Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve
methodes voor tamoxifen zijn actieve
metabolieten en analogen in biologische
matrices
Lien ADRIAENSENS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo
Vakgroep: Klinische biologie,
microbiologie en immunologie
Academiejaar 2012-2013
Ontwikkeling en validatie van kwantitatieve
methodes voor tamoxifen zijn actieve
metabolieten en analogen in biologische
matrices
Lien ADRIAENSENS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo
Vakgroep: Klinische biologie,
microbiologie en immunologie
Academiejaar 2012-2013
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Handtekening student Handtekening promotor
Lien Adriaensens Prof. Dr. Ir. P. Van Eenoo
Woord vooraf
Het tot stand brengen van deze thesis zou niet mogelijk geweest zijn zonder de hulp van vele
mensen en langs deze weg zou ik hen graag willen bedanken.
Op de eerste plaats wil ik Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo bedanken voor de mogelijkheid die hij
mij geboden heeft om dit onderzoek uit te voeren. Tijdens mijn stage in DoCoLab kon ik
steeds bij hem terecht met al mijn vragen en heeft hij heel wat kostbare tijd vrijgemaakt voor
het nalezen en corrigeren van dit werk. Hiervoor wil ik wil hem oprecht bedanken, alsook
voor de aangename samenwerking en alle steun die hij mij gegeven heeft waardoor ik mijn
laatste jaar met succes en met plezier kon voltooien.
Ik zou graag het volledige team van DoCoLab willen bedanken voor hun grote hulp. Zonder
hen had ik dit nooit tot een goed einde kunnen brengen. Bij ieder van hen ben ik wel eens
langs geweest met de vraag ‘Mag ik eens iets vragen?’ en steeds weer kon ik rekenen op hun
bereidwilligheid. De tijd in DoCoLab is voorbij gevlogen en ik ben blij en vereerd dat ik met
dit team heb mogen samenwerken. In het bijzonder wil ik Wim bedanken voor het oneindig
veel geduld en alle wijsheid die hij mij heeft bijgebracht. Hij heeft mij tijdens mijn stage
enorm goed begeleid en er zo voor gezorgd dat alles vlot kon verlopen. Fiona wil ik graag
bedanken voor de extra uitleg en voor het duwtje in de rug dat ik af en toe eens nodig had.
Voor praktische informatie kon ik steeds bij Simone terecht waarvoor ik hem ook oprecht wil
bedanken. Ten slotte wil ik mijn medestudente Leen bedanken voor de leuke momenten.
Dr. Geert Braems, Marleen De Block, Katrien Devalez en Isabel Vlerick wil ik graag
bedanken voor de goede samenwerking.
Uiterst dankbaar ben ik mijn vrienden en familie en in het bijzonder mijn ouders en vriend
voor de financiële en emotionele steun. Ook wanneer het allemaal wat moeilijker ging heb ik
steeds op hun steun kunnen rekenen. Verder dien ik hen ook te bedanken voor het vele
naleeswerk van deze thesis.
Als laatste wil ik mijn medestudenten Liesbeth, Laura, Femke, Jonathan, Fréderique, Jolien en
Aurélie bedanken voor een onvergetelijke studententijd die wij samen hebben beleefd en die
voor veel mooie herinneringen heeft gezorgd.
Inhoudsopgave
Samenvatting .............................................................................................................................. 1
1. Inleiding ................................................................................................................................. 2
1.1 Tamoxifen en borstkanker ................................................................................................ 2
1.2 Detectie van TAM zijn actieve metabolieten ................................................................... 5
1.2.1 Gaschromatograaf (GC) ............................................................................................. 5
1.2.1.1 De injector ........................................................................................................... 6
1.2.1.2 Chromatografische scheiding .............................................................................. 6
1.2.2 Massaspectrometer (MS) ........................................................................................... 7
1.2.2.1 Elektron ionisatie ................................................................................................. 8
1.2.2.2 De quadrupool analysator .................................................................................... 8
1.2.2.3 Triple quadrupool analysator .............................................................................. 9
1.3 Staalvoorbereiding ............................................................................................................ 9
1.3.1 Urinestalen ................................................................................................................. 9
1.3.1.1 Hydrolyse ............................................................................................................ 9
1.3.1.2 Extractie ............................................................................................................ 10
1.3.1.3 Derivatisatie ...................................................................................................... 10
1.3.2 Plasmastalen ............................................................................................................. 10
1.3.2.1 Extractie ............................................................................................................ 10
1.3.2.2 Derivatisatie ...................................................................................................... 10
1.4 Methodevalidatie ............................................................................................................ 11
1.4.1 De lineariteit ............................................................................................................. 11
1.4.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid......................................................................... 12
1.4.3 De juistheid en precisie ............................................................................................ 12
1.4.4 De specificiteit en de selectiviteit ............................................................................ 13
1.4.5 Het rendement .......................................................................................................... 14
1.4.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 14
1.5 Probleemstelling ............................................................................................................. 14
2. Materialen en methode ......................................................................................................... 15
2.1 Producten en reagentia .................................................................................................... 15
2.2 Bereidingen ..................................................................................................................... 16
2.2.1 Metabolietenoplossingen ......................................................................................... 16
2.2.2 ISTD-oplossingen .................................................................................................... 16
2.2.3 Buffers ...................................................................................................................... 17
2.2.4 Derivatisatiemengsel ................................................................................................ 17
2.2.5 SPE-oplossingen ...................................................................................................... 17
2.3 Instrumentatie ................................................................................................................. 18
2.4 Staalvoorbereiding .......................................................................................................... 19
2.4.1 Protocol urine ........................................................................................................... 19
2.4.2 Protocol plasma ........................................................................................................ 20
2.5 Validatieprotocol ............................................................................................................ 21
2.5.1 Lineariteit ................................................................................................................. 21
2.5.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid......................................................................... 22
2.5.3 Juistheid en precisie ................................................................................................. 22
2.5.4 Selectiviteit en specificiteit ...................................................................................... 23
2.5.5 Rendement ............................................................................................................... 23
2.5.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 24
3. Resultaten en bespreking ...................................................................................................... 25
3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 25
3.1.1 Full scan ................................................................................................................... 25
3.1.2 Product Ion scan ....................................................................................................... 27
3.1.3 MRM ........................................................................................................................ 27
3.2 Methodevalidatie ............................................................................................................ 28
3.2.1 Lineariteit ................................................................................................................. 28
3.2.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid......................................................................... 29
3.2.3 Juistheid en precisie ................................................................................................. 30
3.2.4 Selectiviteit en specificiteit ...................................................................................... 31
3.2.5 Rendement ............................................................................................................... 31
3.2.6 Stabiliteit .................................................................................................................. 32
3.3 Analyse patiëntenstalen .................................................................................................. 36
3.3.1 Patiënten ................................................................................................................... 36
3.3.2 Analyse urinestalen .................................................................................................. 37
3.3.3 Analyse plasmastalen ............................................................................................... 44
4. Besluit ................................................................................................................................... 47
5. Referenties ............................................................................................................................ 48
Afkortingenlijst
4-OH-3-Me-TAM 4-hydroxy-3-methoxy tamoxifen
4-OH-TAM 4-hydroxy-tamoxifen
CYP Cytochroom P450
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
EM Extensive Metabolizer
ER Oestrogeen Receptor
FDA Food and Drug Administration
GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry
IM Intermediate Metabolizer
ISTD Inwendige standaard
KT Kamertemperatuur
LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry
LLE Liquid-Liquid Extraction
LLOD Lower Limit Of Detection
LLOQ Lower Limit Of Quantification
MG Moleculair Gewicht
MRM Multipe Reaction Monitoring
MSTFA N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide
PM Poor Metabolizer
PTV Programmed Temperature Vaporisation
QC1 Kwaliteitscontrole 1
QC2 Kwaliteitscontrole 2
RSD Relatieve standaardafwijking
S/N Signaal/Ruis
SCAN Full Scan
SD Standaardafwijking
SIM Selected Ion Monitoring
SPE Solid-Phase-Extraction
SSRI Selective Serotonin Reuptake Inhibitor
TAM Tamoxifen
TMS Ttrimethylsilyl
UM Ultrarapid Metabolizer
1
Samenvatting
Tamoxifen (TAM) wordt wereldwijd gebruikt voor de endocriene behandeling van
borstkanker. In de lever wordt TAM gemetaboliseerd door fase I enzymen tot zijn actieve
metabolieten, waarvan endoxifen therapeutisch het meest relevant is. Interindividuele
verschillen in de metabolisatie van tamoxifen kunnen lagere plasmaconcentraties van
endoxifen veroorzaken en bijgevolg ook een verschil in therapeutisch effect.
In deze studie werd gebruik gemaakt van een gaschromatograaf gekoppeld aan een
massaspectrometer (GC-MS) om de concentraties van endoxifen, 4-hydroxy-tamoxifen (4-
OH-TAM) en 4-hydroxy-3-methoxy-tamoxifen (4-OH-3-Me-TAM) te bepalen in urine en in
plasma. Na een eenvoudige staalvoorbereiding werd een extract gescheiden in zijn individuele
substanties door middel van GC. Moleculen werden geïoniseerd door middel van elektron
ionisatie. Een triple quadrupool werd gebruikt voor de analyse. Ondanks het feit dat urine
onderhevig is aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie en de hiermee verbonden
hoeveelheid uitgescheiden urine, koos men er toch voor om concentratiebepalingen ook in
urine uit te voeren gezien afname van urine minder invasief is dan afname van plasma.
Borstkankerpatiënten die therapeutisch in behandeling waren met TAM werden verzameld in
samenwerking met professor Braems, na goedkeuring van het ethisch comité.
Zowel de methode in urine als de methode in plasma werd volledig gevalideerd. Ondanks een
geslaagde validatie was enkel de methode in urine ‘gevoelig’ genoeg om concentraties van de
metabolieten op een betrouwbare manier te bepalen. Verder onderzoek is noodzakelijk om de
methode in plasma te optimaliseren.
In alle urinestalen van de deelnemende patiënten werd een consistente schommeling
teruggevonden over de verschillende tijdstippen van de urineafname. Verhoudingen van
endoxifen op 4-OH-TAM bleken minder uitgesproken dan verhoudingen teruggevonden in
plasma. Dit zou verklaard kunnen worden door een verschil in fase II metabolisatie tussen
beide metabolieten. Bij vier patiënten werd er een verhouding gevonden kleiner dan 1. De
verklaring kan men opnieuw vinden bij factoren die de eliminatie beïnvloeden, maar
opmerkelijk waren patiënt 3 en patiënt 5 in behandeling met dezelfde selective serotonin
reuptake inhibitor (SSRI), escitalopram. Deze medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd
door CYP3A4. Dit kan inhibitie van CYP3A4 tot gevolg hebben en lagere concentraties van
endoxifen veroorzaken. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine
groep patiënten in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van
escitalopram en TAM noodzakelijk.
2
1. Inleiding
1.1 Tamoxifen en borstkanker
Borstkanker is een ernstig gezondheidsprobleem met een wereldwijd leeftijds-
gestandaardiseerd incidentiecijfer van 37.4/100000. Huidige therapieën tegen borstkanker
evolueren snel maar drugresistentie en toxiciteit vormen een grote beperking. Het observeren
van interetnische en interindividuele verschillen tussen patiënten kan mogelijke verklaringen
opleveren. Men spreekt van de studie van de farmacogenetica (1).
Hormonale therapie, chemotherapie en doelgerichte therapie vormen de drie belangrijkste
behandelingsmogelijkheden bij borstkanker (1). De oestrogeenreceptor (ER) α is bij 75% van
de patiënten aanwezig en is een belangrijke prognostische factor en een determinant in het
verloop van de behandeling. ER-positieve borsttumoren vertonen over het algemeen een
betere prognose. In deze gevallen is endocriene behandeling mogelijk (2). Tamoxifen (TAM)
is een selectieve oestrogeenreceptormodulator en wordt de laatste 25 jaar wereldwijd gebruikt
voor de endocriene behandeling van borstkanker (3,5). Tamoxifen is een niet-steroïdaal
geneesmiddel met een trifenylethyleenstructuur (figuur 1). Het vertoont ter hoogte van
verschillende weefsels een complex spectrum van farmacologische aspecten, steunend op
zowel oestrogeenantagonisme als oestrogeenagonisme (6). Bij borstkankerpatiënten werkt het
ter hoogte van de tumor voornamelijk als anti-oestrogeen, waarbij het de binding van
oestrogeen op de receptor verhindert (6,7).
