Molekulare Diagnostik
1Institute for Genomcs and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Immunoassayshttp://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html
• Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung• Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays• Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays
• Klassifizierung der Immunoassays wie folgt:
RIA (RadioImmunoAssay)FIA (FloureszentImmunoAssay)IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)Immuno-PCR
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Definition
• Antigen– vom Körper als fremd erkannter Stoff, der
eine Reaktion des Immunsystems auslöst• Antikörper
– die von B-Lymphozyten u. Plasmazellen als Reaktion auf ein Antigen gebildeten Immunglobuline
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Antigen-Antikörper Interaktion
Bindungen:• Wasserstoffbdgen• Ionisch• Hydrophobe Interaktionen• Van der Waals Kräfte
Viele schwache Bindungen ergeben starke Bindung bei hoher Komplimentarität
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Festphasenkopplung
• Feste Phase: Boden einer Microtiterplatte
• Flüssige Phase enthält Analyt
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RIA (RadioImmunoAssay)Markiertes Antigen tritt in Kompetition mit unmarkiertem Antigen (zu analysierende Probe)um Bindungsstelle am Antikörper. Signal ist indirekt proportional der Konzentration vom unmarkierten Antigen.
FIA (FloureszentImmunoAssay)Analog RIA, aber floureszenzmarkiert.
Analog RIA, aber enzymmarkiert.
EIA (EnzymeImmunoAssay)
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IRMA (ImmunoRadioMetricAssay)Markierte Antikörper binden an Antigen, Signal ist damit direkt proportional der Konzentration von Antigen in der zu analysierenden Probe.
ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay)Analog IRMA, aber luminiszenzmarkiert.
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ELISA(EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay)
Dient dem Nachweis vonAntigenen
AntikörpernHaptenen
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ELISA: Prinzip Sandwich
• Festphasen-gekoppelter AK (erster AK)• Nachzuweisendes Antigen bindet an diesen 1. AK • Antigen wird mittels Enzym markiertem AK (2. AK) nachgewiesen• Als Enzyme dienen
HRP (HorseRadishPeroxidase)Alkalische Phosphatase
• Gebundene Enzymaktivität wird über Substratumsatz vermessen • Substrat wird gemeinsam mit löslichem Chromogen angeboten (dieses
ist anfänglich farblos und wird durch den Substrat-umsatz zu int. gefärbter, spektroskop. auswertbarer Form)
• Direkte Proportionalität zw. unbekannter Probe und Farbumsatz
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9Institute for Genomcs and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Elisa-Sandwich-Testprinzip
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Elisa-Sandwich-Testprinzip
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11Institute for Genomcs and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Kompetitiver ELISA• Hauptsächlich zum Nachweis von Haptenen wie Steroidhormonen (sind
zu klein um zwei AK zu binden)
Feste Phase wird/ist mit AK beschichtetZugabe von Tracer und Hapten (unbekannte Probe)
-Tracer = enzymmarkiertes Hapten, wird zu jeder Probe in gleicher Menge beigegeben.-Umso mehr nachzuweisendes Hapten in der Probe ist, umso weniger Tracer wird an die Festphase gebunden (Kompetition).
SubstratzugabeTracer setzt Substrat zu Farbstoff um. Umso weniger Tracer umso weniger Farbumsatz, umso mehr Hapten ist in der Probe.
• Farbe und Probenmenge sind indirekt proportional!!!!• Nachteil: Überschuß an Tracer wirkt sich negativ auf Empfindlichkeit aus!!
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Kompetitiver ELISA
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Immuno-PCR• Verbindet Spezifität von Immunoassays mit Sensivität
von PCR• 100-10.000-fach sensitiver als ELISA• Detektionslimit: fg/ml• Für „low-copy-viruses“• Noch nicht im
klinischen Einsatz
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Beispiele• Blut:
HIV1 und HIV2 (Anwesenheit von Anti-HIV Antikörper)Hepatitis C (Anwesenheit von Antikörpern)Hepatitis B (Nachweis von Antikörper und viralem Antigen)
• Hormone:SchwangerschaftshormonLH (Bestimmung des Eisprungs)TSH, T3 und T4 (Thyroidfunktion)Anabol. Steroide, Sportler: Doping Test
• InfektionsdetektionSexuell übertragbare Erreger (HIV, Syphilis, Chlamydien)Hepatitis B und CToxoplasmose
• Allergene in Lebensmittel und Hausstaub• Rheumatische Faktoren (Autoimmunantikörper)• Toxine im Essen• Drogen: Kokain, Opiate, Marihuana (9-Tetrahydrocannabinol)
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