UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJAUNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJALa Universidad Católica de LojaLa Universidad Católica de Loja
Proliferación Muerte
• Muerte Celular Programada.• “Suicidio” para beneficio del
organismo.• No afecta a células vecinas, no
produce inflamación.
• Etapas– Inicio– Decisión– Ejecución– Ablución
• Etapas– Inicio– Decisión– Ejecución– Ablución
E
• Fisiológicamente– Remodelamiento – Liberar espacio– Formar un nuevo tejido– Eliminar células sobrantes
• Patológicamente– Agentes Externos: bacterias,
virus, radiación, etc.– Agentes Internos: mutaciones
• Activación de la maquinaria de reparación.
• Activación de las vías de la Apoptosis
APOPTOSIS
Caspasa 8
p53
Citocromo c
Bcl-2
Bax
Apoptosoma
TNF, etc.Radiación
Quimioterapia, etc.
Vía Extrínseca Vía Intrínseca
Caspasa 3
• Debilitamiento del citoesqueleto y membrana citoplasmática
• Degradación del núcleo y condensación del material genético.
• Degradación de Organelas.• Formación de Cuerpos Apoptóticos.
Célula Normal Proceso Apoptótico
Cuerpos Apoptóticos
• Receptores de reconocimiento: – Fosfatidil Serina (FS)
• Membrana citoplasmática es dependiente de ATP.• Liberación de citocromo c implica una disminución de la reserva
energética y perdida de la estabilidad de la membrana citoplasmática.
Macrófagos
Cuerpos Apoptóticos
= FS
Célula Normal
Matriz Extracelular
Citoplasma
Macrófago
Receptor de FS
ATPATP
Célula Apoptótica
ATPATP
• Principal causa de mortalidad a nivel mundial.
• Proliferación incontrolada de células anormales.
• Las células evaden la Apoptosis y adoptan un nivel de proliferación ilimitado originando una carcinogénesis.
Proliferación
Muerte
CARCINOGÉNESISCARCINOGÉNESIS
Célula Afectada
Célula Normal
• Activación de Apoptosis sobre células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer.
• Quimioterapia:– No es específica– Afecta a las células normales– Efectos adversos
• Compuestos capaces de Inducir apoptosis e inhibir la proliferación celular descontrolada.
• Necrosis:
• Senescencia: Perdida de la capacidad de replicación.• Autofagia: Autofagocitosis.• Oncosis: Perdida de Reserva Energética.• Piroptosis: Caspasa 1.
Célula Normal
Proceso Necrótico
Respuesta Autoinmun
e
linfocitos
• Los eventos bioquímicos durante la apoptosis pueden ser detectados a través biomarcadores.
• Indicadores de uno o varios procesos, pueden ser medidos y analizados.
Ac-Ac-DEVDDEVD
pNA
Caspasa 3
+
Ac-Ac-DEVDDEVD
pNA
Anexina VAnexina VFLUOSFLUOS
Ca2+
= FSCélula Apoptótica
Radiación
Fluorescencia en campo oscuro
Célula Apoptótica
Célula Necrótica
• General:
– Implementar dos diferentes ensayos que permitan la determinación de muerte celular por apoptosis en la línea celular RKO, expuestas durante 24 h a diferentes dosis de Doxorrubicina.
• Específicos:
– Desarrollar curvas Dosis/Respuesta para establecer las dosis a probar de Doxorrubicina mediante el ensayo de viabilidad por captación de: FDA-BrEt.
– Determinar la actividad de caspasa 3 mediante el ensayo “CaspACE™ Assay System, Colorimetric” en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas.
– Mediante el ensayo de Anexina V, determinar el índice de células en apoptosis en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas.