Het geneesmiddel wordt gemetaboliseerd door het cytochroom P450 (CYP), een
enzymsysteem ter hoogte van de lever (1,3-20,31). Tamoxifen ondergaat hierbij sterke fase I
en fase II metabolisatie waarbij verschillende metabolieten gevormd worden. 4-hydroxy
tamoxifen (4-OH-TAM) en 4-hydroxy-N-desmethyl tamoxifen (endoxifen) zijn therapeutisch
de meest relevante fase I metabolieten (figuur 1). Dit wegens de hoge affiniteit voor de
oestrogeenreceptor. Gezien de steady state plasmaconcentratie van endoxifen vijf- tot
tienmaal hoger ligt dan van 4-OH-TAM wordt dit gezien als de belangrijkste metaboliet
(4,7,9,10,13,18-20).
3
Bij metabolisatie van TAM tot zijn actieve metabolieten 4-OH-TAM en endoxifen spelen
verschillende CYP enzymen een rol, onder andere CYP2D6 (1,3-5,7,9-11,13,18-20).
Inactivatie van de metabolieten gebeurt door sulfatatie of glucuronisatie, wat wordt
bewerkstelligd door fase II enzymen (1,11,18).
Figuur 1: de metabolisatie van tamoxifen (3).
Interindividuele verschillen in de metabolisatie van tamoxifen kunnen de oorzaak zijn voor
het verschil in therapeutisch effect (1,3-6,8-20). Er zijn al meer dan 80 genetische variaties
beschreven van CYP2D6 waarvan velen geassocieerd worden met afgenomen of toegenomen
activiteit van het enzym (1,18). Deze varianten uiten zich in verschillende fenotypen. Poor
metabolizers (PM) hebben een sterk verlaagde metabole capaciteit ten gevolge van een
mutatie. Intermediate metabolizers (IM) hebben een verlaagde metabole capaciteit,
gewoonlijk ten gevolge van een mutatie in één allel. Extensive metabolizers (EM) hebben 2
functionele allelen en hebben dus een normale metabole capaciteit. Ultrarapid metabolizers
(UM) vertonen een verhoogde metabole capaciteit veroorzaakt door genduplicatie (1,4,5,18-
20). Men ziet hierbij belangrijke interetnische verschillen. Zo vindt men PM voornamelijk
terug in Europa, IM in Azië en UM het meest in Noord-Afrika en Oceanië (figuur 2) (8).
4
Figuur 2: globale distributie van CYP2D6 fenotype (8).
Steady state plasma concentraties van endoxifen liggen lager bij fenotypes met een
gereduceerde metabole activiteit van CYP2D6 wat een mogelijke impact heeft op de klinische
respons bij behandeling met tamoxifen (9,10,18). Verschillende publicaties rapporteerden een
slechtere klinische uitkomst met verminderde relapse-free en disease-free survival bij PM en
IM in vergelijking met EM (5,19,20).
Genetische polymorfismen ter hoogte van CYP2D6 zijn niet de enige mutaties die invloed
kunnen hebben op de klinische uitkomst bij behandeling met tamoxifen. Zo kunnen enzymen
verantwoordelijk voor eliminatie en inactivatie van tamoxifen en zijn metabolieten,
belangrijke genetische variaties vertonen (1,18). Ook genetische mutaties in de tamoxifen
transporter kunnen invloed hebben op de therapeutische werking (11,18).
Verder wordt het concomitant gebruik van selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI)
antidepressiva geassocieerd met een verminderde klinische uitkomst. SSRI’s worden ook
gemetaboliseerd door het CYP2D6 enzym en remmen bijgevolg de metabolisatie van
gelijktijdig toegediende geneesmiddelen die door CYP2D6 worden gemetaboliseerd. Dit kan
leiden tot verlaagde plasmaconcentraties van endoxifen (3,4,6,9,18,19).
5
De ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve methode voor de bepaling van tamoxifen
zijn actieve metabolieten in biologische matrices is van groot belang om een mogelijke
verklaring te kunnen bieden voor de beperkingen van de therapie. Een gepersonaliseerde dosis
van de medicatie zou hier een oplossing kunnen schenken (12). Zo leidt volgens Irvin WJ et
al. een verhoogde dosis tamoxifen bij PM en IM tot een hogere plasma concentratie van
endoxifen wat tot een betere klinische uitkomst kan leiden (10).
Verschillende publicaties hebben tot nu toe verslag uitgebracht over een kwantitatieve
methode voor de determinatie van tamoxifen en zijn fase I metabolieten (12-17). Het aantal en
variëteit van de gebruikte metabolieten is echter gelimiteerd, en slechts een beperkt aantal van
deze essays zijn volledig gevalideerd. Gevalideerde kwantitatieve bio-analytische studies voor
determinatie van fase I metabolieten van tamoxifen in biologische matrices, zijn dus van
hoogst klinisch belang (12).
1.2 Detectie van TAM zijn actieve metabolieten
1.2.1 Gaschromatograaf (GC)
Gaschromatografie is specifiek voorbehouden aan vluchtige verbindingen of verbindingen die
vluchtig te maken zijn d.m.v. temperatuursverhoging. Verbindingen met een moleculaire
massa tot 800 komen hiervoor in aanmerking (21).
Lopend in de stroomrichting van de mobiele fase, het draaggas bij de GC, kunnen volgende
onderdelen aangetroffen worden (figuur 3) (21):
- Het injectiesysteem waar het monster wordt ingebracht.
- De kolom hangend in een oven waar scheiding van het monster plaats vindt.
- De detector, in dit geval de massaspectrometer.
- Een computer voor de signaalregistratie en -analyse.
6
Figuur 3: schema van de gaschromatograaf (21).
1.2.1.1 De injector
In de ‘Programmed Temperature Vaporisation’ (PTV) injector wordt de temperatuur in de
liner gereguleerd via een temperatuurprogramma. Op deze manier kunnen er grotere volumes
geïnjecteerd worden. Het solvent heeft het laagste kookpunt en zal dus als eerste verdampen
en de liner verlaten (21).
1.2.1.2 Chromatografische scheiding
Een chromatisch systeem bestaat uit twee niet mengbare fasen. De mobiele fase beweegt
langs de stilstaande fase, de stationaire fase. Componenten in het monster worden gescheiden
wanneer ze zich verschillend over de mobiele en stationaire fase verdelen. Een component die
langer in de stationaire fase verblijft, wordt minder snel getransporteerd en zal pas later de
uitgang van de kolom bereiken (21).
7
1.2.2 Massaspectrometer (MS)
Massaspectrometrie is een analysemethode gebaseerd op het scheiden van ionen naar hun
massa/lading verhouding (m/z). In een GC-MS systeem zullen dampmoleculen van neutrale
organische componenten die de kolom verlaten, al dan niet via een interface naar een
ionenbron worden geleid (figuur 4). D.m.v. een ionisatieproces, vacuüm of onder lage druk,
worden de dampmoleculen omgezet in ionen. In de analysator worden de ionen gescheiden
naar hun massa/lading verhouding. Na scheiding worden de deeltjes met behulp van een
elektron-multiplier gedetecteerd. De versterkte detectorsignalen worden omgezet in
massawaarden met een bijbehorende intensiteit (21).
GC-MS heeft zich ontwikkeld tot een bedrijfszekere betrouwbare analysetechniek met veel
toepassingsmogelijkheden, zowel op het gebied van structuuranalyse als kwantitatieve
detectietechniek op basis van de moleculaire massa en/of specifieke fragmenten van het
molecuul (21).
Figuur 4: schematische voorstelling van een GC-MS opstelling (21).
8
1.2.2.1 Elektron ionisatie
Bij elektron ionisatie bevindt zich een gloeidraad die elektronen emitteert. Deze elektronen
worden de ionisatiekamer ingestuurd en door de collectorplaat weer opgevangen. In deze
ruimte wordt ook damp van het monster gebracht. Het elektronenbombardement zorgt ervoor
dat er geïoniseerde fragmenten ontstaan. Bovendien treedt er ook fragmentatie op. Vervolgens
worden de positief geladen fragmenten gecollecteerd en doorgestuurd naar de analysator (21).
1.2.2.2 De quadrupool analysator
De quadrupool analysator bestaat uit vier evenwijdig geplaatste cilindrische of hyperbolische
staven die in een vierkant zijn opgesteld (figuur 5). Tegenoverliggende staven zijn elektrisch
met elkaar verbonden. Elk paar staven wordt gevoed met een gelijkspanningscomponent VDC
en een radiofrequente wisselspanningscomponent VRF.cosϖt, waarbij ϖ = 2πf (f=
radiofrequentie wisselspanning). Ionen worden gescheiden naar hun m/z waarden op basis
van de elektrische velden binnen de quadrupool. Ionen met een welbepaalde massa zullen,
afhankelijk van de VRF en VCD, in een stabiel oscillerende beweging getransporteerd worden
naar de detector. Alle andere ionen zullen door instabiele oscillaties neerslaan op de staven
van de quadrupool en daar worden ontladen (21).
Figuur 5: de quadrupool analysator (21).
9
1.2.2.3 Triple quadrupool analysator
Hier wordt er gebruik gemaakt van 3 quadrupolen Q1 Q2 en Q3. Q2 wordt ook de collisiecel
genoemd en dient voor de fragmentatie van ionen terwijl Q1 en Q3 dienen voor de scheiding
van ionen op basis van m/z (22).
In Full scan (SCAN) wordt het volledige massaspectrum gescand. Selected Ion Monitoring
(SIM) daarentegen wordt gebruikt om slechts een deel van het massaspectrum te scannen,
meestal een beperkt aantal massa-units. Wanneer Q1 in SCAN staat worden Q2 en Q3 niet
gebruikt en wordt er een full scan massaspectrum opgenomen. Men spreekt van Product Ion
Monitoring wanneer Q1 in SIM staat en Q3 in SCAN en van Multiple Reaction Monitoring
(MRM) wanneer zowel Q1 als Q3 in SIM staan (23).
1.3 Staalvoorbereiding
Concentratiebepalingen werden uitgevoerd in urine en in plasma. De afname van urine is
minder invasief ten opzichte van de afname van bloed. Concentratiebepalingen in plasma
daarentegen zijn klinisch meer correct gezien deze niet onderhevig zijn aan effecten
veroorzaakt door (de)hydratatie en de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine
(24).
1.3.1 Urinestalen
Voor er werd overgegaan tot de analyse van urinestalen werden eerst drie voorbereidende
stappen uitgevoerd.
1.3.1.1 Hydrolyse
Metabolieten van tamoxifen kunnen voorkomen in hun vrije of geglucuronideerde vorm. In
urine vinden we voornamelijk de geglucuronideerde vorm terug. Om de totale hoeveelheid te
meten werd het geglucuronideerd deel eerst vrijgesteld door middel van enzymatische
hydrolyse met β-glucuronidase (12).
10
1.3.1.2 Extractie
Wanneer men de metabolieten wil identificeren met behulp van een massaspectrometer
kunnen endogene componenten in urine aanleiding geven tot ionsuppressie, wat de
gevoeligheid, de precisie en de accuraatheid van de MS in het gedrang brengt. Daarom wordt
er preanalytisch een extractie uitgevoerd (12-17).
In deze studie werd voor de extractie uit urine een Liquid-Liquid Extraction (LLE)
uitgevoerd. Deze techniek steunt op de verschillen in relatieve oplosbaarheid van
verschillende componenten in twee niet-mengbare oplossingen. In dit geval urine en een
organisch solvent (25).
1.3.1.3 Derivatisatie
Gezien er gewerkt werd met GC was een bijkomende derivatisatiestap nodig om de te
analyseren componenten vluchtig te maken (12,17).
1.3.2 Plasmastalen
Vooraf aan de analyse van plasmastalen werden twee voorbereidende stappen uitgevoerd.
