Hochschule Anhalt (FH)
Hochschule Anhalt (FH)
Fachbereich Angewandte Biowissenschaften und Prozesstechnik
Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung UFZ
Department Seenforschung
Diplomarbeit
CROSS-FLOW-MIKROFILTRATION FÜR DIE AUFKONZENTRIERUNG VON MIKROORGANISMEN AUS GEWÄSSERN
vorgelegt von: Corinna Völkner
geboren am: 25.09.1966
Studiengang: Verfahrenstechnik
1. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Pätz
2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Lorenz
3. Gutachter: Dr. Katrin Wendt-Potthoff
Magdeburg, 01.09.2010
Diese Arbeit widme ich meinem Sohn
Yves Völkner
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Reinhard Pätz und Prof. Dr. Klaus Lorenz für
die Betreuung dieser externen Arbeit meinen Dank aussprechen.
Frau Dr. Katrin Wendt-Potthoff danke ich für die Bereitstellung dieses sehr interessanten
Themas. Vielen Dank für die Betreuung dieser Arbeit und das entgegengebrachte Vertrauen,
was mir den Freiraum für diese Arbeit ließ. Gleichzeitig möchte mich für die vielen
fachlichen Impulse bedanken.
Herrn Dr. Matthias Koschorreck, dem Leiter des Departments Seenforschung, danke ich für
die Möglichkeit zur Durchführung diese Arbeit.
Ich möchte mich bei den Kolleginnen und Kollegen bedanken, die zum Gelingen der Arbeit
beigetragen haben. Ein besonderer Dank gilt Martin Wieprecht für die souveräne
Unterstützung im Labor. Weiterhin danke ich Yvonne Rosenlöcher, Ute Kuhlicke, Ute Link
und Erika Ruschak für die konstruktive Zusammenarbeit.
Herrn Dr. habil. Bertram Böhrer, Herrn Dr. Olaf Büttner, Frau Dr. Barbara Zippel, Frau Dr.
Susanne Angelstein, Herrn Dr. Jörg Tittel, Herrn Dr. habil. Norbert Kamjunke, Herrn Dr.
Wolf von Tümpling und Herrn Dr. Thomas Neu danke ich für die Beantwortung meiner
vielen Fragen.
Telse David danke ich für die hilfreichen Tipps und vielen wertvollen Gespräche.
Ein besonderer Dank geht an Klaus und Renate Görling. Vielen Dank für die viele kostbare
Zeit, die wir zusammen verbracht haben.
Ein ganz liebevoller Dank gilt meiner Mutter, meinem Vater, meiner Familie und meiner
Freundin Manuela Hirschner.
Bibliothekserklärung
Name: Völkner
Vorname: Corinna
Geb.-Datum: 25.09.1966
Matrikel-Nr.: 4043839
Studiengang: Verfahrenstechnik
Zustimmungserklärung
Ich bin damit einverstanden, dass auf Vorschlag meines Betreuers ein Exemplar meiner
Abschlussarbeit der Bibliothek der Hochschule Anhalt (FH) zur Verfügung gestellt und in
den benutzbaren Bestand aufgenommen wird.
Köthen, den 01.09.2010
Corinna Völkner
Selbständigkeitserklärung
Erklärung
Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst, in gleicher oder
ähnlicher Fassung noch nicht in einem anderen Studiengang als Prüfungsleistung vorgelegt
und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen benutzt habe.
Köthen, den 01.09.2010
Corinna Völkner
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.........................................................................................................I
Abbildungsverzeichnis ..............................................................................................III
Abbildungsverzeichnis Anhang ................................................................................ VI
Tabellenverzeichnis................................................................................................VIII
Tabellenverzeichnis Anhang..................................................................................... IX
Symbolverzeichnis...................................................................................................... X
1 Einleitung..............................................................................................................1
1.1 Problemstellung ............................................................................................................... 1 1.2 Ausgangssituation nach dem Stand der Technik ........................................................ 2 1.3 Konzept der Arbeit ......................................................................................................... 3
2 Verfahrenstechnische Grundlagen....................................................................... 4
2.1 Filtration und Filtrationsverfahren................................................................................ 4 2.2 Mikrofiltrationsverfahren................................................................................................ 6 2.3 Kenngrößen der Mikrofiltration.................................................................................... 7
2.3.1 Transmembrandruck ................................................................................................. 7 2.3.2 Permeabilität ............................................................................................................... 8 2.3.3 Selektivität ................................................................................................................... 8
2.4 Modellierung des Stofftransportes bei der Mikrofiltration........................................ 9 2.4.1 Das Porenmodell........................................................................................................ 9 2.4.2 Diffusionsmodell...................................................................................................... 10 2.4.3 Das Pinch-Modell .................................................................................................... 13 2.4.4 Ablagerungsmodell................................................................................................... 14 2.4.5 Deckschichtmodell................................................................................................... 15
2.5 Membranfouling ............................................................................................................ 17 3 Biotechnologische Grundlagen ..........................................................................19
3.1 Mikroorganismen........................................................................................................... 19 3.1.1 Bakterien.................................................................................................................... 19 3.1.2 Morphologie der Bakterien..................................................................................... 19 3.1.3 Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft mit Biolog-
Mikrotiterplatten ............................................................................................... 20 4 Material und Methoden ..................................................................................... 23
4.1 Untersuchungsgebiete ................................................................................................... 23 4.1.1 Die Elbe..................................................................................................................... 23 4.1.2 Der Sauteich und der Saubach ............................................................................... 24
4.2 Probennahme ................................................................................................................. 24 4.3 Aufbau des Munich Cell Concentrator 1 ................................................................... 25 4.4 Bilanzierung der Filtration............................................................................................ 30 4.5 Durchführung der Filtration ........................................................................................ 32
Inhaltsverzeichnis
II
4.5.1 Vorfiltration .............................................................................................................. 32 4.5.2 Vorbereitung des MCC 1 (Initialisierung) ............................................................ 32 4.5.3 Filtrationsprozess ..................................................................................................... 33 4.5.4 Regenerierung ........................................................................................................... 36
4.6 Biolog-Mikrotiterplatte ................................................................................................. 36 4.6.1 Animpfen................................................................................................................... 38 4.6.2 Inkubation und Vermessung .................................................................................. 38 4.6.3 Auswertung ............................................................................................................... 38
4.7 Mikrobiologische Untersuchungen ............................................................................. 40 4.7.1 Färbung und Mikroskopie ...................................................................................... 40 4.7.2 Bakterienkonzentration ........................................................................................... 41 4.7.3 Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen ........................................... 41 4.7.4 Gesamtbakterienzahl ............................................................................................... 41 4.7.5 Biovolumen der Bakterien ...................................................................................... 42 4.7.6 Biomasse von Bakterien .......................................................................................... 42 4.7.7 Wiederfindungsrate der Bakterien ......................................................................... 42 4.7.8 Anreicherungsfaktor ................................................................................................ 43
4.8 Bestimmung der Proteinkonzentration ...................................................................... 43 5 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................... 45
5.1 Die Wiederfindungsrate der Bakterien, ihr Biovolumen, -masse und die Morphologie ................................................................................................................... 45
5.1.1 Bestimmung des druckkontrollierten Arbeitsbereiches...................................... 45 5.1.2 Bestimmung der Wiederfindungsrate in Abhängigkeit des TMP ..................... 45 5.1.3 Bakterienkonzentration ........................................................................................... 52 5.1.4 Bakterienmorphologie ............................................................................................. 54 5.1.5 Biomasse und Biovolumen ..................................................................................... 55
5.2 Bestimmung der Bakterienzahl durch die Proteinbestimmung .............................. 56 5.3 Spül- und Desinfektionsverfahren des Filtrationsmoduls ....................................... 57 5.4 Auswirkung der Anreicherungsprozesse auf die Substratverwertung.................... 58
5.4.1 Die durchschnittliche Farbentwicklung der einzelnen Fraktionen der Proben............................................................................................................................. 58
6 Zusammenfassung und Ausblick ...................................................................... 65
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 67
8 Anhang .................................................................................................................. i
Abbildungsverzeichnis
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Arbeitsbereiche von Trennverfahren, modifiziert nach (Gasper 2000).......5
Abbildung 2: Prinzip der statischen und dynamischen Filtration.........................................6
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Anlage zur Cross-Flow-Mikrofiltration....7
Abbildung 4: Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen
Druckdifferenz und der Geschwindigkeit der
Membranüberströmungsgeschwindigkeit v , modifiziert nach (Ripperger
1992).......................................................................................................................9
Abbildung 5: Konzentrationspolarisation an einer Membran A Konzentrationsprofil;
B Druckprofil; C Strömungsprofil; DS Deckschicht; G Grenzschicht;
KS Kernströmung; y Abstand zur Membran; v Membranüberströmung;
p Druck; c Konzentration; δ Konzentrationsgrenzschichtdicke;
δDS Deckschichtdicke, modifiziert nach (Ripperger 1993), (Melin &
Rautenbach 2007) ..............................................................................................11
Abbildung 6: Kräfte an einem Einzelpartikel in einem Querstromfilter im laminaren
Grenzschichtbereich..........................................................................................14
Abbildung 7: Darstellung der Kräfte an einem ruhenden Einzelpartikel ..........................15
Abbildung 8: Verlauf des Filtratflusses als Funktion der Prozessdauer.............................17
Abbildung 9: Foulingmechanismen bei der Filtration mit porösen Membranen.............18
Abbildung 10: Morphologie der Bakterien...............................................................................19
Abbildung 11: Reduktion von Tetrazoliumchlorid zu Formazan.........................................20
Abbildung 12: Farbverlauf in den einzelnen Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten
modifiziert nach Konopka (Konopka, Oliver et al. 1998)...........................21
Abbildung 13: Darstellung der Untersuchungen des physiologischen Profils einer
Bakteriengemeinschaft der einzelnen Fraktionen mit den Biolog-
Mikrotiterplatten. ...............................................................................................21
Abbildung 14: Prinzip der Hauptkomponentenanalyse nach Kessler (Kessler 2007) .......22
Abbildung 15: Einzugsgebiet Elbe und Probennahmestelle km 327 ...................................23
Abbildung 16: a) Lage der Talsperre Muldenberg; b) Probenahmestelle Sauteich.............24
Abbildung 17: Schematischer Aufbau a) eines in der Literatur beschriebenen
Filtrationssystems und b) eines Filtrationssystems mit
Rezirkulationsschleife, modifiziert nach Peskoller (Peskoller 2010) ..........25
Abbildung 18: Aufbau des MCC 1 ............................................................................................26
Abbildung 19: Hohlfaserfiltrationsmodul MiniKros Sampler Plus ...........................................27
Abbildungsverzeichnis
IV
Abbildung 20: Softwareoberfläche des Programms LabView 8.2. zur Ansteuerung des
MCC 1 .................................................................................................................28
Abbildung 21: Fließschema des Filtrationsprozesses .............................................................30
Abbildung 22: a) Aufbau der Vorfiltration b) Filtersystem ..................................................32
Abbildung 23: a) Initialisierung des MCC 1 b) schematische Darstellung der
Initialisierung des MCC 1 .................................................................................33
Abbildung 24: MCC 1 während der Filtration.........................................................................33
Abbildung 25: a) Spülung des Systems b) Elution der Bakterien aus der
Rezirkulationsschleife........................................................................................35
Abbildung 26: Anordnung der einzelnen Substrate in den Eco Plates................................37
Abbildung 27: a) Epifluoreszenzmikroskop b) Grid Porton G12........................................40
Abbildung 28: Kalibrierkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration.........................43
Abbildung 29: Lineare Abhängigkeit des Filtratflusses vom TMP.......................................45
Abbildung 30: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und
Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 und Elbe 2 vom 09.11.09 46
Abbildung 31: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und
Permeabilität über die Zeit der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 vom
09.12.09................................................................................................................47
Abbildung 32: Filtratfluss f (TMP) vom Sauteich 1 und Sauteich 2.......................................48
Abbildung 33: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit
zunehmenden TMP der Proben Elbe vom 09.11.09, der Proben Sauteich
und Saubach vom 09.12.09...............................................................................49
Abbildung 34: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und
Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10..50
Abbildung 35: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit
zunehmenden TMP der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10..............52
Abbildung 36: Bakterienkonzentration der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der
Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010.....................................................53
Abbildung 37: Morphologie der Bakterien Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 ........55
Abbildung 38: Biovolumen der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben
Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010 .................................................................56
Abbildung 39: Biomasse der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1
bist Elbe 4 vom 02.02.2010..............................................................................56
Abbildungsverzeichnis
V
Abbildung 40: Grafische Darstellung der Blindwerte der Fraktion Konzentrat mit den
verschiedenen Reinigungslösungen.................................................................58
Abbildung 41: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit in den Fraktionen ORI,
VOR, KON und FIL der Probe Elbe 1 vom 02.02.10 ................................58
Abbildung 42: Grafische Darstellung der AWCD der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom
02.02.10 und deren Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL.......................59
Abbildung 43: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der
Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10...................................................60
Abbildung 44: Baumdiagramm der Fraktion Original der Probe Elbe 2.............................62
Abbildung 45: Baumdiagramm der Fraktion Konzentrat der Probe Elbe 2.......................62
Abbildungsverzeichnis Anhang
VI
Abbildungsverzeichnis Anhang
Abbildung A 1: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP,
Permeabilität über die Zeit ................................................................................vi
Abbildung A 2: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Probe Elbe 2 vom
09.11.2009 ..........................................................................................................viii
Abbildung A 3: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Sauteich und
Saubach vom 09.12.2009 ...................................................................................ix
Abbildung A 4: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Elbe 1 bis
Elbe 4 vom 02.02.2010 .......................................................................................x
Abbildung A 5: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der
Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10....................................................xi
Abbildung A 6: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der
Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10...................................................xii
Abbildung A 7: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xiii
Abbildung A 8: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xiv
Abbildung A 9: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10...................................................xv
Abbildung A 10: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10..................................................xvi
Abbildung A 11: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10.................................................xvii
Abbildung A 12: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10............................................... xviii
Abbildung A 13: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10..................................................xix
Abbildung A 14: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10...................................................xx
Abbildung A 15: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10..................................................xxi
Abbildung A 16: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10.................................................xxii
Abbildungsverzeichnis Anhang
VII
Abbildung A 17: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10................................................xxiii
Abbildung A 18: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen
Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10............................................... xxiv
Tabellenverzeichnis
VIII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Beschreibung der einzelnen Modi ...................................................................26
Tabelle 2: Abkürzungen der einzelnen Fraktionen...........................................................30
Tabelle 3: maximaler TMP für die Optimierung der Elution der verschiedenen
Proben .................................................................................................................34
Tabelle 4: Gegenüberstellung modifiziertes und nichtmodifiziertes Spülen/Elution35
Tabelle 5: Einteilung der Substrate in 6 Substratklassen................................................38
Tabelle 6: Parameter der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 ...............................51
Tabelle 7: Konzentration der Bakterien in den einzelnen Fraktionen und deren
prozentualer Anteil der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2009...........54
Tabelle 8: Proteingehalte in den Konzentraten der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom
02.02.2010 ...........................................................................................................57
Tabelle 9: Hauptcluster der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 63
Tabelle 10: Einzel- und Gesamtvarianz der Hauptkomponentenanalyse der
Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10......64
Tabellenverzeichnis Anhang
IX
Tabellenverzeichnis Anhang
Tabelle A 1: Chemikalien zur Reinigung des Filtrationsmoduls ..........................................i
Tabelle A 2: Kalibrierdaten der Proteinbestimmung nach Bradford..................................ii
Tabelle A 3: TMP, Filtratfluss, Querstromgeschwindigkeit und Permeabilität des
druckkontrollierten Bereichs des Filtrationsaufbaues mit deionisiertem
Wasser....................................................................................................................ii
Tabelle A 4: Prozessparameter Elbe 1 vom 09.11.2009 ......................................................iii
Tabelle A 5: Prozessparameter Elbe 2 vom 09.11.2009 ......................................................iv
Tabelle A 6: Prozessparameter Sauteich 1 vom 09.12.2009................................................iv
Tabelle A 7: Prozessparameter Sauteich 2 vom 09.12.2009.................................................v
Tabelle A 8: Prozessparameter Saubach 1 vom 09.12.2009.................................................v
Tabelle A 9: Prozessparameter Saubach 2 vom 09.12.2009................................................vi
Tabelle A 10: Parameter der Proben Saubach 1 und 2 .........................................................vii
Tabelle A 11: Prozessparameter Elbe 1 vom 02.02.2010 .....................................................vii
Tabelle A 12: Parameter der Proben Elbe 1 und Elbe 2 .....................................................viii
Symbolverzeichnis
X
Symbolverzeichnis
Lateinische Zeichen
Symbol Physikalische Größe
FritteA Fläche der Fritte
MA Membranfläche
SFA Fläche Sichtfeld
b Breite
cB Konzentration Bakterien
ic Konzentration der Komponente i im Zulauf
iFc , Konzentration der Komponente i im Filtrat
Fritted Durchmesser der Fritte
hd hydraulischer Durchmesser
Pd Partikeldurchmesser
Td Rohrdurchmesser
D Diffusionskoeffizient
effD effektiver Diffusionskoeffizient
F Anreicherungsfaktor
AF Adhäsionskraft
LF Liftkraft
RF Reibungskraft
SF Schleppkraft
H Schichthöhe
FJ Flux
k Stoffübergangskoeffizient
K Membrankonstante
l Länge
L Länge der Kapillare
m Masse
Bm Biomasse
ASFn Anzahl der Sichtfelder
Symbolverzeichnis
XI
Bn Anzahl der gezählten Objekte
p Druck
P Permeabilität
r Koordinate in radialer Richtung
GGr Gleichgewichtsradius bei 0=Pv
DSR Deckschichtwiderstand
MR Membranwiderstand
vS spezifische Oberfläche
t Zeit
T Temperatur
TMP transmembrane Druckdifferenz
VUF Umrechnungsfaktor Volumen
V Volumen
BV Biovolumen
FiltratV Filtratvolumen
FV& Filtratvolumenstrom
Kapv Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare
pv Filtratfluss
Fv spezifischer Filtratstrom
v Überströmgeschwindigkeit
v mittlere axiale Strömungsgeschwindigkeit
y Koordinate senkrecht zur Membran
Griechische Zeichen
Symbol Physikalische Größe
Kρ Dichte des Konzentrats
ε Porosität
η dynamische Viskosität der Flüssigkeit
Fη dynamische Viskosität des Filtrats
Kη dynamische Viskosität des Konzentrates
μ Umwegfaktor
Rµ Reibungskoeffizient
Symbolverzeichnis
XII
wτ Wandschubspannung
ν kinematische Viskosität der Flüssigkeit
Indizes
A Ausgang
E Eingang
S Senke
Dimensionslose Kennzahlen
Re Reynoldszahl
Sc Schmidtzahl
Sh Sherwoodzahl
Natur-Konstanten
Bk Boltzmann-Konstante 1-23101,3806 −⋅⋅ KJ
Abkürzungen
AWCD Mittlere Farbentwicklung
ATP Adenosintriphosphat
CA Clusteranalyse
CMF Cross-Flow-Mikrofiltration
DNA Desoxyribonukleinsäure
FIL Filtrat
GBZ Gesamtbakterienzahl
HKA Hauptkomponentenanalyse
KON Konzentrat
MCC 1 Munich Cell Concentrator 1
OD Optische Dichte
ORI Original (Probe)
PC Polycarbonat
PES Polyethersulfon
PTFE Polytetrafluorethylen
PI Propidiumiodid
TMP Transmembrandruck
VOR Vorfiltrat
VF Vorfilter
WFR Wiederfindungsrate
Einleitung
1
1 Einleitung
In den vergangenen Jahren hat sich die Membranfiltration in den verschiedenen
Industriezweigen zu einem Standardverfahren entwickelt und konnte sich im Vergleich zu
konventionellen Verfahrensstrategien mehr und mehr durchsetzen. Sie findet Anwendung in
der Chemie-, Umwelt- und Medizintechnik. Sie wird in der Wasserversorgung eingesetzt
sowie zur Behandlung innerbetrieblicher Abwässer. Beispielsweise wird sie in der
Biotechnologie zur Sterilfiltration, in der Getränke- und Lebensmittelindustrie zur
Klarfiltration oder Aufkonzentration verwendet. Des Weiteren findet sie Anwendung in der
Elektronikindustrie zur Bereitung hochreiner Gase und Flüssigkeiten. Nahezu konkurrenzlos
ist der Einsatz zur Aufkonzentrierung von Eiweißen. Weiterhin wird sie zur
Meerwasserentsalzung und für die Luftzerlegung in kleineren Anlagen eingesetzt. Das
schnelle Wachstum dieser Technologie ist Ursache einer stetigen Entwicklung von
Membranmaterialien, Modulkonfigurationen, Anlagenkonzepten und deren Betriebsweisen
(Melin & Rautenbach 2007), (Ripperger 1992).
