựa trên hai tiêu chí (về lương thực và thực phẩm) thì cây trồng Bt
là an toàn cho tiêu thụ.
+ Các protein Cry gần như không có độc tố tới các sinh vật không chủ
đích, ngoại trừ các loài côn trùng có quan hệ gần gũi với vật chủ đích.
+ Protein Cry, các marker và cây trồng Bt không tìm thấy rủi ro tới
môi trường.
2.1.4. Ứng dụng của chế phẩm Bt
2.1.4.1. Diệt sâu bệnh
Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng
và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc
trừ sâu hoá học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là
Bt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có
rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên
thế giới với hy vọng tìm ra những chủng Bt có phổ gây bệnh mới và khoảng vật
chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng Bt đối với các nhóm côn trùng mới,
hay tìm kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật di truyền tiếp
theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là
công nghệ gen đã mở ra những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc
trừ sâu sinh học Bt. Việc làm giàu thêm bộ sưu tập các chủng B. thuringiensis
phân lập ở Việt Nam và nguồn gen quy từ những chủng này nhằm tạo ra các
chủng tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 11
trọng là rất cần thiết.Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập có tinh thể hình quả trám, trong đó 9/10
chủng có hoạt tính diệt 90 - 100% đối với sâu tơ P. xylostella và sâu keo S.
exiqua; 7/10 chủng có hiệu quả diệt 80-90% đối với sâu khoang S. litura; 6/10
chủng có hoạt tính diệt 50-60% đối với sâu bông H. armigera. 10/10 chủng có
hiệu quả diệt 100% đối với sâu ngài gạo C. cephalonica.
2.1.4.2. Cây trồng Bt
Cây trồng Bt là công cụ diệt sâu bệnh thực vật mới. Vấn đề khai thác
mọi khả năng giảm thiệt hại mùa màng và tăng sản lượng lương thực trở
nên cấp bách khi dân số toàn cầu tăng lên nhanh chóng và diện tích đất
canh tác lại giảm đáng kể. Cùng với kỹ thuật canh tác nông nghiệp thích
hợp, công nghệ kháng côn trùng Bt có thể đem lại rất nhiều lợi ích cho
loài người.
Những lợi ích của cây trồng Bt:
Tăng cường quản ly sâu bệnh.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu.
Thu được lợi nhuận nhiều hơn.
Cải thiện điều kiện cho các sinh vật có ích.
Ngô chứa ít độc tố mycotoxin – độc tố có thể gây chết gia súc và ung
thư cho người
Quản ly tính kháng côn trùng (IRM) Cây Ngô Bt kháng côn trùng biến
đổi gen
2.1.4.3. Ngoài ra vi khuẩn Bt còn được dùng để diệt lăng quăng
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 12
Một nhóm các nhà khoa học tại Viện Pasteur TPHCM vừa nghiên cứu
thành công chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
subsp. israelensis serotype diệt lăng quăng.
TS. Hồ Thị Hồng Nhung - Viện Pasteur TP.HCM cùng các cộng sự
vừa nghiên cứu thành công một loại chế phẩm vi sinh học từ chủng vi
khuẩn có tác dụng diệt trừ được lăng quăng trong nhiều điều kiện sống
khác nhau. Chỉ cần 200g chế phẩm này, với giá thành khoảng 300.000
đồng có thể bảo vệ được một khu vực có diện tích 1 ha khỏi nạn lăng
quăng.
Loại chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn này có tác dụng diệt lăng quăng
trong nhiều điều kiện sống khác nhau, từ ao tù nước đọng cho đến nước
kênh rạch.
Khi Bt theo nước và thức ăn vào trong ruột của lăng quăng, độc chất
của vi khuẩn sẽ gây thủng ruột và diệt lăng quăng.
Trên thế giới, các nước phát triển như Bắc Mỹ, Châu Âu đã kiểm soát
được dịch sốt xuất huyết do hạn chế được lăng quăng. Một trong các biện
pháp là sử dụng chế phẩm vi sinh có thành phần Bti rải xuống các khu
vực tự nhiên có muỗi sinh sống.
