INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM Mitracarpus
Baturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS.
MSc. Igor da Silva Bomfim
Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINAPÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Fortaleza/CE2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFCPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
FACULDADE DE MEDICINALABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL
História
Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos;
Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN,
2010)
Câncer (Grego - caranguejo)◦Hipócrates – Grécia Antiga
Conjunto de doenças ◦Crescimento desordenado◦Poder invasivo
http://www.ciclodavida.com.br
http://www.thedailygreen.com
(BROWN & ATTARDI, 2005)
Câncer
Fonte: OMS 2008
Em 2008:
7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo70 % ocorreram em países de baixa ou média renda
Até 2020:Cerca de 15 milhões de novos casos60 % em países em desenvolvimento
• 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública
Brasil – 518.510 novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013)
Brasil
Fonte: INCA 2011
Câncer
“ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.”
ATIVAÇÃODE
ONCOGENES
SILENCIAMENTO DE GENES
SUPRESSORES DE TUMOR
PROGRAMAS CELULARES:
PROLIFERAÇÃOMIGRAÇÃO
DIFERENCIAÇÃOAPOPTOSE
ALTERAÇÃO
(HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)
Agentes Citotóxicos Dano ao
DNA
DNA reparadoMecanismos de mortefuncionantes
Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica
Dano ao DNA – mutação
Reparação de céls.com menor intensidadeproliferativa
Céls. transformadas
Expanção clonal – câncer
Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005
Carcinogênese
TIPOS DE MORTE CELULAR
Catástrofe Mitótica
Necrose
LC3
LC3
AutofagiaApoptose
PS
PS PS
PS P
S
PS
NECROSE
Célula normal
Alterações mitocondriais
VacuolizaçãoInchaço
Perda da integridade de membranaExtravasamento de mediadores inflamatóriosDesintegração de organelas
APOPTOSE
Célula normal
Diminuição do volume celularCondensação da cromatina
Formação de BlebsFragmentação internucleossomal do DNA
Formação dos corpos apoptóticos
Lise dos corpos apoptóticos
http://www.tendenciasemercado.com.br/
Ações Importantes:
Promoção da saúde;Detecção precoce;Assistência aos pacientes;Vigilância;Formação de recursos humanos;Comunicação e mobilização social;Na pesquisa e gestão do SUS;Desenvolvimento de tratamento mais eficazes.
Terapias Anticâncer
Cirurgia
Radiação Ionizante
Imunoterapia
Terapia Dirigida
Quimioterapia
Remoção da massa tumoral
Mata rapidamente células tumorais em divisão,
incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes
Terapia que se utiliza do sistema imunepara combater o câncer
Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula
tumoral
Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias)
KUMAR et al., 2004
QuimioterapiaDefinição:
◦Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007).
Objetivo primário:◦Destruir células neoplásicas preservando
células normais.
Síntese QuímicaProdutos Naturais
MicroorganismosOrganismos Marinhos
Plantas
Papaver somniferum
Cryptotethya crypta
Penicillium notatum
PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER
Drogas Anti-câncer Originadas de PlantasDerivados da Vinca
Vimblastina Vincristina Vindesina
Taxanos Paclitaxel Docetaxel
Camptotecinas Topotecano Irinotecano
Podofilotoxinas Etoposídeo Tenoposídeo
Camptotheca accuminata
Vinca rosea
Taxus brevifolia
Produtos Naturais x DerivadosContudo há necessidade do
desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversos do tratamento;
O trabalho da química medicinal tem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótipos de drogas;
(MARKMAN, 1998)
Produtos Naturais x Derivados
Número de drogasDerivados de prod. nat.Produtos naturais
Nº
de D
rogas
Apro
vadas
nos
EU
A a
té 2
007
anosAdaptado de LI & VEDERAS, 2010
Problemática da Quimioterapia
Esquemas terapêuticos falhos;Altos índices de recidivas;Redução da sobrevida de
pacientes;Efeitos adversos;Resistência
◦Inerente ◦Adquirida
http://www.mountnittany.org/wellness-library/healthsheets/documents?ID=4834
Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae)Utilizadas para tratamento:HanseníaseCefaléiaDor de denteDoenças venéreasDispepsia
OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42
benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)
•Parte aérea seca (temp. Ambiente)•Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH.•Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida.•Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica
QuinonasDefinição: Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado.
Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural;
Amplo espectro de atividades biológicas:
Microbicida
Tripanossomicidas
Viruscidas
Antitumorais
naftoquinona antraquinonabenzoquinona
QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER
MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS
Inibição de Topoisomerase
Geração de espécies reativas de oxigênio
ObjetivosGeral:
Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de ação da FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.
Objetivos
Epecíficos:Determinar a IC50 da FR42 em um painel de
linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue.
Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence)
Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.
METODOLOGIARESULTADOS
DISCUSSÃO
Manutenção das Linhagens Celulares
Cultura de células
• Meio de cultura RPMI 1640;•10 ou 20% de soro fetal bovino;• 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina);• 3% de fitohemaglutinina (linfócitos).
10mL
37°C / 5% de CO2
Contagem/Observação
Repique em meio de cultura novo
Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT
Contagem
0,039 a 5µg/mL
Cultura de células
Células plaqueadas e drogas diluídasusando o HTS (High throughput screening)
72 h3 h
MTT
Absorbância em 595nm
Formasan
Formazan
Redu
ção
Citoplasma
meio extra-celularBerridge & Tan, 1993
Doadores de e-
MTT
NADH
NADPH+
Succinato
TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSPENSAIO DO ALAMAR BLUE
Forma oxidada Forma reduzida
Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular.
Linhagens FR42 μM DOX
Tumorais
SF-2952,0 (1,70 -2,45)
0,41 (0,34 – 046)
0,01-0,02
HCT-1162,10 (1,72 – 2,48) 0,21 (0,15 – 0,29)
OVCAR - 84,39 (3,53 – 5,40) 0,45 (0,29 – 0,52)
HL-60 2,20 (1,90 – 2,77)0,02 (0,02 – 0,03)
Normais
CMSPH 16,82 (12,18 – 23,27) 1,78 (0,52 – 1,80)
Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h
Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).
Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).
C-
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
FR42
48 h
Diluição comCorante desejado
Células SF-295
CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha.
Viáveis Não Viáveis
Iodeto de propídeonão ligado
Iodeto de propídeo ligado
CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNADETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA
Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA.
G1
G2/M DNA Fragmentado
S
Quantidade de DNApor núcleo
Mitose
Interfase
G1 G2S
4n
2n
FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA
CICLO CELULAR
Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência.
Despolarizadas
Polarizadas
POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA
POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA
Microscopia ConfocalSF-295
20.000 céls/poço
24h
Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de
meio novo
Tratar com os
compostos testes
24h
Adicionar 4 uL da Anexina
V/AlexaFluor568
15 min – temp. ambiente
Lavar com PBSResuspende
com 200 uL de meio novo
Hoechst – 10 min
Externalização da fosfatidilserina – Anexina V/Alexa Fluor 564
A B
C D A
B
C
D
Cont. Negativo (DMSO)
Doxorrubicina 0,3 uM
Droga 4 uM
Droga 8 uM
Escala: 50 UM
Vermelho: Anexina V/AlexaFluor 568
Azul: Núcleo/Hoechst33342
CONCLUSÃO
OBRIGADO!
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