Para qu romper clulas?
Para obtener productos que se encuentran en el interior de las clulas.
La tcnica de RC seleccionada determina el tamao de los desechos y la influencia que tendrn en las operaciones que se utilicen para su separacin.
Ejemplos de productos intracelulares
cidos nucleicos Enzimas
Tanasa Invertasa Proteasas DNA polimerasa
Pigmentos B-ficoeritrina (BPE), colorante rosa
Polmeros intracelulares AnBbiBcos
Caldo de fermentacin
Separacin de clulas
Rompimiento celular
Separacin, tratamiento de
cuerpos de inclusin
sobr
enad
ante
Con clulas
protenas intracelulares
Concentracin
Purificacin alta resolucin
refinamiento
Refinamiento
Sin clulas
C
lulas inmovilizadas o
Clulas retenidas
La recuperacin ptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las clulas.
Paredes microbianas:
La tcnica uBlizada determinar el tamao de los desechos que se
producirn
MECANISMOS DE RUPTURA CELULAR
La seleccin de una tcnica depende de las caractersBcas del producto:
u Resistencia a:
Medios alcalinos
Solventes
Detergentes
Enzimas
Temperatura
Esfuerzo de corte
Los mtodos de ruptura celular en la industria pueden ser divididos en:
Mtodos qumicos Mtodos Qsicos Mtodos biolgicos
ROMPIMIENTO CELULAR RUPTURA DE CLULAS DE MICROORGANISMOS
Mtodos Fsicos Mtodos Qumicos Mtodos Biolgicos
Mtodo Slido
Mtodo Lquido
Liofilizacin
Detergentes
Enzimas que digieren la pared
celular
Congelacin, descongelacin
Ultrasonido
Molinos Molino Dyno
Molino coloidal
Prensas Gaulin/Manton
Prensa de French
Prensas Prensa X
Prensa Hughes
Molino de bolas
Cambio en la presin osmRca
Tratamiento con cidos
Extraccin con acetona/tolueno
Fagos
Agentes que inhiben la pared
celular
Mtodos qumicos:
Choque osmBco Permeabilizacin Disolucin lipdica (tolueno 10% de la biomasa) DigesBn enzimBca (enzimas que atacan la
pared celular) Tratamiento alcalino Detergentes Liofilizacin
Los mtodos no-mecnicos son fciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces ms materia orgnica basta con adicionar 10 veces ms reacBvo qumico o enzimBco
TCNICAS PRINCIPIO ESTRS EN EL PRODUCTO COSTO EJEMPLO
Solubilizacin Detergentes solubilizan la membrana Suave Moderado/
Caro
Choque osmtico Ruptura osmtica de la membrana Suave Barato Ruptura
de glbulos rojos
Disolucin lipdica
Solventes orgnicos actan sobre
la pared celular desestabilizndola
Moderado Barato Rompimiento de levaduras con
tolueno
Digestin enzimtica
Rompimiento por la digestin de
la pared celular Suave Caro
Micrococcus lysodeikticus tratado con
lisozima
Tratamiento alcalino
La saponificacin de los lpidos solubiliza la
membrana Fuerte Barato
Permeabilizacin enzimatica
Permeabilizan la membrana ocasionando
la ruptura de la clula Suave Caro
Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima
Rompimiento celular por mtodos qumicos.
Mtodos mecnicos:
Mtodos a pequea escala: Ultrasonificacin Molido con abrasivos Homogeneizadores
Mtodos a gran escala: Homogeneizadores a alta presin Molinos de perlas
TCNICAS PRINCIPIO ESTRS
SOBRE EL PRODUCTO
COSTO EJEMPLO
Homogeneizador de cuchillos
Las clulas son rotas en un mezclador
Moderado Moderado Rompimiento de tejidos y clulas animales.
Homogeneizador alta
presin
Las clulas son forzadas a pasar a travs de un
pequeo orificio, produciendo su ruptura
por el esfuerzo de corte
Fuerte Moderado
Tratamiento a gran escala
de suspensin de clulas.