Bt có thể giết được mọi loại lăng quăng muỗi thường cũng như muỗi
truyền bệnh sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản, sốt ret, hay loại bệnh mới
như viêm não Nipar (Philipine), bệnh viêm não Chikungunya.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 13
2.2. Vi khuẩn bacillus thuringiensis
2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt)
Bacillus thuringiensis là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở
vùng Thuringia, Đức. Ở Việt Nam trong số 185 mẫu đất, bùn thu thập ở
Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh
Bình đã phân lập được 920 chủng Bacillus với đặc điểm Gram +, hình
que, bào tử không phình. Chỉ có 295 chủng trong số đó có tinh thể hình
tròn, tháp đôi, hình kim. Các chủng Bacillus có tinh thể được phân loại
thành loài Bacillus thuringiensis (Bt).
Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ… Hình dạng
tinh thể (một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài
phụ) rất đa dạng. Phần lớn các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình
tháp đôi, một số hình cầu và một số chủng có tinh thể với các hình dạng
khác nhau. Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram
dương (không mất màu nhuộm khi tẩy bằng iôt và cồn, kích thước 3(-)6
µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành từng
chuỗi, chứa tinh thể độc có khả năng diệt sâu. Bt phát triển trong điều
kiện nhiệt độ 15(-)45oC nhưng thích hợp nhất 29(-)30oC. Bào tử dạng
hình oval, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 14
Hình 2.2. Vi khuẩn Bacillus thuringensis
Hình 2.3. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringensis
Trưởng thành mỗi tế bào vi khuẩn có một bào tử hình trứng và một
tinh thể độc hình quả trám.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 15
Hình 2.4. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)
2.2.2. Đặc điểm tinh thể độc và cơ chế tác động của vi khuẩn Bacillus
thuringiensis.
2.2.2.1. Đặc điểm tinh thể độc
Dựa vào cơ chế tác động diệt côn trùng người ta xác định có 4 loại độc
tố:- Nội độc tố endotoxin, còn gọi là tinh thể độc crystal: cry I, cry II, cry
III, cry IV. Hầu hết là các chủng Bt có một hoặc nhiều gen tiền độc tố. Cơ
sở gây bệnh cho côn trùng chính là các gen Cry khác nhau. Gen Cry được
chia thành 4 lớp chính: Cry I, II, III, IV.
+ Gen Cry I: Thường tổng hợp các protein hình thoi gây bệnh cho côn
trùng bộ cánh vẩy.
+ Gen Cry II: Tạo tinh thể dạng hình tháp gây bệnh cho côn trùng bộ
cánh vẩy và côn trùng bộ 2 cánh. Ví dụ như gen Cry IIA gây bệnh cho
loài Lymantria dispa, Cry IIB Helicoverpaarmigera.
+ Gen Cry III: Tổng hợp tinh thể dạng hình thoi, gây bệnh cho côn
trùng bộ cánh cứng Coleoptera .