1.1 Problemstellung
Für Kultivierungen, Mikrokosmen-Experimente oder biochemische Analysen, wie z.B.
Pathogennachweis, Substratverwertungstests für Bakteriengemeinschaften, DNA-
Fingerprints, mit Mikroorganismen aus Gewässerproben müssen die vorhandenen Zellen
aufkonzentriert werden, um eine ausreichende Nachweisempfindlichkeit oder hinreichend
repräsentative Messergebnisse zu erreichen. Bei natürlichen Gewässerproben, die
inhomogener als Kulturen sind, können aber technische Probleme auftreten, die zu
wechselnden Wiederfindungsraten und zu Beeinträchtigungen der Aktivität und
Lebensfähigkeit der Zellen führen können. Deshalb werden schonende und
reproduzierbare Konzentrationsverfahren gebraucht. Außerdem ist es notwendig die
Wiederfindungsrate und den Zustand der Zellen schnell zu bestimmen. Als schonendes
Verfahren bietet sich die Cross-Flow-Mikrofiltration (CMF) an.
Einleitung
2
1.2 Ausgangssituation nach dem Stand der Technik
Das Zurückhalten bzw. Abtrennen von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit gehört zu
der Hauptanwendung der Mikrofiltration. Bei der Aufkonzentrierung der Mikroorganismen
mittels Membran kommt häufig die Dead-End-Filtration zum Einsatz. Hierbei werden
jedoch die auf dem Filter aufkonzentrierten Zellen direkt auf der Membran analysiert oder
mit der Membran kultiviert (Musial, Arrowood et al. 1987), (Wang, Hammes et al. 2007).
Weiterhin können die Zellen nicht reproduzierbar von der Membran abgelöst werden und
die Wiederfindungsraten liegen hier zwischen 20 bis 50 % (Melin & Rautenbach 2007),
(Wohlsen, Bates et al. 2004), wobei Lee Wiederfindungen zwischen 20 bis 80 % erreichte
(Lee, Gomez et al. 2004).
Die auf dem Markt für Cross-Flow-Filtration aktiven Firmen haben sich bisher nicht auf
analytische Probleme fokussiert, so dass es keine fertigen Systeme gibt, bei denen
Wiederfindung der Zellen und Reproduzierbarkeit des Prozesses bekannt und
dokumentiert sind. Im Gegensatz zur Anreicherung von Molekülen aus relativ kleinen
Flüssigkeitsvolumina gibt es für die Aufkonzentrierung von Bakterienzellen keine
kommerziellen Systeme. Eine Arbeitsgruppe aus München hat sich mit diesem Problem
befasst und für Escherichia coli (E. coli) in Trinkwasser ohne Verwendung von Zusatzstoffen
eine reproduzierbare Wiederfindung von >90% erreicht (Peskoller, Niessner et al. 2009).
Das System ist prinzipiell auch für natürliche Gewässerbakterien einsetzbar, diese
Anwendungen befinden sich aber noch im Versuchsstadium. Aus der vorangegangenen
Praktikumsarbeit ist bekannt, dass eine Vorfiltration der Wasserproben notwendig ist und
die bei der dort ausgearbeiteten Verfahrensweise auftretenden Zellverluste vernachlässigt
werden können. Außerdem wurde festgestellt, dass es nicht zu einer nachteiligen
Anreicherung von Huminstoffen aus der Probe kommt.
Einleitung
3
1.3 Konzept der Arbeit
Es wurden Gewässerproben von 2 Litern auf etwa 50-100 ml eingeengt. Es wurde ein in
München gebautes Mikrofiltrationssystem für die Anreicherung von Bakterien aus
verschiedenen Gewässerproben getestet. Der Einfluss des Konzentrationsprozesses auf die
Zellzahl, das Biovolumen, die Biomasse und die Substratverwertung der Mikroorganismen-
gemeinschaft war zu untersuchen. Für die Bestimmung der Zellzahl, des Biovolumens und
der Biomasse wurde neben der klassischen Epifluoreszenzmikroskopie eine alternative
Methode getestet und kalibriert. Eine einfache Trübungsmessung ist nicht ausreichend,
weil Gewässerproben außer den Zellen zahlreiche andere Partikel enthalten können.
Folgende Fragen waren im Detail zu beantworten:
1. Wie viele der ursprünglich vorhandenen Bakterienzellen werden wiedergewonnen?
2. Ist das empfohlene Desinfektions- und Spülverfahren für die Filtrationsmodule
ausreichend und nicht schädlich für die Anwendung bei Substratverwertungstests?
3. Kann die relativ mühsame Zählung der Bakterienzellen durch eine photometrische
Proteinbestimmung ersetzt werden?
4. Wie wirkt das Anreichern der Zellen auf das verwertete Substratspektrum und die
Abbaukinetiken?
Verfahrenstechnische Grundlagen
4
2 Verfahrenstechnische Grundlagen
2.1 Filtration und Filtrationsverfahren
Unter Filtration versteht man die Trennung eines Flüssigkeits-Feststoff-Gemisches
(Suspension) in seine Bestandteile. Dies geschieht über ein für die Flüssigkeit durchlässiges
Filtermedium, das den Feststoff zurückhält.
Je nach Suspensionszusammensetzung und Aufgabenstellung der Anwendung wird die
Fest/Flüssigfiltration als Kuchen- oder Klarfiltration bezeichnet. Die Kuchenfiltration
Klarfiltration ist die weitgehend vollständige Abtrennung aller Partikel aus der Suspension
mit geringem Feststoffanteil. Sonderformen sind hier die Anschwemmfiltration (hohe
Feststoffbeladung der Suspension) und die Siebfiltration (Partikel oberhalb einer
bestimmten Trenngrenze werden abgetrennt, Partikel unterhalb dieser Trenngrenze werden
durch das Filtermedium durchgelassen).
Die Ultra- und Mikrofiltration schließen bezüglich des Trennbereiches, d. h. der Größe der
abzutrennenden Partikel bzw. Moleküle, die Lücke zwischen Umkehrosmose und
Nanofiltration auf der einen Seite und Filtration auf der anderen Seite (Melin &
Rautenbach 2007), (Gasper 2000). In Abbildung 1 sind die Arbeitsbereiche verschiedener
Trennverfahren und die Größenbereiche, die Trennursache und die Druckdifferenz der
jeweiligen Verfahren dargestellt.
Verfahrenstechnische Grundlagen
5
Arbeitsbereiche von Trennverfahren
Bereich
ionogen / nieder- molekular
molekular /
makromolekular
kolloid- bzw.
feindispers
mechanisch
suspendiert
Größen- beispiele
Trenn- Ursache
Ionen
Wasserlösliche Salze
Kolloide
Pyrogene
Viren
Pigmente
Bakterien
Fein-Teststaub
Latex
Hefe
mit bloßem Auge
erkennbar
Konzentrations-
gradient
Molekülgröße
Partikelgröße
µm
Abbildung 1: Arbeitsbereiche von Trennverfahren, modifiziert nach (Gasper 2000)
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 1000
200,00 Umkehrosmose
Nanofiltration
Ultrafiltration
Mikrofiltration
Filtration
0,10
1,00
10,00
100,00
Druckdifferenz Δp [bar]
5
Verfahrenstechnische Grundlagen
6
2.2 Mikrofiltrationsverfahren
Druckgetriebene Membranfiltrationsverfahren werden zwischen statischen (Dead-End)
und dynamischen (Cross-Flow) Betriebsweisen unterschieden. In Abbildung 2 ist das
Prinzip der statischen und dynamischen Filtration dargestellt.
Abbildung 2: Prinzip der statischen und dynamischen Filtration
Bei der statischen Filtration strömt die Suspension senkrecht zur Membranoberfläche,
wobei sich mit dem wachsenden Filtratvolumen die Deckschicht kontinuierlich vergrößert.
Bei der Cross-Flow-Mikrofiltration wird das Filtermedium während des
Filtrationsvorganges von der Suspension überströmt, sodass zwei Hauptstromrichtungen
orthogonal zueinander bestehen. Die Hauptstromrichtungen sind der Filterstrom durch das
Filtermedium und die Überströmung parallel zum Filtermedium. Dem Aufbau des
Filterkuchens während des Filtrationsvorganges wird durch die Überströmung der
Suspension entgegengewirkt. Eine Deckschichtausbildung auf der Membran kann meist
jedoch nicht ganz verhindert werden. (Ripperger 1992), (Melin & Rautenbach 2007).
Zeit
Dicke der Deckschicht (Filterkuchen)
spezifischer Filtratfluss
statische Filtration Dead-End-Filtration
Zeit
spezifischer Filtratfluss
Dicke der Deckschicht
dynamische Filtration Cross-Flow-Filtration
Zulauf (Feed)
Filtrat (Permeat)
Zulauf (Feed)
Konzentrat (Retentat)
Filtrat (Permeat)
Filterkuchen Filtermedium
Deckschicht Membran
Verfahrenstechnische Grundlagen
7
2.3 Kenngrößen der Mikrofiltration
2.3.1 Transmembrandruck
Zur Überströmung der Membran sowie zur Filtration wird die Suspension unter Druck
über das Membranmodul gepumpt. Infolge der Membranüberströmung fällt der Druck am
Moduleingang vom Wert p0 auf p1 am Modulausgang ab. Der Druckabfall ist von den
geometrischen Abmessungen des Strömungskanals, der Strömungsgeschwindigkeit im
Modul und den Fließeigenschaften des Konzentrats abhängig. Der Druck p2 auf der
Filtratseite ist wegen der dort vorhandenen, geringen Strömungsgeschwindigkeiten nahezu
konstant. Um die Filtration über die gesamte Länge des Membranmoduls zu gewährleisten,
muss der Druck p2 auf der Filtratseite kleiner sein als der Druck p1 am Modulausgang
(Abbildung 3). Der Druckunterschied zwischen Konzentrat und Filtrat wird als
transmembrane Druckdifferenz (TMP) bezeichnet. Hier wird für die Angabe der
transmembranen Druckdifferenz meistens der arithmetische Mittelwert gebildet (Ripperger
1992).
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer Anlage zur Cross-Flow-Mikrofiltration
210
2p
ppTMP −
+= 2-1
TMP : transmembrane Druckdifferenz [ ]bar
0p : Druck am Moduleingang (Probe) [ ]bar
1p : Druck am Modulausgang (Konzentrat) [ ]bar
2p : Druck auf der Filtratseite [ ]bar
p1p2
Hohlfasermodul
t
p0
p1
Konzentrat
Filtrat
p2
p
Probe
p0
Verfahrenstechnische Grundlagen
8
2.3.2 Permeabilität
Die Durchlässigkeit einer Membran für Gase und Flüssigkeiten wird als Permeabilität P
bezeichnet und in barmhL ⋅⋅ 2 angegeben. Die Permeabilität wird wie folgt berechnet:
TMPAVP
M
F
⋅=
& 2-2
P : Permeabilität [ ]barmhL ⋅⋅ 2
FV& : Filtratvolumenstrom [ ]hL
MA : Membranfläche [ ]2m
Folgende Einflussgrößen sind für den Filtratstrom (Permeatfluss) bei der Cross-Flow-
Mikrofiltration von Bedeutung:
o transmembrane Druckdifferenz entlang des Membranmoduls (TMP);
o Geschwindigkeit der Membranüberströmung v ;
o Geometrie des Strömungskanals;
o Konzentration der abtrennbaren Stoffe c;
o Eigenschaften der abtrennbaren Stoffe (Partikelgröße, Konsistenz);
o Eigenschaften der Flüssigkeit (Viskosität);
o oberflächenaktive Stoffe in Verbindung mit den Oberflächeneigenschaften der
Membran und der Partikel
2.3.3 Selektivität
Der Volumenstrom durch die Membran wird als Filtratvolumenstrom FV& bezeichnet. Die
Abbildung 4 zeigt die Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen
Druckdifferenz. Es werden zwei Regionen unterschieden: die druckkontrollierte Region
und die stofftransferkontrollierte Region. In der druckkontrollierten Region kommt es zu
keiner Deckschichtbildung auf der Membranoberfläche, da der hydrodynamische
Rücktransport der Partikel größer ist als der konvektive Hintransport. Eine wesentliche
Rolle spielen hier die Größe, Art und Konsistenz der abzutrennenden Stoffe (Sethi &
Wiesner 1997). Im Bereich der stofftransferkontrollierten Region hat eine Erhöhung der
transmembranen Druckdifferenz keine Steigerung des Filtratstroms mehr zur Folge
(Altmann & Ripperger 1997).
Verfahrenstechnische Grundlagen
9
Abbildung 4: Abhängigkeit des Filtratvolumenstroms von der transmembranen Druckdifferenz und der Geschwindigkeit der Membranüberströmungsgeschwindigkeit v , modifiziert nach (Ripperger 1992)
2.4 Modellierung des Stofftransportes bei der Mikrofiltration
Für die Planung und Durchführung von Membranprozessen ist es notwendig Trenn- und
Flussleistungen zu betrachten. Dies geschieht mit Hilfe verschiedener empirischer und
theoretischer Ansätze. Sie dienen nicht nur der Leistungsvorhersage sondern auch dem
Verständnis der stattfindenden Vorgänge. Diese Modelle berücksichtigen hydrodynamische
und thermodynamische Randbedingungen, sowie auch physikalisch-chemische
Eigenschaften der Membranen, der Partikel und die damit auftretenden Wechselwirkungen.
Es werden zum Verständnis der Stofftransportvorgänge grundlegende
Gleichgewichtsmodelle für die Cross-Flow-Filtration vorgestellt (Ripperger 1992), (Melin
& Rautenbach 2007), (Schock 1985).
Die nachfolgenden verschiedenen Modelle beschreiben verschiedene Mechanismen.
2.4.1 Das Porenmodell
Im Porenmodell wird der Fluss durch eine poröse Membran analog zur Strömung durch
ein Haufwerk, das aus parallel geschalteten Kapillaren besteht, betrachtet. Es ist ein
Vergleich zur Strömung in Röhren angebracht. Sie wird mit Hilfe der
Widerstandscharakteristik im laminaren Bereich durch das Hagen-Poiseuillesche Gesetz
beschrieben.
druckkontrol-lierte Region
reine Flüssigkeit ◦ höhere Anströmgeschwindigkeit
◦ höhere Temperatur
◦ geringere Konzentration
3v
2v 123 vvv >>
1v stofftransferkontrollierte Region
Transmembrane Druckdifferenz
Filtr
atvo
lum
enst
rom
Verfahrenstechnische Grundlagen
10
LTMPd
v hKap ⋅
⋅=
η32
2
2-3
Kapv : Strömungsgeschwindigkeit in der Kapillare [m/s]
2hd : hydraulischer Durchmesser [m]
TMP : transmembrane Druckdifferenz [bar]
η : dynamische Viskosität der Flüssigkeit [Pa s]
L : Kapillarlänge [m]
Die Strömungsgeschwindigkeit in einer Kapillare Kapv kann in die Permeatgeschwindigkeit
des Haufwerkes bzw. der Membran pv übertragen werden, indem die Porosität als
Verhältnis der freien Anströmfläche zur Gesamtfläche verwendet wird.
