UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE BIOTECNOLOGIA
BIOLOGIA CELULAR
MORTE CELULAR
LEIDI D. PREICHARDTLIANA MACIEL
MARTA E. DOUMERVANESSA GALLI
MORTE CELULAR
Interesse científico últimos anos;
Classicamente 2 processos
Morte celular programada
Apoptose
Necrose
MORTE CELULAR
ApoptoseParapoptose,
Autofagia, Mitose catastrófica
Necrose
Estímulos e tipo de morte celularFonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
Mais recentemente ...
MORTE CELULAR
A morte celular pode acontecer:
Em situações fisiológicas (Relógio Genético)Embriogênese;Processos de metamorfose;Regulação do desenvolvimento e renovação celular
Em situações patológicasInjúria severa como Hipóxia.
MORTE CELULAR
Sydney Brenner Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia (2002)
Estudos com Caenorhabtis elegans para entendimento do controle da morte celular
Caenorhabtis elegans modelo para estudo de morte celular
MORTE CELULAR
ApoptoseRemoção de células ou tecidos alterados,
exercendo importante papel na manutenção da estrutura do órgão ou dos tecidos impedindo que suas funções fossem
alteradas por fatores externos.
Oposto de Mitose.
Induçãoradiações;drogas;choque térmico;metais pesados;agentes oxidantes;
alcoóis;hipóxia;jejum;inibidores metabólicos;infecções víricas.
MORTE CELULAR
Apoptose
Clivagem do DNA por endonucleases
O mecanismo bioquímico fundamental da apoptose é conservado ao longo da escala
evolutiva, havendo genes homólogos regulando a morte celular em todos os
organismos estudados, embora, nos mamíferos, seja um processo mais complexo
MORTE CELULAR
NecroseFalha nas respostas adaptativas genéticas e
metabólicas (morte acidental).
Alguns autores denominam oncose (do grego ónkos: intumescimento) por considerarem o termo necrose seria melhor indicado para se
referir a alterações subsequentes à morte celular propriamente dita
Indução injúrias severashipertemia;privação de nutrientes;estresse oxidativo;sobrecarga intracelular de Ca2+
hipóxia;altas concentrações de substâncias tóxicas
MORTE CELULAR
Parapoptose
Forma ativa e regulada de morte celular;Apresenta inchamento mitocondrial e formação de vacúolos citoplasmáticos.
AutofagiaMorte celular ativa e regulada, caracterizada
pela lenta degradação do citoplasma e organelas por autofagossomos, vacúolos originários do retículo endoplasmático.
É observada em privação crônica de nutrientes e em algumas doenças
neurodegenerativas
MORTE CELULAR
Distinção das diferentes alterações morfológicas nos processos de morte celular por apoptose versus necrose. A necrose (a) é caracterizada pela perda de integridade de membrana plasmática, floculação da cromatina, inchaço seguido de lise celular com extravasamento do conteúdo intracelular e desintegração de organelas. O processo apoptótico (b) envolve alteração de permeabilidade de membranas, condensação cromatínica, encolhimento celular, formação de corpos apoptóticos sem desintegração de organelas.
MORTE CELULAR
Formação de vacúolos citoplasmáticos
Encolhimento ediminuição doContato
FragmentaçãoM. nuclear
Fragmentação Do DNA
DespolarizaçãoM. mitocondrial
Colapso citoesqueleto
Superfície celularalterada
Fagocitose por célulavizinha e macrófago
Permite reciclagem doscomponentes orgânicos
Apoptose
MORTE CELULAR
Maquinaria intracelular responsável pela apoptose
• É aparentemente semelhante em todas as células animais
• Dependente de uma família de proteases que apresenta uma cisteína
no sítio ativo clivando proteínas-alvo em ácido aspártico específico.
CASPASES
MORTE CELULAR
• As caspases são sintetizadas na célula com um precursor inativo, ou
procaspases, que são ativados pela clivagem do ácido aspártico por
outras caspases.