+ Gen Cry IV: Tổng hợp cả tinh thể dạng hình thoi và hình tháp, chỉ
gây bệnh cho côn trùng bộ 2 cánh Diptera.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 16
Hình 2.5. Pansy peacock
Hình 2.6. Diaethria
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 17
Hình 2.7. Helicoverpa armigera
Hình 2.8. Lymantria dispa
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 18
Hình 2.9. Bộ cánh cứng coleoptera
Hình 2.10. Bộ 2 cánh Diptera
Năm 1955, C.L. Hannay và P.C Fitz James xác định được bản chất
protein có liên quan đến độc tính của vi khuẩn. Tinh thể độc của Bt có
dạng hình thoi, hình quả trám, hình tháp mang bản chất protein và có độc
tính cao với rất nhiều loại côn trùng, chiếm 30% trọng lượng khô của tế
bào. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu dưới kính
hiển vi đối pha tinh thể độc. Tinh thể độc rất bền vững ở nhiệt độ cao, có
trọng lượng phântử là 5000 đơn vị và không phải bào tử nào cũng có tinh
thể độc. Trong quá trình bảo quản nếu để lâu Bt sẽ mất hoạt tính do tinh
thể độc bị biến dạng hoặc phân huy. Chất formandehyde 20% và tia tử
ngoại có thể làm mất hoạt tính của tinh thể độc.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 19
Hình 2.11. Bào tử Bt và tinh thể độc
Bản chất hóa học của tinh thể: trong tinh thể độc có nhiều loại acid
amin, trong đó có hai loại có tỉ lệ cao nhất là acid glutamic và acid
asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng khá lớn 5 nguyên tố C, N, H,
O, S. Ngoài ra còn chứa 19 nguyên tố khác nhưng không có P.Các phân tử
có khối lượng lớn thì có độc tính còn loại có phân tử lượng nhỏ thì không
có độc tính.Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố ở dạng hòa
tan, chẳng hạn tinh thể B.thuringensis sotto ở 65oC sau 1 giờ vẫn còn
hoạt tính trong khi các dạng khác sẽ mất hoàn toàn độc tính. - Ngoại độc
tố (anpha) exotoxin, còn được gọi là phospholipaza. Thực chất đây là một
loại men liên quan đến sự phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng
chết. Ngoại độc tố (beta) exotoxin, còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt,
chúng có khối lượng phân tử thấp 707()850. Sau 15 phút ở 120oC vẫn
còn hoạt tính. Chúng tác động lên côn trùng làm cản trở việc tổng hợp
ARN thông tin. Chúng còn có tác động cộng hưởng với nội độc tố, sau
khi nội độc tố phá vỡ biểu bì ruột giữa, chúng nhanh chóng xâm nhiễm
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 20
vào huyết tương và máu đi đến các cơ quan làm thay đổi quá trình trao
đổi chất và làm cho côn trùng mau chết. - Ngoại độc tố
(gamma) exotoxin, còn gọi là độc tố tan trong nước. Chúng có khối
lượng phân tử thấp 200(-)2000, có một số acid amin tự do, tan
trong nước, mẫn cảm với ánh sángvà đặc biệt mất hoạt lực trong 15 phút
ở 600oC trở lên.
2.1.2.2. Cơ chế tác động
Hình 2.12. Cơ chế tác động của tinh thể độc đối với sâu
Khi được phun lên lá cây, protein độc tố dưới dạng tinh thể sẽ diệt
những loại sâu hại nhất định. Tác động của tinh thể lên côn trùng là rất
phức tạp. Tác động điển hình là làm liệt đường ruột và xoang miệng. Cụ
thể là sau khi sâu hại ăn phải các tinh thể tiền độc tố, dưới tác dụng của
một loại men tiêu hoá trong dịch ruột của sâu, tiền độc tố bị hoà tan thành
những phân tử nhỏ có hoạt tính độc.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 21
Các độc tố này bám vào màng vi mao trong ruột, tạo ra các lỗ rò để
cho nước chảy vào, làm sâu mọng nước, ngừng ăn và chết. Sau khi ăn tinh
thể 1()7 giờ tằm dâu bị liệt toàn thân các tế bào thượng bì. Sau khi ăn
1 phút, tinh thể đã xuất hiện tại thượng bì ruột giữa sâu xanh bướm cải.