1.3.2.1 Extractie
Voor de extractie uit plasma werd gebruik gemaakt van Solid-Phase Extraction (SPE). Hierbij
worden stoffen gescheiden op basis van verschillen in affiniteit voor de mobiele fase en de
stationaire fase. Retentie treedt op als gevolg van interactie tussen de polaire groepen van de
analyt en de polaire groepen van de stationaire fase (26).
1.3.2.2 Derivatisatie
Een derivatisatiestap werd uitgevoerd om de componenten vluchtig te maken (12,17).
11
1.4 Methodevalidatie
Om na te gaan of een methode voldoet aan vooropgestelde eisen en dus voldoende
betrouwbaar is om een vooropgesteld doel te verwezenlijken wordt een methodevalidatie
uitgevoerd. Er werd een volledige validatie uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Food and
Drug Administration (FDA) (27).
Volgende parameters werden geëvalueerd:
1.4.1 De lineariteit
De calibratiecurve geeft de relatie weer tussen de respons van de meetmethode en de gekende
concentratie van de analyt. Deze wordt opgesteld ter controle van de lineariteit. De
calibratiecurve bestaat uit zes tot acht stalen gespreid over het verwachte lineaire bereik van
de meetmethode, inclusief de Lower Limit Of Quantification (LLOQ) (28).
De calibratiecurve wordt opgesteld door negatieve urine aan te rijken met de analyten en de
inwendige standaard (ISTD). De calibratielijn volgt de wiskundige functie y=ax+b. Hierbij is
x de verhouding tussen de theoretische concentratie van de analyt en de theoretische
concentratie van de ISTD, en y de verhouding tussen het piekoppervlak van de analyt en het
piekoppervlak van de ISTD. De lineariteit kan uitgedrukt worden door middel van de
correlatiecoëfficiënt (R²), deze moet groter zijn dan 0,98 (Waarde vooropgesteld DoCoLab).
Dit is op zich geen goede parameter gezien deze enkel uitdrukt in hoeverre de variatie in y
uitgedrukt kan worden door de variatie in x. De goodness of fit factor (g) geeft een meer
correcte evaluatie van de lineariteit. Wanneer de meerderheid van de calibratoren groter is dan
10 ng/ml moet de g-factor kleiner zijn dan 10% (28).
(28)
12
1.4.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid
De LLOQ of de bepaalbaarheidsgrens is de laagste concentratie van de analyt die
gedetecteerd kan worden met aanvaardbare precisie en juistheid. Dit punt vormt het laagste
punt van de calibratiecurve (28).
De Lower Limit Of Detection (LLOD) of de aantoonbaarheidsgrens is de laagste concentratie
verschillend van nul die een significant signaal geeft, duidelijk verschillend van het signaal
verkregen van een blanco staal. De signaal/ruis (S/N) verhouding dient hierbij groter dan drie
te zijn. Criteria van precisie en juistheid dienen hier niet te worden voldaan (28).
1.4.3 De juistheid en precisie
De juistheid is de overeenstemming tussen het gemiddelde van een groot aantal gemeten
waarden en de ware waarde. De systematische afwijking (bias of onjuistheid) wordt gebruikt
als maat voor de juistheid (28).
(28)
De (on)juistheid wordt bepaald door minimum 5 bepalingen per concentratie. De gemiddelde
waarde mag niet meer dan 15% van de werkelijke waarde liggen, met uitzondering van de
LLOQ die maximum 20% van de werkelijke waarde mag verschillen (27,28).
De precisie is de mate van overeenstemming tussen onafhankelijke resultaten. De precisie
wordt uitgedrukt als de relatieve standaardafwijking (imprecisie) (28).
Standaardafwijking (SD):
(28)
13
Relatieve standaardafwijking (RSD):
(28)
Bij precisie onderscheidt men herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. De herhaalbaarheid is
de mate van overeenstemming tussen opeenvolgende resultaten die verkregen worden onder
identieke omstandigheden. De herhaalbaarheid mag niet meer zijn dan 2/3 RSDMAX. RSDMAX
wordt berekend aan de hand van de Horwitz vergelijking waarin de concentratie (C) wordt
uitgedrukt in g/ml. De RSD wordt berekend door minimaal 5 bepalingen per concentratie
(28).
(28)
De reproduceerbaarheid is de mate van overeenstemming tussen resultaten die worden
verkregen door gebruik van dezelfde methode maar uitgevoerd onder verschillende
omstandigheden. De reproduceerbaarheid mag niet meer zijn dan RSDMAX (28).
1.4.4 De specificiteit en de selectiviteit
De specificiteit is de eigenschap van een methode om enkel en alleen de analyt te meten (28).
Een methode is selectief wanneer deze het onderscheid kan maken tussen de analyt en de
achtergrond/interferenties. Het retentiegedrag van andere componenten, behorend tot dezelfde
klasse van stoffen als de analyt, moet hiervoor worden nagegaan (28).
Deze factoren kunnen gecontroleerd worden door analyse van blancostalen en stalen
aangerijkt met eventueel interfererende componenten (27,28).
14
1.4.5 Het rendement
Het rendement is de fractie van een analyt dat aan een staal wordt toegevoegd die effectief
gemeten wordt. Hierbij wordt de detectorrespons, verkregen door een hoeveelheid van de
analyt toe te voegen en te extraheren uit een biologische matrix, vergeleken met de
detectorrespons verkregen na analyse van het staal wanneer de analyt pas na extractie wordt
toegevoegd (28).
1.4.6 Stabiliteit
De stabiliteit van het geneesmiddel in een biologische vloeistof is afhankelijk van de
temperatuur, de chemische eigenschappen van de stof, de matrix en het opslagsysteem.
Stabiliteitsprocedures moeten geëvalueerd worden na korte of lange opslagprocedures (27).
1.5 Probleemstelling
Het verschil in de metabolisatie van tamoxifen kan een invloed hebben op de klinische
uitkomst bij borstkankerpatiënten. Er is al reeds veel onderzoek gevoerd omtrent dit
onderwerp maar tot op heden is er nog steeds nood aan nieuwe inzichten. In deze studie zal
getracht worden een kwantitatieve, volledig gevalideerde GC-MS methode te ontwikkelen
voor een beperkt aantal fase I metabolieten van tamoxifen. De concentratie van 4-OH-TAM,
4-hydroxy-3-methoxy tamoxifen (4-OH-3-Me-TAM) en endoxifen zal bepaald worden in
urine en in plasma.
Het finale doel zal een kwantitatieve bepaling zijn in urine en plasma van
borstkankerpatiënten die medicamenteus behandeld worden met tamoxifen. Stalen zullen
worden aangevraagd via het ethisch comité in samenwerking met professor Braems,
gynaecoloog en staflid aan de Vrouwenkliniek, UZ Gent.
Op deze manier kunnen eventuele interindividuele verschillen in de metabolisatie van
tamoxifen gevisualiseerd worden door belangrijke verschillen in steady state
plasmaconcentraties. Vermits de donatie van urine minder invasief is, zal ook in urine
onderzocht worden of er bepaalde waarnemingen kunnen gedaan worden.
15
2. Materialen en methode
2.1 Producten en reagentia
4-OH-TAM, 4-OH-3-Me-TAM en de gedeutereerde ISTD’en 4-OH-TAM-d5 en endoxifen-
d5 werden verkregen via Toronto Research Chemicals (North York, Canada) en endoxifen via
Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
De urinestalen voor de methode ontwikkeling en validatie waren afkomstig van eigen
productie. Plasmastalen voor de methode ontwikkeling en validatie waren afkomstig van het
Rode Kruis Oost-Vlaanderen (Gent).
Na goedkeuring van het ethisch comité (EC 2012/869) werden bloed- en urinestalen van
borstkankerpatiënten verkregen op de afdeling gynaecologie van het UZ Gent via Dr. G.
Braems. Deze patiënten werden medicamenteus behandeld met TAM (Nolvadex, 1
tablet/dag). Rekening houdend met de instelling van de steady state concentratie werd
verwacht dat de patiënten reeds 8 weken (of langer) in behandeling waren (7). Bloedstalen
werden afgenomen in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bloedbuizen. Bloedstalen
werden gecollecteerd voor inname van de medicatie en vervolgens één en twee uur na
inname. Urinestalen werden gecollecteerd voor inname van de medicatie en vervolgens één,
twee, vier en acht uur na inname.
Patiënten werden gevraagd de geboortedatum, het geslacht, de start van het gebruik van TAM
en de inname van eventueel andere geneesmiddelen te vermelden.
Diethylether, ammonium formaat, methanol en natrium waterstofcarbonaat werden verkregen
via Fisher Scientific (Loughborough, United Kingdom). Waterstofchloride, natriumsulfaat,
ammoniakoplossing 25%, dinatriumwaterstoffosfaat-dihydraat, natriumdiwaterstoffosfaat
monohydraat, fosforzuur, kaliumcarbonaat en natriumhydroxide werden verkregen via Merck
(Darmstadt, Duitsland). Ammoniumjodide en ethaanthiol waren afkomstig van Sigma Aldrich
(St. Louis, USA). N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) was afkomstig
van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland). Acetonitril was afkomstig van Biosolve BV
(Valkenswaard, Nederland). Ten slotte werd β-glucuronidase (E. coli) verkregen via Roche
(Mannheim, Duitsland).
16
SPE werd uitgevoerd met behulp van een Oasis MCX 3cc (60mg) extraction cartridge van
Waters Corporation (Massachusetts, USA).
2.2 Bereidingen
2.2.1 Metabolietenoplossingen
De stockoplossing van endoxifen hydrochloride hydraat werd aangemaakt door 5 mg
endoxifen hydrochloride hydraat op te lossen in methanol en aan te lengen tot 50 ml
(concentratie endoxifen hydrochloride hydraat: 100 µg/ml; concentratie endoxifen: 91,11
µg/ml). De stockoplossing werd 10, 100 en 1000 maal verdund.
De stockoplossing van 4-OH-TAM werd aangemaakt door 1 mg 4-OH-TAM op te lossen in
methanol en aan te lengen tot 10 ml (concentratie 100 µg/ml). De stockoplossing werd 10,
100 en 1000 maal verdund.
De stockoplossing 4-OH-3-Me-TAM werd aangemaakt door 1,04 mg 4-OH-3-Me-TAM op te
lossen in methanol en aan te lengen tot 10 ml (concentratie 104 µg/ml). De stockoplossing
werd 10, 100 en 1000 maal verdund.
Aan de hand van het concentratiebereik werd de samengestelde werkoplossing aangemaakt
door 1,1 ml endoxifen hydrochloride hydraat (10 µg/ml), 0,5 ml 4-OH-TAM (10 µg/ml) en
4,81 ml 4-OH-3-Me-TAM (10,4 µg/ml) samen te voegen en aan te lengen met methanol tot
10 ml. De concentratie van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM bedragen
respectievelijk 1 µg/ml, 0,5 µg/ml en 5 µg/ml. Deze werkoplossing werd nog 10 maal
verdund.
2.2.2 ISTD-oplossingen
De stockoplossing van endoxifen-d5 werd aangemaakt door 1 mg endoxifen-d5 op te lossen
in 10 ml methanol (concentratie 100 µg/ml) en de stockoplossing van 4-OH-TAM-d5 werd
aangemaakt door 2,5 mg 4-OH-TAM-d5 op te lossen in 25 ml methanol.
17
De samengestelde werkoplossing werd aangemaakt door 1 ml van de stockoplossing van
endoxifen-d5 en 1 ml van de stockoplossing van 4-OH-TAM-d5 samen te voegen en aan te
lengen met methanol tot 25 ml. De concentratie van endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5 bedroeg
voor beiden 4 µg/ml.
2.2.3 Buffers
De fosfaatbuffer (0,1M; pH=7) werd aangemaakt door 140 g dinatriumwaterstoffosfaat
dihydraat en 28 g natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat af te wegen en op te lossen in 2000
ml aqua bidest. Nadien werd de buffer bijgesteld met fosforzuur.