Molienda Las clulas son rotas
por medio de una molienda con abrasivos
Moderado Barato
Molino de perlas Las clulas son
trituradas con perlas de acero o vidrio
Fuerte Barato Rompimiento a gran escala
para suspensiones de clulas y clulas de plantas
Ultrasonificacin Las clulas son
quebradas en una cavidad ultrasnica
Fuerte Caro Rompimiento de suspensiones
de clulas a lo menos en pequea escala
Rompimiento celular por mtodos mecnicos
Mtodos biolgicos:
Enzimas Fagos Agentes inhibidores de pared celular
Estos mtodos no son muy empleados debido a que son muy costosos.
Animales Micelio Bacterias Gram + Bacterias Gram Levaduras Esporas
7 = Fcil de romper 1 = Difcil de romper
Dificultad para rompimiento de diferentes Bpos de clulas.
Que hay que tomar en cuenta para la seleccin de un mtodo de ruptura celular
Naturaleza del producto intracelular Escala de la operacin Velocidad Estabilidad del producto Pureza del producto Costo del mtodo
CHOQUE OSMTICO
Las clulas se colocan en un volumen de agua frecuentemente 2 veces mayor que el volumen de clulas.
Las clulas se expanden, por un simple flujo osmBco que se produce debido a que las clulas conBenen solutos, ocasionando que el agua entre al interior.
Debido a esta expansin puede conducir a su lisis o rompimiento.
El uso de este mtodo depende de la resistencia de las
clulas.
Ley de van`t Hoff
Toluenizacin:
Ruptura a altas concentraciones, , se trabaja a bajas temperaturas, clulas inacBvas metablicamente.
Permeabilizacin a bajas concentraciones, clulas metablicamente acBvas comienzan a destruirse.
DigesRn enzimRca
Consiste en el empleo de enzimas que atacan a la pared celular hidrolizndola.
Permeabilizando la membrana para liberar compuestos intracelulares al medio o rompiendo completamente la clula.
DigesRn enzimRca
A pH< 5 las clulas no se rompen an cuando la pared haya sido destruida por digesBn.
Los costos son muy altos No hay recuperacin de las enzimas empleadas Mayor suscepBbilidad a Gram +
Ejemplos Gram(+): lisozima Gram(-): lisozima + AEDT Levaduras: 1,3-glucanasa, 1,6-glucanasa manasa, quiBnasa
Permeabilizacin con detergentes
Los detergentes Benen una zona hidroQlica y otra hidrofbica, por esta razn pueden interactuar tanto con el agua como con los lpidos. Su habilidad se basa en la solubilizacin de los lpidos de la pared celular
Los detergentes ms uBlizados son de tres Bpos:
Detergente aninico Detergente caBnico Detergente no-inico
Ejemplos Detergentes aninicos :
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Sulfonato de Sodio Tauroclorato de Sodio Colato de sodio
Ejemplos Detergentes caBnicos: Bromuro de CaBltrimeBl Amonio (CTAB)
Ejemplos Detergente no-inicos Triton X-100 Tween Spam
Permeabilizacin con detergentes
A bajas concentraciones no se produce degradacin de lpidos.
A alta concentracin se produce una degradacin que resulta lineal a la concentracin de detergente, junto a esta variable tambin se altera la tensin
superficial de la solucin.
Permeabilizacin con detergentes
Procedimiento: 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de clulas. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de clulas.
2. El detergente rompe la membrana celular.
3. La suspensin resultante se centrifuga para remover los fragmentos de clulas y se pasa por etapas de extraccin para aislar el producto.
Permeabilizacin con detergentes
Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)
Ventajas: Simple y barato Aplicacin a gran escala
Desventajas: Tratamiento fuerte, los lpidos son converBdos en detergentes
No selecBvo Aplica nicamente si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino
Ultrasonificacin
Frecuencias >20 KHz produciendo vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin.
