Identification de gènes impliqués
dans le développement des
lymphomes cutanés primitifs
CD30+Laboratoire d’Histologie et Pathologie Moléculaire des
Tumeurs
EA 2406 - Université Victor Ségalen Bordeaux 2
Directeur de thèse : Jean Philippe Merlio
Thèse présentée par Emilie Loreau
Lymphomes
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
DéfinitionProlifération maligne de lymphocytes B ou T
Localisation principale dans les tissus lymphoïdes
Monoclonalité
Lymphoproliférations CD30+Lymphome cutané primitif (LCP) CD30+
Papulose lymphomatoïde (Ply)
Lymphome systémique CD30+
Peau
Ganglion
Antigène de surface CD30
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Expressions
- Lymphocytes T activés sanguins (15%)
- Lymphoproliférations CD30+
Famille du TNF-R
Fonction Récepteur transmembranaire (120 kDa)
NF-KB
CD30L
CD30Membrane plasmique
MAPK
TRAF
Lymphome cutané primitif CD30+
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Classification 9 % des lymphomes cutanés primitifs (EORTC)
Clinique Tumeur cutanée, régression spontanée, récidive
Age 60 à 70 ans
Pronostic Survie à 5 ans 95%, si extension extra-cutanée 25%
Histologie Non épidermotrope, infiltrat dense
Phénotype Lymphocytes T exprimant le CD30+ (70 %)
Génotype Réarrangement clonal du gène du TcR : (70 %)
Lymphome cutané primitif CD30+
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Epiderme
Derme
Prolifération tumorale
LCP CD30+
Patient
Peau Saine
Hypoderme
Derme
Epiderme
Papulose lymphomatoïde / LCP CD30+
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Ply type A Ply type CAutre cas frontière
LCP CD30+
HistologieCellules CD30+
Cellules inflammatoires
disperséesnombreuses
en amas+/- rares
disperséesnombreuses
en amas+/- rares
CliniqueLésions
Distribution
EvolutionRégression spontanée
Atteinte extra-cutanée
toujoursexceptionnell
e
toujoursexceptionne
lle
50 %rare
30 %25 %
papule>nodulegénéralisée
nodule>tumeurloco-régionale
L. systémique CD30+ / LCP CD30+
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
L. systémique CD30+ LCP CD30+
Age Bimodal : 20 et 70 ans 60 à 70 ans
Clinique
AgressifAtteinte extra-ganglionnaire, osseuse ou cutanée (20/30
%)
Non agressifTumeur cutanée souvent
localiséeAtteinte extra-cutanée, ganglionnaire (25 %)
Histologie Infiltrat diffus détruisant l’architecture du ganglion
Infiltrat dense non épidermotrope
Phénotype T, nul ou rarement B, CD30+
T ou nul, CD30+
Génotype Réarrangement clonal du TcR t(2;5) > 50 %
Réarrangement clonal du TcR
Pronostic : survie à 5
ans
77 % chez le sujet jeune54 % pour les sujets âgés
95 %Extension extra-cutanée : 25
%
Gènes et cancers
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
OncogèneActivation du cycle cellulaire
Inhibition de l’apoptose
Mutation dominante
Gène suppresseur de tumeur
Inhibition du cycle cellulaire
Activation de l’apoptose
Mutation récessive
Colon sain
Cancer + Métastase
s
Cancer
APC
K-Ras
DCC
p53
…
Objectif
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Oncogenèse du LCP CD30+ ?
Aide au diagnostic
Cible thérapeutique
Voies de transduction
Etude du transcriptome
Etude du transcriptome
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Approches globalesPuce à ADNc
mRNA differential display
SSH « Substractive Suppressive Hybridization »
Approches cibléesRT-PCR
RT-PCR en temps réel
Stratégie
Introduction
Conclusion
Banque SSHCriblage banque
Validation candidats
Banque soustraite
Macro-array
RQ-PCR
?