• Uma vez ativadas as caspases clivam e ativam outras procaspases,
formando uma cascata de amplificação proteolítica.
• Algumas clivam a lâmina nuclear, outras uma proteína que mantém a
enzima degradadora do DNA ( DNAse) inativa, liberando-a para digerir o
DNA.
A célula se desmancha de forma rápida e ordenada, sendo
rapidamente digerida por outras células
MORTE CELULAR
Procaspases são ativadas por ligações a Proteínas Adaptadoras
• Todas as células animais nucleadas contém as procaspases inativas,
que ficam aguardando sinais para iniciar a destruição da célula.
• A atividade das caspases é especificamente regulada na célula para
garantir que a morte celular esteja controlada até que seja necessária
Como são ativadas as procaspases para iniciar a cascata da
caspase??
MORTE CELULAR
• A ativação é feita por proteínas adaptadoras;
• Múltiplas cópias de procaspases iniciadoras se unen em um
complexo;
• Quando forçadas a entrar no complexo, sua proximidade faz
com que uma clive a outra.
MÚTUA ATIVAÇÃO
MORTE CELULAR
• Há casos em que a agregação gera uma mudança conformacional,
ativando as procaspases.
A caspase ativada no topo da cascata cliva a
próxima procaspase para estimular o sinal de
morte que estende-se para toda célula
MORTE CELULAR
Ativação da Apoptose por via extrínseca
• Ocorre pela ativação de “receptores da morte” na superfície da célula.
• Linfócitos “assassinos” podem induzir apoptose produzindo a proteína
ligante Fas.
Ligante Fas Receptor da morte
Superfície Célula-alvo
MORTE CELULAR
Agrupamento proteína Fas
Recruta adaptadores prot. intracelulares
Ligam e agregam procaspases-8
Clivam e ativam uma à outra
Caspase-8 ativada
Ativam as próximas procaspases
Apoptose
MORTE CELULAR
• Quando as células estão estressadas ou danificadas podem matar a
si próprias desencadeando a agregação das procaspases e a ativação
dentro da célula.
Via intrínseca
MORTE CELULAR
Mitocôndrias
Liberam Citocromo c
Citosol
Liga e ativa Apaf-1
Apaf-1 liga e agrega
Procaspase 9
Cliva e desencadeia a cascata
MORTE CELULAR
Principais Reguladoras Intracelulares do Programa de Morte Celular
Proteínas da Família Bcl-2
Proteínas IAP
MORTE CELULAR
Família Bcl-2
• São proteínas intracelulares que regulam a ativação das
procaspases.
• Bcl-2 ou a Bcl-XL inibem a apoptose, bloqueando a liberação do
Citocromo c da mitocôndria.
• Alguns membros da Bcl-2 não são inibidores da morte, mas sim
ativadores das procaspases e a consequente morte celular.
MORTE CELULAR
• Algumas proteínas da família, promotoras da apoptose como a Bad
funcionam por ligação e inativação dos inibidores da morte.
• Bax e a Bak estimulam a liberação do citocromo c.
• Se os genes que codificam Bax e Bak são inativados as células são
resistentes a estímulos indutores da apoptose.
• Bax e Bak podem ser ativadas por outros promotores da família Bcl-
2 como a Bid
MORTE CELULAR
Família IAP
• São proteínas inibidoras da apoptose.
• Inibem a apoptose por duas vias:
se ligam a algumas procaspases para evitar sua ativação
ligam-se as caspases inibindo sua atividade
MORTE CELULAR
• O programa de morte celular intracelular é regulado por sinais
extracelulares que podem ativar ou inibir a apoptose.
• Estes sinais moleculares atuam regulando os níveis ou atividade dos
membros das famílias Bcl-2 e IAP.