Tratamiento
24 h Incubación
Cosecha
EXTRACTO CELULAR
RKO(Carcinoma de Colon)
0,5 µM
1 µM
2,5 µM
5 µM
37ºC5% CO2
24 h Incubación
37 ºC, 5% CO2
Microscopio de Fluorescencia
Vivas
Muertas
Agonizantes
EXTRACTO CELULAR
FDA
BrEt
Tinción con Solución de Trabajo
Lavados
ConteoConteo
BRADFORD
µg/mL ProteínaCurva Estándar: ASB
Incubación a Temperatura Ambiente: 30min
Incubación a 37 ºC, 4 h
Lisis Celular
Extracto Proteico
Ac-DEVD p-NA
Espectrofotómetro620 nm620 nm405 nm405 nm
EXTRACTO CELULAR
Microscopio de Fluorescencia
LavadosBrEtBrEt
Tinción con Solución de Trabajo
Anexina VAnexina VFLUOSFLUOS
Ca2+
ConteoConteo
Vivas
MuertasAPOPTÓTICAS
• Cada ensayo fue realizado por duplicado en tres experimentos independientes
• Analizados mediante es Software estadístico “GraphPad”, a través del test de Dunnet y Tukey
• La activación de apoptosis en células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer.
• La Dxo permitió implementar dos biomarcadores para la detección de apoptosis.
ControlControl 0,5 0,5 μμM DxoM Dxo 1 1 μμM DxoM Dxo 2,5 2,5 μμM DxoM Dxo 5 5 μμM DxoM Dxo
Smukste, et al. 2006
MTT:
C-26 (Cáncer de Colon)
1 µM Dxo – 24 h40 % Viabilidad
Smukste, et al. 2006
MTT:
C-26 (Cáncer de Colon)
1 µM Dxo – 24 h40 % Viabilidad
Han, et al. 1997
Eficiencia en Placa:
Rat-1 (Fibroblastos de Rata)
0,1 µM Dxo – 24 h- 90 % Viabilidad
Han, et al. 1997
Eficiencia en Placa:
Rat-1 (Fibroblastos de Rata)
0,1 µM Dxo – 24 h- 90 % Viabilidad
El sustrato Ac-DEVD-pNA tambien puede ser clivado
por las caspasas: 7, 1, 4 y 6.
El sustrato Ac-DEVD-pNA tambien puede ser clivado
por las caspasas: 7, 1, 4 y 6.
Tong, et al. 2000
U-937 (Cáncer leucémico)
20 Gy/min de radiación0,250 nm aproximadamente
Tong, et al. 2000
U-937 (Cáncer leucémico)
20 Gy/min de radiación0,250 nm aproximadamente
La línea celular MCF-7 no expresa caspasa 3.
La línea celular MCF-7 no expresa caspasa 3.
Thompson, et al. 2004
RKO, 0,5 µM Dxo – 48 h90 % de células apoptóticas
Thompson, et al. 2004
RKO, 0,5 µM Dxo – 48 h90 % de células apoptóticas
La vía de muerte apoptótica no es estática.
Ambos biomarcadores se activan en tiempos diferentes.
A pesar de que las células entren en apoptosis tardía, la actividad de la caspasa 3 todavía no decrece y dependiendo de las condiciones, puede seguir clivando a sus sustratos.
La vía de muerte apoptótica no es estática.
Ambos biomarcadores se activan en tiempos diferentes.
A pesar de que las células entren en apoptosis tardía, la actividad de la caspasa 3 todavía no decrece y dependiendo de las condiciones, puede seguir clivando a sus sustratos.
• 1 µM de Dxo, es una adecuada concentración para ser aplicada en ensayos de viabilidad y de inducción de apoptosis.
• Para determinar el tipo de muerte que induce un compuesto citotóxico es importante escoger adecuadamente el modelo biológico, el biomarcador y el tiempo en cual se hace la cuantificación.
• La Caspasa 3 y Anexina-V, son biomarcadores para la determinación de apoptosis.
• Ambos miden distintos proceso, y son igual de útiles y Ambos miden distintos proceso, y son igual de útiles y complementarios entre sí.complementarios entre sí.