HS
TMPTMPAvv
p⋅⋅−⋅
⋅=⋅=
μεηε
2)1( 22
3
2-4
pv : Filtratfluss
ε : Porosität [ - ]
vS : volumenspezifische Oberfläche [m2/m3]
μ : Umwegfaktor [ -]
H : Schichthöhe [m]
2.4.2 Diffusionsmodell
Das Diffusionsmodell beschreibt die Konzentrationspolarisation bei Membranverfahren.
Aufgrund des Rückhaltevermögens der Membran werden einige konvektiv zur Membran
transportierte Komponenten zurückgehalten. Die Konzentration der abgetrennten
Komponenten erhöht sich zur Membran hin und es bildet sich eine dünne Deckschicht.
Ein Rücktransport der zurückgehaltenen Komponenten in die Kernströmung kann auf
diffusiven oder hydrodynamischen Effekten beruhen, wobei hydrodynamische Effekte
(Scherkraft) aufgrund des Geschwindigkeitsgradienten an der Deckschicht resultieren
(Porter 1972), (Rautenbach & Albrecht 1981). Das Prinzip der Konzentrationspolarisation
und des diffusiven Rücktransports ist in der Abbildung 5 schematisch dargestellt.
Verfahrenstechnische Grundlagen
11
Abbildung 5: Konzentrationspolarisation an einer Membran A Konzentrationsprofil; B Druckprofil; C Strömungsprofil; DS Deckschicht; G Grenzschicht; KS Kernströmung; y Abstand zur Membran; v Membranüberströmung; p Druck; c Konzentration; δ Konzentrationsgrenzschichtdicke; δDS Deckschichtdicke, modifiziert nach (Ripperger 1993), (Melin & Rautenbach 2007)
Im Diffusionsmodell werden die Transportvorgänge für den einfachen Fall der
Membrankontrolle beschrieben. Unter Berücksichtigung der Teilströme
o konvektiver Hintransport,
o Transport durch die Membran und
o dem diffusiven Rücktransport
ergibt sich folgende Stoffbilanz (Rautenbach & Albrecht 1981):
0, =−⋅+⋅dydcDvcvc FiFFi 2-5
ic : Konzentration der Komponente i im Zulauf (Suspension) [mol/m3]
iFc , : Konzentration der Komponente i im Filtrat [mol/m3]
Fv : spezifischer Filtratstrom [m/s]
D : Diffusionskoeffizient [m2/s]
y : Koordinate senkrecht zur Membran [m]
DS G
KS
M
A B C
c p v
konvektiver Transport
KV&
diffusiver Rücktransport
Fc FV&
y
δDS
δ
Verfahrenstechnische Grundlagen
12
Nach Integration und Einführung der Konzentrationsgrenzschichtdicke δ, in der die
Konzentration der zu betrachtenden Komponente i auf den Wert der Kernströmung iKc ,
abfällt, erhält man folgende Gleichung.
iFiK
iFiM
iFiK
iFiMF cc
cck
ccccDv
,,
,,
,,
,, lnln−
−⋅=
−
−⋅=
δ 2-6
k : Stoffübergangskoeffizient [m/s]
δ : Konzentrationsgrenzschichtdicke [m]
Die Größe des Stoffübergangskoeffizienten hängt von den Strömungsbedingungen über
der Membran und den Stoffwerten ab. Dieser kann nach den bekannten Produktansätzen,
die meist auf experimentellen Untersuchungen beruhen, ermittelt werden.
Für eine laminare Strömung in einem Strömungskanal der Länge L wurde für den
Stoffübergang folgende Beziehung ermittelt:
31
31
31
Re62,1 ⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛⋅⋅⋅⋅=Ld
ScdDk h
h 2-7
Sh : Sherwoodzahl
Re : Reynoldszahl
Sc : Schmidtzahl
hd : hydraulischer Durchmesser des Strömungskanals [m]
Für kugelförmige Partikel und Kolloide wird nach der Stokes-Einstein-Beziehung
folgender Diffusionskoeffizient abgeschätzt.
P
BdTk
D⋅⋅⋅⋅
=ηπ3
2-8
Bk : Boltzmann-Konstante 1-23101,3806 −⋅⋅ KJ
T : Temperatur [K]
η : dynamische Viskosität der Flüssigkeit [Pa s]
Pd : Partikeldurchmesser [m]
Verfahrenstechnische Grundlagen
13
Die berechnete Diffusion hat ihren Ursprung in der Brownschen-Molekularbewegung,
wodurch ein Partikel seine gerichtete Bewegung erfährt. Die Bewegungsintensität der
Partikel ist von der Temperatur und der Partikelgröße abhängig. Demnach verringert sich
der Filtratstrom mit steigender Partikelgröße. Dies gilt nur bis zu einer Partikelgröße
> 0,1 µm, da auf der Basis der Stokes-Einstein-Beziehung für die Mikrofiltration
ermittelten spezifischen Filtratflüsse niedriger sind als die berechneten Werte (Segré &
Silberberg 1962). Der Filtratstrom erfährt in Abhängigkeit der Partikelgröße in diesem
Bereich ein Minimum und steigt danach wieder an, weil andere Prozesse den Filtratstrom
bestimmen.
Das erweiterte Diffusionsmodell ergänzt den Ansatz des Diffusionsmodells durch
Einführen des effektiven Diffusionskoeffizienten, in welchem die durch die Brownsche
Molekularbewegung hervorgerufene Diffusion durch eine von der Wandschubspannung
induzierte zusätzliche „Diffusion“ erweitert wird. Somit gelingt eine Übertragung auf die
Mikrofiltration.
)(2
iwP
eff cfd
KD ⋅⋅
⋅=ητ
2-9
effD : effektiver Diffusionskoeffizient [m2/s]
wτ : Wandschubspannung [N/m2]
K : Membrankonstante [ - ]
η : dynamische Viskosität [Pa s]
Pd : Partikeldurchmesser [m]
ic : Konzentration der Komponente i [mol/m3]
Der effektive Diffusionskoeffizient ist von der Wandschubspannung und wesentlich von
der Partikelgröße abhängig. In diesem Fall wird der Rücktransport durch Zunahme der
Partikelgröße begünstigt und der Filtratfluss steigt.
2.4.3 Das Pinch-Modell
Der Pinch-Effekt beschreibt in einer Strömung die Querkraftwirkung eines
ungleichförmigen Geschwindigkeitsprofils an einem umströmten Körper, so dass diese
zurück in die Kernströmung transportiert werden (Porter 1972).
Segré und Silberberg beschreiben auf der Grundlage ihrer experimentellen Analysen
folgende Beziehung für die radiale Geschwindigkeitskomponente Pv suspendierter Partikel
Verfahrenstechnische Grundlagen
14
in einem Rohr (Segré & Silberberg 1962). Bei der Cross-Flow-Mikrofiltration ist dieser
Effekt vor allem bei Partikeln > 5 µm in laminaren Strömungen von Bedeutung (Ripperger
1992).
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−⋅⋅⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅⋅⋅=
GGTT
PP r
rdr
dd
vv 12Re17,084,2
2-10
v : mittlere axiale Strömungsgeschwindigkeit [m/s]
Td : Rohrdurchmesser [m]
r : Koordinate in radialer Richtung [m]
GGr : Gleichgewichtsradius bei 0=Pv [m]
Nach den Gesetzen des Pinch-Effekts ergibt sich, dass sich kleine Partikel nicht aus der
Kernströmung zurückbewegen, sondern sich an der Membranoberfläche ablagern.
2.4.4 Ablagerungsmodell
Das Ablagerungsmodell beschreibt vorwiegend eine Kräftebilanz an einem einzelnen
Partikel auf der Membranoberfläche (Abbildung 6). Die durch die Filtratströmung
hervorgerufene Haftkraft FN, eine aus der Kernströmung resultierende membranparallele
Schleppkraft FS und eine ihr entgegen gesetzte Reibungskraft FR wirken dabei auf einen
Partikel.
Abbildung 6: Kräfte an einem Einzelpartikel in einem Querstromfilter im laminaren Grenzschichtbereich
x
y
w(y)
Membran
Fv&
Partikel
FN
FS
FR
Verfahrenstechnische Grundlagen
15
Ein Partikel wird sich nicht ablagern, solange die Schleppkraft größer ist als die
Reibungskraft. Wird ein Reibungskoeffizient µ eingeführt, gilt für diesen Fall
NRS FF ⋅> μ 2-11.
Durch unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten ergeben sich für Partikeln
verschiedener Größen unterschiedliche Kräfteverhältnisse. Ebner berücksichtigt hierbei
noch die Wirkung des Filtratdruckes (Ebner 1991). Der auf diese Weise erklärte
Klassierungseffekt von Schock, nach dem kleinere Partikeln bevorzugt abgeschieden
werden, konnte zusammen mit Fischer und Raasch nachgewiesen werden (Schock 1985),
(Fischer & Raasch 1984), (Melin & Rautenbach 2007).
Bei der Betrachtung der Kräfte ist eine Unterscheidung nach Lage der Partikel wichtig. So
kommt bei einem abgelagerten Partikel noch die Adhäsionskraft FA hinzu (Abbildung 7).
Abbildung 7: Darstellung der Kräfte an einem ruhenden Einzelpartikel
Dieses Modell ist für eine Partikelgröße von mehr als 0,2 µm gültig. Bei kleineren Partikeln
wird auch der diffusive Partikeltransport mit in Betracht gezogen.
2.4.5 Deckschichtmodell
Als Grundlage der Deckschichtmodelle gilt die Filtergleichung nach Darcy. Hier wird der
proportionale Zusammenhang des Filtratflusses Fv und dem angelegten Druckgefälle
TMP, sowie die umgekehrt proportionale Abhängigkeit von der dynamischen
x
y
w(y) Reibungskraft FR
Membran
Fv&
Partikel
Liftkraft FL
Adhäsionskraft FA Schleppkraft FSy
Schleppkraft FSw
Verfahrenstechnische Grundlagen
16
Filtratviskosität Fη und den Widerständen der Membran MR und der Deckschicht DSR
beschrieben.
)( DSMF
F RRTMPv
+⋅=η
2-12
Fη : dynamische Viskosität des Filtrats [Pa s]
Meist ist bei der dynamischen Filtration der Deckschichtwiderstand dominierend. Gernedel
und Kessler fanden für die Cross-Flow-Filtration von Milch und Molke einen empirischen
Zusammenhang, wobei Riesmeier ihn um einen Exponenten erweiterte und ihn erfolgreich
auf eigene Versuchsergebnisse mit Fermenterbrühen anwandte (Gernedel 1980), (Riesmeier
1987).
)(TMPKc
RKW
KKDS ⋅
⋅⋅
=ρτ
η 2-13
DSR : Deckschichtwiderstand [m-1]
Kη : dynamische Viskosität des Konzentrates [Pa s]
Wτ : Wandschubspannung [N/m2]
Kρ : Dichte des Konzentrates [kg/m3]
K : Membrankonstante [ - ]
In der Praxis zeigt sich eine Deckschichtalterung, sodass kein stationärer Zustand nach der
Anfangsphase der Filtration eintritt. Mögliche Ursachen hierfür sind:
o Adsorption von Makromolekülen,
o Ablagerung sehr feiner Partikeln auf der Membran,
o Adhäsion und Wachstum von Mikroorganismen,
o Ausfällungen
o chemische Veränderung der Deckschichtbestandteile.
Diese Mechanismen werden im Abschnitt 2.5 näher erläutert.
Um jedoch das Phänomen der Deckschichtalterung im Deckschichtmodell zu
berücksichtigen, kann ein zeitabhängiger Teil des Widerstandes zur vorhergehenden
Verfahrenstechnische Grundlagen
17
Gleichung hinzugefügt werden. Hier hat Lotz nach Fane eine Erweiterung vorgenommen
und folgenden Ansatz formuliert:
⎟⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜⎜
⎝
⎛−⋅= ∞
kt
DSDS eRR 1, 2-14
∞,DSR : Deckschichtwiderstand für t=∞ [m-1]
k : Konstante [ - ]
t : Zeit [s]
Dieser Ansatz beschreibt die schnelle Ablagerung von Partikeln zu Filtrationsbeginn, den
langsameren Aufbau einer Ablagerungsschicht auf der Membran und die
Deckschichtalterung (Fane, Fell et al. 1980), (Lotz 1997).
2.5 Membranfouling
Fouling ist die reversible oder irreversible Verschmutzung der Membranoberfläche, die den
Filtratfluss vermindert. Eine einheitliche Definition des Fouling gibt es in der
Membrantechnik nicht, da jeweils unterschiedliche Effekte und Mechanismen stattfinden
(Chmiel, Bauser et al. 1990), (Melin & Rautenbach 2007). Ist die Leistung eines
Membranfiltrationsprozesses im Prozessbetrieb niedriger als erwartet bzw. sinkt die
Leistung stetig ab, wird dies als Fouling bezeichnet (Abbildung 8).
Abbildung 8: Verlauf des Filtratflusses als Funktion der Prozessdauer
Prozessdauer
Filtr
atflu
ss
Konzentrations- polarisation
Membranfouling
Verfahrenstechnische Grundlagen
18
Grundsätzlich unterscheidet man beim Membranfouling zwischen dem Scaling, dem
Biofouling und dem Fouling im klassischen Sinne. Beim Scaling handelt es sich um die
Ablagerung anorganischer Salze infolge einer Löslichkeitsüberschreitung. Biofouling
entsteht durch das Wachsen eines Biofilms infolge der Adsorption und Wachstum von
Makromolekülen (Proteine, Polysaccharide etc.). Als Fouling wird alles Weitere
zusammengefasst, was nicht eindeutig dem Scaling oder Biofouling zugeordnet werden
kann. Hierzu gehören Ablagerungen von kolloidalen oder von grenzflächenaktiven
Substanzen. In der Abbildung 9 sind die Foulingmechanismen bei der Filtration mit
porösen Membranen dargestellt.
Abbildung 9: Foulingmechanismen bei der Filtration mit porösen Membranen
Die zur Entfernung des Fouling benötigten mechanischen Spülungen und chemischen
Reinigungen werden meist außerhalb des normalen Filtrationsbetriebes durchgeführt
(Ripperger 1992), (Zeman & Zydney 1996), (Pinnekamp & Friedrich 2006). Hierbei werden
die entfernbaren Verschmutzungen als reversibles Fouling aufgefasst. Verschmutzungen,
die sich durch die mechanische oder chemische Reinigung nicht entfernen lassen, stellen
irreversibles Fouling dar.
Bioflouling Mikroorganismen in einem Film aus EPS
Innere Adsorption membrangängige Substanzen mit Affinität zum Membranmaterial
Porenverblockung Partikeldurchmesser ≈ Porendurchmesser
Irreversible Deckschicht Adsorption, Kompaktierung, Einlagerung, Ausfällung, etc.
Membran
Biotechnologische Grundlagen
19
3 Biotechnologische Grundlagen
3.1 Mikroorganismen
Mikroorganismen sind mikroskopisch kleine Lebewesen. Sie werden nach zwei Kriterien
klassifiziert. Zum Einen werden die Mikroorganismen, also ihrer physiologischen
Ähnlichkeit, in Bakterien, Archaea, Pilze, Mikroalgen, Protozoen und Viren eingeteilt
(Fuchs, Wallner et al. 1998). Zum Anderen wird eine Einteilung nach der phylogenetischen
Klassifikation vorgenommen, die darauf beruht die Organismen aufgrund ihrer
Verwandtschaftsverhältnisse zu gruppieren. Die Nukleotidsequenzen der ribosomalen
Ribonukleinsäure (rRNS) werden dafür verglichen. Untersuchungen ergaben einen
Phylogenetischen Stammbaum in ein dreiteiliges Konzept, den Bakteria, Archaea und
Eukarya der von dem vorangegangenen zweiteiligen Konzept in Prokarionten den
Mikroorganismen ohne Zellkern und Eukarionten Mikroorganismen mit Zellkern abgelöst
wurde (Woese & Fox 1977), (Fox, Stackebrandt et al. 1980), (Woese 1987), (Woese,
Kandler et al. 1990).
3.1.1 Bakterien
Bakterien sind Prokaryoten. Ihre DNA ist nicht in einem abgegrenzten Zellkern enthalten
wie bei Eukaryoten. Bei ihnen liegt die DNA vielmehr wie bei allen Prokaryoten frei im
Cytoplasma und zwar zusammengedrängt in einem engen Raum, dem Nucleoid.
3.1.2 Morphologie der Bakterien
Die Bakterien können in drei Morphologieklassen eingeteilt werden; den Kokken, Stäbchen
und Spirillen (Abbildung 10).
Abbildung 10: Morphologie der Bakterien
Kokken Stäbchen Spirillen
Biotechnologische Grundlagen
20
3.1.3 Charakterisierung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft mit Biolog-
Mikrotiterplatten
Die ersten Biolog-Mikrotiterplatten kamen 1989 auf den Markt und wurden für die
Identifizierung und Charakterisierung von Isolaten entwickelt. In den Biolog-
Mikrotiterplatten befinden sich 96 Vertiefungen. Sie enthalten jeweils ein Kohlenstoff-
substrat und den Redoxfarbstoff Tetrazoliumchlorid (TTC). Wird das Substrat einer
Vertiefung umgesetzt, dient Tetrazoliumchlorid als Elektronenakzeptor und zeigt im
reduzierten Zustand eine violette Färbung und infolge dessen die direkte oxidative
Verwertung des Substrats (Bochner 1989), (Abbildung 11).
Abbildung 11: Reduktion von Tetrazoliumchlorid zu Formazan
Zusätzlich zur Identifizierung von Reinkulturen können die Biolog-Mikrotiterplatten
genutzt werden, um die funktionellen Möglichkeiten einer gesamten Bakteriengemeinschaft
zu ermitteln. Mit Hilfe der Biolog-Mikrotiterplatten kann das physiologische Profil einer
Bakteriengemeinschaft annähernd dargestellt werden. Garland und Mills haben als erste die
Biolog-Mikrotiterplatten auf diese Weise genutzt und konnten Unterschiede zwischen den
Populationen verschiedener Lebensräume nachweisen (Garland & Mills 1991).
