Algunas definiciones previas:
Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente.
Tejido: es el conjunto de las células y sus materiales extracelulares que contribuyen a cumplir una(s) función(es) común(es).
Órgano: es el conjunto de tejidos que comparten una forma y un grupo de funciones comunes y más o menos independientes.
Aparato: es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y que es anatómicamente aislable.
Sistema: el es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y que NO es anatómicamente aislable.
Células
Tejidos
Órganos
Aparatos
Sistemas
BIOLOGÍA CELULAR (citología)
HISTOLOGÍA (anatomía microscópica o microanatomía)
ANATOMÍA
¿Cómo son?
¿Cómo llegan a ser?
EMBRIOLOGÍA GENÉTICA
¿Por qué los tejidos de los seres vivos se llaman así: tejidos?
Constitución del cuerpo humano
HUMORES (bilis, sangre, flema, linfa)
Desde los griegos y durante la Edad Media
FIBRAS
En el RENACIMIENTO (antes del microscopio)
Jean François FERNEL (1497-1558)
Gabrielle FALLOPIA (1523-1562)
Universa Medicina (1554): las partes sólidas del cuerpo animal están constituidas por “hilillos” o “fibras” elementales (villi seu stamina).
Lectiones de partibus similaribus et selectorum explicationes (1575): las partes del cuerpo se componen por “fibras”
(fibrae) de 3 tipos encargadas de sendas funciones: movimiento voluntario (fibra carnea), movimiento involuntario
(fibra cartilaginea y en arterias), y función mixta (fibras del tubo digestivo).
Los tejidos del cuerpo se hallan constituidos por una trama lineal, superficial o tridimensional de fibras
elementales.
Fibrae (fibra) Texturae (tejido) HISTOLOGÍA
En HISTOLOGÍA se estudian las células, los tejidos y órganos
que componen al cuerpo
Se pueden estudiar células y tejidos vivos: por medio de
- Cultivos:
· Celulares (primarios, líneas celulares, etc)
· Organotípicos (explantos)
· de Órganos.
- Manipulación experimental:
· Micromanipulación mecánica
· Microelectrodos
· Microinyectores
· Microirradiación
· Microcinematografía
Cultivo celular
Microinyección (ovocito)
Microinyección en células individuales (neuronas, amarillo Lucifer y sulforodamina)
MicrocinematografíaLab. Dr. Gabriel Scicolone (IBCN)
¿Les gustó?
Se pueden estudiar células y tejidos muertos:
- Componentes celulares por medio de su fraccionamiento por:· Centrifugación diferencial· Centrifugación en gradiente
de densidad
- Cortes histológicos
Fracción mitocondrial
Fracción nuclear
Fracción microsomal
Estudio de CORTES HISTOLÓGICOS
Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos, tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí.
Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras. Por eso se colorean los tejidos.
Puesto este órgano en un microscopio, ¿veríamos algo?... ¿lo atraviesa la luz?...
…entonces hay que seccionarlo en rebanadas delgadas, muy delgadas (5-10
milésimas de milímetro)… para poder observarlo a trasluz con un microscopio…
Pero un órgano blando, ¿se puede cortar en rebanadas muy, muy delgadas?...