De carbonaatbuffer (pH=9,5) werd aangemaakt door 135 g kaliumcarbonaat en 111 g natrium
watersctofcarbonaat af te wegen en op te lossen in 900 ml aqua bidest. Vervolgens werd de
pH bijgesteld met natriumhydroxide (6M) of waterstofchloride (1M).
2.2.4 Derivatisatiemengsel
De stockoplossing van het trimethylsilyl (TMS)- derivatisatiemengsel (REA 19) werd
aangemaakt door 200 mg ammoniumjodide af te wegen en op te lossen in 10 ml MSTFA.
Vervolgens werd 400 µl ethaanthiol toegevoegd. Voor de werkoplossing werd 3 ml
stockoplossing overgebracht in een recipiënt en aangelengd met MSTFA tot 10 ml.
ANAL-60 derivatisatiemengsel werd aangemaakt door 5 ml van de REA 19 werkoplossing, 5
ml MSTFA en 2 ml acetonitril samen te voegen.
2.2.5 SPE-oplossingen
HCl oplossing (0,1M) werd aangemaakt door 10 ml HCl (1M) op te lossen in 100 ml aqua
bidest.
5% ammoniakoplossing in methanol werd aangemaakt door 5 ml ammoniakoplossing aan te
lengen met methanol tot 100 ml.
18
2.3 Instrumentatie
Voor het indampen van de stalen werd gebruik gemaakt van de Reacti-Vap III van Pierce
(Rockford, USA) en de TurboVap LV van Caliper (Massachusetts, USA). Om de stalen te
vortexen werd gebruik gemaakt van Techmatic TM1 van Merck Belgolabo (Overijse, België).
Tijdens hydrolyse werden urinestalen gerold op de RM 5 rollers van CAT (Staufen,
Duitsland). Bloedstalen werden gecentrifugeerd in een C412 centrifuge van Jouan (Nantes,
Frankrijk).
Voor de analyse van de stalen werd een GC-MS opstelling gebruikt die bestaat uit een Agilent
7000 MS gekoppeld aan een Agilent 6890 GC van Agilent Technologies (Palo Alto, USA). Er
werd een capillaire kolom (fused silica) gebruikt: 15 m HP1MS kolom van J&W Scientific
(Folsom, USA) met een inwendige diameter van 0,32 mm en een filmdikte van 0,25 µm. De
stationaire fase van de kolom bestaat uit cross-linked dimethylsilicone. Helium werd gekozen
als draaggas met een constante flow van 2 ml/min. Het collisiegas in de collisiecel van de MS
was stikstofgas.
Het geïnjecteerd volume was 6 µl en werd via de PTV injector van Gerstel ( Mülheim en der
Ruhr, Duitsland) in solvent vent modus opgespoten. Om injectie van zo’n groot volume toe te
laten werd gebruik gemaakt van een ‘baffled liner’. Het temperatuurprogramma voor de PTV
was initieel 80°C (0,03 min), 12°C/s 310°C (1 min), 12°C/s 380°C (4min).
Het temperatuurprogramma van de oven werd geoptimaliseerd, vertrekkend vanaf de methode
zoals beschreven in P. Van Eenoo et al. (30). De initiële temperatuur was 120°C (0 min),
50°C/min 220°C (0 min), 25°C/min 270°C (0 min), 70°C/min 320°C (1 min). De
bron werd gehouden op 280°C en de transferline op 300°C. De totale run time was 5,6 min.
Bij een full scan massaspectrum werd er gescand van de m/z waarden 50 tot 800 met een
scantijd van 350 ms en stappen van 1 amu. Als MS resolutie werd steeds de voorkeur gegeven
aan ‘widest’. Bij een product Ion scan werd er gescand van een m/z waarde van 40 tot een m/z
van het precursorion + 5.
Analyse werd uitgevoerd met Masshunter Workstation software. Verdere verwerking van de
resultaten gebeurde met Excel.
19
Tabel I illustreert de transities gevolgd voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3Me-TAM,
endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5.
Tabel I: transities gevolgd voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3Me-TAM, endoxifen-d5 en 4-OH-TAM-d5.
Analyt Precursor Ion Product Ion Collisie Energie (V)
Endoxifen 460 369 10
460 294 10
460 279 20
460 179 30
4-OH-TAM 459 72 10
459 58 20
4-OH-3-Me-TAM 489 72 5
489 58 15
Endoxifen-d5 465 447 10
465 387 10
465 298 10
4-OH-TAM-d5 464 72 10
464 58 10
2.4 Staalvoorbereiding
Aan elke batch stalen werd steeds een systeem blanco (water), een blanco (negatieve urine- of
plasmastaal) en twee positieve kwaliteitscontroles (QC1 en QC2) toegevoegd. QC1 en QC2
werden aangerijkt op niveau 2 en 6 (tabel II en III) met alle componenten en met 25 µl van de
samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en. Na indampen van QC1 en QC2
onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C werd er negatieve urine/plasma toegevoegd waarna al
deze stalen voorbereid werden volgens standaard protocol (zie 2.4.1 protocol urine en 2.4.2
protocol plasma).
2.4.1 Protocol urine
Het gebruikte protocol werd gebaseerd op een bestaande methode: SOP ANAL-60 D.
25 µl van de samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en (4µg/ml) werd
ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C. Vervolgens werd 1 ml urine toegevoegd.
Voor de hydrolysestap werd aan elk staal 1 ml fosfaatbuffer (0,1M) pH = 7 en 50 µl β-
20
glucuronidase toegevoegd waarna de buizen werden dichtgedraaid en de stalen voor 90
minuten in de oven werden geplaatst bij 56 +/- 5°C.
Voor de extractiestap werd 250 µl carbonaatbuffer (pH = 9,5) en 5 ml diethylether
toegevoegd nadat de stalen waren afgekoeld tot kamertemperatuur. De buizen werden
dichtgedraaid en 20 minuten gerold. Vervolgens werd de organische fase afgenomen en
overgebracht in een nieuwe buis. De organische fase werd gedroogd met 100 mg
natriumsulfaat en vervolgens ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C.
De stalen werden gederivatiseerd door 100 µl van het ANAL-60 derivatisatiemengsel toe te
voegen en nadien te vortexen. Uiteindelijk werden de stalen overgebracht in een vial waarna
analyse volgde met GC-MS.
De dichtheid van urine werd bepaald met een refractometer UG-1van Atago (Tokyo, Japan).
Vervolgens werden de concentraties van de metabolieten gemeten in urine, gecorrigeerd via
onderstaande formule (C = concentratie):
(29)
2.4.2 Protocol plasma
Bloedstalen werden eerst vijf minuten in de centrifuge geplaatst bij kamertemperatuur (1300
toeren/minuut). Vervolgens werd het gebruikte protocol gebaseerd op een bestaande methode
van Madlensky et al (31).
25 µl van de samengestelde werkoplossing van de gedeutereerde ISTD’en (4µg/ml) werd
ingedampt onder een stikstofstroom bij 40 +/- 5°C. Vervolgens werd 200 µl plasma en 800 µl
ammoniumformaat 0,5 mM (pH = 3) toegevoegd.
SPE gebeurde met behulp van MCX kolommen. De MCX kolommen werden geactiveerd met
1 ml methanol en nadien geconditioneerd met 1 ml water. Vervolgens werden de stalen op de
kolommen geladen waarna twee wasstappen volgden met 1 ml waterstofchloride (0,1M) en 1
ml methanol. Elutie gebeurde met 1 ml 5% ammoniakoplossing in methanol.
21
Na elutie werden de stalen ingedampt onder een stikstofstroom bij 60 +/- 5°C. De stalen
werden gederivatiseerd met 100 µl ANAL-60 derivatisatiemengsel en overgebracht in een
vial waarna analyse volgde met GC-MS.
2.5 Validatieprotocol (gebaseerd op QUAL 12)
2.5.1 Lineariteit
Negatieve urine en negatief plasma werden in drievoud aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM
en 4-OH-3-Me-TAM op zeven verschillende niveaus (tabel II en III).
Tabel II: validatie lineariteit: negatieve urine op 7 niveaus aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-
TAM.
Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
Niveau 1 1 0,5 5
Niveau 2 2,5 1,25 12,5
Niveau 3 10 5 50
Niveau 4 25 12,5 125
Niveau 5 50 25 250
Niveau 6 75 37,5 375
Niveau 7 100 50 500
Tabel III: validatie lineariteit: negatief plasma op 7 niveaus aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-
Me-TAM.
Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
Niveau 1 5 2,5 25
Niveau 2 12,5 6,25 62,5
Niveau 3 50 25 250
Niveau 4 125 62,5 625
Niveau 5 250 125 1250
Niveau 6 375 187,5 1875
Niveau 7 500 250 2500
22
Vervolgens werd het protocol voor urine of plasma doorlopen, zoals hierboven beschreven bij
de staalvoorbereiding, en werden de stalen geanalyseerd.
De lineariteit kan uitgedrukt worden door middel van de R² of de g-factor. De validatie was
geslaagd indien R² > 0,98 (waarde vooropgesteld DoCoLab) en wanneer g < 10% (28).
2.5.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid
De bepaalbaarheidsgrens is de laagste concentratie met aanvaardbare juistheid en precisie. Dit
is het laagste punt van de calibratiecurve (28).
De aantoonbaarheidsgrens werd arbitrair gelijk gesteld aan de helft van de
bepaalbaarheidsgrens (QUAL 12).
2.5.3 Juistheid en precisie
Negatieve urine en negatief plasma werden in zesvoud aangerijkt met endoxifen, 4-OH-TAM
en 4-OH-Me-TAM op drie verschillende niveaus (tabel IV en V).
Tabel IV: validatie juistheid en precisie: negatieve urine werd op 3 verschillende niveaus aangerijkt met
endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.
Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
Niveau 1 1 0,5 5
Niveau 2 25 12,5 125
Niveau 3 100 50 500
Tabel V: validatie juistheid en precisie: negatief plasma werd op 3 verschillende niveaus aangerijkt met
endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.
Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
Niveau 1 25 2,5 25
Niveau 2 125 62,5 625
Niveau 3 500 250 2500
23
Vervolgens werd het protocol voor urine of plasma doorlopen, zoals hierboven beschreven bij
de staalvoorbereiding, en werden de stalen geanalyseerd.
De gemiddelde waarde mag niet meer dan 15% van de werkelijke waarde liggen, behalve de
LLOQ mag maximum 20% van de werkelijke waarde verschillen (27).
De herhaalbaarheid wordt uitgedrukt in de RSD en deze mag niet meer zijn dan zijn dan 2/3
RSDMAX (28).
2.5.4 Selectiviteit en specificiteit
Een negatief urinestaal en een negatief plasmastaal, alsook zeven referentiemengsels,
overgenomen uit P. Van Eenoo et al. (30), werden geanalyseerd en gecontroleerd op
interfererende pieken.
Een methode is selectief wanneer deze het onderscheid kan maken tussen de analyt en de
achtergrond/interferenties (27, 28).
2.5.5 Rendement
Om het rendement van de extractie na te gaan werd negatieve urine aangerijkt op één niveau
met endoxifen, 4-0H-TAM en 4-OH-3-Me-TAM bij de start van de staalvoorbereiding en
vlak voor derivatisatie ( tabel VI).
Negatief plasma werd aangerijkt op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-
TAM bij de start van de staalvoorbereiding en vlak voor derivatisatie (tabel VI).
Tabel VI: validatie rendement: negatieve urine en negatief plasma werden op 1 niveau aangerijkt met endoxifen,
4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM.
Matrix Endoxifen (ng/ml) 4-OH-TAM (ng/ml) 4-OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
Urine 25 12,5 125
Plasma 125 62,5 625
24
Vervolgens werd het protocol voor urine of plasma doorlopen, zoals hierboven beschreven bij
de staalvoorbereiding, en werden de stalen geanalyseerd.
Het rendement werd berekend door de verhouding te nemen tussen het piekoppervlak van het
staal aangerijkt bij de start van de staalvoorbereiding en het piekoppervlak van het staal
aangerijkt vlak voor derivatisatie (27).
2.5.6 Stabiliteit
Negatieve urine werd aangerijkt in 160-voud op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM en 4-
OH-3-Me-TAM. Meer specifiek voor endoxifen met 25 ng. Voor 4-OH-TAM met 12,5 ng en
voor 4-OH-3-Me-TAM met 125 ng.
