PCRThe Polymerase Chain Reaction
PCRThe Polymerase Chain Reaction
Г.ЗолзаяаА.АриунчанарБ.МөнхбилэгБ.БуянхишигД.Эрдэнэчимэг 424 АУС
Г.ЗолзаяаА.АриунчанарБ.МөнхбилэгБ.БуянхишигД.Эрдэнэчимэг 424 АУС
АгуулгаАгуулга
PCR шинжилгээ арга PCR шинжилгээний хувилбарууд Үндсэн үе шатууд Шинжилгээний үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд Параметрийн үзүүлэлт Шинжилгээнд нөлөөлж болох бусад параметр Давуу тал, сул тал Халдвартт өвчин судлалын практикт хэрэглэх нь
PCR шинжилгээ арга PCR шинжилгээний хувилбарууд Үндсэн үе шатууд Шинжилгээний үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд Параметрийн үзүүлэлт Шинжилгээнд нөлөөлж болох бусад параметр Давуу тал, сул тал Халдвартт өвчин судлалын практикт хэрэглэх нь
Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction
1983 онд Кэрри Мюллис PCR шинжилгээний аргыг боловсруулж 1993 онд нобелийн шагнал хүртсэн.
Нуклейн хүчлийг олшруулах шинжилгээний арга юм.
ДНХ өвөрмөц секвенсийн хэсгийг in vitro нөхцөлд урвалын дэс дараалсан мөчлөгийн явцад олшруулан тодорхой урттай ДНХ-ийн молекул гарган авна.
1983 онд Кэрри Мюллис PCR шинжилгээний аргыг боловсруулж 1993 онд нобелийн шагнал хүртсэн.
Нуклейн хүчлийг олшруулах шинжилгээний арга юм.
ДНХ өвөрмөц секвенсийн хэсгийг in vitro нөхцөлд урвалын дэс дараалсан мөчлөгийн явцад олшруулан тодорхой урттай ДНХ-ийн молекул гарган авна.
Polymerase Chain Reaction төрөл
Polymerase Chain Reaction төрөл
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Polymerase Chain Reaction хувилбар
Полимераза гинжин урвал үе шатПолимераза гинжин урвал үе шат
PCR шинжилгээний материал
Эпитель эсийн хусам /эрэгтэй эмэгтэй хүмүүсийн шээсний сүвнээс авсан /
Цус, сийвэн
Биологийн шингэн /түрүү булчирхайн шингэн, нугасны шингэн, ураг орчмын шингэн, үений шингэн, шүлс, гялтангийн шингэн /
Шээс
Ходоод, арван хоёр хуруу гэдэсний биопатууд
Тухайн организмаас нук хүчил чөлөөлөгдсөн байхЧөлөөт нук хүчил деградаци болохоос сэргийлэхОлшруулахад саатуулагч ямар нэгэн бодис агуулаагүй байхНук хүчлийн конц-д тохирох бага хэмжээнйи буферт хадгалсан байх ёстой.
Нуклейн хүчлийн шинжилгээнд сорьц бэлтгэх
ДНХ ялгах Саатуулагч бодис зайлуулах
Фенол, хлорформоор ДНХ ялгаж, этанолоор угаах /олон дахин угаах /
PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд
1) ДНХ, РНХ матриц – олшруулахаар төлөвлөсөн ДНХ хэсэг 2) Хос праймер – нук молекул нийлэгжилтийг эхлүүлэх гарааны молекул
3) dNTPs - дезоксирибонуклеотид: тулгуур өрөгч ДНХ полимеразаар шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг.
PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд4) Дулаанд тэсвэртэй DNA полимераза – Термус акуатикус бактериас гаргаж авсан фермент /taq polymerase/
Кинетик шинж чанар
Молекул жин 94000 Da
Тохиромжтой PH 7-8
Тохиромжтой температур 75-80 ̊ С
Ионы хамаарал 10мМ Mg²
Полимеразийн хурд 150 нук /сек
Хагас задралын хугацаа 92,5º С –т 130
3 ҆ , 5 ҆ төгсгөл экзонуклеаз идэвхижилт
тодорхойлогдоогүй
PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд
5) Mg++ ион - ферментийн кофактор, катализын идэвхижилтийг эрчимжүүлдэг.
6) Буфер уусмал – PH нөхцөлдүүлэх
7) Ионы хамаарал- NaCl KCl энерги үүсэлтйг хангах
Original protocol
Шинжилгээний явцад гарч болох техник ажилбарын нөхцлөөс шалтгаалсан бүх алдааг туршилтаар хянаж харьцуулан засварласан үндсэн баримт юм.