No se puede… prueben hacerlo con una nalga…
Hay que indurar al órgano con sus tejidos, incluyéndolo en un material más duro que se pueda cortar más delgado
Pasos de la técnica histológica de rutina:
1) Obtención de la muestra
2) Fijación
3) Inclusión:
a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Inclusión propiamente dicha
4) Corte
5) Montaje preliminar
6) Coloración:
a) Aclaración
b) Rehidratación
c) Coloración propiamente dicha
7) Montaje final
a) Deshiddratación
b) Aclaración
c) Montaje final propiamente dicho
Obtención de la muestra
Para observación mediata (post-mortem) = AUTOPSIA
Para observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA
Obtención de la muestra
Observación del material coloreado
Coloración supravital (se administra el colorante a partes o células del animal que aún conservan la vida, después de la toma de la muestra)
Reticulocitos (violeta de cresilo)
Coloración intravital (se administra el colorante al animal vivo, antes de la toma de la muestra)
Macrófagos (tinta china)
Feto de ratón, matriz ósea (rojo alizarina y alcian blue)
Observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA
Observación del material fresco, sin colorear
Epitelio vaginal, células descamadas
Fijación
Objetivos de la fijación:
- Fijar estructuras biológicas como son in vivo
- Impedir/detener autólisis y procesos vitales
- Impedir desaparición de elementos solubles (insolubilización por enlaces cruzados)
- Evitar acción de bacterias/hongos (antisepsia)
Características de un buen fijador:
- Rápida acción fijadora
- Alta penetración
- Indura a los tejidos
- No crear artificios
Fijación
Tipos de agentes fijadores:
- Físicos:
Calor
Frío (congelación-desecación)
Microondas
- Químicos:
Simples:
agentes Oxidantes: ácido crómico, tetróxido de osmio, bicromato de potasio, bicromato de mercurio, ácido acético, ácido
pícrico
agentes Reductores: etanol, metanol, formaldehído, glutaraldehído
Compuestos o mezclas fijadoras:
Líquido de Zenker (bicloruro de Hg, bicromato de K- ác. acético)
Líquido de Helly (bicloruro de Hg-bicromato de K-formaldehído)
Líquido de Bouin (ác. pícrico-formaldehído-ác. acético)
Líquido de Dubosque-Brasil (ác. pícrico-ác. acético-formaldehído-etanol)
Fijación
Métodos de fijación
por Inmersión
por Perfusión
Inclusión
50% 70% 96% 100%
Post-fijación por inmersión
Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL
Aclaración con XILOL
Etanol 100%XILOL
Inclusión
Distintos tipos de parafinas se funden (son líquidas) a 45º-58º…
…se sumerge la muestra de tejido en
parafina líquida…
…se incuba en estufa a 60º para que la parafina impregne todo el tejido
Inclusión propiamente dicha
Moldes de inclusión
Taco de inclusión
Se obtiene un taco de inclusión, sólido, con el tejido incluido en parafina. El taco se talla y se pasa al…
Charles Sedgwick Minot (1852-1914)
Corte
¿Con qué se corta el taco de inclusión?...
…con un MICRÓTOMO
Corte
Micrótomo rotatorio tipo Minot
Taco
Platina
Taco
Cuchilla Tira de cortes Grosor: 5-10 μm
Montaje preliminar
Portaobjetos de vidrio Corte de tejido
Coloración
Aclaración (desparafinización) con XILOL
Rehidratación en concentraciones decrecientes de ETANOL
Coloración propiamente dicha HEMATOXILINA + virado + EOSINA
Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL
Aclaración con XILOLMontaje final propiamente dicho con Bálsamo de Canadá o similar
Montaje final
Corte sin colorear
Corte coloreado sólo con EOSINA
Corte coloreado con EOSINA y HEMATOXILINA
CONCEPTOS
ACIDOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes celulares y extracelulares básicos o catiónicos (con carga eléctrica neta positiva) para formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes ácidos o aniónicos (con carga eléctrica negativa).
BASOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes celulares y extracelulares ácidos o aniónicos (con carga eléctrica negativa)para formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes básicos o catiónicos (con carga eléctrica neta positiva).
Acidofilia y Basofilia con H-E
Acidofilia y Basofilia con H-E
Acidofilia y Basofilia con H-E
Acidofilia y Basofilia con H-E
Coloraciones tricrómicas:Tricrómico de Mallory (azul de anilina
+ naranja G + fucsina ácida; todos ácidos; se desconoce el fundamento)
Frank Burr Mallory (1862-1941)
Cirrosis
Coloraciones tricrómicas:
Tricrómico de van Giesson (ácido pícrico + fucsina ácida + hematoxilina férrica de Weigert)
Tricrómico de Masson-Lillie (fucsina Ponceau + verde luz + hematoxilina de Mayer)
Tricrómico de Masson (fucsina Ponceau + azul de anilina + hematoxilina de Mayer)
Técnicas de impregnación argéntica:Depósito de sales de plata metálica
Método de del Río Hortega (microgliocito)
Método de Cajal para neurofibrillas (neurona)
Impregnación argéntica de Gomori para fibras reticulares (hígado)
Método de Golgi (neurona)
Técnica de de Olmos (amino-cupro-argéntica;
neuronas en degeneración)Aparato de Golgi (enterocitos)
CONCEPTOS
ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de mantener invariable su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares.
METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes básicos o catiónicos derivados de las tiazinas de virar su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con ciertos componentes celulares y extracelulares que son polímeros polianiónicos.
Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo, azul de tionina, azur A
Metacromasia
(matriz cartilaginosa; cartílago hialino)H&E Azul de toluidina
Metacromasia (mastocitos; oreja de ratón)H&E Azul de toluidina
Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff)
1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos 1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)
H&E PAS Alcian blue
Células caliciformes
Técnicas histoquímicas: Localización de ácidos nucleicos Técnica de Feulgen
1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del ADN (A y G) y expone grupos aldehído.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)
Ácidos nucleicos (raíz de cebolla)
H&EFeulgen
Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos
Nervio, mielina (OsO4)
Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico)
Sudán III grasas (naranja)
Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa)
Sudán negro B fosfolípidos
Aceite rojo O triacilglicéridos
Azul de Nilo fosfolípidos
Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro)
Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo)
Glándula mamaria (OsO4-verde de metilo)
Técnicas histoquímicas: Localización de enzimas
Fosfatasa alcalina (bazo; técnia de Gomori)
Demostración de lectina PNA que se une a galactosil-N-acetilgalactosamina de glucoproteínas por reacción de la
peroxidasa-DAB (epitelio respiratorio)
Fundamento: localización de la reacción enzimática por demostración del lugar en el que se encuentra una enzima que transforma un sustrato en un producto; el producto, con una reactivo agregado, forma un compuesto insoluble y coloreado
Demostración de NADPH-diaforasa (deshidrogenasa; corteza frontal, neuronas nitrérgicas) (Boccoli, Loidl, López-Costa, Pistone Creydt, Ibarra, Goldstein (2008) Brain Res)
Reacción de Pearls: hierro en hemosiderina (precipitado azul-turquesa; bazo de rata)
Técnicas histoquímicas: Localización de iones
Reacción de von Kossa: para calcio; (precipitado negro; hueso en osificación)
Azul de Prusia: hierro en hemosiderina (precipitado azul-turquesa; pulpa roja en bazo; tubulos renales)
Inmunohistoquímica:Se basa en: la detección de reacciones controladas antígeno-anticuerpo por medio de la marcación de los anticuerpos.
Sirve para: detectar sustancias (principalmente proteínas), muy específicamente, que pueden estar en muy bajas concentracioens en el tejido en estudio.
Métodos: existen dos grupos, el directo y el indirecto.
Tipos de anticuerpos: policlonales (desarrollados en conejo), monoclonales (desarrollados en ratón).
Ludwig A. Sternberger
Albert H. Coons (1912-1978)
Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970)
César MilsteinCésar Milstein (1927-2002)(1927-2002)
Georges J. F. KöhlerGeorges J. F. Köhler (1946-1995)(1946-1995)
Ac. monoclonales (1975)
Inmunohistoquímica:
Inmunohistoquímica:
Vimentina (céls. de Sertoli, testículo)
BrDU (céls. postmitóticas, yeyuno-íleon)
S-100B (astrocito, hipocampo; Evrard, Duhalde-Vega, Ramos, Tagliaferro, Brusco
(2003) Dev Brain Res)Nf-200 (neurona, c.
frontal; Evrard, Duhalde-Vega, Tagliaferro,
Mirochnic, Caltana, Brusco (2006) Exp Neurol)
MTCO2, marcador de mitocondrias humanas (glioblastoma humano)
Células en cultivo marcadas para actina, tubulina y núcleo
Inmunohistoquímica:
Marca Nuclear (Hoescht 33342)
Lic. Guadagnoli (cultivo celular; Lab. Dra. Brusco)
Inmunohistoquímica:
Marca Glial (GFAP)
Lic. Guadagnoli (cultivo celular, Lab. Dra. Brusco)
Inmunohistoquímica:
Marca Neuronal (MAP-2)
Lic. Guadagnoli (cultivo celular, Lab. Dra. Brusco)
Inmunohistoquímica:
Marca Glial y Neuronal (GFAP; MAP-2)
Lic. Guadagnoli (cultivo celular, Lab. Dra. Brusco)
Inmunohistoquímica:
Marca Nuclear, Glial y Neuronal (Hoescht 33342; GFAP; MAP-2)
Lic. Guadagnoli (cultivo celular, Lab. Dra. Brusco)
Hibridización in situ:
ARNm de la subunidad NR3B del receptor glutamatérgico (motoneuronas, méd. espinal)
Nissl NR3B
Se basa en: hibridización ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN.