Untersuchungen von anaeroben Gewässerproben wurden von Christian durchgeführt
(Christian & Lind 2006).
Nach dem Animpfen der Biolog-Mikrotiterplatten und in regelmäßigen Zeitabständen
während der Inkubation wird die Farbentwicklung in den verschiedenen Vertiefungen
photometrisch bestimmt. Die Abbildung 12 zeigt einen typischen Farbverlauf in den
Vertiefungen der Mikrotiterplatten.
Biotechnologische Grundlagen
21
Plateaubildung durch Substrataufbrauch
Zeit
Abs
orpt
ion
Reduktion von TTC durchOxidation des Subtrats
Lag-PhaseWachstum der Zellen bis 108
Abbildung 12: Farbverlauf in den einzelnen Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten modifiziert nach Konopka (Konopka, Oliver et al. 1998)
In dieser Arbeit soll diese Methode zur Charakterisierung des physiologischen Profils der
Bakteriengemeinschaft vor und nach dem Anreicherungsprozess mit der CMF angewandt
werden. Weiterhin soll die Gesamtrate und Stärke der Farbentwicklung der
unterschiedlichen Substratklassen untersucht werden. Die Clusteranalyse (CA) und die
Hauptkomponentenanalyse (HKA) einer Probe der Fraktionen Original und Konzentrat
über die einzelnen Substrate soll Aufschluss über die Ähnlichkeit dieser Fraktionen geben
(Abbildung 13).
Abbildung 13: Darstellung der Untersuchungen des physiologischen Profils einer Bakteriengemeinschaft der einzelnen Fraktionen mit den Biolog-Mikrotiterplatten.
A
B
C
D
E
F
G
H
Charakterisierung des physiologischen Profils der Bakteriengemeinschaft in den einzelnen Fraktionen durch die:
Gesamtrate der Farbentwicklung
Stärke der Farbentwicklung der unterschiedlichen Substratklassen
CMF
VF
Wasserprobe
Vorfiltrat
Konzentrat
Filtrat
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
CA und HKA für eine Probe in den Fraktionen ORI und KON über die Substrate
Biotechnologische Grundlagen
22
Bei der Clusteranalyse werden Objekte an Hand der Ähnlichkeit ihrer Merkmale
schrittweise zu verschiedenen Gruppen bzw. Cluster zusammengefasst. Unter Verwendung
der Ward Methode, die als Proximitätsmaß die quadrierte Euklidische Distanz zu Grunde
legt, werden die Cluster so aggregiert, dass ein minimales Anwachsen der
Fehlerquadratsumme innerhalb eines Clusters resultiert (Otto 1997). Sind die Cluster in
etwa gleich groß, spiegelt dieses Verfahren die reale Struktur des Datensatzes gut wider.
Diese Methode ist neben der Average Linkage die Wahl und sollte bei vollkommen
unbekannter Datenstruktur zuerst angewandt werden (Einax, Zwanziger et al. 1997).
Bei der Hauptkomponentenanalyse, ist die Datenreduktion das wichtigste Ziel. Viele
beobachtete Merkmale (Variablen V1-V10) werden zu Hauptkomponenten
zusammengefasst, mit denen die Objekte (Faktoren 1-3) beschrieben werden (Beispiel
Abbildung 14) (Kessler 2007).
Abbildung 14: Prinzip der Hauptkomponentenanalyse nach Kessler (Kessler 2007)
Ausgangspunkt Viele Objekte, viele Daten Unübersichtlich Informationen bleiben versteckt Variablen der Ausgangsmatrix: V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 Zielpunkt: Weniger unabhängige Übersichtlich Einflussgrößen Information wird herausgehoben
V1 V7 V8 V10 V2 V4 V3 V5 V6 V9
Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3
Faktoren sind Hintergrundgrößen, die aus den Vordergrundgrößen,
den Variablen berechnet werden.
Jedes Objekt wird im Faktorraum beschrieben Datenreduktion
Material und Methoden
23
4 Material und Methoden
4.1 Untersuchungsgebiete
Für die Optimierung des MCC 1 wurden Proben aus verschiedenen Gewässern
genommen. Hierbei handelt es sich um Proben aus der Elbe sowie dem Sauteich und dem
Saubach.
4.1.1 Die Elbe
Die Elbe ist mit einer Länge von 1 094 km von der Quelle im Riesengebirge bis zur
Mündung in die Nordsee bei Cuxhaven und einem Einzugsgebiet von 148 268 km2 das
viertgrößte Flussgebiet Mitteleuropas (Abbildung 15). Im Einzugsgebiet der Elbe leben
24,5 Mio. Einwohner. Zu den wichtigsten Nebenflüssen der Elbe gehören die Moldau,
Saale, Havel, Mulde, Schwarze Elster und Eger.
Abbildung 15: Einzugsgebiet Elbe und Probennahmestelle km 327
Probenahmestelle km 327 links
Magdeburg
Nordsee
1km
Material und Methoden
24
4.1.2 Der Sauteich und der Saubach
Die Talsperre Muldenberg befindet sich im Vogtlandkreis des Freistaates Sachsen und ihre
nächstgelegene Stadt ist Schöneck (Abbildung 16). Die Talsperre wurde 1925 in Betrieb
genommen und staut die Rote Mulde, die Weiße Mulde und den Saubach (einen Abfluss
des Sauteichs). Sie dient der Rohwasserbereitstellung für die Trinkwasserversorgung und
darüber hinaus dem Hochwasserschutz. Das Einzugsgebiet der Talsperre Muldenberg
besteht zum größten Teil aus Hochmoor, was einen Huminstoffeintrag in den
Wasserkörper bewirkt. Die Talsperre hat einen niedrigen pH-Wert der natürlichen
Ursprungs ist (Sieber 1992).
Abbildung 16: a) Lage der Talsperre Muldenberg; b) Probenahmestelle Sauteich
4.2 Probennahme
Die Probennahmen erfolgten mittels Stielschöpfer bzw. Probenschöpfer in einem
autoklavierten 10 L Kanister aus Polypropylen. Die Proben wurden gekühlt bei 4 °C und
abgedunkelt transportiert.
Rote Mulde Weiße Mulde
Auslauf Talsperre
Sauteich
1km
Saubach
a) b)
Material und Methoden
25
4.3 Aufbau des Munich Cell Concentrator 1 Der Munich Cell Concentrator wurde für die Anreicherung von Bakterien in Wasserproben
entwickelt (Peskoller, Niessner et al. 2009). Er wurde so konstruiert, dass das Konzentrat
nicht, wie in der Literatur beschrieben, in den Probenbehälter zurückgeführt wird, sondern
eine Aufkonzentrierung durch kontinuierliche Mehrfachüberspülung in einer
Zirkulationsschleife stattfindet (Nagata, Herouvis et al. 1989), (Abbildung 17). Der Vorteil
besteht darin, dass Zellen aus der Probe, die sich nach der Anreicherung noch auf der
Membran befinden, durch gezielte Spülvorgänge aus dem System nahezu vollständig
wiedergewonnen werden können. Der MCC 1 zeichnet sich auch durch ein geringes
Volumen der Zirkulationsschleife und einen dadurch erreichbaren höheren
Anreicherungsfaktor aus. Aufgrund seiner robusten Bauweise ist er nicht nur für den
Einsatz im Labor sondern auch für die Anreicherung im Feld geeignet.
Abbildung 17: Schematischer Aufbau a) eines in der Literatur beschriebenen Filtrationssystems und b) eines Filtrationssystems mit Rezirkulationsschleife, modifiziert nach Peskoller (Peskoller 2010)
p1 p2p0
Probe
Filtrat
Hohlfasermodul
Konzentrat
V1
p1 p2p0
V2
V3
Eluat
Hohlfasermodul
Probe
Filtrat
pi Drucksensoren
Durchflusssensor
Drei-Wege-Regelventil
Magnetventile Vi
Schlauchpumpe
Rezirkulationsschleife
b)a)
Material und Methoden
26
Für die Realisierung des Filtrationsprozesses wurden zusätzlich drei Ventile, die mittels
Computer angesteuert werden, eingebaut. Dies ermöglicht eine automatisierte Ansteuerung
des MCC 1 in den verschiedenen Modi (Tabelle 1).
Tabelle 1: Beschreibung der einzelnen Modi
*Austausch des Zirkulationsschlauches mit dem Filtratschlauch
Abbildung 18: Aufbau des MCC 1
Modus Pump-
richtung U/ min
Ventilstellung Ventil 1 Ventil 2 Ventil 3
Konditionierung RL 350 Befüllen-Elution offen geschlossen offen
Dead-End RL 200 Dead-End offen geschlossen geschlossen
Anreicherung RL 350 Filtration offen offen geschlossen
Elution RL 350 Befüllen-Elution offen geschlossen offen
Spülen RL 400 Spülen geschlossen offen geschlossen
Rückwärtsspülen RR 400 Rückwärtsspülen geschlossen offen geschlossen
Rückspülung* RR 100 Rückspülung geschlossen offen geschlossen
p0 p1
p2
V1 V3
V2
Hohlfasermodul
Konzentrat
Material und Methoden
27
Die Abbildungen 17b und 18 zeigen den Aufbau des MCC 1. Das Gehäuse besteht aus
eloxiertem Metall. An den Seiten sind Tragegriffe angebracht, um den Transport im Feld
zu erleichtern. Die Schläuche bestehen aus Marprene und haben einen Innendurchmesser
von 6,4 mm. Sie lassen Flüsse von 1,6 L/min zu und werden vorwiegend für biologische
Prozesse eingesetzt. Des Weiteren ist der MCC 1 so konzipiert, dass sich Filtrationsmodul
und Schläuche leicht wechseln lassen. Mittels der Einkanalschlauchpumpe, welche eine
Fördermenge bis zu 2 L/min und einen Druck von 2 bar zulässt, wird die Probe mittels
Schlauch in die Rezirkulationsschleife und durch das Hohlfasermodul befördert. Im Modul
findet die Trennung in Filtrat- und Konzentratstrom statt. Das Filtrat wird in ein separates
Gefäß geleitet und das Konzentrat verbleibt zur stetigen Aufkonzentrierung in der
Rezirkulationsschleife, wobei eine kontinuierliche Probenzufuhr die Zirkulation im
Kreislauf ermöglicht. Der Filtratfluss wird mittels Durchflussmesser POM Opto, einem
Durchfluss-Impulsgeber für besonders durchscheinende Flüssigkeiten, gemessen. Der
Messbereich liegt zwischen 0,025 und 2,5 L/min. Für die Filtration wird ein
Hohlfasermodul mit einem Membranmaterial aus Polyethylensulfon (PES) und einer
Membranfläche von 365 cm2 verwendet (Abbildung 19). Das Material der Membran
zeichnet sich durch hydrophile Eigenschaften aus und wird häufig für die Filtration von
biologischen Suspensionen verwendet. Der Kapillarinnendurchmesser der Hohlfasern des
Moduls beträgt 0,5 mm und der Porendurchmesser 0,5 µm. Der TMP des Moduls ist auf
maximal 2 bar ausgelegt.
Abbildung 19: Hohlfaserfiltrationsmodul MiniKros Sampler Plus
Der Filtrationsprozess kann durch drei Magnetventile, dem Probenventil (V1), dem
Rezirkulationsventil (V2) und dem Elutionsventil (V3) in verschiedenen Modi (Tabelle 1)
gesteuert werden. Ein elektromagnetischer Aktuator betätigt die Schlauchklemme des
Ventils und kann den Durchfluss der Probe durch Abklemmen oder Freigeben des
eingelegten Schlauches regulieren. Zur Bestimmung der transmembranen Druckdifferenz
Material und Methoden
28
sind am Moduleingang, am Modulausgang und am Filtratausgang Drucksensoren
angebracht. Hier wurde jeweils ein Flashmount-Transmitter mit einer frontbündigen
Membran verwendet und an eine Flusszelle aus PTFE (Polytetrafluorethylen) mit zwei
Schlauchanschlüssen angebracht.
Mit Hilfe des Restriktionsventils wird manuell die Filtrationsgeschwindigkeit geregelt und
somit der Arbeitsdruck (die transmembrane Druckdifferenz) im Filtrationsmodul.
In einem sterilen 125 ml Probengefäß kann das Konzentrat über den Elutionsschlauch
überführt werden.
Die automatisierte Ansteuerung und Erfassung der Messwerte erfolgte mittels externen
Laptop über das Programm LabView 8.2. In der Abbildung 20 ist die Softwareoberfläche
dargestellt.
Abbildung 20: Softwareoberfläche des Programms LabView 8.2. zur Ansteuerung des MCC 1
Ventil aktiv
Material und Methoden
29
Nachdem die Geräte eingeschaltet sind, wird durch das Drücken der Mode-Taste der
Digitalmodus der Pumpe aktiviert. Im Feld „Befehl“ können die gewünschten Parameter
wie Geschwindigkeit und Drehrichtung der Pumpe eingegeben werden, die durch Drücken
der Taste „Start“ oder „Stop“ aktiviert bzw. deaktiviert werden können. Die
verschiedenen Ventilstellungen der Ventile V1, V2 und V3 können im Feld „Ventile“
(Tabelle 2) ausgewählt und somit aktiviert werden. Die aktivierten Ventile sind mit einer
anderen Farbe unterlegt.
Des Weiteren werden die während der Filtration auftretenden Drücke am Moduleingang,
am Modulausgang und am Filtratausgang, sowie der errechnete TMP angezeigt. Außerdem
wird der Filtratfluss in ml min-1 numerisch wiedergegeben und in der Grafik gezeigt. Durch
die Eingabe der Membranfläche in cm2 wird der Flux in L h-1 m-2 und die Permeabilität in
L h-1 m-2 bar-1 berechnet und angezeigt. Im Dateipfad werden die Daten in einer Datei im
ASCII-Format abgespeichert. Mit der Taste Stopp kann das Programm beendet werden.
Material und Methoden
30
(3) Vorfiltrat
CFM
(1) Probe
(3) Vorfiltrat
(2) Vorfiltrat- überschuss
(4) Konzentrat (Eluat)
(5) Filtrat
(Permeat)
Bilanzraum 1 Vorfiltration
Bilanzraum 2 Cross-Flow-Mikrofiltration
Senke 1 Senke 2
Vorfilter
(Original)
4.4 Bilanzierung der Filtration
Zur Beschreibung des Filtrationsprozess wurde eine Bilanz aufgestellt. In Abbildung 21 ist
ein Fließschema des Filtrationsprozesses dargestellt. Hier werden die Bilanzräume
Vorfiltration, Cross-Flow-Mikrofiltration und deren einzelnen Ströme gezeigt.
Abbildung 21: Fließschema des Filtrationsprozesses
Im weiteren Verlauf werden die einzelnen Fraktionen Original, Vorfiltrat, Konzentrat und
Filtrat mit den Abkürzungen ORI, VOR, KON, FIL (Tabelle 2) versehen.
Tabelle 2: Abkürzungen der einzelnen Fraktionen Fraktion Abkürzung
Original ORI
Vorfiltrat VOR
Konzentrat KON
Filtrat FIL
Allgemeine Massenbilanz einer Prozesseinheit
01 11
=−−∑ ∑∑= ==
a
i
s
i
Si
Ai
e
i
Ei mmm 4-1
Mit ρ⋅=Vm 4-1a
m Masse [g]
V Volumen [L]
Material und Methoden
31
ρ Dichte [g · L-1] Annahme ρ =konstant
Für einen Bilanzraum gelten folgende allgemeine Bilanzen:
Eingangsvolumen (E) – Ausgangsvolumen (A) - Senke (S) = 0
Volumenbilanz : 0111
=−− ∑∑∑===
s
i
Swi
a
i
Awi
e
i
Ewi VVV 4-2
Mit: VW i Wasser im Strom i [L]
Bakterienzahl Eingang (E) – Bakterienzahl Ausgang (A) - Senke (S) = 0
Bilanz der GBZ: 0111
=⋅−⋅−⋅ ∑∑∑===
s
i
SBi
SWi
a
i
ABi
AWi
e
i
EBi
EWi cVcVcV 4-3
Mit: cB i Konzentration Bakterien im Strom i [Zellen L-1]
GBZ Gesamtbakterienzahl [Zellen]
Bilanzgleichungen der Bilanzräume:
Bilanzraum für die Vorfiltration:
0321 =−−− WSWWW VVVV [ 1 ]
011332211 =⋅−⋅−⋅−⋅ BSWSBWBWBW cVcVcVcV [ 2 ]
Bilanzraum für die Cross-Flow-Mikrofiltration:
02543 =−−− WSWWW VVVV [ 3 ]
022554433 =⋅−⋅−⋅−⋅ BSWSBWBWBW cVcVcVcV [ 4 ]
Material und Methoden
32
4.5 Durchführung der Filtration
4.5.1 Vorfiltration
Für die Filtration wurde die Probe homogenisiert und jeweils in Zweiliterflaschen abgefüllt.
Durch Wägung wurde das Volumen bestimmt unter Annahme der Dichte gleich 1. Es
erfolgte eine Vorfiltration (Abbildung 22a) mittels Schlauchquetschpumpe über ein
Filtersystem mit einem Oberteil aus Polypropylen, dem Unterteil aus Trogamid und dem
Filtermodul aus Nylon 50 µm in einen neuen Behälter mit einer Flussrate von 1,6-2 L min-1
(Abbildung 22b). Aufgrund des transparenten Filtergehäuses des Filtersystems konnte
Einblick auf das Filterelement genommen werden. Um eine Kontamination der Probe zu
vermeiden, wurde die Vorfiltrationseinheit autoklaviert und der Nylonfilter mit Ethanol
desinfiziert und anschließend unter der Sterilbank eingesetzt.
Abbildung 22: a) Aufbau der Vorfiltration b) Filtersystem
4.5.2 Vorbereitung des MCC 1 (Initialisierung)
Die einzelnen Modi sind in der Tabelle 2 erläutert.