Một số tế bào bị tách rời, biến đổi, các chất bên trong chảy ra ngoài màng
(như trên sâu độc thân) làm tăng tínhthấm thẩu Kali và đã chứng minh
tăng K+ trong máu và bạch huyết là nguyên nhân gây tê liệt đường ruột
và toàn thân tằm dâu. Sự thay đổi tác động của tinh thể phụ thuộc vào
nhiều yếu tố. Chẳng hạn bình thường, khivào ruột trước và ruột giữa, nếu
pH cao (>7,0) và cơ thể không có cơ chế giải độc, tinh thể sẽ vỡ ra làm
nhiễm độc máu. Hiện tượng thấy phổ biến trên tằm, sâu róm, bướm cải…
Tuy vậy trong nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra, một số loài sâu có
cơ chế tự giải độc, ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời
gian nhất định đường tiêu hóa được phục hồi. Các động vật có vú không
bị ngộ độc khi ăn phải tinh thể là do chất pepsin trong ruột động vật (hoạt
động thích hợp khi pH =2) đã làm mất tính độc của tinh thể vi khuẩn.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 22
Hình 2.13. Sâu chết do trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 23
CHƯƠNG 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM Bt
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 24
3.1. Phân tích định lượng tổng số bào tử Bacillus thuringiensis trong
chế phẩm
3.1.1. Nguyên tắc
Trên môi trường đặc, mỗi vi sinh vật hoặc mỗi bào tử đứng riêng sẽ
phát triển thành một khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc có thể tính ra số lượng
vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Ưu điểm của
phương pháp này là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các
mảnh xác hữu cơ.
Sử dụng phương pháp đếm thạch đĩa, đếm số khuẩn lạc trên môi
trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37oC ± 1oC trong 24h. Tổng số
bào tử Bacillus trong 1g hoặc 1ml mẫu chế phẩm kiểm nghiệm được tính
từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng.
3.1.2. Môi trường và hóa chất
Môi trường nuôi cấy, pH 7,0 ± 0,2 có thành phần như sau:
Bảng 3.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
Thành phần Khối lượng
Cao nấm men 5g
Peptone 10g
NaCl 5g
Agar 15()20g
Nước cất 1000ml
- Cao nấm men
- Agar
- NaCl
- Peptone
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 25
- Nước cất
- NaOH
- HCl
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ
3.1.3.1. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông
thường và cụ thể như sau:
- Tủ cấy vi sinh vật.
- Nồi hấp áp lực.
- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37oC.
- Tủ lạnh.
- Máy lắc.
- Máy đếm khuẩn lạc.
- Máy đo pH.
- Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến 0,1mg.
- Kính hiển vi quang học.
- Lò vi sóng.
- Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ ở 45oC ± 1oC và 80oC.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 26
Hình 3.1. Các thiết bị dùng trong phân tích
A. Autoclave D. Máy đếm khuẩn lạc
B. Máy đo pH E. Máy lắc
C. Cân phân tích F. Tủ ấm
3.1.3.2. Dụng cụ
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 27
- Bình định mức, dung tích 1000 ml (loại A).
- Bình nón.
- Ống nghiệm
- Pipet, dung tích 1 ml và 10 ml.
- Ống đong, dung tích 100 ml và 250 ml.
- Micropipet, dung tích 1000 µl.
- Bông không thấm nước.
3.1.4. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
3.1.4.1. Yêu cầu chung
- Lấy mẫu theo nguyên tắc ngẫu nhiên.
Lượng thuốc trong mẫu phân tích cũng như trong mẫu lưu ít nhất phải
đủ cho ba lần phân tích hoặc phải đủ để thực hiện các phep thử đảm bảo
thu được kết quả chính xác và tin cậy. Lượng thuốc này được tính toán
trên cơ sở tiêu chuẩn phương pháp thử của sản phẩm. Thông thường mỗi
lô sản xuất được lấy hai mẫu (một mẫu phân tích và một mẫu lưu).
Trường hợp đặc biệt, số mẫu phân tích và mẫu lưu có thể nhiều hơn
hai để đủ gửi kiểm nghiệm và lưu ở nhiều nơi nếu xet thấy cần thiết.
- Lấy mẫu thành phẩm
Mẫu được lấy tại những vị trí khác nhau của lô sản xuất, không được
phá lẻ các đơn vị đóng gói sản phẩm để lấy mẫu. Từ các đơn vị lấy mẫu
được tập hợp lại thành mẫu chung và mẫu cuối cùng.