Se producen zonas de baja presin en el lquido El lquido se transforma en gas formndose pequeas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.
Ultrasonificacin
Desventajas:
Produccin de radicales libres Destruccin del producto por las ondas Destruccin del producto por la temperatura
Elevados requerimientos de energa Altos costos
Homogeneizacin
Homogeneizadores: el material biolgico se somete a una fuerte presin
hidrostBca (500 atm) y la presin se libera bruscamente que el lquido salga
por una vlvula.
La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la rupturas. Estos se pueden
obtener por:
1. mbolos 2. Cuchillas 3. Pistones
Congelacin-descongelacin
Formar y deshacer los cristales de hielo
Ventajas: Muy simple de realizar Se realiza a bajas temperaturas
Desventajas: Tiempos largos Algunos microorganismos son resistentes Sensibilidad de las enzimas a congelacin/descongelacin
Molino de perlas
Operacin intermitente: El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinBca de primer orden. El balance de masa liberada puede ser expresado mediante la ecuacin:
Ejemplo 1:
Obtencin y purificacin de la enzima monxido de carbono deshidrogenasa, a parBr de extractos celulares de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM5.
Las bacterias con lisozima se colocaron en un bao mara durante 12 horas a 40C. Posteriormente, se complet el rompimiento celular por sonificacin en un equipo Branson Sonifer (VWR Company), con la siguientes indicaciones:
Output control: 7, Duty cycle: 60, Time: 10 minutos
Posteriormente se solubiliz con el detergente Tritn X-100 debido a que la enzima que se desea obtener estaba ligada a la membrana.
La metodologa uBlizada consisB en agregar a cada 600mL de extracto celular despus de la sonificacion, 200mL de Tritn X-100; se dej homogenizar la solucin. Se dej actuar por una hora y se centrifug a 10000 rpm durante 45 min en una centrifuga refrigerada.
Se tom el sobrenadante y el detergente remanente fue reBrado mediante dilisis.
Ejemplo 2: Ruptura celular de Saccharomyces cerevisiae por medio de mtodos qumicos.
Se basan en el uso de solventes orgnicos y detergentes para acelerar los procesos de autlisis de S. cerevisiae. El sistema se basa en la autlisis celular por medio de una plasmlisis originada por tratamiento de las clulas con solventes orgnicos.
Para seguir la liberacin del contenido intracelular miden la canBdad de la proteasa vacuolar carboxipepBdasa. Y liberada por la clula, requiriendo el proceso un fino control del pH alrededor de 8. Entre los solventes orgnicos destacan los alcoholes de cadena
entre 6 y 9 carbonos de longitud.
Los detergentes con mejores resultados son el Tritn X-100 y N-laurilsarcosina.
Ventajas a nivel industrial: No requiere aparatos especiales Restos celulares fciles de separar por centrifuga Costo de los productos inductores bajo. Desventajas: Dificultad para eliminar compuestos qumicos Riesgo de desnaturalizacin Largos Bempos para lograr la autlisis 20-30h. Aumentan el riesgo de las protenas de inters por
la proteasas presentes.
Ejemplo 3: Ruptura celular de S. cerevisiae por medio de enzimas lBcos combinado con el uso de estabilizadores osmBcos.
Con estos tratamientos se ha logrado la liberacin selecBva de enzimas y protenas localizados en diferentes comparBmientos celulares. El complejo empleado procede de Oerskowia xanthinoly;ca. Se trata de una mezcla de enzimas lBcos con acBvidades en beta-1,3-gluconasa, proteasa, beta-1,6-glucanasa, mananasa y quiBnasa.
Todas actan en forma sinrgica en la degradacin de la pared celular, la acBvidad mananasa que degrada la capa externa de
manano de la pared y la beta-1,3-glucanasa para la degradacin de la capa interna de glucano.
La produccion de estas enzimas obtenida en un fermentados de 2000 litros es suficiente para lisar un fermentador de 100,000 litros de S.
cerevisiae.