Zur Durchführung des Anreicherungsprozesses wurde der MCC 1 initialisiert. Deshalb
wurde die Anlage im Konditionierungsmodus „Befüllen-Elution“ mit vollständig
geöffnetem Restriktionsventil befüllt. Dazu wurden der Probenahme-, Filtrat- und
Konzentrationsstrom in das Vorratsgefäß geleitet (Abbildung 23a und 23b). Nach dem
Starten der Pumpe wurden die Schläuche sowie das Filtrationsmodul solange befüllt, bis
alle Luftblasen im Zirkulationssystem entwichen waren. Das Entlüften des Modulausgangs
erfolgte für 30 Sekunden im Dead-End-Modus. Um die restlichen Luftblasen aus dem
Zirkulationsmodul zu entfernen, wurde für 30 Sekunden der Filtrationsmodus und
anschließend für 30 Sekunden der Elutions-Modus verwendet. Dazu wurden die Ventile
a) b)
Material und Methoden
33
auf „Filtration“ und anschließend „Befüllen-Elution“ bei laufender Pumpe gestellt. Dieser
Vorgang wurde zweimal wiederholt. Anschließend war das Gerät bereit für die Filtration.
Abbildung 23: a) Initialisierung des MCC 1 b) schematische Darstellung der Initialisierung des MCC 1
4.5.3 Filtrationsprozess
Für die Filtration wurde der Filtrationsschlauch in ein separates Gefäß geleitet. Unter dem
Elutionsschlauch wurde ein gewogenes 125 ml Gefäß gestellt (Abbildung 24).
Abbildung 24: MCC 1 während der Filtration
V1
p1 p2p0
V2
V3
Hohlfasermodul
Probe
Filtrat
b)a)
Material und Methoden
34
Nach dem Starten der Filtration im Anreicherungsmodus wurde das Restriktionsventil so
eingestellt, dass der gewünschte TMP erreicht wurde. Für die einzelnen
Anreicherungsversuche wurde mit verschiedenen maximalen TMP gearbeitet (Tabelle 3),
um eine optimale Elution der Bakterien von der Membran für natürliche Gewässerproben
zu erzielen.
Tabelle 3: maximaler TMP für die Optimierung der Elution der verschiedenen Proben
Probe Datum maximaler TMP [bar]
Spülung modifiziert 2. Elution
Elbe 1 09.11.2009 0,083 - -
Elbe 2 ″ 0,076 - -
Moritzteich 1 19.11.2009 0,083 - -
Moritzteich 2 ″ 0,083 - -
Saubach 1 09.12.2009 0,232 - -
Saubach 2 ″ 0,340 - -
Sauteich 1 ″ 0,318 - -
Sauteich 2 ″ 0,200 - -
Elbe 3 02.02.2010 0,033 x x
Elbe 4 ″ 0,041 x x
Elbe 5 ″ 0,051 x x
Elbe 6 ″ 0,084 x x
Während der Filtration wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen in das System
gelangten. Es wurden die Prozessparameter Filtratfluss, TMP notiert und die Permeabilität
nach Gleichung 2-2 berechnet. Nachdem sich noch ca. 100 ml der Probe im Gefäß
befanden, wurde die Pumpe gestoppt, das Restriktionsventil geschlossen und die Ventile
sofort auf den Modus „Spülen“ gestellt. Das Spülen der Rezirkulationsschleife
(Abbildung 25a) erfolgte nach einer Minute, die Pumpe wurde gestartet und für eine
Minute in diesem Modus betrieben. Danach erfolgte bei laufender Pumpe ein
Pumpenrichtungswechsel. Für eine Minute wurde die Rückwärtsspülung vorgenommen
und anschließend gestoppt. Die Elution (Gewinn des Konzentrats, Abbildung 25b) erfolgte
durch das Öffnen des Elutionsventils durch den Modus „Befüllen-Elution“ und dem
Pumprichtungswechsel „RL“. Der Elutionsmodus lief für drei Sekunden. Das
Elutionsgefäß wurde somit befüllt und zurück gewogen. Aus der Differenz konnte die
Menge an Flüssigkeit im Konzentrat bestimmt werden.
Material und Methoden
35
Abbildung 25: a) Spülung des Systems b) Elution der Bakterien aus der Rezirkulationsschleife
Für die Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010 wurde ein modifiziertes Spülen/Elution
vorgenommen. Dies ist in der Tabelle 4 dem nichtmodifiziertem Spülen/Elution
gegenübergestellt.
Tabelle 4: Gegenüberstellung modifiziertes und nichtmodifiziertes Spülen/Elution Spülen/Elution Spülen/Elution modifiziert
Modi Pumprichtung/Drehzahl
Zeit [s] Modi Pumprichtung/
Drehzahl Zeit [s]
Ruhen - 60 Ruhen - 60
Spülung RL 400 60 Rückwärtsspülung RR 400 10
Rückwärtsspülung RR 400 60 Ruhen - 10
Elution RL 350 3 Rückwärtsspülung RR 400 10
Ruhen - 10
Rückwärtsspülung RR 400 10
Ruhen - 10
Rückwärtsspülung RR 400 30
Spülung RL 400 60
Elution RL 350 3
V1
p1 p2p0
V2
Eluat
V3
Hohlfasermodul
Probe
Filtrat
b)
V1
p1 p2p0
V2
V3
Eluat
Hohlfasermodul
Probe
Filtrat
a)
Material und Methoden
36
4.5.4 Regenerierung
Zur Regenerierung der Cross-Flow-Mikrofiltrationsanlage wurde eine 0,5 %ige alkalische
Detergenzlösung Hellmanex II verwendet, welche hauptsächlich zur Entfernung von
organischem und biologischem Fouling dient (Flemming 1995). Hierzu wurde die Lösung
in ein Gefäß vorgelegt, der Proben-, Elutions- und Filtrationsschlauch eingetaucht und der
MCC 1 für 15 Minuten im Konditionsmodus betrieben. Danach erfolgte die Rückspülung
für 5 Minuten im Rückspülmodus, indem durch Öffnen der Schlauchhalterung der Pumpe
der Zirkulationsschlauch mit dem Filtrationsschlauch ausgetauscht wurde. Im Anschluss
wurde die Spüllösung durch autoklaviertes deionisiertes Wasser ersetzt, der
Zirkulationsschlauch wieder mit den Filtrationsschlauch ausgetauscht, der Proben- und der
Elutionsschlauch in ein leeres Gefäß geleitet und für weitere 5 Minuten im
Konditionsmodus konditioniert. Anschließend war die Cross-Flow-Mikrofiltration für die
nächste Probe zur Initialisierung bereit.
Jedoch zeigte sich, dass eine Regenerierung mit 0,5 %iger alkalische Detergenzlösung
Hellmanex II nicht ausreicht. Deshalb wurde das Filtrationsmodul mit den Lösungen
0,05% Natriumhypochloritlösung und 0,5 N Natriumhydroxid-Lösung für jeweils 20
Minuten gespült. Weitere Spülschritte sind mit den in der Tabelle A1 aufgeführten
Chemikalien möglich. Die Filtrationseinheit war nun für den nächsten
Anreicherungsprozess bereit.
4.6 Biolog-Mikrotiterplatte
Die Charakterisierung des physiologischen Profils der Bakteriengemeinschaften in den
unterschiedlichen Fraktionen wurde mit Hilfe von Mikrotiterplatten der Firma BIOLOG
durchgeführt. Es wurden Platten des Typs EcoPlate eingesetzt. Die 96 Vertiefungen dieser
Platten enthalten in dreifacher Ausführung je 31 verschiedene Kohlenstoffsubstrate und
den Redoxfarbstoff Tetrazoliumchlorid, sowie ein Kontrollfeld ohne Substrat. Die
Anordnung der einzelnen Substrate ist in Abbildung 26 dargestellt. Die EcoPlates wurden
speziell für die Analyse von Umweltproben entwickelt.
Material und Methoden
37
A1 Wasser
A2 β-methyl-D- Glucosid
A3 D-Galcton- Säure γ-Lacton
A4 L-Arginin
A1 Wasser
A2 β-methyl-D- Glucosid
A3 D-Galcton- Säure γ-Lacton
A4 L-Arginin
A1 Wasser
A2 β-methyl-D- Glucosid
A3 D-Galcton- Säure γ-Lacton
A4 L-Arginin
B1 Methyl- pyruvat
B2 D-Xylose
B3 D- Galakturon- säure
B4 L-Asparagin
B1 Methyl- pyruvat
B2 D-Xylose
B3 D- Galakturon- säure
B4 L-Asparagin
B1 Methyl- pyruvat
B2 D-Xylose
B3 D- Galakturon- säure
B4 L-Asparagin
C1 Tween 40
C2 i-Erythritol
C3 2-Hydroxy- Benzoat
C4 L-Phenyl- alanin
C1 Tween 40
C2 i-Erythritol
C3 2-Hydroxy- Benzoat
C4 L-Phenyl- alanin
C1 Tween 40
C2 i-Erythritol
C3 2-Hydroxy- Benzoat
C4 L-Phenyl- alanin
D1 Tween 80
D2 D-Mannitol
D3 4-Hydroxy- Benzoat
D4 L-Serin
D1 Tween 80
D2 D-Mannitol
D3 4-Hydroxy- Benzoat
D4 L-Serin
D1 Tween 80
D2 D-Mannitol
D3 4-Hydroxy- Benzoat
D4 L-Serin
E1 α-Cyclodextrin
E2 N-acetyl-D- Glukosamin
E3 γ-Hydroxy- Buttersäure
E4 L-Threonin
E1 α-Cyclodextrin
E2 N-acetyl-D- Glukosamin
E3 γ-Hydroxy- Buttersäure
E4 L-Threonin
E1 α-Cyclodextrin
E2 N-acetyl-D- Glukosamin
E3 γ-Hydroxy- Buttersäure
E4 L-Threonin
F1 Glycogen
F2 D- Glukosamin- säure
F3 Itaconsäure
F4 Glycyl-L- Glutamin- säure
F1 Glycogen
F2 D- Glukosamin- säure
F3 Itaconsäure
F4 Glycyl-L- Glutamin- säure
F1 Glycogen
F2 D- Glukosamin- säure
F3 Itaconsäure
F4 Glycyl-L- Glutamin- säure
G1 D-Cellobiose
G2 Glucose-1- Phosphat
G3 α-keto- Glutarsäure
G4 Phenyl- Ethylamin
G1 D-Cellobiose
G2 Glucose-1- Phosphat
G3 α-keto- Glutarsäure
G4 Phenyl- Ethylamin
G1 D-Cellobiose
G2 Glucose-1- Phosphat
G3 α-keto- Glutarsäure
G4 Phenyl- Ethylamin
H1 α-D-Lactose
H2 D,L- α- Glycerol- phosphat
H3 D-Apfelsäure
H4 Putrescin
H1 α-D-Lactose
H2 D,L- α- Glycerol- phosphat
H3 D-Apfelsäure
H4 Putrescin
H1 α-D-Lactose
H2 D,L- α- Glycerol- phosphat
H3 D-Apfelsäure
H4 Putrescin
Abbildung 26: Anordnung der einzelnen Substrate in den Eco Plates
37
Material und Methoden
38
Die 31 Substrate wurden nach Insam in 6 Substratklassen eingeteilt (Insam 1997). Diese
Einteilung ist in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: Einteilung der Substrate in 6 Substratklassen Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische
Verbindungen
Putrescin L-Arginin α-D-Lactose α-keto- Glutarsäure
α-Cyclodextrin
2-Hydroxy- Benzoat
Phenyl- Ethylamin L-Asparagin β-methyl-D-
Glucosid D- Galakturonsäure Glycogen 4-Hydroxy-
Benzoat
L-Phenylalanin D-Cellobiose D-
Glukosaminsäure Tween 40
L-Serin D-Mannitol D-Apfelsäure Tween 80
L-Threonin i-Erythritol Itaconsäure
Glycyl-L- Glutaminsäure
Glucose-1- Phosphat
Methylpyruvat
D-Xylose γ-Hydroxy- Buttersäure
D-Galcton- Säure γ-Lacton
N-acetyl-D- Glukosamin
D,L- α- Glycerolphosphat
4.6.1 Animpfen
Die Biolog-Platten wurden direkt mit den Fraktionen Original, Vorfiltrat, Konzentrat und
Filtrat beimpft. Dazu wurden 150 µl der Fraktion mittels elektronischer Mehrkanalpipette
in die 96 Vertiefungen pipettiert. Diese Arbeit fand unter einer Sterilbank statt, um
Kontaminationen zu vermeiden.
4.6.2 Inkubation und Vermessung
Die Inkubation der Mikrotiterplatten erfolgte bei einer Temperatur von 20°C im
Brutschrank. Die Farbentwicklung in den verschiedenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte
wurde sofort und in zeitlichen Abständen mittels Mikrotiterplatten-Photometer (Multiskan
RC) bei einer Wellenlänge von 595 nm vermessen.
4.6.3 Auswertung
Um Hintergrundsignale die durch Substrate oder durch die Aufkonzentration der Bakterien
ausgelöst werden zu entfernen, wurden die vom Photometer für die einzelnen Substrate
Material und Methoden
39
gemessenen Rohwerte der optischen Dichte (OD) zweifach korrigiert. Zunächst wurden
von allen Rohwerten die Messwerte der ersten Messung direkt nach dem Ansetzen der
Platten (zum Zeitpunkt t=0) und allen Rohwerten einer Platte der Mittelwert der 3
Kontrollfelder ohne Substrat (Hintergrundsignal) abgezogen (Girvan, Bullimore et al.
2003). Entstanden dabei für ein Feld negative Werte, erhielten diese den Wert 0.
Zur Normalisierung der Daten wurde für jeden Messzeitpunkt die durchschnittliche
Farbentwicklung („average well colour development“ AWCD) der jeweils
zusammengehörenden 31 Substrate einer Parallele berechnet. Für die 31
zusammengehörigen Substrate der Parallele j, die zum Zeitpunkt t gemessen wurden,
berechnet er sich wie folgt:
),,(311 31
1, tjiODAWCD
ikortj ∑
=
= 4-4
wobei ODkor(i,j,t) die korrigierte OD für die Vertiefung i der Parallele j zum Messzeitpunkt
t ist. Um den Einfluss eventuell ungleichmäßiger Verteilung der Bakterien durch
Bakterienaggregate zu minimieren, wurden alle für die Umsetzung der einzelnen Substrate
erhaltenen OD-Werte einer Normalisierung unterzogen (Garland 1996). Das heißt, die
OD-Werte der einzelnen Substrate wurden durch den AWCD-Wert der jeweils
zugehörigen 31 Substrate einer Parallele geteilt. Die normalisierten Werte für jeden
Messwert errechnen sich dann wie folgt:
),(),,(
),,(tjAWCDtjiOD
tjiOD kornorm =
4-5
Diese normalisierten Werte waren die Grundlage für die weiteren Auswertungen.
Für den Vergleich der verschiedenen Fraktionen wurden
o die Gesamtraten der Farbentwicklung
o die Farbentwicklung der 6 Substratklassen verglichen.
Weiterhin wurde eine Clusteranalyse und eine Hauptkomponentenanalyse der Fraktionen
Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 durchgeführt. Die 31 Substrate wurden mittels
der Hauptkomponentenanalyse auf eine überschaubare Anzahl an Hauptkomponenten
reduziert. Möglichst wenig der durch die ursprünglichen Muster gegebenen Varianz soll
dabei verloren gehen. Dies wird durch eine lineare Transformation auf eine neue Menge
von Mustern erreicht. Die erste Hauptkomponente repräsentiert hierbei die größte Varianz
der 31 Substrate (Hackett & Griffiths 1997).
Material und Methoden
40
4.7 Mikrobiologische Untersuchungen
4.7.1 Färbung und Mikroskopie
Für die Bestimmung der Bakterienkonzentration wurden die Bakterien mit Acridin-Orange
angefärbt. Hierzu wurde eine Filtrationseinheit mit einem Aufsatz von 22 mm
Durchmesser und einer Fritte von 20,1 mm Durchmesser verwendet. Für die Filtration
wurden ein Unterlegfilter und ein schwarzer Nuclepore-Filter (PC; 0,2 µm) jeweils mit
einem Durchmesser von 25 mm eingesetzt. Die Probe wurde 2 Minuten homogenisiert.
Danach wurde 1 ml der Probe auf den Filter gegeben, mit 0,2 ml 3 %iger
Natriumthiosulfatlösung entfärbt und mit einem Unterdruck von maximal 150 hPa filtriert.
Anschließend wurde tröpfchenweise 1 ml Acridin-Orange aufgegeben, die Vakuumpumpe
kurz eingeschaltet, um den Farbstoff anzusaugen. Nach 2 Minuten wurde der Farbstoff
abgesaugt und der Nuclepore-Filter auf einen vorbereiteten Objektträger mit einem
Tropfen Immersionsöl gelegt, ein weiterer Tropfen wurde auf den Filter gegeben und ein
Deckglas aufgelegt (Hobbie, Daley et al. 1977).
Die Bakterien wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Typ: Axiolab, Zeiss) bei
1000facher Vergrößerung gezählt (Abbildung 27a). Die Zählung und Vermessung der
Bakterien erfolgte mit einem Grid Porton G12 (May 1965), (Abbildung 27b).
Abbildung 27: a) Epifluoreszenzmikroskop b) Grid Porton G12
a) b)
Material und Methoden
41
4.7.2 Bakterienkonzentration
Die Bakterienkonzentration gibt die Zahl der Bakterien in einem Liter der Fraktion an.
Filtrat
V
SFASF
FritteBB V
UFnAAnc ⋅⋅⋅
= 4-6
2
4 FritteFritte dA π=
4-6a
SFSFSF blA ⋅= 4-6b
cB Konzentration Bakterien [Zellen L-1]
nB Anzahl der gezählten Objekte [-]
nASF Anzahl der Sichtfelder [-]
AFritte Fläche der Fritte [mm2]
ASF Fläche Sichtfeld 3,19·10-3[mm2]
VFiltrat Filtratvolumen [ml]
UFV Umrechnungsfaktor Volumen [ml · L-1]
dFritte Durchmesser der Fritte 20,1 [mm]
4.7.3 Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen
Die Bakterienkonzentration der einzelnen Formklassen gibt die Zahl der Bakterienklasse in
einem Liter der Fraktion an.