Negatief plasma werd ook aangerijkt in 160-voud op één niveau met endoxifen, 4-OH-TAM
en 4-OH-3-Me-TAM. Meer specifiek voor endoxifen met 125 ng. Voor 4-OH-TAM met 62,5
ng en voor 4-OH-3-Me-TAM met 625 ng.
Deze stalen werden bewaard in vier verschillende omstandigheden. 40 urinestalen werden
bewaard bij -20 °C, 40 stalen bij 3 °C, 40 stalen bij kamertemperatuur (KT) en 40 stalen bij
40°C. Hetzelfde werd toegepast voor de plasmastalen.
De stalen werden geanalyseerd op verschillende tijdstippen, meerbepaald na dag 1, 2, 3, 4, 5
en 14 waarna de stabiliteit beoordeeld werd aan de hand van een curve waar de concentratie
werd uitgesteld in functie van de tijd.
25
3. Resultaten en bespreking
3.1 Analyse van referentiestandaarden
3.1.1 Full scan
Bij de start van de methodeontwikkeling is het belangrijk om eerst een full scan spectra op te
nemen van de referentiestandaarden. 50 µl (10 µg/ml) endoxifen hydrochloride hydraat, 50 µl
(10 µg/ml) 4-OH-TAM, 50 µl (10,4 µg/ml) 4-OH-3-Me-TAM, 20 µl (100 µg/ml) endoxifen-
d5 en 20 µl (100 µg/ml) 4-OH-TAM-d5 werden ingedampt, gederivatiseerd en opgespoten.
Aan de hand van deze spectra kunnen de precursorionen geselecteerd worden. Idealiter is een
precursorion een specifiek ion met een hoge m/z waarde en een grote abundantie.
Endoxifen heeft een moleculair gewicht (MG) van 373,49 g/mol en endoxifen-d5 heeft een
MG van 378,49 g/mol. Na derivatisatie worden twee TMS-groepen (73 g/mol) geplaatst op
elk van deze moleculen ter hoogte van de alcohol functie en het amine (figuur 6). 4-OH-TAM
heeft een MG van 387,51 g/mol en 4-OH-TAM-d5 heeft een MG van 392,51. Na derivatisatie
wordt één TMS-groep geplaatst op elk van deze moleculen ter hoogte van de alcohol functie.
4-OH-3-Me-TAM heeft een MG van 417,5 g/mol. Na derivatisatie wordt één TMS-groep
geplaatst ter hoogte van de alcohol functie. Het MG voor endoxifen, endoxifen-d5, 4-OH-
TAM, 4-OH-TAM-d5 en 4-OH-3-Me-TAM bedraagt na derivatisatie respectievelijk 460
g/mol, 465 g/mol, 459 g/mol, 464 g/mol en 489 g/mol. Deze ionen werden teruggevonden op
de massaspectra en werden geselecteerd als precursorion zoals weergegeven in tabel VII.
Bijhorende retentietijd wordt vermeld. Figuur 7 geeft een representatief full scan
massaspectrum weer, meerbepaald het massaspectrum van endoxifen. Het geselecteerde
precursorion is aangeduid.
26
Figuur 6: derivatisatie van endoxifen
Figuur 7: full scan massaspectrum van endoxifen.
Tabel VII: selectie precursorionen
Metaboliet Moleculair ion (M+) Precursorion Retentietijd (RT)
Endoxifen 460 460 3,02
4-OH-TAM 459 459 3,56
4-OH-3-Me-TAM 489 489 3,61
Endoxifen-d5 465 465 3,02
4-OH-TAM-d5 464 464 3,55
27
3.1.2 Product Ion scan
Door een product Ion scan op te nemen van de geselecteerde precursorionen kunnen de
productionen gevisualiseerd worden. Opnieuw verkiest men bij de selectie van de
productionen een hoge m/z waarde, een grote abundantie en ionen die voldoende specifiek
zijn. De collisie-energie wordt hierbij aangepast zodat een zo groot mogelijke abundantie
verkregen wordt van het production. Figuur 8 geeft een representatieve product Ion scan weer,
meerbepaald deze van endoxifen. De geselecteerde productionen zijn aangeduid.
Het ion met m/z 73 komt overeen met TMS. Dit ion is niet specifiek en wordt dus
preferentieel niet geselecteerd als precursorion.
Figuur 8: product Ion scan van endoxifen
3.1.3 MRM
De gekozen transities voor endoxifen, 4-OH-TAM, 4-OH-3-Me-TAM, endoxifen-d5 en 4-
OH-TAM-d5 kunnen eerder teruggevonden worden in tabel I in materialen en methode.
Met behulp van een softwareprogramma (MassHunter) kon een kwantitatieve methode
worden opgesteld voor de bepaling van de metabolieten. Hiervoor dienden de gekozen
transities en de retentietijden ingegeven te worden in het programma. Op deze manier werden
de relatieve piekoppervlakten van de metabolieten in het chromatogram bepaald, welke in
verband gesteld werden met een bepaalde concentratie.
28
3.2 Methodevalidatie
3.2.1 Lineariteit
Figuur 9 toont een representatieve calibratiecurve, meerbepaald deze van endoxifen in urine.
Figuur 9: calibratiecurve van endoxifen in urine.
Tabel VIII geeft van elke calibratiecurve (urine en plasma) de correlatiecoëfficiënt weer. R² is
steeds groter dan 0,98.
Tabel VIII: R² van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en r² van de
calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasma.
Metaboliet Matrix R²
Endoxifen Urine 0,998
4-OH-TAM Urine 0,999
4-OH-3-Me-TAM Urine 0,998
Endoxifen Plasma 0,995
4-OH-TAM Plasma 0,997
4-OH-3-Me-TAM Plasma 0,996
29
Tabel IX geeft van elke calibratiecurve (urine en plasma) de g-factor weer. Deze is steeds
kleiner dan 10% behalve voor 4-OH-3-Me-TAM in plasma (g-factor = 11,291).
Tabel IX: de g-factor van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en de g-
factor van de calibratiecurve van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasma.
Metaboliet Matrix g-factor
Endoxifen Urine 7,693
4-OH-TAM Urine 9,432
4-OH-3-Me-TAM Urine 8,854
Endoxifen Plasma 9,685
4-OH-TAM Plasma 8,861
4-OH-3-Me-TAM Plasma 11,291
Hieruit kan geconcludeerd worden dat voor de bepaling in urine de methode lineair is. De
methode in plasma is lineair voor endoxifen en 4-OH-TAM.
3.2.2 Bepaalbaarheid en aantoonbaarheid
De bepaalbaarheid is het laagste punt van de calibratiecurve met voldoende juistheid en
precisie. Tabel X geeft de juistheid en precisie (herhaalbaarheid) weer van het laagste punt
van de calibratiecurve voor zowel de methode in urine als de methode in plasma. De bias is
nooit groter dan 20% en de RSD is steeds kleiner dan 2/3 RSDMAX. De vereisten van de
LLOQ zijn dus voldaan.
Tabel X: juistheid en RSD van het laagste punt van de calibratiecurve van de metabolieten in urine en plasma.
Metaboliet Matrix Ware
waarde
(ng/ml)
Gemeten
gemiddelde
concentratie
(ng/ml)
Juistheid
(%)
RSD
(%)
2/3
RSDMAX
(%)
Endoxifen Urine 1 1,14 13,8 8,2 30,2
4-OH-TAM Urine 0,5 0,51 1,7 7,6 33,5
4-OH-3-Me-TAM Urine 5 5,24 4,7 8,7 23,7
Endoxifen Plasma 5 5,48 9,5 6,5 23,7
4-OH-TAM Plasma 2,5 2,65 6,0 7,0 26,3
4-OH-3-Me-TAM Plasma 25 24,5 -2,0 5,5 26,3
30
De aantoonbaarheidsgrens voor elke metaboliet in urine en plasma wordt weergegeven in
tabel XI.
Tabel XI: de aantoonbaarheidsgrens van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urine en in plasma.
Metaboliet Matrix Aantoonbaarheidsgrens
(ng/ml)
Endoxifen Urine 0,5
4-OH-TAM Urine 0,25
4-OH-3-Me-TAM Urine 2,5
Endoxifen Plasma 2,5
4-OH-TAM Plasma 1,25
4-OH-3-Me-TAM Plasma 12,5
3.2.3 Juistheid en precisie
Tabel XII geeft de juistheid en de herhaalbaarheid (RSD) weer van de metabolieten op 3
verschillende niveaus in urine en plasma. De bias is nooit groter dan 15% en de RSD was
steeds kleiner dan 2/3 RSDMAX met uitzondering van één punt. Op het niveau van 500 ng/ml
endoxifen in plasma was de bias van de methode 15,3%. Gezien er gewerkt werd onder
strengere voorwaarden dan in DoCoLab (bias < 20%) en de onjuistheid afgerond 15% is,
werd dit punt toch aanvaard. Hieruit kan geconcludeerd worden dat zowel voor de bepaling in
urine als voor de bepaling in plasma de methode juist en herhaalbaar is.
31
Tabel XII: juistheid en RSD op 3 niveaus van de metabolieten in urine en plasma.
Metaboliet Matrix Ware
waarde
(ng/ml)
Gemeten
gemiddelde
concentratie
(ng/ml)
Juistheid
(%)
RSD
(%)
2/3
RSDMAX
(%)
Endoxifen Urine 1 1,14 13,8 8,2 30,2
25 26,41 5,6 4,9 18,6
100 101,03 1,0 10,8 15,1
4-OH-TAM Urine 0,5 0,51 1,7 7,6 33,5
12,5 12,97 3,8 2,8 20,6
50 49,65 -0,7 8,8 16,7
4-OH-3-Me-
TAM
Urine 5 5,24 4,7 8,7 23,7
125 134,95 8,0 4,3 14,6
500 515,2 3,0 9,6 11,8
Endoxifen Plasma 5 5,48 9,5 6,5 23,7
125 122,18 -2,3 10,5 20,6
500 423,29 -15,3 3,8 11,8
4-OH-TAM Plasma 2,5 2,65 6,0 7,0 26,3
62,5 62,37 -0,2 4,1 16,2
250 268,36 7,3 2,4 18,6
4-OH-3-Me-
TAM
Plasma 25 24,5 -2,0 5,5 26,3
2500 2521,73 0,9 2,8 13,1
3.2.4 Selectiviteit en specificiteit
Er konden geen interfererende pieken worden waargenomen ter hoogte van de retentietijd van
de metabolieten in blanco urine en blanco plasma. De analyse van referentiemengsels
vertoonden ook geen interfererende pieken. Hiervan uitgaande kan geconcludeerd worden dat
de methode zowel selectief als specifiek is voor urine en plasma.
3.2.5 Rendement
Tabel XIII geeft het extractierendement weer van de methode voor elke metaboliet in zowel
urine als in plasma. Er wordt een beter rendement waargenomen in urine dan in plasma. Een
mogelijke verklaring kan de onvolledige staaloverdracht zijn vanuit het recipiënt naar de SPE
kolom. Ondanks de lagere resultaten in plasma zijn alle resultaten aanvaardbaar.
32
Tabel XIII: extractierendement.
Metaboliet Matrix Rendement (%)
Endoxifen Urine 88,14
4-OH-TAM Urine 88,73
4-OH-3-Me-TAM Urine 84,94
Endoxifen Plasma 65,8
4-OH-TAM Plasma 73,00
4-OH-3-Me-TAM Plasma 78,34
3.2.6 Stabiliteit
Figuur 10 en 11 geven de stabiliteitsanalyse weer in urine en plasma. De stabiliteitsanalyse
had een looptijd van twee weken. Er werd verondersteld dat stalen binnen deze tijdsperiode
geanalyseerd werden.
Op beide figuren zien we links de stabiliteitscurven van endoxifen bewaard bij -20°C, 3°C,
KT en 40°C (onder elkaar). In het midden zien we de stabiliteitscurven van 4-OH-TAM
bewaard bij -20°C, 3°C, KT en 40°C en rechts de stabiliteitscurven van 4-OH-3-Me-TAM
bewaard bij -20°C, 3°C, KT en 40°C. De standaarddeviatie is per punt weergegeven.
