Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Aula 2: Purificação de Proteínas
(revisão) e Determinação de Estruturas
(difração de raio-X)
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Trabalhando com Proteínas
• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais.
• Separadas de outras de forma pura considerando suas propriedades.
• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.
Análise de Proteínas
• Absorbância;
• Eletroforese em gel desnaturante;
• Western blot (imunoblot).
A280
• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos.
• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.
Métodos de Quantificação Proteica
Principais ensaios de quantificação de proteínas
Fonte: http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html
Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)
• Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico.
• Não é utilizado para purificar proteínas porque afetam sua estrutura e a função.
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
Eletroforese de Proteínas
SDS-PAGE
• SDS (sodium dodecyl sulfate)
• 1 molécula de SDS para cada 2
resíduos de aminoácidos.
• Contribui com grande carga negativa.
• SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.
Eletroforese de Proteínas
• Método analítico: útil tanto para separar quanto para visualizar proteínas.
• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.
• Permite determinação da
massa molecular
aproximada.
Eletroforese de Proteínas
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.
• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
Western blot (imunoblot)
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína
Métodos clássicos
Diferença de propriedades das proteínas: carga,
tamanho, ligantes.
Métodos modernos
Clonagem de DNA, sequenciamento
genômico, proteínas recombinantes, etc.
Trabalhando com Proteínas
• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.
• Mais de um método de purificação utilizado.
• Escolha do método: empírico.
• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.
• Iniciar com métodos de baixo custo.
Purificação Proteica: Fonte Proteica
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
• Extração Isolamento
1. Material de Partida ------ Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
•Solubilidade
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Separação
Diálise
Ultra filtração
Coluna Cromatografica
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
Métodos Cromatográficos
• Poderoso método de fracionamento.
• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.
• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.
Cromatografia em Coluna
Lehninger, 6ª ed. 2010
Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:
o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);
o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;
o Afinidade;
o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).
Blue-Sepharose
C+ Ind S FT W1
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN
Fosfocelulose
S FT W1 W2
Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4
1 2 3 4
Coloração com Prata
Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646
©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Western Blot
Proteínas Recombinantes
Cromatografia de Afinidade
Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Sistemas de Expressão
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
6 códons para His (CAT ou CAC)
ou
Inclusão dos códons de His
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática – Vetor de
Expressão para Células Humanas
Tags de Fusão de Proteína Comuns
Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:
1 - Abundância
2 - Especificidade pela Coluna
Cromatográfica
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante
Expressão em Sf9
Extrato Celular
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de Ni-NTA
Quilos de ovos de D. melanogaster
Centrifugação diferencial
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de DNA-celulose
Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose
Coluna de Blue-agarose
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa vs
Recombinante
Determinação da Estrutura Tridimensional de Proteínas por
Difração de Raios-X
Níveis estruturais das proteínas
Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.
Estrutura proteica
• A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos
• A função depende da estrutura
• Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis
• As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes
Estrutura tridimensional
• Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação
• As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes.
• Porém, poucas são as conformações nativas.
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
Determinação da estrutura
tridimensional proteica
• O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas.
• Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.
Mas...o que são cristais?
• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional.
• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.
Sólidos cristalinos
• Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.
Como observar os cristais?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.
Como observar os cristais?
• Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
Cristalografia de raios-x
• Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-X.
• O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!!
• Segundo, obter cristais!!!
Cristalografia de raios-x
Cristalografia de raios-x
• Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);
Padrão de difração dos raios x
Fonte: Paula Kuser Falcão.
Cristalografia de raios-x
• Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem.
• Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.
Cristalografia de raios-x
• A difração de raios-X aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.
Padrão de difração dos raios x
Cristalografia de raios-x
• A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra.
• Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados.
• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.
Cristalografia de raios-x
• O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva.
• Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.
A partir da cristalografia de raios-x, é
possível...
• Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.
ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS
Exemplo de proteínas cristalizadas
Fonte: Paula Kuser Falcão.
Oliveira et al. 2015. Genome Biol Evol.
Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Próxima aula 21/08: Prática – Entendendo Cristalografia
e Visualizando Estruturas Proteicas
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