B
FormklasseBFormklasse n
ncc ∑⋅= 4-7
4.7.4 Gesamtbakterienzahl
Die Gesamtbakterienzahl gibt an, wie viele Bakterien absolut sich in einer Fraktion
befinden.
BiWi cVGBZ ⋅= 4-8 GBZ Gesamtbakterienzahl [Zellen]
Material und Methoden
42
4.7.5 Biovolumen der Bakterien
Das Biovolumen der Bakterien gibt an, wie viel Volumen die Bakterien in einem Liter der
Fraktion einnehmen
BB n
blbGBZV
∑ ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −⋅⋅⋅
=
− )3
(4
10 29 π
4-9
VB Biovolumen [mm3 L-1]
b Breite Bakterien [µm]
l Länge Bakterien [µm]
nB Anzahl der gezählten Objekte
für Kokken bl = 4-9a
für Spirillen 2bl ⋅
=π
4-9b
4.7.6 Biomasse von Bakterien
Die Biomasse der Bakterien gibt an, wie viel Milligramm Kohlenstoff sich in einem Liter
der Fraktion befindet.
Die Biomasse wurde unter Anwendung einer nichtlinearen Gleichung berechnet (Simon &
Azam 1989).
359,0 1086,06,88 −⋅⋅⋅= BB Vm 4-10
mB Biomasse [mgC L-1]
4.7.7 Wiederfindungsrate der Bakterien
Die Wiederfindungsrate der Bakterien gibt an, wie viel Prozent der Bakterien im
Konzentrat wiedergewonnen wurden.
100
PrPr
⋅⋅⋅
=obeobe
KonzentratKonzentrat
cVcV
WFR 4-11
WFR Wiederfindungsrate [%]
Material und Methoden
43
4.7.8 Anreicherungsfaktor
Der Anreicherungsfaktor gibt das Verhältnis der Volumen zwischen Probe und Konzentrat
an.
Konzentrat
obe
VV
F Pr= 4-12
F Anreicherungsfaktor [-]
4.8 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration wurde mit dem Triphenylmethanfarbstoff (TPM) Coomassie-
Brilliant-Blau beruhend auf einer Modifikation der Bestimmung der Proteinkonzentration
nach Bradford bestimmt (Bradford 1976). Der Farbstoff TPM reagiert basisch mit
Aminosäuren. Infolge dessen sich das Absorptionsmaximum von 465 nm hin zu 595 nm
verschiebt.
Für die Kalibrierung wurden verschiedene Proteinkonzentrationen aus BSA (Albumin
Fraktion V) und dem Farbstoff TPM hergestellt. Das Rinderserum-Albumin Fraktion V
hat sich als international anerkannter Standard für die Kalibrierung durchgesetzt. Es wurde
der Quotient aus den optischen Dichten (OD) OD590/OD450 gegen die eingesetzte
Proteinmenge aufgetragen (Abbildung 28, Tabelle A2).
Kalibrierkurve mit Roti-Nanoquant und BSA (Albumin Fraktion V) 0-100 µg/ml
y = 0,01740x + 0,62365R2 = 0,99997
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80 100 120
µg/ml
OD
590
/450
Abbildung 28: Kalibrierkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Material und Methoden
44
Die analytischen Grenzwerte für diese Kalibriergeraden sind die Nachweisgrenze mit
0,722 µg/ml, die Erfassungsgrenze mit 1,44 µg/ml und die Bestimmungsgrenze mit
2,90 µg/ml. Das Bestimmtheitsmaß dieser Kalibriergeraden beträgt R2=1.
Die Berechnung der Proteinkonzentration wurde mit Hilfe der folgenden Gleichung
bestimmt:
0174,0
)62365,0(450
590
Pr
−=OD
c 4-13
OD : Optische Dichte [nm]
Prc : Proteinkonzentration [µg/ml]
Die Messung der Kalibrierung und der Proben erfolgte am Beckman-Photometer.
Ergebnisse und Diskussion
45
5 Ergebnisse und Diskussion
5.1 Die Wiederfindungsrate der Bakterien, ihr Biovolumen, -masse
und die Morphologie
5.1.1 Bestimmung des druckkontrollierten Arbeitsbereiches
Um eine hohe Wiederfindungsrate zu erzielen, sollte die Filtration im druckkontrollierten
Bereich stattfinden. Es wurde der druckkontrollierte Bereich des Filtrationsaufbaues mit
deionisiertem Wasser bestimmt (Abbildung 29, Tabelle A3). Grundsätzlich gilt, dass der
Filtratfluss linear mit dem TMP ansteigt. Es kann zu einer Komprimierung der
Deckschicht auf der Membran kommen, wenn ein kritischer Druck erreicht ist. Der
Filtratfluss nimmt dabei langsam ab und erreicht meist einen konstanten Wert, welcher als
kritischer Fluss bezeichnet wird.
Abbildung 29: Lineare Abhängigkeit des Filtratflusses vom TMP
5.1.2 Bestimmung der Wiederfindungsrate in Abhängigkeit des TMP
Für die Anreicherung von Mikroorganismen aus Gewässerproben mit dem MCC 1 wurde
mit unterschiedlichen TMP gearbeitet. Hierbei sollte die Reproduzierbarkeit durch
Wiederholungsmessungen von Proben in Bezug auf den TMP und auf die
Wiederfindungsrate getestet werden. Die Prozessparameter Filtratfluss und Permeabilität
wurden ermittelt.
R2 = 0,9956
0
400
800
1200
1600
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100
TMP [bar]
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
Ergebnisse und Diskussion
46
In einem 1. Anreicherungsversuch sollten zwei Elbeproben vom 09.11.2009 mit einem
Druck von 0,075 bar filtriert werden. Es ergaben sich maximale TMP von 0,083 bar
und 0,076 bar. Die Abbildung 30 zeigt die Prozessparameter Filtratfluss, TMP und
Permeabilität als Funktion der Zeit (Tabelle A4 und A5). In der Probe Elbe 1 stieg der
Filtratfluss auf 271,4 ml/min bei einem TMP von 0,083 bar an. Die Permeabilität erreichte
ihr Maximum bei 7590 L/h m2 bar. Während der TMP annähernd gleich blieb, nahmen der
Filtratfluss um 24 % und die Permeabilität um 42 % ab. Es wurden 23% der Bakterien im
Konzentrat wiedergewonnen bei einer Anreicherungszeit von 6,3 Minuten. In der Probe
Elbe 2 stieg der Filtratfluss auf 185,4 ml/min und die Permeabilität auf 5079 L/h m2 bar
bei einem TMP von 0,076 bar an. Der Filtratfluss nahm um 11 % und die Permeabilität um
23 % ab bei einer Anreicherungszeit von 13 Minuten. Es wurden 33% der Bakterien im
Konzentrat wiedergewonnen.
Abbildung 30: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 und Elbe 2 vom 09.11.09
0 2 4 6 8 10 12 14
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
100
150
200
250
300
350
400
TMP
[bar
]
0,000
0,015
0,030
0,045
0,060
0,075
0,090
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Zeit [min]
0 2 4 6 8 10 12 14
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
100
150
200
250
300
350
400
TMP
[bar
]
0,000
0,015
0,030
0,045
0,060
0,075
0,090
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Filtratfluss TMPPermeabilität
Elbe 1 WFR: 23%
Elbe 2 WFR: 33%
Ergebnisse und Diskussion
47
In einem 2. Anreicherungsversuch sollte ebenfalls die Reproduzierbarkeit getestet werden.
Es sollten zwei Sauteichproben mit einem TMP von 0,300 bar filtriert werden. Es wurden
maximale TMP von 0,232 bar bzw. 0,340 bar erreicht. Durch eine schnellere
Überströmung der Membranoberfläche sollte eine Ablagerung von Partikeln verhindert
werden. Die Prozessdaten Filtratfluss, TMP und Permeabilität sind als Funktion der Zeit in
der Abbildung 31 dargestellt (Tabelle A6 und A7). Der TMP wurde jeweils in zwei Stufen,
nach erkennbarer Abnahme des Filtratflusses, erhöht. In der Probe Sauteich 1 zeigte sich,
dass eine Erhöhung des TMP auch eine Steigerung des Filtratflusses zur Folge hatte.
Dennoch nahm nach kurzer Zeit der Filtratfluss wieder leicht ab. Es kam zu einer
Deckschichtbildung. Bei der Probe Sauteich 2 ist gut zu erkennen, dass der Filtratfluss nach
1,7 Minuten sank, während der TMP stieg. Die Wiederfindungsrate der Bakterien in den
Konzentraten von 22 % bzw. 17 % lagen hier niedriger als im ersten Versuch. Es zeigte
sich, dass das Eluieren der Bakterien von der Membran bei einer weiteren Erhöhung des
TMP zunehmend schwieriger wird.
Abbildung 31: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 vom 09.12.09
0 1 2 3 4
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
200
400
600
800
1000
TMP
[bar
]
0 ,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Zeit [m in]
0 1 2 3 4
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
200
400
600
800
1000
TMP
[bar
]
0 ,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Filtratfluss TMPPermeabilität
Sauteich 1 WFR: 22 %
Sauteich 2 WFR: 17 %
↑ TMP
1. Stufe2. Stufe
1. Stufe
2. Stufe
Ergebnisse und Diskussion
48
In der Abbildung 32 ist der Filtratfluss als Funktion des TMP aufgetragen. Wie im
Kapitel 2.2.3 und Abbildung 4 beschrieben, hat hier eine Erhöhung des TMP keine
Erhöhung des Filtratflusses mehr zur Folge.
Abbildung 32: Filtratfluss f (TMP) vom Sauteich 1 und Sauteich 2
Da sich die Anreicherungsversuche der Proben Saubach 1 und Saubach 2 mit den
Anreicherungsversuchen der Proben Sauteich 1 und Sauteich 2 in Bezug auf den
maximalen TMP ähneln, sind diese im Anhang in der Abbildung A 1 grafisch dargestellt
und deren Prozessparameter in den Tabellen A 9 und A 10 aufgeführt.
Die Abbildung 33 zeigt die Wiederfindungsrate, den TMP und die Filtrationszeit der bisher
angereicherten Proben. Werden die Proben nach steigendem maximalen TMP aufgetragen,
ist mit dessen Zunahme von 0,076 bar auf 0,340 bar eine gleichzeitige Abnahme der
Wiederfindungsrate der Bakterien und der Filtrationszeit zu erkennen.
Konzentrationspolarisation (Abschnitt 2.4.2, Abbildung 5) und Membranfouling
(Abschnitt 2.5) verbunden mit Deckschichtkomprimierung sind wahrscheinliche Ursachen
für die Abnahme der Wiederfindungsrate der Bakterien während des
Anreicherungsprozesses. Es zeigt sich, dass der maximale TMP ausschlaggebend für die
Wiederfindung der Bakterien ist.
TMP [bar]
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
300
400
500
600
700
800
Sauteich 1Sauteich 2
Ergebnisse und Diskussion
49
Proben
Elbe 2
Elbe 1
Sautei
ch 1
Sauba
ch 1
Sauba
ch 2
Sautei
ch 2
Wie
derf
indu
ngsr
ate
[%]
0
25
50
75
100
TMP
[bar
]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Zeit
[min
]
0
2
4
6
8
10
12
14
WFRTMPZeit
Abbildung 33: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit zunehmenden TMP der Proben Elbe vom 09.11.09, der Proben Sauteich und Saubach vom 09.12.09
In einem weiteren Versuch wurden vier Elbeproben vom 02.02.2010 mit unterschiedlichen
maximalen TMP filtriert. Ein maximaler TMP von 0,100 bar sollte dabei nicht
überschritten werden, da hier in den ersten Anreicherungsversuchen die WFR der
Bakterien sehr niedrig war. Um ein nahezu vollständiges Ablösen der Bakterien von der
Membran zu gewährleisten, wurde bei diesen Proben mit einer modifizierten
Spülung/Elution gearbeitet (Abschnitt 4.5.3, Tabelle 4). Eine zweite Elution wurde
durchgeführt, um zu prüfen, ob das Elutionsvolumen ausreichend war. Hier sind allerdings
Verdünnungseffekte zu erwarten. In der Abbildung 34 sind der Filtratfluss, der TMP und
die Permeabilität als Funktion der Zeit aufgetragen.
Ergebnisse und Diskussion
50
Abbildung 34: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP und Permeabilität über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
0
100
200
300
400
500
TMP
[bar
]
0,000,020,040,060,080,100,12
Perm
eabi
lität
[L/h
m2
bar]
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
0
100
200
300
400
500
TMP
[bar
]
0,000,020,040,060,080,100,12
Perm
eabi
lität
[L/h
m2
bar]
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
Filtratfluss TMPPermeabilität
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
0
100
200
300
400
500
TMP
[bar
]
0,000,020,040,060,080,100,12
Perm
eabi
lität
[L/h
m2
bar]
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
0
100
200
300
400
500
TMP
[bar
]
0,000,020,040,060,080,100,12
Perm
eabi
lität
[L/h
m2
bar]
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
Zeit [min]
Elbe 1 WFR: 85%
Elbe 2 WFR: 92%
Elbe 3 WFR: 76%
Elbe 4 WFR: 38%
Ergebnisse und Diskussion
51
Die höchste Wiederfindungsrate von 92% wurde in der Probe Elbe 2 bei einem maximalen
TMP von 0,041 bar erzielt. Wird dabei nur die Cross-Flow-Mikrofiltration betrachtet und
von 100% der Zellen im Vorfiltrat ausgegangen, beträgt die Wiederfindungsrate 94 %. In
der Tabelle 6 sind die Wiederfindungsraten der einzelnen Proben Elbe 1 bis Elbe 4
aufgeführt. Bei einem maximalen TMP von 0,033 bar in der Probe Elbe 1 und bei einem
maximalen TMP von 0,064 bar in der Probe Elbe 3 sind niedrigere Wiederfindungsraten
von 85 % und 76 % zu verzeichnen. Jedoch kann aufgrund der Variabilität der
Bakterienzählung kein signifikanter Unterschied in den Proben Elbe 1 bis Elbe 3
festgestellt werden (Abbildung 35). Eine deutliche Abnahme der Wiederfindungsrate auf
38 % ist bei einem maximalen TMP von 0,103 bar zu beobachten. In der Abbildung 34 ist
bei der Probe Elbe 4 ein Störpeak zu erkennen. Dieser ist dadurch entstanden, dass die
Probenflasche kurzzeitig angehoben wurde und dieses zu einer Schwankung des
hydrostatischen Drucks führte. Generell ist darauf zu achten, dass diese Einflüsse bei der
Filtration vermieden werden.
Tabelle 6: Parameter der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10 Probe Elbe 1 2 3 4 Wiederfindung (gesamt) [%] 85 92 76 38
Wiederfindung (gesamt 2. Elution) [%] 84 93 84 40 Wiederfindung (CMF) [%] 90 94 82 40 Wiederfindung (CFM 2. Elution) [%] 89 95 90 41 Filtrationszeit [min] 5,7 9,7 15 11,3 TMP (maximale) [bar] 0,033 0,041 0,064 0,103 Anreicherung 1: 24 34 29 31 Anreicherung (2. Elution) 1: 17 19 20 17
Wird für die WFR die zweite Elution in die Berechnung mit einbezogen, zeigt sich bei den
Proben Elbe 1, Elbe 2 und Elbe 4, dass keine oder nur sehr wenige Zellen noch von der
Membran eluiert werden können. In der Probe Elbe 3 zeigt sich, dass bei diesem TMP dass
Elutionsvolumen nicht mehr ausreicht, um die Zellen nahezu vollständig von der Membran
zu eluieren. Die WFR steigt von 76% auf 84% an, wobei der Anreicherungsfaktor von 29
auf 20 abnimmt. In der Abbildung 34 ist bei dieser Probe an Hand der Prozessdaten zu
erkennen, dass sich eine zweite Deckschicht bildet (Nagata, Herouvis et al. 1989).
Die Abbildung 35 zeigt die Wiederfindungsraten, den TMP und die Filtrationszeit der
Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010. Mit zunehmendem TMP wird deutlich, dass bei
Ergebnisse und Diskussion
52
einem TMP kleiner als 0,041 bar die Filtrationszeit nicht weiter steigt, sondern die
Filtrationsdauer wieder abnimmt. Ein positiver Effekt ist, dass die Filtrationszeit bei einem
TMP von 0,041 bar niedriger ist als bei einem TMP von 0,103 bar. Dies kann darauf
zurückgeführt werden, dass die Deckschicht weniger an der Membranoberfläche
komprimiert und somit ein höherer Filtratfluss erreicht wird (Abbildung 34).
Proben
Elbe 1 Elbe 2 Elbe 3 Elbe 4
Wie
derf
indu
ngsr
ate
[%]
0
20
40
60
80
100
120
TMP
[bar
]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Zei
t [m
in]
0
2
4
6
8
10
12
14
16
WFRTMPZeit
Abbildung 35: Vergleich der Wiederfindungsrate der Bakterien und der Zeit mit zunehmenden TMP der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10
Zusammenfassend zeigen die Versuche, dass ein optimaler TMP von maximal 0,41 bar die
beste Wiederfindungsrate liefert. Weiterhin ist eine zweite Elution bei diesem Druck nicht
notwendig, da nahezu alle der Bakterien von der Membran eluiert werden und somit ein
höherer Anreicherungsfaktor erreicht wird.
5.1.3 Bakterienkonzentration
In der Abbildung 36 sind die Bakterienkonzentrationen der Fraktionen ORI, VOR, KON
und FIL der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010 dargestellt. Es zeigt sich, dass die
Bakterienkonzentrationen der einzelnen Proben schwanken. Die Aufteilung der Probe in
die Zweilitergefäße erfolgte somit nicht homogen. Ein Grund hierfür kann die
Inhomogenität durch vorhandene Bakterienaggregate in der Probe sein.