MORTE CELULAR
MorfologiaApoptose
Mudança no aspecto morfológico célula
Perda da integridade celular:
Condensação e segregação da cromatina
Identificação da morte celular
MORTE CELULAR
Invaginação das membranas celular e nuclear
Ruptura do núcleo
Corpos apoptóticos_circundados por envoltório nuclear
MORTE CELULAR
Necrose
Aumento do volume total da célula e organelas Autólise:
Dissolução das membranasRuptura da célulaLiberação de seus subprodutos
MORTE CELULAR
Estímulo a uma inflamação
O núcleo sofre desorganização da cromatina, intumescimento e exibe estruturas vacuolizadas
MORTE CELULAR
Aspectos morfológicos
Quadro esquemático das alterações morfológicas com a apoptose (a) e a necrose (b)
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
Citoquímica e imunocitoquímica
Reação de Feulgen: corante reativo de Schiff
Quantificação do DNA
Exibe morfologia de compactações e descompactações cromatínicas
MORTE CELULAR
Células em apoptose coradas podem ser estudadas em vídeo analisador
Contracoradas com “Fast Green” indica presença e quantificação de micronúcleos
MORTE CELULAR
Aspectos genéticos e bioquímicos
Células gigantes com núcleos de diferentes tamanhos originados por processo de mitose catastrófica (MC), presentes em culturas de células MCF-10. a)Reação de Feulgen e contracoloração com fast green. b) Método de impregnação por prata.
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
Citoquímica e imunocitoquímica Reação de Felgen
Imagens de apoptose (A) em células epiteliais mamárias humanas e em culturas submetidas àreação de Feulgen e contracoradas com fast green
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
Citoquímica e imunocitoquímica Reação de Felgen
Aspectos morfológicos e citoquímicos de núcleos de células em apoptose (A) e necrose (N), cujo DNA é identificado pela reaçao de Feulgen.a) Células epiteliais de hemíptero triatomíneo em que se detectam imagens de células em necrose, além de núcleos com aspecto normal usual (U);b) Células epiteliais mamárias humanas in vitro. Imagem de perfil absorciométrico ao longo de um eixo traçado sobre núcleo apoptótico estudado em vídeo-analisador de imagem. Regiões de cromatina condensada aparecem pseudcolonizadas em vermelho.
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
Concentração crítica de eletrólitos (CEC)
Identificação de nucléolos
Células são coradas com azul de toluidina a pH 4,0
Tratamento com MgCl2 em baixa molaridade
MORTE CELULAR
DNA perde sua metacromasia:Cor violeta verde
Concentração Mg 2+ em molaridade
Ponto ou valor de CEC
MORTE CELULAR
RNA permanece em metacromasia
CEC ocorre numa concentração superior à do DNA
DNA com cromatina compactada
verde intenso
MORTE CELULAR
Identificação imunocitoquímica
Kits
Identificam-se:
fragmentação do DNA internucleossomal
núcleos vesículas
MORTE CELULAR
Princípio
Resíduos de nucleotídeos, ligados àdigoxigenitina, serão ligados ao DNA da célula apoptótica por uma enzima, a TdT( terminal deoxynucleotidyl transferase)
Heteropolissacarídeo, reconhecido pelo anticorpo anti-digoxigenina
MORTE CELULAR
Citoquímica e imunocitoquímica Concentração crítica de eletrólitos (CEC)
Aspectos citoquímicos e imunocitoquimicos de apoptose e morte celular programada. a,b. Apoptose em células V79, submetidas ao método CEC. (a) e a um método imunocitoquímico para apoptose (b) (setas). c, d. Células epiteliais mamárias humanas in vitro em apoptose (setas), identificadas pelo método CEC. e. Morte celular programada (setas) identificada em eritrócitos nucleados de tartaruga por método imunoquímico.Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