Réalisation de banques par
SSH
Criblage des banques
Validation des gènes candidats
Principe de la SSH
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
Diatchenko et al, 1996
Comparaison de deux populations cellulaires différentes :
tester et driver
Gènes spécifiques de la population cellulaire tester
ButMise en évidence de gènes spécifiques d’une population cellulaire
Normalisation entre les ARNm fortement ou faiblement représentés
Suppression des gènes présents dans les deux populations
Etapes de la SSH
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
AAAA
tester ou driver
tester
RT
RsaI
Ligatio
n
PCR
Clonage
Hybridations
SSH
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
PCR2PCR1
a, c et d
b
Tester 1
Tester 2R
Driver
H1b
H1a
a b c d
a b c d +
e
H2
Ex
a b c d
e
Choix des échantillons
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
Prélèvement de la tumeur cutanée
Lymphocytes tumoraux
ARN totaux
Prise de sang
Lymphocytes sanguins
ARN totaux
DriverTester
18S
28S
ARN dégradés
SSH
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
Etapes critiques
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver)
1 2 3 4 5Gel d’agarose 2 % w/v
1. Marqueur PM 100 pb
2. Tester 1, lié
3. Tester 1, lié ou non
4. tester 2R, lié
5. tester 2R, lié ou non
1 2
Gel d’agarose 1,2 % w/v
1. ADNc non digéré
2. ADNc digéré
Ligation des adaptateurs pour créer deux populations tester
S NS S NS M
Validation d’une banque SSH
IntroductionConclusio
nBanque
SSHCriblage banque
Validation candidats
S NS
18 23 28 33 18 23 28 33
Soustrait Non Soustrait
Clonage dans le pGEM T vector
8 SSH réalisées
3 SSH validées
4 SSH criblées
PCR1 PCR2
Efficacité de soustraction
Criblage des banques soustraites
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Organisation des banques
sur membranes
Clonage
T C G A G T C A
SéquençageHybridation des sondes
radioactives
ButDiminuer le nombre
de faux positifs
S NS
PCR2
A partir des clones
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Sonde tumoral
e
Sonde non tumorale
Organisation des clones en deux boites homologues : grille à 228 positions
Transfert des bactéries sur membrane de nylon
Fixation de l’ADN des bactéries sur les membranes
Hybridation des sondes radio-marquées
Par Dot Blot
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Tumeur Non tumeur
Organisation des clones dans des plaques de 96 puits
PCR à partir des clones en suspension (amorces M13)
Fixation des produits de PCR sur deux membranes de nylon par Dot Blot
Hybridation des sondes radio-marquées
Résultats du criblage
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
2230 spots 349 clones
Criblage
118 gènes candidats
Séquençage
Dot Blot : 15 gènes
THW
Humanine
Bibliographie : 16 gènes
PTTG1
Bcl11B CIN85
SPARC p120 cat
+ Validation RQ-PCR
Résultats du criblage
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Kératine 6Annexes cutanéesSurexpression dans un environnement prolifératif
ARN 18STrack de ASurexpression dans les cellules tumorales
CMH IIFortement exprimé dans les lymphocytes T activés
Importance du choix des échantillons
Validation des candidats
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
PCR en temps réel ou RQ-PCR
Normalisation par PO (gène de ménage)
Quantification relative (tumeur par rapport à non tumeur)
Augmenter le nombre d’échantillons testés
But Vérifier par une autre technique les variations d’expressions
RT-PCR en temps réel
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Transcription inverse 2 g
11 cas de LCP CD30+
7 tumeurs initiales
3 récidives
1 ganglion
2 cas de L. systémique CD30+
7 lymphocytes sanguins sains
Echantillons testés
RT-PCR en temps réel
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Amplification avec des amorces spécifiques du gène d’intérêt
Utilisation d’un intercalent fluorescent : le SYBR-Green
Mesure de la fluorescence en fin d’élongation
Intensité de fluorescence quantité de cible
Amplification par PCR
T-
3 mM
5 mM
4 mM
Cinétiq
ueCt
Exemple de résultats
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
T-3 mM
4 mM
5 mM
Courbe de
fusion
[MgCl2] pour le
gène PO
Choix d’un gène de ménage
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Choix des amorces : GAPDH, G6PD, PO, -actine
Etude sur 14 échantillons dont 4 tumeurs LCP CD30+
Travail en duplicate et en Ct
0
5
10
15
20
25
30
35
P1 P3 P10E P11 LP8 LPx LPy Lc Ld L1 L2 LP3 LP4 Plhu
Echantillon
Ct
PO actine G6PD
GAPDH GAPDH3
Choix d’un gène de ménage
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
P1 P3 P10E P11 LP8 LPx LPy Lc Ld L1 L2 LP3 LP4 Plhu
actine/GAPDH3 PO/GAPDH3 G6PD/GAPDH3
Gène de ménage
GAPDH
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
P1 P3 P10E P11 LP8 LPx LPy Lc Ld L1 L2 LP3 LP4 Plhu
PO/actine G6PD/actine GAPDH3/act
Gène de ménage
actine
Analyse des résultats de RQ-PCR
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
x
RQ-PCR en duplicate sur chaque échantillon
Moyenne des Ct des duplicates (0,3)
Gamme de dilution [concentration arbitraire]
Normalisation : [Gène d’intérêt]
[PO]
Gènes d’intérêts
Gène de ménage PO
Résultats RQ-PCR relative
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
THW (11) p120 caténine (7)
SPARC (5) PTTG1 (9)
Surexpressions31 candidats étudiés sur 13 échantillons
Sousexpressions
Humanine (9) CIN85 (7) Bcl11B (7)
Gènes Surexprimés - THW
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Hildebrandt et al, 2000 et 2001
Perte d’hétérozygotie fréquente en 6q
Mélanome sans métastase : 10 à 20 %
Mélanome avec métastases : 50 %
THW et kératine 6 : même profil d’expression
!