Ergebnisse und Diskussion
53
Elbe 1 Elbe 2 Elbe 3 Elbe 4
Bakt
erie
nkon
zent
ratio
n [Z
ellen
/L]
0
2e+9
4e+9
6e+9
8e+9
ORI VOR KON FIL
Abbildung 36: Bakterienkonzentration der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010
Werden die Zellverluste im Vorfilter in den Proben Elbe 1 und Elbe 3 angeschaut, ist zu
erkennen, dass ein Wechseln des Vorfilters hätte stattfinden können. Hier lagen auch die
höchsten Bakterienkonzentrationen in der Originalprobe vor. Jedoch ist bei den Proben
Elbe 1 bis Elbe 3 kein wesentlicher Zellverlust aufgrund der Variabilität der
Bakterienzählung vom Original hin zum Konzentrat zu erkennen.
Ergebnisse und Diskussion
54
Tabelle 7: Konzentration der Bakterien in den einzelnen Fraktionen und deren prozentualer Anteil der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2009
Elbe 1 Elbe 2
Fraktion Bakterien- konzentration Anteil Bakterien-
konzentration Anteil
[Zellen/L] [%] [Zellen/L] [%]
ORI 6,78E+09 100 1,73E+09 100
VOR 6,41E+09 94 1,69E+09 97
KON 5,79E+09 85 1,59E+09 92
FIL 4,79E+09 0,7 8,61E+07 5 Vorfilter (Senke 1) 3,76E+08 6 4,91E+07 3
CFM (Senke 2) 6,19E+08 10 9,38E+07 6
Elbe 3 Elbe 4
Fraktion Bakterien- konzentration Anteil Bakterien-
konzentration Anteil
[Zellen/L] [%] [Zellen/L] [%]
ORI 4,25E+09 100 1,71E+09 100
VOR 3,96E+09 93 1,65E+09 97
KON 3,23E+09 76 6,54E+08 38
FIL 3,48E+07 0,8 0,00E+00 0 Vorfilter (Senke 1) 2,89E+08 7 5,57E+07 3
CFM (Senke 2) 7,30E+08 18 9,97E+08 60
5.1.4 Bakterienmorphologie
Ein wesentlicher Aspekt bei der Anreicherung von Bakterien durch die Cross-Flow-
Mikrofiltration ist die Morphologie der Bakterien. Werden wie in der Probe Elbe 4 nur
38% der Zellen wiedergewonnen, ist eine Aussage über die Zellverluste wesentlich. In der
Abbildung 37 ist die Morphologie der Zellen in den Proben Elbe 1 bis Elbe 4 über die
Fraktionen aufgetragen. Bei der Probe Elbe 4 wurden 46±9,8 % der Kokken, 35±16,6 %
der Stäbchen und 11±173 % der Spirillen wiedergewonnen. Die hohe Abweichung für die
Zählung der Spirillen ist darauf zurückzuführen, dass nur wenige Spirillen in der Probe
vorhanden waren. Es ist zweckmäßig eine höhere Anzahl dieser Bakterien zu vermessen.
Ergebnisse und Diskussion
55
Jedoch ist der Verlust umso höher, je komplexer die Zellen in der Probe sind. Ein Einfluss
der Zellformen auf die Wiederfindung der Bakterien war nicht zu beobachten.
Elbe 1
[Zel
len/
L]
0
1e+9
2e+9
3e+9
4e+9
5e+9 Elbe 2
0
5e+8
1e+9
2e+9
2e+95e+9
Original Vorfiltrat Konzentrat Filtrat
Elbe 3
Formklassen
Kokken Stäbchen Spirillen
[Zell
en/L
]
0
1e+9
2e+9
3e+9
4e+9
5e+9 Elbe 4
Kokken Stäbchen Spirillen0
5e+8
1e+9
2e+9
2e+95e+9
Abbildung 37: Morphologie der Bakterien Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.10
5.1.5 Biomasse und Biovolumen
Werden z. B. für Mikrokosmen-Experimente die aufkonzentrierten Bakterien eingesetzt, ist
für die Bilanzierung der Kohlenstoffgehalt von Interesse. Nachfolgend sind die
Biovolumina (Abbildung 38) und die Biomasse (Abbildung 39) der Proben Elbe 1 bis Elbe
4 vom 02.02.10 dargestellt. Ändert sich durch den Anreicherungsprozess die Morphologie
der Bakterien im Konzentrat, so findet eine Ab- bzw. Zunahme der Biomasse und des
Biovolumens statt. Bei der Probe Elbe 3 ist zu erkennen, dass die Biomasse in der Fraktion
Original geringer ist als in den anderen Fraktionen. Hier wurden mehr Kokken als
Stäbchen gezählt (Abbildung 37) und somit verringern sich das Biovolumen sowie die
Biomasse (Abbildung 38, Abbildung 39).
Ergebnisse und Diskussion
56
Abbildung 38: Biovolumen der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010
Elbe 1 Elbe 2 Elbe 3 Elbe 4
Biom
asse
[mgC
/L]
0,000,020,040,060,080,100,120,140,160,18
ORI VOR KON FIL
Abbildung 39: Biomasse der Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Proben Elbe 1 bist Elbe 4 vom 02.02.2010
5.2 Bestimmung der Bakterienzahl durch die Proteinbestimmung
Es wurde untersucht, ob eine Proteinbestimmung die aufwendige Bakterienzählung
ersetzen kann. Da eine einfache Trübungsmessung zur Bestimmung der Bakterienzahl
nicht ausreicht, wurde eine photometrische Proteinbestimmung nach Bradford
durchgeführt. Das Zählen der Bakterien durch eine photometrische Proteinbestimmung zu
ersetzen war nicht möglich, da schon der Proteingehalt der aufkonzentrierten Proben unter
der Bestimmungsgrenze (BG=2,90 µg/ml) der Proteinbestimmung von 1-100 µg/ml lag
Elbe 1 Elbe 2 Elbe 3 Elbe 4
Biov
olum
en [m
m3 /L
]
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
ORI VOR KON FIL
Ergebnisse und Diskussion
57
(Tabelle 8). Die Bestimmungsgrenze kann durch eine Kalibrierung im Bereich von 1-
5 µg/ml zwar verbessert und die Empfindlichkeit durch eine 5 cm Küvette erhöht werden,
jedoch würde es zu keinen Ergebnissen in den Fraktionen Original und Vorfiltrat führen.
Aus diesem Grund kann eine Bestimmung der Bakterienzahl durch eine Bestimmung der
Proteinkonzentration nicht ersetzt werden.
Tabelle 8: Proteingehalte in den Konzentraten der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010
Proben Proteingehalt [µg/ml] Zellen im Konzentrat
Elbe 1 1,04 1,18E+13
Elbe 2 1,60 3,07E+12
Elbe 3 1,70 6,43E+12
Elbe 4 1,80 1,32E+12
5.3 Spül- und Desinfektionsverfahren des Filtrationsmoduls
Um zu prüfen, ob sich die Filtrationseinheit mittels Spülung reinigen bzw. sterilisieren lässt,
wurde mit verschiedenen Reinigungslösungen gearbeitet. Es wurde nach der Reinigung eine
Aufkonzentrierung mit steril filtriertem autoklavierten Reinstwasser als Blindwert
durchgeführt. Danach wurden die Biolog-Mikrotiterplatten mit diesen Blindwerten
beimpft. Das empfohlene Spül- und Desinfektionsverfahren mit der 0,5 %igen alkalischen
Detergenzlösung Hellmanex II ist für Umweltproben nicht ausreichend. Zum Einen ist bei
einigen Proben eine sichtbare Färbung der Hohlfasern im Filtrationsmodul zu erkennen
und zum Anderen lagert sich Biofilm auf der Membran ab. Durch eine Modifizierung
konnte dies verbessert werden. Eine Reinigung mit 70 % Ethanol und 1 %
Wasserstoffperoxid zeigt noch eine AWCD von 0,1 im Konzentrat (Abbildung 40). Die
Reinigung mit 0,05 %iger aktiver Natriumhypochloritlösung ist am zweckmäßigsten. Somit
sollte eine Reinigung mit dieser Lösung stattfinden und das Modul anschließend wieder mit
der 0,5 %igen alkalischen Detergenzlösung Helmanex II regeneriert werden.
Ergebnisse und Diskussion
58
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2Hellmanex IIEthanol, WasserstoffperoxidNatriumhypochlorid
Abbildung 40: Grafische Darstellung der Blindwerte der Fraktion Konzentrat mit den verschiedenen Reinigungslösungen
5.4 Auswirkung der Anreicherungsprozesse auf die
Substratverwertung
5.4.1 Die durchschnittliche Farbentwicklung der einzelnen Fraktionen der Proben
Für jeden Anreichungsprozess wurden die einzelnen Fraktionen ORI, VOR, KON und
FIL jeder Probe in die Biolog-Mikrotiterplatten pipettiert. Wird die durchschnittliche
mittlere Farbentwicklung (AWCD) als Parameter der Substratverwertung über die Zeit
betrachtet, ist grundsätzlich während bzw. nach der Lag-Phase eine höhere AWCD in den
Konzentraten zu erkennen (Abbildung 41, Abbildungen A2-A4). Im weiteren Verlauf steigt
die AWCD bzw. die Substratverwertung im KON weniger stark an als in ORI und VOR.
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Abbildung 41: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit in den Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Ergebnisse und Diskussion
59
Da die höchsten WFR bei den Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom 02.02.10 gefunden wurden,
werden nachfolgend nur noch diese betrachtet. Bei diesen Versuchen nimmt die Steigung
der AWCD im Konzentrat schneller ab als im Original. Ein frühzeitiger Substratverbrauch
und ein eventueller Sauerstoffmangel durch die hohe Bakteriendichte am Boden der
Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten können die Ursache sein. Die Abbildung 42
zeigt den Verlauf der AWCD der einzelnen Fraktionen der drei Elbeproben. Um die
Bakteriengemeinschaft aller Fraktionen zu vergleichen, wäre es daher angemessen, das
Konzentrat um den Anreicherungsfaktor zu verdünnen.
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI VOR KONFIL
Abbildung 42: Grafische Darstellung der AWCD der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 vom 02.02.10 und deren Fraktionen ORI, VOR, KON und FIL
Eine Einteilung der 31 Substrate in die 6 Substratklassen nach Insam (Kapitel 4.6,
Tabelle 5) zeigt Unterschiede in der AWCD zwischen Original und Vorfiltrat mit dem
Konzentrat. Im Filtrat findet keine oder eine sehr geringe Farbentwicklung statt. In den
Abbildungen 43, A5 und A6 sind die Farbentwicklungen der 6 Substratklassen über die
AWCD aufgetragen. Deutlich wird hier, dass die AWCD im Konzentrat geringer ist als im
Original und im Vorfiltrat. Die Substratgruppen Polymere und Kohlenhydrate weisen
einen hohen Umsatz auf und liegen über den Aminosäuren und Karbonsäuren. Die
Substrate aus der Gruppe der phenolischen Verbindungen weisen hierbei den geringsten
Umsatz auf. Die Substratgruppe Amine zeigt zu einem späteren Zeitpunkt einen hohen
Umsatz.
Ergebnisse und Diskussion
60
ORI 1Fa
rben
twick
lung
(OD
kor 5
95) d
er e
inze
lnen
Sub
tratk
lasse
n
0,00,20,40,60,81,01,21,4
VOR 1
0,00,20,40,60,81,01,21,4
KON 1
0,00,20,40,60,81,01,21,4
FIL 1
Mittelwert der Farbentwicklung (ODkor 595)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,00,20,40,60,81,01,21,4
Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische Verbindungen
Abbildung 43: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Ergebnisse und Diskussion
61
Werden die Farbentwicklungen für die einzelnen Substrate betrachtet, benötigen sie
unterschiedliche Inkubationszeiten bis ein erster Umsatz durch beginnende
Farbentwicklung angezeigt wird. Die einzelnen Substrate der Proben Elbe 1 bis Elbe 3 sind
in den Abbildungen A 7 bis A 18 dargestellt.
Mit Hilfe der normalisierten Daten (Kapitel 4.6.3) wurde für die Fraktionen Original und
Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10 mit dem Programm Statistika eine
Clusteranalyse durchgeführt, welche die AWCD der 31 Substrate vergleicht und zu
Gruppen zusammenfasst (Abbildung 44, Abbilung 45). Hierbei wurde die Ward-Methode
(Otto 1997), (Einax, Zwanziger et al. 1997) genutzt. Es sind jeweils zwei Hauptcluster zu
erkennen. Die Distanz des Gesamtclusters im Original beträgt 185, wobei die Distanz im
Konzentrat nur noch 108 beträgt. Die Abnahme der Distanz weist auf eine größere
Ähnlichkeit der AWCD der einzelnen Substrate im Konzentrat hin und somit auf einen
höheren Anteil verwertungsfähiger Bakterien. In der Tabelle 9 sind die zwei Hauptcluster
der Fraktionen Original und Konzentrat gegenübergestellt. Die Substrate L-Arginin, D-
Galcton-Säure γ-Lacton und Glucose-1-Phosphat werden in den beiden Fraktionen
unterschiedlichen Gruppen zugeordnet.
Eine Übereinstimmung dieser Gruppen mit den Substratklassen nach Insam ist nicht zu
erkennen, da die Substrate in den einzelnen Klassen verschieden verwertet werden.
Bei der Interpretation dieser Ergebnisse ist darauf zu achten, dass diese Methode kein
in situ Verfahren darstellt. Die Farbentwicklung auf den Platten ist somit auch durch ein
Wachstum der Bakterien auf den Platten beeinflusst. Es können nur Zellen zur
Auswertung beitragen, die auf flüssigem Medium wachsen, oder zumindest ihren
Stoffwechsel aufrecht erhalten können. Der auf den Platten vollzogene Substratumsatz
wird hauptsächlich durch Organismen beeinflusst, die in der Lage sind, unter den auf der
Platte herrschenden Bedingungen schnell zu wachsen (Degens & Harris 1997).
Die Biolog-Methode sollte daher hauptsächlich dafür eingesetzt werden, verschiedene
Gemeinschaften miteinander zu vergleichen, anstatt direkte Schlussfolgerungen auf die im
Habitat tatsächlich geleisteten Umsätze zu ziehen (Konopka, Oliver et al. 1998).
Ergebnisse und Diskussion
62
Abbildung 44: Baumdiagramm der Fraktion Original der Probe Elbe 2
Abbildung 45: Baumdiagramm der Fraktion Konzentrat der Probe Elbe 2
Ergebnisse und Diskussion
63
Tabelle 9: Hauptcluster der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 Hauptcluster 1
Original Hauptcluster 1
Konzentrat Hauptcluster 2
Original Hauptcluster 2
Konzentrat β-methyl-D-Glucosid β-methyl-D-Glucosid Methylpyruvat Methylpyruvat
D-Cellobiose D-Cellobiose α-Cyclodextrin α-Cyclodextrin
α-D-Lactose α-D-Lactose Tween 80 Tween 80
L-Asparagin L-Asparagin Putrescin Putrescin
L-Serin L-Serin D-Apfelsäure D-Apfelsäure N-acetyl-D-Glukosamin
N-acetyl-D-Glukosamin D-Xylose D-Xylose
Tween 40 Tween 40 4-Hydroxy-Benzoat
4-Hydroxy-Benzoat
D-Galakturonsäure D-Galakturonsäure Itaconsäure Itaconsäure
D-Mannitol D-Mannitol Phenyl- Ethylamin
Phenyl- Ethylamin
Glycogen Glycogen i-Erythritol i-Erythritol
Glycyl-L-Glutaminsäure
Glycyl-L-Glutaminsäure
D, L-α-Glycerolphosphat
D, L-α-Glycerolphosphat
2-Hydroxy-Benzoat
2-Hydroxy-Benzoat
L-Phenylalanin L-Phenylalanin γ-Hydroxy-
Buttersäure γ-Hydroxy- Buttersäure
D-Glukosaminsäure
D-Glukosaminsäure
L-Threonin L-Threonin α-keto-Glutarsäure α-keto-Glutarsäure
L-Arginin _ _ L-Arginin D-Galactonic- Säure γ-Lacton _ _ D-Galacton-
Säure γ-Lacton _ Glucose-1-
Phosphat Glucose-1- Phosphat
_
Bei der Aufbereitung der Daten durch die Hauptkomponentenanalyse mit dem Programm
Statistika konnten durch die ersten vier der dabei festgelegten Achsen für die Fraktion
Original 98 % und für die Fraktion Konzentrat 99 % der Gesamtvarianz erklärt werden
(Tabelle 12). Die ersten zwei Achsen erklärten dabei bereits 68,9 % bzw. 75,4 % der
Gesamtvarianz. Weiterhin wurde ein U-Test nach Wilcoxon, Mann und Whitney mit dem
Programm SigmaPlot durchgeführt (Sachs 1993). Nach der Durchführung wurde
Ergebnisse und Diskussion
64
festgestellt, dass kein signifikanter Unterschied in den Fraktionen Original und Konzentrat
vorliegt. Eine Veränderung der Originalprobe durch den Anreicherungsprozess hat somit
nicht stattgefunden, lediglich die Anzahl an verwertenden Zellen hat zugenommen und
tragen somit zu einem anfänglich schnelleren Wachstum bei.
Tabelle 10: Einzel- und Gesamtvarianz der Hauptkomponentenanalyse der Fraktionen Original und Konzentrat der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Achsen Varianz [%] Original 2
Varianz [%] Konzentrat 2
Achse 1 47,35 53,47
Achse 2 21,53 21,95
Achse 3 19,34 17,09
Achse 4 9,53 6,33
Gesamtvarianz 97,8 98,8
Zusammenfassung und Ausblick
65
6 Zusammenfassung und Ausblick
Für Kultivierungen, Mikrokosmen-Experimente oder biochemische Analysen mit
Mikroorganismen aus Gewässerproben sollten die vorhandenen Zellen aufkonzentriert
werden, um eine ausreichende Nachweisempfindlichkeit und hinreichend repräsentative
Messergebnisse zu erreichen.