Số lượng mẫu thành phẩm cần lấy theo quy định tại Bảng 1.
Bảng 3.2. Số lượng mẫu cần lấy theo quy cách đóng gói
Quy cách đóng gói (g hoặc ml) Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 28
gói)
Đến 2 70
Từ 2 đến 5 30
Từ 5 đến 50 7
Từ 50 đến 100 4
Từ 100 trở lên 3
Trong trường hợp đặc biệt thì tùy theo quy cách đóng gói và tính chất
của thuốc chỉ lấy mẫu đủ để phân tích và lưu.
3.1.4.2. Bảo quản mẫu
Xem tiêu chuẩn cụ thể đối với sản phẩm liên quan hoặc theo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
3.1.5. Cách tiến hành
3.1.5.1. Chuẩn bị dung dịch pha loãng
Cân 9g natri clorua, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức
1000ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch
HCl 0,1N và NaOH 0,1N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình
90ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9ml dung dịch trên.
Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt
độ 121oC trong 15 phút. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8oC, sử
dụng trong 15 ngày.
3.1.5.2. Chuẩn bị môi trường
Cân các thành phần môi trường PCA theo bảng 1 hoặc lấy 22,5g môi
trường tổng hợp, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 29
dung dịch HCl 0,1N và NaOH 0,1N. Lắc đều và đun cách thủy hoặc trong
lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250ml lượng môi
trường 100ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45oC ± 1oC ở bể điều
nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ
2 đến 8oC không quá 30 ngày.
3.1.5.3. Chuẩn bị mẫu thử
Cân vô trùng khoảng 10g (10ml), chính xác đến 0,1mg, mẫu thử cho
vào bình nón đựng 90ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha
loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 min. Đặt trong bể
điều nhiệt 800C trong 10 phút.
3.1.5.4. Các bước tiến hành
- Pha loãng mẫu
Dùng micropipet lấy 1ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng
hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được
độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng cần thiết
để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa theo dự kiến.
- Cấy giống
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 nồng độ pha
loãng liên tiếp, mỗi nồng độ dùng 2 đĩa petri vô trùng.
Lấy 1ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các nồng độ khác nhau cho
vào giữa từng đĩa petri.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 30
Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45oC ± 1oC. Rót vào
từng đĩa 12ml đến 15ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với
môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái.
Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang.
Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không
được quá 30 phút.
3.1.5.5. Ủ ấm
Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian
từ 18h đến 24h.
3.1.5.6. Đọc kết quả
Sau 24h, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa.
Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch tạo thành khuẩn lạc màu
trắng, hình dạng thay đổi.
3.1.6. Tính và biểu thị kết quả
3.1.6.1. Tính kết quả
Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 nồng độ
pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 nồng độ
nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, thì tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm
bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các
đĩa theo công thức sau:
Trong đó:
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 31
C: là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2
nồng độ pha loãng liên tiếp.
V: là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml).
n1: là số đĩa có nồng độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
n2: là số đĩa có nồng độ pha loãng thứ hai được giữ lại.
d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Làm tròn
số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
3.1.6.2. Biểu thị kết quả
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1,0 và 9,9 nhân với 10n
(n là số mũ thích hợp của 10).
Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 nồng độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của
nồng độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc nồng độ pha loãng ban
đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả là trung bình cộng của các khuẩn
lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1g hoặc 1ml sản phẩm.
Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như
sau:
- Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1 ml sản phẩm.
- Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1g sản phẩm.
trong đó d là hệ số pha loãng của nồng độ pha loãng ban đầu (10-1).
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 32
3.2 Xác định hiệu quả tiêu diệt sâu hại của chế phẩm Bt
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
- Sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bt được lấy từ nhà sản xuất.
- Sâu xanh được bắt ngoài đồng về.
- Cây đậu.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
- Bình phun.