Op het eerste zicht kan er een trend van degradatie worden waargenomen in zowel urine als
plasma. In plasma is dit meer uitgesproken.
De uiterste bewaarcondities (-20°C en 40°C) werden voor elke metaboliet statistisch met
elkaar vergeleken na 14 dagen bewaring. Er werd een t-test uitgevoerd met behulp van Excel.
Hierbij werd uitgegaan van een 95% betrouwbaarheidsinterval (α = 0,05), ongelijke varianties
en een tweezijdige verdeling. Tabel XIV geeft de resultaten weer. Significante resultaten
worden aangeduid met *. Voor endoxifen en 4-OH-TAM kon in urine een statistisch
significant verschil worden aangeduid tussen de uiterste bewaarcondities. De gemeten
concentraties in urine lagen duidelijk lager na bewaring bij 40°C in vergelijking met bewaring
bij -20°C. Wanneer we de P-waarden van endoxifen en 4-OH-TAM in plasma bekijken dient
te worden opgemerkt dat deze op de significantiegrens liggen. Deze resultaten kunnen nog net
als statistisch significant beschouwd worden. Ook hier lagen concentraties lager na bewaring
bij 40°C in vergelijking met bewaring bij -20°C. Voor concentraties van 4-OH-3-Me-TAM
wordt zowel in urine als in plasma geen significant verschil aangetoond tussen de twee
verschillende bewaarcondities.
33
Het laatste punt (14 dagen) op de grafiek ligt steeds hoger dan de voorgaande. Dit kan
verklaard worden door de meetonzekerheid. Het 95% zekerheidsinterval, rekeninghoudende
met de meetonzekerheid, wordt eveneens op de grafieken aangeduid. Wanneer deze in
rekening wordt gebracht, valt op dat de meeste metingen binnen deze grenzen vallen. Voor
deze metingen kan men dus geen ondubbelzinnige degradatie vast stellen. Dit blijkt ook uit de
laatste meting (na twee weken bewaring). Deze vallen immers steeds binnen de grenzen van
de meetonzekerheid, waaruit blijkt dat de ogenschijnlijke degradatie in de eerste week enkel
toe te schrijven is aan de meetonzekerheid.
Tabel XIV: t-test uitgevoerd voor de uiterste bewaarcondities (-20°C en 40°C) voor elke metaboliet in urine en
plasma. Hierbij werd uitgegaan van een 95% betrouwbaarheidsinterval (α = 0,05), ongelijke varianties en een
tweezijdige verdeling. * duidt de resultaten aan waar een significant verschil kon worden waargenomen.
Matrix Metaboliet P-waarde
Urine Endoxifen 0,005*
4-OH-TAM 0,008*
4-OH-3-Me-TAM 0,202
Plasma Endoxifen 0,050*
4-OH-TAM 0,055*
4-OH-3-Me-TAM 0,166
34
Figuur 10: de stabiliteit in urine onder 4 condities. De standaarddeviatie wordt per punt weergegeven en de
meetonzekerheid wordt per grafiek afgebeeld.
35
Figuur 11: de stabiliteit in plasma onder 4 condities. De standaarddeviatie wordt per punt weergegeven en de
meetonzekerheid wordt per grafiek afgebeeld.
36
3.3 Analyse patiëntenstalen
3.3.1 Patiënten
Tabel XV geeft de gegevens van de deelnemende patiënten weer. In totaal namen 16 patiënten
deel aan de studie. Dit waren allemaal vrouwen. Bij patiënt 2, 7 en 14 ontbreekt de
gebruiksperiode van TAM. Er kan echter vanuit gegaan worden dat deze periode langer was
dan 8 weken gezien dit een criterium was voor deelname (patiënt 3 vormt hier een
uitzondering op en was slechts 3 weken in behandeling). Ook het eventueel concomitant
gebruik van andere geneesmiddelen werd niet opgegeven door patiënt 2, 7 en 14.
Tabel XV: geslacht, leeftijd, gebruiksperiode van TAM en eventueel concomitant gebruik van andere
geneesmiddelen van de deelnemende patiënten.
Patiënt Geslacht Leeftijd
(jaren)
TAM-gebruik
(maanden)
Gebruik andere
geneesmiddelen
1 Vrouw 36 23 Zoladex
2 Vrouw 54 / /
3 Vrouw 48 > 1 Sipralexa
(escitalopram)
4 Vrouw 61 4 Lyrica 150 mg
5 Vrouw 58 6 Citalopram
Pantomed
Zolpidem
6 Vrouw 48 39 Deanxit
Bisoprolol
7 Vrouw 44 / /
8 Vrouw 50 21 Cipramil
9 Vrouw 47 42 Voedingssuplementen
10 Vrouw 48 36 Geen
11 Vrouw 43 7 Geen
12 Vrouw 58 60 Geen
13 Vrouw 52 2 Bisoprolol
Temesta expedit
14 Vrouw 48 / /
15 Vrouw 48 7 Bisoprolol
Herceptine
16 Vrouw 46 6 Herceptine
37
3.3.2 Analyse urinestalen
Tabel XVI geeft de gemeten concentratie weer van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-
TAM in de urinestalen van de deelnemende patiënten. Ook de verhouding endoxifen op 4-
OH-TAM is weergegeven. Het was voor de patiënten niet altijd mogelijk om urinestalen te
doneren op alle gevraagde tijdstippen waardoor de tabel niet helemaal volledig is.
Over de vijf gemeten tijdstippen wordt er een consistente schommeling in de concentratie van
de metabolieten gezien. Na tijdstip A (voor de inname van de medicatie) wordt bij de meeste
patiënten een daling gezien in de concentratie van de metabolieten. Deze daling in de
concentratie wordt waargenomen op tijdstip B (1 uur na inname) en soms verder aangehouden
tot tijdstip C (2 uur na inname). Na inname van de medicatie verloopt de excretie van de
metabolieten in de urine dus met enige vertraging. Vanaf tijdstip C of D (4 uur na inname)
wordt er een stijging waargenomen in de concentratie van de metabolieten. Op tijdstip E (8
uur na inname) wordt deze concentratiestijging aangehouden of neemt deze reeds terug af.
Afwijkende resultaten bij patiënten 6 en 8 doen vermoeden dat de urinestalen omgewisseld
zijn op tijdstip C en D bij patiënt 6 en op tijdstip B en C bij patiënt 8.
Voor patiënten 1, 2, 5, 8 en 16 werd er een directe stijging van de concentratie waargenomen
na inname van de medicatie. Dit kan verklaard worden door het tijdstip van inname van de
medicatie van de voorgaande dag.
Zoals de gegevens in de tabel illustreren worden van 4-OH-3-Me-TAM duidelijk de hoogste
concentraties teruggevonden in de urine in vergelijking met endoxifen en 4-OH-TAM. 4-OH-
3-Me-TAM wordt dus in belangrijke mate gevormd en geëxcreteerd in urine en kan dermate
interessant zijn voor kwalitatieve bepalingen. Therapeutisch gezien is deze metaboliet echter
minder belangrijk.
Absolute concentraties gemeten in urine zijn afhankelijk van verschillende factoren zoals het
individueel metabolisme, het concentrerend vermogen van de nier en de hoeveelheid vocht
die men tot zich neemt (24). Toch werd er gekozen om concentratiebepalingen in urine uit te
voeren vermits afname van urine minder invasief is dan afname van plasma. Verhoudingen
tussen de metabolieten zijn niet onderhevig aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en
de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine. Omwille van deze reden is de
verhouding van endoxifen op 4-OH-TAM ook weergegeven in tabel XVI.
Uit verschillende publicaties blijkt dat de steady state plasmaconcentraties van endoxifen vijf-
tot tienmaal hoger liggen dan van 4-OH-TAM (4,7,9,10,13,18-20). De gegevens in de tabel
38
tonen aan dat deze verhouding in urine veel minder uitgesproken is. Dit kan enerzijds
verklaard worden door een verschillende fase II metabolisatie van beide metabolieten. Zo is
eerder ook gebleken dat bij testosteron en epitestosteron de verschillende genotypen anders
geglucuronideerd worden (32). Het al of niet glucuronideren van een molecule (en zijn
analogen) heeft een invloed op de polariteit van de molecule en bijgevolg ook op de
uitscheiding (33). Anderzijds kunnen reabsorptieprocessen ook een oorzaak zijn voor de
geobserveerde verschillen.
Bij vier patiënten (patiënten 1, 3, 5 en 9) werd een opmerkelijke verhouding gevonden kleiner
dan 1. De endoxifen concentraties lagen bij deze patiënten lager dan de 4-OH-TAM
concentraties. Meerdere verklaringen zijn hier mogelijk.
Een eerste verklaring kan een probleem zijn bij de omzetting van TAM tot zijn actieve
metabolieten door fase I enzymen. Wanneer CYP3A4/5 een verminderde werking vertoont,
kan verwacht worden dat concentraties van endoxifen lager zullen liggen en dat deze van 4-
OH-TAM gelijk blijven (figuur 1). Bij patiënt 3 en patiënt 5 liggen de endoxifen concentraties
in urine lager dan de 4-OH-TAM concentraties. Deze patiënten zijn in behandeling met
dezelfde SSRI (tabel XV). Escitalopram (patiënt 3) is het actieve S-enantiomeer van de SSRI
citalopram (patiënt 5). Deze medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd door CYP3A4
(34). Zo kan het dat, door inwerking van de SSRI, het CYP3A4 isoenzym geïnhibeerd wordt.
Dit zou lagere concentraties van endoxifen tot resultaat hebben en bijgevolg kan dit een effect
hebben op de therapie. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine
groep patiënten in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van
escitalopram en TAM noodzakelijk.
Een tweede verklaring kan een probleem zijn bij de omzetting van de actieve metabolieten
naar inactieve metabolieten door fase II enzymen. Wanneer inactivatie door glucuronidatie of
sulfatatie minder goed verloopt, kan dit leiden tot verlaagde excretie van de metabolieten.
Als laatste kunnen ook andere factoren die de eliminatie beïnvloeden zoals
reabsorptieprocessen, de oorzaak zijn van gewijzigde concentraties van de metabolieten in
urine.
39
Tabel XVI: concentraties van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urinestalen van deelnemende
patiënten. A = urinestaal voor inname TAM, B = urinestaal 1 uur na inname TAM, C = urinestaal 2 uur na
inname TAM, D = urinestaal 4 uur na inname TAM en E = urinestaal 8 uur na inname TAM.