THW fortement exprimé dans les cellules épidermiques
Gène
suppresseur de
tumeur
MP
p120
E-cadhérine
cat
actine
cat
Gènes Surexprimés - p120 caténine
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Surexpression : cancer gastrique
Sousexpression : autres cancers
Noyau
?Kasio
Xp120
Quels sont les gènes inhibés dans les lymphocytes T ?
Anastasiadis et Reynolds, 2001
Gènes Surexprimés
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Oncogène
s
JUN-B surexprimé dans LCP CD30+
Tumeurs initiales (facteur 4)
Récidives (facteur 8 à 15)
c-junSPARC
AP1
SPARC
Briggs et al, 2002. Mao et al, 2003
Glycoprotéine MEC
Surexpression : certains cancers
Surexpression :
Lymphoproliférations T (70 %)
Ségrégation des chromatides (mitose)
PTTG1Tumeurs initiales
Pey et Melmed, 1997. Saez et al, 2002
Gènes sousexprimés
IntroductionConclusio
nBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Protéine doigt de zinc nucléaire
Cerveau, système immunitaire
Lymphomes du thymus (souris) :
Délétions homozygotes
Bcl11B
Wakabayashi et al, 2003
Gène
suppresseur de
tumeur
Protéine adaptatrice
Prolifération/apoptose ?
PI3KCIN 85 Apoptose (neurones)
CIN85
Take et al, 2000. Gout et al, 2000
Hashimoto et al, 2001. Guo et al, 2003
Peptide anti-apoptotique (24 aa)
Séquence homologue à l’ARN 16S
HumanineOncogène
Humanine Apoptose
Bax
Conclusion
IntroductionConclusi
onBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Trois gènes sousexprimés
Bcl11B : gène suppresseur de tumeur
CIN85
Humanine
Quatre gènes surexprimés dans les LCP CD30+
SPARC et PTTG1 : oncogènes
p120 caténine
THW : biais expérimental (choix des échantillons de départ)
Fonction
oncogénique ou
phénotype
Perspectives
IntroductionConclusi
onBanque SSH
Criblage banque
Validation candidats
Augmenter le nombre des échantillons analysés : Marqueurs ?
ISH ou microdissection : localisation des ARNm
Immunohistochimie : localisation et niveau d’expression protéique
SSH et CGH ?Voies de signalisations impliquant les différents
gènes
CIN85 : recherche des partenaires - immunoprécipitation (prolifération ou apoptose)
JUN-B et SPARC
p120 et Kasio
Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Jean Philippe Merlio
Financement : Programme de Recherche Clinique d’Aquitaine
Pr. Jacques Emile Bonnet
Pr. Gilles Favre
Pr. Pierre Brousset
Remerciements
Pr. Marie Beylot Barry
Dr. Béatrice Vergier
Dr. Marie Parrens
Laboratoire du Pr. Merlio
Dr. Nathalie Carrère
Jackie Ferrer
Dr. Edith ChevretLaboratoire du Pr. De
Mascarel
Mme Beau
Labo Bio Mol
Endocube
Et aussi !
Christine Bartoli
Michelle Turmo
Jean Christophe Garoste
Jean Christophe Cometta
Martina Prochazkova
Alexis Groppi
Henri Gomez
Pierre Dubus
Marc Antoine Belaud Rotureau
Nicolas Bitteau
Brigitte Tauzin
Christophe Barthe
Fanny Pelluard
Armelle Bolzec
Lilian
Sylvain Caillol
Ma famille et mes amis pour leur soutien permanent
Cédric Barrière
Peyo
Dominique Bertheau
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