Se utilizan sondas marcadas (radiactivas, fluorescentes, con cromógenos) complementarias de lo que se desea encontrar y se visualiza por IHQ o radioautografía.
Tipos: FISH: fluorescente; CISH: cromógeno
Sirve para: detectar la presencia de secuencias de ADN/ARN (expresión de genes durante el desarrollo, ARNm de proteínas, genomas virales, etc.)
Citomegalovirus en submucosa de colon
Factores de transcripción delta-1 y hairy-2a; embrión de Xenopus (López, Rosato-Siri, Franco, Paganelli, Carrasco (2005) Development).
Radioautografía:
Charles Philippe Leblond (1910-2007)
Se basa en: los isótopos radiactivos (3H, 32P, 99Tc, 131I, 14C, 35S) de un elemento se comportan igual que los no radioactivos.
Se administra una sustancia radiactiva a una animal y “se rastrea” su utilización metabólica por las células.
Se expone el tejido con el material radiactivo a una película fotográfica y se revela de igual modo.
Sirve para: detectar y seguir vías metabólicas (síntesis y catabolismo de proteínas, por ejemplo), localización espacial precisa de determinadas moléculas, estudios de unión ligando-receptor (binding), etc.
Síntesis de glúcidos complejos en el Golgi ([3H]-glucosa; células caliciformes
al MO; Neutra y Leblond, 1966)Receptor A1 de adenosina, en cerebro de rata, marcado con [3H]-
CCPA (Giraldez, Zanetti, Antonelli, Rodríguez de Lores Arnais, Girardi -1998-)
Síntesis de glúcidos complejos en el Golgi ([3H]-glucosa; células caliciformes al MET; Neutra y Leblond, 1966)
Criofractura:
Se basa en: se congela el tejido (-150º C); se lo fractura con una navaja dentro de un aparato especial al vacío; se sublima el hielo; se realiza una réplica (etching) sombreando con Pt (1) y contrastando con C evaporado (2); se eliminan los tejidos por digestión química; se examina la réplica al MET.
Resolución: 3 nm.
Sirve para: estudiar membranas biológicas y procesos celulares que involucran membranas.
Microscopía óptica y electrónica: diferencias en la técnica
DiferenciasDiferencias MO MET
Fijador más usadoFijador más usado FormaldehídoFormaldehído Glutaraldehído, OsOGlutaraldehído, OsO44
Medio de inclusiónMedio de inclusión Parafina, gelatinas, resinas Parafina, gelatinas, resinas epoxiepoxi
Resinas epóxicas o Resinas epóxicas o acrílicas (araldita, epón, acrílicas (araldita, epón,
metacrilato)metacrilato)
Formación del tacoFormación del taco Moldes de papel, plástico o Moldes de papel, plástico o metalmetal
Cápsulas de gelatina o Cápsulas de gelatina o plásticas de Beemplásticas de Beem
Instrumento de corteInstrumento de corte Micrótomo, vibrátomo, Micrótomo, vibrátomo, crióstatocrióstato UltramicrótomoUltramicrótomo
Cuchillas de corteCuchillas de corte AceroAcero VidrioVidrio
Grosor del corteGrosor del corte 5-10 5-10 μμmm 10-100 nm10-100 nm
PortaobjetosPortaobjetos VidrioVidrio Grilla de cobre, niquel, Grilla de cobre, niquel, titanio, carbono, u orotitanio, carbono, u oro
Elemento contrastanteElemento contrastante Colorantes hidro- o Colorantes hidro- o liposolublesliposolubles
Sales de metales pesados Sales de metales pesados (U, Pb, La, W, Fe, Pd, Ir)(U, Pb, La, W, Fe, Pd, Ir)
Microscopía óptica Microscopía electrónica
Moldes de papel, plástico o metal
Cápsulas de gelatina o de plástico (de Beem)
Microscopía óptica Microscopía electrónica
Taco
Cuchilla de vidrio
Ultramicrótomo
Micrótomo rotatorio tipo Minot
Microscopía óptica Microscopía electrónica
Vibrátomo
Crióstato
Taco
Cuchilla de vidrio
Ultramicrótomo
Microscopía óptica Microscopía electrónica
Portaobjetos de vidrio
Grillas de cobre
FIN
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