Patiënt Urinestaal Concentratie
endoxifen
(ng/ml)
Concentratie
4-OH-TAM
(ng/ml)
Concentratie
4-OH-3-Me-
TAM (ng/ml)
Verhouding
endoxifen/4-
OH-TAM
1 A 230,68 295,32 3731,78 0,78
B 501,57 683,24 8290,89 0,73
C / / / /
D 1279,36 1749,07 16726,91 0,73
E 675,13 839,70 10273,03 0,80
2 A 225,43 164,33 1105,21 1,37
B 246,33 158,90 1073,20 1,55
C 285,42 192,20 1113,24 1,49
D 138,59 116,38 987,87 1,19
E 187,11 147,76 1452,68 1,27
3 A 18,01 41,05 508,37 0,44
B 8,43 15,29 281,89 0,55
C / / / /
D 12,26 29,34 631,22 0,42
E 25,84 82,25 964,73 0,31
4 A 49,34 41,59 789,81 1,19
B / / / /
C / / / /
D 83,14 72,27 1770,12 1,15
E 53,70 49,87 1042,66 1,08
5 A 3,63 7,90 188,18 0,46
B 4,87 9,90 317,49 0,49
C / / / /
D 27,92 54,80 1496,52 0,51
E 43,24 115,18 2997,42 0,38
6 A 60,49 38,67 500,37 1,56
B 50,89 30,61 475,04 1,66
C 64,53 36,53 540,60 1,77
D 35,93 35,01 519,24 1,03
E 74,74 52,59 968,62 1,42
7 A 35,96 21,33 271,95 1,69
B 23,82 16,99 172,16 1,40
C 13,07 10,62 96,80 1,23
D 21,53 15,51 163,39 1,39
E 73,09 70,44 697,60 1,04
8 A 49,39 41,89 808,64 1,18
B 52,63 48,60 777,59 1,08
40
C 44,92 41,57 724,70 1,08
D 67,52 65,81 1151,35 1,03
E 25,25 33,89 524,43 0,75
9 A 28,59 54,63 785,48 0,52
B 18,97 61,94 737,85 0,31
C 19,13 68,10 814,66 0,28
D 33,60 88,84 1190,79 0,38
E 10,39 36,43 545,81 0,29
10 A 30,40 28,38 283,02 1,07
B 10,91 10,86 105,05 1,00
C 13,08 12,23 124,80 1,07
D 26,31 25,77 248,99 1,02
E 23,12 22,49 250,40 1,03
11 A 40,16 34,45 219,17 1,17
B 23,04 21,98 139,52 1,05
C 38,66 35,86 211,88 1,08
D 99,87 87,21 559,71 1,15
E 64,07 61,64 418,47 1,04
12 A 42,83 34,18 262,50 1,25
B 15,77 9,83 102,50 1,60
C 14,95 10,74 105,92 1,39
D 65,19 50,39 412,19 1,29
E 97,62 64,20 547,18 1,52
13 A 35,23 31,92 353,49 1,10
B 22,09 20,92 286,80 1,06
C 44,74 42,15 570,67 1,06
D 58,37 50,32 529,52 1,16
E 36,05 31,41 301,79 1,15
14 A 140,85 123,60 1496,85 1,14
B 84,01 80,24 1013,75 1,05
C 36,57 33,42 494,09 1,09
D 62,61 51,30 652,00 1,22
E 85,66 92,81 1247,38 0,92
15 A 68,83 53,18 668,02 1,29
B 64,98 42,04 575,37 1,55
C 69,85 48,38 666,08 1,44
D / / / /
E 65,29 53,00 738,50 1,23
16 A 20,59 14,51 133,75 1,42
B 50,94 39,40 402,49 1,29
C 42,06 31,32 338,93 1,34
D / / / /
E / / / /
41
Vermits urineconcentraties onderhevig zijn aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en
de hiermee verbonden hoeveelheid uitgescheiden urine, worden in Tabel XVII de
urineconcentraties van de drie metabolieten weergegeven gecorrigeerd voor de dichtheid.
De meeste gecorrigeerde urineconcentraties van endoxifen liggen tussen de 10 en 100 ng/ml.
De eerste twee patiënten vormen hier een uitzondering op.
Ook hier wordt een gelijkaardige schommeling waargenomen over de verschillende
tijdstippen van de urineafname, zoals eerder in tabel XVI.
Concentraties van endoxifen in urine zijn tot op heden nog niet gepubliceerd. Irvin WJ et al.
(10) beschreef eerder plasmaconcentraties van endoxifen in EM’s, IM’s en PM’s. Zoals
verwacht lagen deze plasmaconcentraties hoger bij EM’s (34.3 ng/mL) in vergelijking met
IM’s (18.5 ng/mL) en PM’s (4.2 ng/mL). Er werd echter niets vermeld over het tijdstip van de
bloedafname ten opzichte van de inname van de medicatie. Hierdoor, en omdat concentraties
gemeten in urine ook afhankelijk zijn van het individueel metabolisme, is het moeilijk om de
verkregen resultaten te vergelijken met eerder beschreven plasmaconcentraties.
42
Tabel XVII: concentraties van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in urinestalen van patiënten
gecorrigeerd voor de dichtheid. A = urinestaal voor inname TAM, B = urinestaal 1 uur na inname TAM, C =
urinestaal 2 uur na inname TAM, D = urinestaal 4 uur na inname TAM en E = urinestaal 8 uur na inname TAM.
Patiënt Urinestaal Dichtheid
urine (kg/l)
Concentratie
endoxifen
(ng/ml)
Concentratie
4-OH-TAM
(ng/ml)
Concentratie 4-
OH-3-Me-TAM
(ng/ml)
1 A 1,004 230,68 295,32 3731,78
B 1,005 501,57 683,24 8290,89
C / / / /
D 1,017 1279,36 1749,07 16726,91
E 1,007 675,13 839,7 10273,03
2 A 1,026 225,43 164,33 1105,21
B 1,027 246,33 158,9 1073,2
C 1,028 285,42 192,2 1113,24
D 1,020 138,59 116,38 987,87
E 1,012 187,11 147,76 1452,68
3 A 1,022 18,01 41,05 508,37
B 1,019 8,43 15,29 281,89
C / / / /
D 1,023 12,26 29,34 631,22
E 1,026 25,84 82,25 964,73
4 A 1,015 49,34 41,59 789,81
B / / / /
C / / / /
D 1,016 83,14 72,27 1770,12
E 1,015 53,7 49,87 1042,66
5 A 1,003 3,63 7,9 188,18
B 1,003 4,87 9,9 317,49
C / / / /
D 1,015 27,92 54,8 1496,52
E 1,019 43,24 115,18 2997,42
6 A 1,021 60,49 38,67 500,37
B 1,021 50,89 30,61 475,04
C 1,006 64,53 36,53 540,6
D 1,023 35,93 35,01 519,24
E 1,027 74,74 52,59 968,62
7 A 1,011 35,96 21,33 271,95
B 1,009 23,82 16,99 172,16
C 1,006 13,07 10,62 96,8
D 1,010 21,53 15,51 163,39
E 1,018 73,09 70,44 697,6
8 A 1,019 49,39 41,89 808,64
B 1,020 52,63 48,6 777,59
43
C 1,020 44,92 41,57 724,7
D 1,023 67,52 65,81 1151,35
E 1,010 25,25 33,89 524,43
9 A 1,034 28,59 54,63 785,48
B 1,037 18,97 61,94 737,85
C 1,033 19,13 68,1 814,66
D 1,026 33,6 88,84 1190,79
E 1,026 10,39 36,43 545,81
10 A 1,008 30,4 28,38 283,02
B 1,004 10,91 10,86 105,05
C 1,002 13,08 12,23 124,8
D 1,007 26,31 25,77 248,99
E 1,005 23,12 22,49 250,4
11 A 1,010 40,16 34,45 219,17
B 1,008 23,04 21,98 139,52
C 1,012 38,66 35,86 211,88
D 1,017 99,87 87,21 559,71
E 1,017 64,07 61,64 418,47
12 A 1,009 42,83 34,18 262,5
B 1,005 15,77 9,83 102,5
C 1,003 14,95 10,74 105,92
D 1,010 65,19 50,39 412,19
E 1,016 97,62 64,2 547,18
13 A 1,012 35,23 31,92 353,49
B 1,017 22,09 20,92 286,8
C 1,020 44,74 42,15 570,67
D 1,021 58,37 50,32 529,52
E 1,012 36,05 31,41 301,79
14 A 1,025 140,85 123,6 1496,85
B 1,024 84,01 80,24 1013,75
C 1,015 36,57 33,42 494,09
D 1,020 62,61 51,3 652
E 1,028 85,66 92,81 1247,38
15 A 1,021 68,83 53,18 668,02
B 1,020 64,98 42,04 575,37
C 1,023 69,85 48,38 666,08
D / / / /
E 1,023 65,29 53 738,5
16 A 1,011 20,59 14,51 133,75
B 1,021 50,94 39,4 402,49
C 1,018 42,06 31,32 338,93
D / / / /
E / / / /
44
3.3.3 Analyse plasmastalen
In tegenstelling tot concentratiebepalingen in urine zijn concentratiebepalingen in plasma niet
onderhevig aan effecten veroorzaakt door (de)hydratatie, en de hiermee verbonden
hoeveelheid uitgescheiden urine. In tegenstelling tot het volume urine dat uitgescheiden
wordt, is het bloedvolume vrij constant. Zelfs wanneer urineconcentraties gecorrigeerd
worden voor de dichtheid van de urinestalen zijn deze niet even betrouwbaar als metingen
uitgevoerd in plasma voor het trekken van klinische conclusies. Omwille van deze redenen
werd er ook geopteerd om concentratiebepalingen uit te voeren in plasma, ondanks het feit dat
afname van bloed meer invasief is dan afname van urine.
Tabel XVIII geeft de gemeten concentratie weer van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-
TAM in de plasmastalen van de eerste tien patiënten. Ook de verhouding endoxifen op 4-OH-
TAM is weergegeven. Het was voor de patiënten niet altijd mogelijk om bloedstalen te
doneren op alle gevraagde tijdstippen waardoor de tabel niet helemaal volledig is.
Het analyseren van de verzamelde plasmastalen verliep moeizaam. Hierdoor werden niet alle
plasmastalen geanalyseerd maar slechts deze van de eerste tien patiënten. De plasmastalen
waren na de staalvoorbereiding, ondanks een geslaagde validatie, onvoldoende zuiver om een
optimale ontleding toe te laten met GC-MS. Dit kon gelegen zijn aan de kwaliteit van de
plasmastalen. Deze waren immers licht hemolytisch. Naargelang de omstandigheden werden
de bloedstalen één of twee nachten bewaard in de koelkast voor ze werden afgecentrifugeerd.
Direct afcentrifugeren na afname zou hemolyse kunnen voorkomen. Verder kan men proberen
de S/N te verbeteren door de aanwezige proteïnen in het plasma te precipiteren, vóór het
uitvoeren van SPE, en het extractierendement te verhogen. Anderzijds kan werken met een
groter plasmavolume ook een verbetering opleveren. Wel is de bijdrage van deze opties
beperkt gezien gewerkt wordt met een triple quadrupool en deze methode al reeds zeer
selectief is. Het gebruik van een andere techniek, bijvoorbeeld Liquid Chromatography–Mass
Spectrometry (LC-MS), kan een oplossing zijn. Er dient overigens opgemerkt te worden dat
het gebruikte protocol, waarop SPE gebaseerd werd, voorbestemd was voor LC-MS in plaats
van GC-MS.
Bij het bekijken van de resultaten worden, net zoals in urine, van 4-OH-3-Me-TAM de
hoogste concentraties gemeten in plasma. Er wordt echter geen consistent patroon gezien over
de drie verschillende tijdstippen van de bloedafname.
45
Plasmaconcentraties van endoxifen lagen opmerkelijk lager dan eerder beschreven in Irvin
WJ et al (10), waar plasmaconcentraties van gemiddeld 34.3 ng/mL werden gemeten bij
EM’s.
Uit verschillende publicaties blijkt dat steady state plasmaconcentraties van endoxifen vijf- tot
tienmaal hoger liggen dan van 4-OH-TAM (4,7,9,10,13,18-20). Deze resultaten konden niet
herhaald worden. Concentraties van endoxifen lagen in de meeste gevallen twee- tot vijfmaal
hoger dan 4-OH-TAM, maar in een aantal gevallen werd een verhouding van 2 niet bereikt. In
tegenstelling tot de verhoudingen van endoxifen op 4-OH-TAM in urine bij patiënten 1, 3, 5
en 9, konden in plasma geen verhoudingen gevonden worden kleiner dan 1. Dit zou er kunnen
op wijzen dat factoren die de eliminatie beïnvloeden de oorzaak zijn van de gewijzigde
concentraties van de metabolieten in urine. Helaas kunnen hier geen betrouwbare conclusies
getrokken worden omdat de gemeten concentraties van de drie metabolieten in plasma steeds
lager liggen dan de LLOQ (tabel X). Dit betekent dat de ‘gevoeligheid’ van de gebruikte
methode onvoldoende is om dergelijke metingen uit te voeren.
In de toekomst dient nog verder onderzoek uitgevoerd te worden ter verbetering van de
staalvoorbereiding en de ‘gevoeligheid’ van de methode.
46
Tabel XVIII: concentratie van endoxifen, 4-OH-TAM en 4-OH-3-Me-TAM in plasmastalen van deelnemende
patiënten. A = plasmastaal voor inname TAM, B = plasmastaal 1 uur na inname TAM en C = plasmastaal 2 uur
na inname TAM.