PCR шинжилгээ бусад шинжилгээнээс ялгагдах онцлог
PCR параметр үзүүлэлтPCR параметр үзүүлэлт• ДНХ матриц- шугаман жижиг фрагмент (0.5 - 50 ng)
< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes
• Олигонуклеотид праймер (0.025 – 0.2 μM)• Дизоксинуклеотид (20 –200 μM) • Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза (1 – 2.5 Unit)• Mg (1,2 –2,5 mM) affects primer annealing and Taq activity
• Ионы концентраци(40mM NaCl, 50mM KCl)• Буфер уусмал
Tris-HCl (10-50 mM, pH 8.3-8,8)
NaCl2 (заримдаа)
PH=7-8
• ДНХ матриц- шугаман жижиг фрагмент (0.5 - 50 ng)
< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes
• Олигонуклеотид праймер (0.025 – 0.2 μM)• Дизоксинуклеотид (20 –200 μM) • Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза (1 – 2.5 Unit)• Mg (1,2 –2,5 mM) affects primer annealing and Taq activity
• Ионы концентраци(40mM NaCl, 50mM KCl)• Буфер уусмал
Tris-HCl (10-50 mM, pH 8.3-8,8)
NaCl2 (заримдаа)
PH=7-8dNTPs
Taq polymerase
Primers
DNA template
Buffer
+ +
A C T G
MgCl2
Циклийн тоо
ДНХ матрицийн конц- циклийн тоог тогтоогч параметр
300,000 молекул- <25-30н цикл>
DNA полимержих
1 copy
Цик
л 1
+dNTPs, buffer, salts,Taq pol,primers
цикл 25-30
n36 = 68,719,476,736 copies in ~ 2 hrs
2 copies
цикл 2
4 copies
цикл 3
8 copies
Термал циклерПГУ-ын дээжийг тодорхой температурын шатлалуудын дагуу явуулах үүднээс ээлжлэн халааж, хөргөх процессыг явуулдаг.
Thermocyclers
Polymerasa chain reaction
THERMOCYCLERPCR tube
эрл
ий
жүүл
эгэр
ли
йж
үүлэг
94ºC94ºC 94ºC94ºC
55ºC55ºC
72ºC72ºC
4ºC4ºC
3 min3 min 1 min1 min
45 sec45 sec
1 min1 min
∞ hold∞ hold
ДНХ денатурациДНХ денатураци
1X1X 25-30X25-30X 1X1Xп
ол
им
ераза
по
ли
мер
аза
ден
атурац
ид
енатур
аци
PCR шинжилгээнд нөлөөлөх бусад параметр
Харь ДНХ-ийн контаминаци илрэх
Үүнээс сэргийлэхийн тулд
Тусгаар өрөөнд явуулахАриун нөхцөлд ажиллахУрвалжийг стандарт хэмжилтээр хэсэгчлэн савлахЭерэг сөрөг хяналтыг тогтмол тавихЗааврын дагуу гүйцэтгэх
PCR шинжилгээ
Бэлгийн замын халдварт өвчний Практикт PCR шинжилгээний аргыг хэрэглэх нь
PCR шинжилгээ
C.TrachomatisПлазмидын ДНХ гадна мембраны гол уургийг кодлогч хромосомын ДНХ-ийн фрагмент хэсгүүдийг олшруулахЭр-шээс эм-умайн хүзүүний сувгийн арчдас
C.Trachomatis N.gonorrhoeaeМултифлекс ПГУ-р илрүүлэх
PCR шинжилгээ
HSVТууралтын халдварын түвшинЭмнэлзүйн шинж тэмдэг бүдэг байгаа өвчтнүүдийн халдварлах эрсдлийг тодорхойлохЭхээс хүүхдэд халдвар дамжих эрсдэлийг тогтоохОнош баталгаажуулах зорилгоор
HSV, T.Pallidum, H.Ducrey /бэлэг эрхтний шархлаат өвчин/Мултифлекс ПГУ-р нэгэн зэрэг тодорхойлохҮүсгэгч тус бүрт 90%-с дээш байсан нь өвөрмөц чанартай байгааг илтгэнэ.
PCR шинжилгээ
CMV цитомегаловирусӨсгөвөрлөх шинжилгээг нэг үе алтан стандарт гэж үздэг байсанPCR илүү мэдрэг чанартайОношилгоо, эмчилгээний үр дүнг хянах боломжтой.
PCR шинжилгээ HPVReal time PCRВирусын L1 генийн нук илрүүлэх шинжилгээ хийхE6 E7 генийн ДНХ илрүүлэх
Биопсийн эд, бэлэг эрхтний арчдас, шээс бэлгийн замаар халдварлах боломжтой HPV-ийн хэв шинжүүдийг илрүүлэх ерөнхий праймерыг ПГУ-р олшруулсны дараа хэв шинжийг тусад нь илрүүлэх шинжилгээ хийж оношлох
PCR шинжилгээ
HIV вирусыг шууд илрүүлэх халдвартай мөртлөө эсрэг бие үүсээгүй үед илрүүлэх халдвартай нярайг оношлох тодорхойгүй хариуг батлах өвчний явцыг үнэлэх /вирусын РНХ тоог тогтоох/ Эмчилгээний үр дүнг хянах
PCR шинжилгээ
HBV Вирусын ДНХ-г баттай байгааг нарийвчлан тодорхойлдог. Судалгаа шинжилгээний ажилд түлхүү хэрэглэдэг.
Анхаарал тавьсанд бүгдэнд нь баярлалаа
Top Related