- Hộp nhựa.
- Bảng biểu.
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
Chuẩn bị 4 hộp nhựa 10x20cm. Cây đậu được cắt nhỏ 2x3cm cho vào
4 hợp nhựa làm giá thể cho sâu sống. Cho vào mổi hộp nhựa 30 con sâu
xanh.
Tiếp theo ta tiến hành pha chế và phun thuốc vào 3 hộp nhựa và một
hộp không phun làm mẫu đối chứng. thuốc được pha chế theo đúng hướng
dẫn được in trên bao bì về nồng độ và đúng liều lượng. Sau khi phun
xong ta dùng vải mùng che mẫu lại. Sau 2 ngày đêm kể từ khi phun chúng
tôi tiến hành điều tra và ghi chep số sâu chết, theo dõi cho đến tận ngày
cuối cùng.
3.2.4. Tính toán kết quả
Tỉ lệ sâu chết trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức:
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 33
T ỉ l ệ s âu ch ế t=S ố s â u ch ế t t hí ng h iệ mT ổ ng s â ut h í ng h i ệm
x100
Tính hiệu quả tiêu diệt sâu của thuốc
Hiệu quả tiêu diệt sâu trong thí nghiệm được tính theo công thức sau:
H %= B – K100 – K
x100
Trong đó:
- H%: Hiệu quả tiêu diệt sâu của thuốc ở các công thức.
- K: Là tỉ số phần trăm số sâu chết ở công thức đối chứng.
- B: Là tỉ số phần trăm số sâu chết ở công thí nghiệm.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 34
CHƯƠNG 4:
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 35
4.1. Kết luận
Hoàn thành qui trình phân tích tổng số bào tử có trong sản phẩm.
Hương pháp đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm Bt
Đã xây dựng được quy trình phân tích chế phẩm Bacillus
thuringiensis. Qui trình này đơn giản hóa qui trình kiểm tra chất lượng
của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis. Giúp việc
quản lí chất lượng chế phẩm dễ dàng hơn.
4.2. Kiến nghị
Cần phải chú trọng đầu tư hơn nữa về mặt kĩ thuật phân tích đánh giá
chất lượng sản phẩm.
Tiếp tục nghiên cứu xây dựng hoàn thiện kĩ thuật phân tích đánh giá
chất lượng chế phẫm Bt.
Thường xuyên kiểm tra đánh gia chất lượng các sản phẩm Bt thường
xuyên hơn.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Nguyễn Thị Me, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần
Ngọc Hân (2001), Kết quả xác định tính kháng thuốc của rầy nâu
hại lúa của một số Tỉnh đồng bằng Sông Hồng. tuyển tập công
trình nghiên cứu BVTV 2000-2002, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
2002.
[2]. Lương Minh Châu( 2007), State of insecticide resistance of brown
planthopper in Mekong delta, Viet Nam.
[3]. Nguyễn Thế Nhã, Trần Văn Mão, Trần Công Loanh (2001 ), Điều
tra dự tính - dự báo sâu bệnh hại trong lâm nghiệp . Nxb Nông
nghiệp - Hà Nội.
[4]. Kết quả khảo nghiệm một số chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại
chính bộ cách vảy ăn lá muồn đen tại Bắc Cạn.
2. Tài liệu Tiếng Anh
[5]. Bacillus thuringiensis an environment biopesticides.(1986), Theory &
Practice.
[6]. Cannon, R.J.C. (1993) Bacillus thuringiensis use in agriculture: a
molecular perspec-tive.
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 37
[7]. Becker, N., Zgomba, M., Ludwig, M., Petric, D. and Rettich, F. (1992b)
Factors influencing the activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis
treatments.
3. Tài liệu Internet
[8]. http://www.sinhhocvietnam.com/forum/index.php
[9]. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis
[10]. http://tailieu.vn
[11]. http://violet.vn
[12]. http://dienkhanh.vn
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 38
GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh Page 39
Top Related