Patiënt Plasmastaal Concentratie
endoxifen
(ng/ml)
Concentratie
4-OH-TAM
(ng/ml)
Concentratie 4-
OH-3-Me-
TAM (ng/ml)
Verhouding
endoxifen/4-
OH-TAM
1 A 4,04 1,65 5,62 2,45
B 3,81 1,54 6,32 2,47
C / / / /
2 A 7,14 1,95 12,15 3,66
B 7,57 2,47 14,88 3,06
C 6,02 2,23 8,54 2,69
3 A 1,37 0,38 6,81 3,59
B 1,13 0,58 9,52 1,94
C 2,36 2,28 11,24 1,04
4 A 6,79 1,15 6,75 5,89
B 3,58 0,90 8,31 3,98
C / / / /
5 A 5,34 1,76 25,70 3,03
B 3,06 1,64 15,95 1,86
C 5,57 1,45 24,65 3,84
6 A 4,71 1,26 10,39 3,75
B 3,14 0,93 11,20 3,37
C 2,93 1,06 10,34 2,77
7 A 5,09 1,52 6,54 3,34
B 3,61 0,92 5,53 3,91
C 4,94 1,06 7,40 4,65
8 A 2,25 0,67 7,65 3,36
B 1,14 0,66 6,04 1,73
C / / / /
9 A 1,20 0,58 6,32 2,08
B 0,98 0,83 7,99 1,18
C 0,95 0,66 7,12 1,45
10 A 4,45 1,94 10,76 2,30
B 1,48 0,88 6,05 1,69
C 4,10 1,72 10,28 2,38
47
4. Besluit
Er werd een kwantitatieve GC-MS methode ontwikkeld voor de bepaling van endoxifen, 4-
OH-TAM en 4-OH-3Me-TAM in urine en in plasma. Hierbij werd gebruik gemaakt van een
triple quadrupool analysator. Ondanks het feit dat beide methoden volledig gevalideerd zijn,
is enkel de methode in urine ‘gevoelig’ genoeg om dergelijke metingen uit te voeren. Verder
onderzoek is nodig om de staalvoorbereiding in plasma te verbeteren en een meer ‘gevoelige’
methode te ontwikkelen.
Absolute concentraties gemeten in urine zijn afhankelijk van verschillende factoren zoals het
individueel metabolisme, het concentrerend vermogen van de nier en de hoeveelheid vocht
die men tot zich neemt (24). Toch werd er gekozen om concentratiebepalingen in urine uit te
voeren vermits afname van urine minder invasief is dan afname van plasma.
In alle urinestalen van de deelnemende patiënten werd een consistente schommeling
teruggevonden over de verschillende tijdstippen van de urine afname. Verhoudingen van
endoxifen op 4-OH-TAM blijken minder uitgesproken dan verhoudingen teruggevonden in
plasma (4,7,9,10,13,18-20). Dit zou verklaard kunnen worden door een verschil in fase II
metabolisatie of een verschil in de reabsorptieprocessen van beide metabolieten. Bij vier
patiënten (patiënten 1, 3, 5 en 9) werd er een verhouding gevonden kleiner dan 1. De
endoxifen concentraties lagen bij deze patiënten lager dan de 4-OH-TAM concentraties. Ook
hier kan de verklaring liggen bij factoren die de eliminatie beïnvloeden. Opmerkelijk waren
patiënt 3 en patiënt 5 in behandeling met dezelfde SSRI, escitalopram (tabel XV). Deze
medicatie wordt onder andere gemetaboliseerd door CYP3A4 (34). Zo kan het dat, door
inwerking van de SSRI, het CYP3A4 isoenzym geïnhibeerd wordt. Dit zou lagere
concentraties van endoxifen tot resultaat hebben en bijgevolg kan dit een effect hebben op de
therapie. Gezien de mogelijke implicaties en rekeninghoudende met de kleine groep patiënten
in deze studie is verder onderzoek betreffende het concomitant gebruik van escitalopram en
TAM noodzakelijk.
48
5. Referenties
1. Tan S-H, Lee S-C, Goh B-C, Wong J. Pharmacogenetics in Breast Cancer Therapy. Clinical Cancer
Research. 2008;14(24):8027-8041.
2. Baumgarten S C, Frasor J. Minireview: inflammation: an instigator of more aggressive estrogen
receptor (ER) positive breast cancer. Molecular Endocrinology. 2012;26(3):360-371.
3. Jin Y, Desta Z, Stearns V, Ward B, Ho H, Lee KH, Skaar T, Storniolo AM, Li L, Araba A,
Blanchard R, Nguyen A, Ullmer L, Hayden J, Lemler S, Weinshilboum RM, Rae JM, Hayes DF,
Flockhart DA. CYP2D6 genotype, antidepressant use, and tamoxifen metabolism during adjuvant
breast cancer treatment. Journal of the National Cancer Institute. 2005;97(1):30-39.
4. Zhou S-F. Polymorphism of Human Cytochrome P450 2D6 and Its Clinical Significance Part II.
Clinical Pharmacokinetics. 2009;48(12):761-804.
5. Schroth W, Goetz MP, Hamann U, Fasching PA, Schmidt M, Winter S, Fritz P, Simon W, Suman
VJ, Ames MM, Safgren SL, Kuffel MJ, Ulmer HU, Boländer J, Strick R, Beckmann MW, Koelbl
H, Weinshilboum RM, Ingle JN, Eichebaum M, Schwab M, Brauch H. Association Between
CYP2D6 Polymorphisms and Outcomes Among Women With Early Stage Breast Cancer Treated
With Tamoxifen. Jama-Journal of the American Medical Association. 2009;302(13):1429-1436.
6. http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=web&cd=5&ved=0CD8QFjA
E&url=http%3A%2F%2F195.130.154.23%2Furlnotices%2Flid%2Flid.aspx%3FsLID%3D20740%
26sUID%3D2ZP8SQ55&ei=dACdUKGkC8nW0QW__YHIDg&usg=AFQjCNE_bADGMgYdrSrz
CopGVKRnie95ww&sig2=fVlngBMANT4WYETab23_Gg (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).
7. Braems G, Denys H, De Wever O, Cocquyt V, Van den Broecke R. Use of Tamoxifen before and
during pregnancy. The Oncologist. 2011; 16:1547-1551.
8. Ingelman-Sundberg M, Sim SC, Gomez A, Rodriguez-Antona C. Influence of cytochrome P450
polymorphisms on drug therapies: Pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects.
Pharmacology & Therapeutics. 2007;116(3):496-526.
9. Borges S, Desta Z, Li L, Skaar TC, Ward BA, Nguyen A, Jin Y, Storniolo AM, Nikoloff DM, Wu
L, Hillman G, Hayes DF, Stearns V, Flockhart DA. Quantitative effect of CYP2D6 genotype and
inhibitors on tamoxifen metabolism: Implication for optimization of breast cancer treatment.
Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2006;80(1):61-74.
10. Irvin WJ, Jr, Walko CM, Weck KE, Ibrahim JG, Chiu WK, Dees EC, Moore SG, Olajide OA,
Graham ML, Canale ST, Raab RE, Corso SW, Peppercorn JM, Anderson SM, Friedman KJ,
Ogburn ET, Desta Z, Flockhart DA, McLeod HL, Evans JP, Carey LA. Genotype-Guided
Tamoxifen Dosing Increases Active Metabolite Exposure in Women With Reduced CYP2D6
Metabolism: A Multicenter Study. Journal of Clinical Oncology. 2011;29(24):3232-3239.
11. Kiyotani K, Mushiroda T, Nakamura Y, Zembutsu H. Pharmacogenomics of Tamoxifen: Roles of
Drug Metabolizing Enzymes and Transporters. Drug Metabolism and Pharmacokinetics.
2012;27(1):122-131.
12. Teunissen SF, Rosing H, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH. Bioanalytical methods for
determination of tamoxifen and its phase I metabolites: A review. Analytica Chimica Acta.
2010;683(1):21-37.
13. Binkhorst L, Mathijssen RHJ, Moghaddam-Helmentel IMG, de Bruijn P, van Gelder T, Wiemer
EAC, Loos WJ. Quantification of tamoxifen and three of its phase-I metabolitesin human plasma
by liquid chromatography/triple-quadrupole mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis. 2011;56(5):1016-1023.
14. Teunissen SF, Jager NGL, Rosing H, Schinkel AH, Schellens JHM, Beijnen JH. Development and
validation of a quantitative assay for the determination of tamoxifen and its five main phase I
metabolites in human serum using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.
Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences.
2011;879(19):1677-1685.
15. Lee KH, Ward BA, Desta Z, Flockhart DA, Jones DR. Quantification of tamoxifen and three
metabolites in plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection:
application to a clinical trial. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the
Biomedical and Life Sciences. 2003;791(1-2):245-253.
16. Gjerde J, Kisanga ER, Hauglid M, Holm PI, Mellgren G, Lien EA. Identification and quantification
of tamoxifen and four metabolites in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Journal of Chromatography A. 2005;1082(1):6-14.
49
17. Mihailescu R, Aboul-Enein HY, Efstatide MD. Identification of tamoxifen and metabolites in
human male urine by GC/MS. Biomedical Chromatography. 2000;14(3):180-183.
18. Higgins MJ, Stearns V. Pharmacogenetics of endocrine therapy for breast cancer. Annual Review
of Medicine. 2011;62:281-293.
19. Goetz MP, Knox SK, Suman VJ, Rae JM, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynolds C,
Couch FJ, Lingle WL, Weinshilboum RM, Fritcher EGB, Nibbe AM, Desta Z, Nguyen A,
Flockhart DA, Perez EA, Ingle JN. The impact of cytochrome P450 2D6 metabolism in women
receiving adjuvant tamoxifen. Breast Cancer Research and Treatment. 2007;101(1):113-121.
20. Goetz MP, Rae JM, Suman VJ, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynold C, Couch FJ,
Lingle WL, Flockhart DA, Desta Z, Perez EA, Ingle JN. Pharmacogenetics of tamoxifen
biotransformation is associated with clinical outcomes of efficacy and hot flashes. Journal of
Clinical Oncology. 2005;23(36):9312-9318.
21. Lipschitz C, Baars B, van den Berg J, Janssen H-G, Schoenmakers P, Tijssen R, Vonk N.
Gaschromatografie. Ten Hagen en Stam. 1996.
22. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tandem-ms.html (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).
23. http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/intro.htm (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).
24. http://www.maasstadziekenhuis.nl/dsresource?objectid=4241&type=org (Laatst geconsulteerd op
16/04/2013).
25. http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).
26. http://nl.wikipedia.org/wiki/solid-phase_extraction (Laatst geconsulteerd op 29/11/2012).
27. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/guidances/UC
M070107.pdf (Laatst geconsulteerd op: 09/11/2012).
28. Cursusboek: Pieters I, De logi E, Vandekerckhove B, Van Eenoo P, Plum J, Verhofstede C. Goede
Laboratorium Praktijk. 2011.
29. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-
Laboratories/Technical_Documents/WADA_TD2004EAAS_Reporting_Evaluation_Testosterone_
Epitestosterone_TE_Ratio_EN.pdf (Laatst geconsulteerd op: 02/05/2013).
30. Van Eenoo P, Van Gansbeke W, De Brabanter N, Deventer K, Delbeke FT. A fast, comprehensive
screening method for doping agents in urine by gas chromatography-triple quadrupole mass
spectrometry. Journal of Chromatography A. 2011;1218(21):3306-3316.
31. Madlensky L, Natarajan L, Tchu S, Pu M, Mortimer J, Flatt SW, Nikoloff DM, Hillman G,
Fontecha MR, Lawrence HJ, Parker BA, Wu AHB, Pierce JP. Tamoxifen metabolite
concentrations, CYP2D6 genotype, and breast cancer outcomes. Clinical Pharmacology &
Therapeutics. 2011;89(5):718-725.
32. Van Renterghem P. Alternative steroid profiling - advances in detection of misuse with endogenous
steroids in sports.2010.
33. Cursusboek: Lefebvre RA. Farmacologie. 2011.
34. Rao N. The Clinical pharmacokinetics of escitalopram. Clinical Pharmacokinetics. 2007:46
(4):281-290.
50
Top Related