In der vorliegenden Arbeit wurde getestet, ob der Munich Cell Concentrator 1 für die
Anreicherung von Mikroorganismen aus Gewässerproben geeignet ist. Es wurden jeweils
Gewässerproben von 2 Liter auf 50-100 ml aufkonzentriert. Dabei konnte gezeigt werden,
dass der optimale maximale Transmembrandruck bei 0,041 bar liegt. Weiterhin hat sich
eine modifizierte Spülung als geeignet erwiesen. Es konnte eine Wiederfindungsrate von
92±12 % erzielt werden.
Für die Vorfiltration wurde ein Filtersystem mit einem Oberteil aus Polypropylen, dem
Unterteil aus Trogamid und dem Filtermodul aus Nylon 50 µm verwendet und erwies sich
als geeignet. Bei Proben mit einem hohen Partikelgehalt sollte jedoch das Filtermodul
während der Vorfiltration gewechselt werden, um so Zellverluste zu vermeiden.
Da in der vorliegenden Arbeit Proben mit einem Volumen von 2 Liter getestet wurden,
sollte in einer weiterführenden Arbeit geprüft werden, inwieweit sich ein
Anreicherungsprozess mit einem größeren Volumen auf die Wiederfindungsrate auswirkt.
Andernfalls kann bei der gleichen Probe eine Elution erfolgen und das Filtrationsmodul
ohne Regenerierung wieder verwendet werden. Dieser Vorgang kann solange wiederholt
werden, bis die gewünschte Anzahl an Bakterien erreicht ist bzw. das gewünschte Volumen
filtriert wurde.
Weiterhin sind Versuche mit einem Filtrationsmodul geplant, dessen
Hohlfaserinnendurchmesser 1 mm beträgt. Eine Verbesserung zur Regelung TMP kann
durch ein Spindelventil erreicht werden.
Für die Elution der Bakterien von der Membran des Filtrationsmoduls hat sich eine
modifizierte Spülung/Elution als geeignet erwiesen. Die periodische Spülung mit
Ruhezeiten, beginnend mit der Rückwärtsspülung, sorgt für ein nahezu vollständiges
Ablösen der Bakterien von der Membran. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine zweite
Elution bei einem optimalen maximalen TMP nicht notwendig ist, da sich bei der ersten
Elution nahezu alle Zellen von der Membran lösen.
Zusammenfassung und Ausblick
66
Bei der Optimierung des Spül- und Desinfektionsverfahrens hat sich gezeigt, dass eine
0,05 %ige aktive Natriumhypochloritlösung mit einer anschließenden Regenerierung mit
dem Detergenz Hellmanex II die gewünschte Reinigung erzielt.
Mit Hilfe der Biolog-Methode und der Aufbereitung der Daten und die Durchführung
einer Cluster- und der Hauptkomponentenanalyse konnte festgestellt werden, dass keine
oder eine nur sehr geringe Änderung der Bakterienzusammensetzung hinsichtlich des
metabolischen Potentials stattgefunden hat. Es hat sich gezeigt, dass lediglich die Zahl der
verwertungsfähigen Bakterien durch den Anreicherungsprozess zugenommen hat. Hier
kann die Aussage getroffen werden, dass die Vitalität der Zellen nicht wesentlich durch den
Anreicherungsprozess beeinflusst wird. Eine weitere Möglichkeit die Vitalität der
Bakteriengemeinschaft im Original und im Konzentrat zu vergleichen ist, das Konzentrat
um den Anreicherungsfaktor zu verdünnen und die Biolog-Mikrotiterplatten so zu
beimpfen. Hier sollte eine nahezu gleiche Farbentwicklung der einzelnen Substrate
stattfinden. Weiterhin soll bei einem weiteren Versuch eine Sauerstoffmessung mittels
Mikrosensor in den Vertiefungen der Biolog-Mikrotiterplatten stattfinden, um eine
Hemmung des Bakterienwachstums durch den Sauerstoffverbrauch zu ermitteln.
Die Bestimmung der Vitalität der Zellen kann durch die Messung des ATP
(Adenosintriphosphat)-Gehaltes im Original und im Konzentrat erfolgen. Hier sollte das
Konzentrat mit dem Anreicherungsfaktor verdünnt werden. ATP ist das Molekül, das in
den Zellen aller Lebewesen Energie transportiert, sozusagen ist es die Indikatorsubstanz
für das Leben. In toten Zellen wird es sofort abgebaut. Die Menge an ATP in einer
Umweltprobe spiegelt die aktive Biomasse darin wieder (Karl 1980).
Eine geeignete Methode zur Zählung und zur Bestimmung der Vitalität der Bakterien ist
die Confocale Laser Scanning Microskopie. Die Probe wird, wie in Kapitel 4.5.1
beschrieben, filtriert, nur dass hier eine gezielte Färbung mit Syto 9 und PI
(Propidiumiodid) durchgeführt wird. Die Auswertung erfolgt hier mit Hilfe einer Software
und erspart das mühsame Zählen der Zellen am Epifluoreszenzmikroskop.
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Anhang
i
8 Anhang
Tabelle A 1: Chemikalien zur Reinigung des Filtrationsmoduls Chemikalien empfohlen bedingt anwendbar
Essigsäure (5 %) x
Ammoniumhydroxid x
Benzol x
Amylalkohol x
Borsäure x
Brine (beinahe gesättigte Kochsalzlösung) x
Butylalkohol x
Chloroform x
Cyclohexan x
Dichlormethan x
Ethylalkohol (15 %) x
Ethylalkohol (95 %) x
Ethylenglykol x
Isobutylalkohol x
Isopropanol x
Isobutylalkohol x
Methylalkohol x
Pentan x
Phenol (0,5 %) x
Phenol (10 %) x
Phosphorsäure (25 %) x
Kaliumhydroxid (25-50 %) x
Propanol x
Natriumhydroxid (0,5 N) x
Natriumhypochloritlösung (500 ppm) x
Salzsäure (5-25 %) x
Schwefelsäure (5 %) x
Wasser x
Anhang
ii
Tabelle A 2: Kalibrierdaten der Proteinbestimmung nach Bradford
cP OD 450 OD 450 OD 590 OD 590 MW OD 450
MW OD 590
OD 590/450
[µg/ml]
0 0,7307 0,4524 0,7307 0,4524 0,6191
1 0,7169 0,7199 0,4574 0,4623 0,7184 0,45985 0,6401
10 0,698 0,6945 0,5619 0,5536 0,69625 0,55775 0,8011
50 0,5859 0,5937 0,8804 0,8875 0,5898 0,88395 1,4987
100 0,5047 0,487 1,1655 1,1763 0,49585 1,1709 2,3614
Tabelle A 3: TMP, Filtratfluss, Querstromgeschwindigkeit und Permeabilität des druckkontrollierten Bereichs des Filtrationsaufbaues mit deionisiertem Wasser
TMP [bar]
Filtratfluss [ml/min]
Querstromgeschwindigkeit [L/h· m2]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,013 312,8 0,313 39553
0,022 381,0 0,381 28468
0,033 512,4 0,512 25524
0,043 615,3 0,615 23522
0,058 779,1 0,779 22081
0,072 940,7 0,941 21477
0,086 1146 1,15 21899
Anhang
iii
Tabelle A 4: Prozessparameter Elbe 1 vom 09.11.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,1 161,9 0,04 6049
0,2 184,7 0,04 7590
0,3 255,4 0,08 5524
0,7 271,4 0,08 5870
1,0 267,7 0,07 6568
1,3 261,4 0,07 6052
1,7 260,7 0,07 5791
2,0 256,6 0,08 5624
2,3 254,2 0,08 5223
2,7 250,8 0,08 5153
3,0 249,2 0,08 5185
3,3 246,0 0,08 5119
3,7 242,4 0,08 4981
4,0 240,2 0,08 4875
4,3 233,9 0,08 4689
4,7 233,4 0,08 4679
5,0 233,4 0,08 4623
5,3 223,7 0,08 4484
5,7 220,2 0,08 4469
6,0 218,6 0,08 4436
6,3 207,2 0,07 4731
Anhang
iv
Tabelle A 5: Prozessparameter Elbe 2 vom 09.11.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 117,9 0,053 3657
0,5 121,5 0,055 3631
0,8 138,2 0,059 3850
1,2 138,3 0,062 3667
1,5 159,9 0,071 3702
1,8 171,2 0,076 3703
6,2 177,5 0,073 3997
7,2 177,1 0,075 3882
8,5 174,9 0,073 3938
9,7 185,4 0,06 5079
10,8 165,5 0,071 3832
11,0 155,5 0,065 3933
12,0 162,5 0,067 3987
13,0 165,7 0,064 4256
Tabelle A 6: Prozessparameter Sauteich 1 vom 09.12.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 391,9 0,091 7079
0,3 391,9 0,092 7002
0,7 385,5 0,09 7041
1,0 383,1 0,093 6772
1,3 378,2 0,099 6280
1,7 372,9 0,098 6255
2,0 370,4 0,105 5799
2,3 502,4 0,139 5941
2,7 495,1 0,144 5652
3,0 486,4 0,148 5402
3,3 549,4 0,215 4201
3,7 637,4 0,225 4657
4,0 634,1 0,232 4493
Anhang
v
Tabelle A 7: Prozessparameter Sauteich 2 vom 09.12.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 449,6 0,112 6599
0,3 445,2 0,121 6048
0,7 439,1 0,124 5821
1,0 610,1 0,200 5015
1,3 605,1 0,211 4714
1,7 763,9 0,281 4469
2,0 762,8 0,301 4166
2,3 746,3 0,318 3858
2,7 748,1 0,340 3617
Tabelle A 8: Prozessparameter Saubach 1 vom 09.12.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 598,4 0,209 4707
0,3 595,9 0,214 4577
0,7 578,1 0,224 4242
1,0 577,3 0,243 3905
1,3 556,6 0,252 3631
1,7 552,9 0,265 3430
2,0 528,2 0,27 3216
2,3 525 0,283 3050
2,7 516 0,294 2885
3,0 506 0,302 2754
3,3 509,4 0,318 2633
Anhang
vi
Tabelle A 9: Prozessparameter Saubach 2 vom 09.12.2009 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 726,1 0,110 10851
0,3 727,9 0,114 10496
0,7 726,6 0,117 10209
1,0 722,7 0,121 9818
1,3 718,7 0,127 9303
1,7 705,9 0,132 8791
2,0 963,7 0,182 8704
2,3 964,0 0,200 7923
Abbildung A 1: Grafische Darstellung der Prozessparameter Filtratfluss, TMP, Permeabilität über die Zeit
0 1 2 3 4
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
200
400
600
800
1000
TMP
[bar
]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Zeit [min]
0 1 2 3 4
Filtr
atflu
ss [m
l/m
in]
200
400
600
800
1000
TMP
[bar
]
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Perm
eabi
lität
[L/h
m2 b
ar]
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Filtratfluss TMPPermeabilität
Saubach 1 WFR: 20 %
Saubach 2 WFR: 18 %
Anhang
vii
Tabelle A 10: Parameter der Proben Saubach 1 und 2
Probe Saubach 1 2
Anreicherung (soll) 1: 22 29
Wiederfindung [%] 20 18
Filtrationszeit [min] 3,3 2,3
TMP (mittlere) [bar] 0,261 0,318
TMP (maximale) [bar] 0,138 0,200
Filtratfluss (mittlere) [ml/min] 549,4 782
Permeabilität (mittlere) [L/h m2 bar] 3548 9512
Tabelle A 11: Prozessparameter Elbe 1 vom 02.02.2010 Zeit [min]
Filtratfluss [ml/min]
TMP [bar]
Permeabilität [L/h m2 bar]
0,2 275,0 0,001 452055
0,3 280,2 0,001 460603
0,7 279,0 0,002 229315
1,0 287,1 0,003 157315
1,3 307,4 0,004 126329
1,7 347,9 0,011 51990
2,0 376,0 0,014 44149
2,3 390,0 0,020 32055
2,7 399,0 0,025 26236
3,0 393,9 0,026 24904
3,3 392,6 0,028 23049
3,7 391,0 0,029 22163
4,0 387,8 0,030 21249
4,3 383,5 0,031 20336
4,7 384,7 0,032 19762
5,0 382,5 0,033 19054
5,3 365,2 0,031 19365
5,7 364,3 0,030 19962
Anhang
viii
Tabelle A 12: Parameter der Proben Elbe 1 und Elbe 2 Elbe 1 Elbe 2
Fraktion Bakterien- konzentration Anteil Bakterien-
konzentration Anteil
[Zellen/L] [%] [Zellen/L] [%]
Original 4,75E+09 100 4,75E+09 100
Vorfiltrat 4,69E+09 99 4,65E+09 98
Konzentrat 1,08E+09 23 1,56E+09 33
Permeat 4,53E+08 10 2,74E+07 1 Vorfilter (Senke 1) 6,96E+07 1 1,09E+08 2
CFM (Senke 2) 3,15E+09 66 3,06E+09 64
Elbe 2
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORIVOR KON FIL
Abbildung A 2: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Probe Elbe 2 vom 09.11.2009
Anhang
ix
Sauteich 1
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 1 VOR 1KON 1FIL 1
Sauteich 2
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
ORI 2 VOR 2KON 2FIL 2
Saubach 1
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 3 VOR 3KON 3FIL 3
Saubach 2
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 4 VOR 4KON 4FIL 4
Abbildung A 3: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Sauteich und Saubach vom 09.12.2009
Anhang
x
Elbe 1
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Elbe 2
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 2VOR 2KON 2FIL 2
Elbe 3
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 3VOR 3KON 3FIL 3
Elbe 4
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
AW
CD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2ORI 4VOR 4KON 4FIL 4
Abbildung A 4: Grafische Darstellung des AWCD über die Zeit der Proben Elbe 1 bis Elbe 4 vom 02.02.2010
Anhang
xi
ORI 2Fa
rben
twick
lung
(OD
kor 5
95) d
er e
inze
lnen
Sub
tratk
lasse
n
0,00,20,40,60,81,01,21,4
VOR 2
0,00,20,40,60,81,01,21,4
KON 2
0,00,20,40,60,81,01,21,4
FIL 2
AWCD (ODkor 595)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,00,20,40,60,81,01,21,4
Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische Verbindungen
Abbildung A 5: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Anhang
xii
ORI 3Fa
rben
twick
lung
(OD
kor 5
95) d
er e
inze
lnen
Sub
tratk
lasse
n
0,00,20,40,60,81,01,21,4
VOR 3
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
KON 3
0,00,20,40,60,81,01,21,4
FIL 3
Mittelwert der Farbentwicklung (ODkor 595)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,00,20,40,60,81,01,21,4
Amine Aminosäuren Kohlenhydrate Karbonsäuren Polymere Phenolische Verbindungen
Abbildung A 6: Farbentwicklung der einzelnen Substratklassen über die AWCD der Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10
Anhang
xiii
ß-methyl-D-Glucosid
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galacton Säure γ-Lacton
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Arginin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Methylpyruvat
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Xylose
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galakturonsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Asparagin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 40
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Abbildung A 7: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Anhang
xiv
i-Erythritol
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Phenylalanin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 80
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Mannitol
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
4-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Serin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-Cyclodextrin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Abbildung A 8: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Anhang
xv
N-acetyl-D-Glukosamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
γ-Hydroxy-Buttersäure
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Threonin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycogen
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D- Glukosaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Itaconsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycyl-L-Glutaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Cellobiose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Abbildung A 9: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Anhang
xvi
Glucose-1-Phosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-keto-Glutarsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Phenyl-Ethylamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-D-Lactose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D,L- α-Glycerolphosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Apfelsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Putrescin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 1VOR 1KON 1FIL 1
Abbildung A 10: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 1 vom 02.02.10
Anhang
xvii
ß-methyl-D-Glucosid
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galacton Säure γ-Lacton
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Arginin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Methylpyruvat
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Xylose
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galakturonsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Asparagin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 40
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 2VOR 2KON 2FIL 2
Abbildung A 11: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Anhang
xviii
i-Erythritol
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Phenylalanin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 80
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Mannitol
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
4-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Serin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-Cyclodextrin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 2VOR 2KON 2FIL 2
Abbildung A 12: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Anhang
xix
N-acetyl-D-Glukosamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
γ-Hydroxy-Buttersäure
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Threonin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycogen
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D- Glukosaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Itaconsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycyl-L-Glutaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Cellobiose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 2VOR 2KON 2FIL 2
Abbildung A 13: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Anhang
xx
Glucose-1-Phosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-keto-Glutarsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Phenyl-Ethylamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-D-Lactose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D,L- α-Glycerolphosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Apfelsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Putrescin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 2VOR 2KON 2FIL 2
Abbildung A 14: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 2 vom 02.02.10
Anhang
xxi
ß-methyl-D-Glucosid
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galacton Säure γ-Lacton
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Arginin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Methylpyruvat
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Xylose
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Galakturonsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Asparagin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 40
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 3VOR 3KON 3FIL 3
Abbildung A 15: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10
Anhang
xxii
i-Erythritol
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Phenylalanin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tween 80
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Mannitol
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
4-Hydroxy-Benzoat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Serin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-Cyclodextrin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 3VOR 3KON 3FIL 3
Abbildung A 16: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10
Anhang
xxiii
N-acetyl-D-Glukosamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
γ-Hydroxy-Buttersäure
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
L-Threonin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycogen
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D- Glukosaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Itaconsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Glycyl-L-Glutaminsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Cellobiose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 3VOR 3KON 3FIL 3
Abbildung A 17: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10
Anhang
xxiv
Glucose-1-Phosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-keto-Glutarsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Phenyl-Ethylamin
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
α-D-Lactose
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D,L- α-Glycerolphosphat
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
D-Apfelsäure
0 20 40 60 80 100
OD
kor
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Putrescin
Zeit [h]
0 20 40 60 80 100O
D k
or
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
ORI 3VOR 3KON 3FIL 3
Abbildung A 18: Farbentwicklung der einzelnen Substrate über die Zeit der einzelnen Fraktionen der Probe Elbe 3 vom 02.02.10
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