Teste TUNEL
Nucleotídeos irão se ligar as extremidades3’-OH do DNA fragmentado pela ação daTdT.Acham-se marcados com fluoresceína:
Microscópio de fluorescência
MORTE CELULAR
Tratado com anticorpos anti-fluoresceína conjugados com peroxidase
Microscópio de luz comum
MORTE CELULAR
Teste “Annexin V”
Identificação por fluorescência células nas fases iniciais da apoptose
Grupamentos de fosfatidilserina são translocados da parte interna para a parte externa da membrana plasmática
meio extracelular
MORTE CELULAR
Proteína anexina v tem alta afinidade pelas fosfatidilserinas
identifica externalização promovida por apoptose
MORTE CELULAR
Há testes imunocitoquímicos que identificam membros da família Bcl-2 e
caspases específicas
MORTE CELULAR
Identificação em nível bioquímico
Apoptose:DNA nuclear – células em apoptose
eletroforese em gel de agarose
Padrão típico de bandas com segmentos de 185 pares de bases e de seus múltiplos
MORTE CELULAR
Teste Cometa
Células em agarose e com proteínas removida campo elétrico
Padrão de habilidade de migração do DNA (cauda)
Identificação da necrose ou apoptose
MORTE CELULAR
Citoquímica e imunocitoquímica Identificação em nível bioquímico
Imagens de eritrócitos de serpentes submetidos ao teste cometa. a. Controle. b. Apoptose. c. Necrose (experimental)
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)
MORTE CELULAR
APOPTOSE
1- substrato específico
TNF (Fas)- Citocinas
- Estresse oxidativo
- Ca- pH- lesão do DNA (via gene p53)
Bcl-2 - mitocôndria
Citocromo – c
Estímulo interno
Caspase-8, 10
Caspase-3
1
Caspase-9
Estímulo externo
Apaf-1
Caspases executoras
Apoptose
Antagônicos
MORTE CELULAR
CaspasesCaspases executoras:
clivagem de quinases
proteínas do citoesqueleto
proteínas de reparo do DNA
subunidades inibidoras de endonucleases
destruição das funções celulares “housekeeping”
afetam regulação do ciclo celular e rotas de sinalização
manifestações morfológicas de apoptose – condensação e fragmentação do DNA e rompimento de membranas
MORTE CELULAR
Fagocitose das células apoptóticas
Phagocyte
ApoptoticCell
RAC-1DOCK 180
CRKII
ELMO
CytoskeletalReorganization for
Engulfment
C1q Receptor
BridgeC1q
C1qBindingSite
PS
Phosphatidyl-serineReceptors
ScavengerReceptors
? Oxidized LDL-like Site
MORTE CELULAR
Câncer X Apoptose
Câncer
Mutações Seleção Natural
Ciclo Celular Apoptose
Oncogenes Supressores de Tumor
MORTE CELULAR
c-Myc superexpresso + p53 ou ARF ou ganho de função de genes Bcl-2 = apoptose
CANCER X APOPTOSE
MORTE CELULAR
Câncer de mama: BRCA1 e BRCA2 – se ligam a Rad51 para reparar quebras na fita de DNA p53
E1B – codifica dois produtos, um que ativa Bcl-2e outro que inibe p53
Sistema Ubiquitin/Proteosome
P53 – ativa Bax inibição da apoptose
CANCER X APOPTOSE
MORTE CELULAR
Terapêutica
ABT-737 - inibe Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w de células cancerígenas
Estratégias antisense e com moléculas antagonistas para inibir membros da Bcl-2
Adenovirus com p53
Aivadores de TNF (Fas)
MORTE CELULAR
STAT3 β - Regula negativamente células T-helperAtivador de genes de imunossupresãoBcl-xl, p53, c-Myc
Terapêutica
miRNA
MORTE CELULAR
Sistema imunológico X Apoptose
Rejeição do enxerto - célula T citotóxica induzem a apoptose das células alvo
glicocorticóides, ciclosporina e tacrolimus - induzem a apoptose das células T