Meccanismi d’azione del fitocromo
•Regolazione espressione genica:-Componenti del “photosynthetic machinery” sono regolati dalla luce, spesso tramite Phy-Attivazione di geni targets, mediante interazione con TFs, quali PIF3, HY5, DOF...
R
FR darklight
Percezione segnale
Trasduzionesegnale
Network trascrizionale
Variazioniespressione Fotomorfogenesi
I Pathways attivati da phyA/B.........
Identificazione delle molecole poste a valle di phyA/B:• approccio genetico• approccio cellulare/biochimico
Approccio Genetico screening per mutanti nel/i fitocromo/i e nel signalling del/i fitocromo/i identificazione di 2 classi di mutanti:
•cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca)
•hy (long hypocotyl)
cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca):
hy (long hypocotyl):
LUCE BUIO
wtcop wtcop
LUCE
wthy
cop/det/fus (constitutive photomorphogenic/deetiolate/fusca):
mutanti deeziolati anche se cresciuti al buio,risposte al segnale luminoso costitutivamente
accese mutazioni recessive
le proteine Wt sono regolatori negativi che agiscono al buio x reprimere la fotomorfogenesihy (long hypocotyl):
fenotipo alla luce ≈ plantula cresciuta al buio,risposte al segnale luminoso ridotte o nulle
Mutanti nel cromoforo: •ipocotile allungato in luce W•ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Mutanti in uno specifico fitocromo:•ipocotile allungato in luce W•ipocotile allungato in condizioni di luce -specifiche Mutanti in un regolatore positivo (hy5):•ipocotile allungato in luce W, R. FR, blu
Effetti fenotipici delle mutazioni cop/det
Fenotipo al buioGerminazione Phy-mediatedLungh.ipocotileEspansione cotiledoniSviluppo foglieDifferenz. CloroplastiAccumulo antocianiInduzione geni luce-regolati
Fenotipo alla luceFiorituraAltezza pianta
+ - ? + +lungo corto corto corto corto
- + + + +- + - - -- + - + +
- + + + +- ++ ++ ++ ++
normale normale ritardato anticipato letale
normale nano nano nano max4 fog.
WT det1 det2 cop1 cop9
Fattori nucleari coinvolti nel pathway fitocromo
• COP1: funziona da E3 ubiquitin-protein ligasi, targeting proteine specifiche per la degradazione mediante ubiquitinazione. Agisce come repressore, antagonista di HY5• COP9: “signalosome complex” (11 fattori) responsabile della degradazione di proteine ubiquitinate• HY5: bZip TF, target 1°ario di questo pathway; lega le G-box sui promotori luce-regolati. Il livello steady-state del suo mRNA è mantenuto basso al buio mediante ubiquitinazione (COP1) e azione del complesso COP9
• DET2: putativo fattore di remodeling della cromatina
• DET1: elemento di biosintesi dei Brassinosteroidi, ormoni steroidei vegetali, che mimano parte degli effetti mediati dalla luce
• PIF3: fattore di trascrizione bHLH, localizzato costitutivamente nel nucleo, lega in modo luce-dipendente e Phy-dipendente, i promotori di geni luce regolati • interagisce sia con PhyA che con PhyB, ma l’interazione è 10x > con PhyA• poc1: mutante knock-on nel promotore di PIF3, aumentata risposta a luce R• PIF4: altro fattore di trascrizione, PIF3-like, interagisce con PhyB Pfr
•Regolazione intercellulare phy-mediata:-Alcune risposte di crescita/sviluppo sono molto rapide e probabilmente mediate da variazioni inter-intracellulari di ioni/metaboliti (meccanismo citosolico di crescita/omeostasi)
Meccanismi d’azione del fitocromo
Single-cell assays:•Microiniezione in cellule WT & del mutante aurea (phyA-, tomato)•Aurea manca di PhyA attivo mentre PhyB è normale•Cellule dell’ipocotile di aurea non sviluppano cloroplasti ne’ antociani in risposta alla luce a differenza del WT•Mutante aurea complementato da microiniezione di PhyA esogeno: sviluppo cloroplasti, sintesi antociani e induzione di un gene reporter fotoregolato (Pr.light/GUS)
Approccio Cellulare-Biochimico
Reazioni controllate da Phy a livello cellulare:•Regolazione genica•Sviluppo dei cloroplasti (PSII, PSI)•Biosintesi degli antociani
Agonisti:GTPS (GTP analogo), subunità A di cholera toxin (GTP analogo), 8Br-cGMP (cGMP analogo), Calcium, CaMAntagonisti:GTPS, Rp-8Br-cGMPS
cGMP attiva espressione di chs in cellule WT al buio
ATP syn
Cyt.b6f
0 1 2 3 5 7 9 11
Luce (ore)
cab
fnr
atp
rieske
rbcS
chs
PSII
antho
PSI
stroma
Complessifotosintetici
0 1 3 7 10 1 3 7 10 1 3 7 10
Dark8Br-cGMP Rp-8Br-cGMPS-
Analogo cGMPattivo
Analogo cGMPinattivo
phyA PSIICyt.b6f
Ca2+
CGMP
G
CaM
Anthocyanin(chs)
PSILHCI/IIATPsynth.RUBISCO
Choloroplast development
G: heterotrimeric G proteins, switch molecolari che cambiano conformazione da una forma attiva GTP-legata ad una GDP-legata inattiva
• Il sistema agisce modulando l’espressione di geni a livello nucleare FTs attivati da Ca2+, caM, cGMP, • i due segnali sono generati separatamente• i targets dei 2 pathways sono geni distinti• anche i prodotti finali (outputs) sono distinti
Pfr Ca2+
G protein
Pr
PK pathway
Pfr Pfr*
DET/COPPIF3
LIGHT
PKS
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