Hémogramme automatisé
Pentra 120 Retic Horiba-ABX
Pentra 60 Horiba-ABX
CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories
Coulter HMX Beckman Coulter
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter
CELL-DYN WorkCell Abbott
Laboratories
Intérêt
• Cadence d’analyse
40-150 échantillons /heure en 18 paramètres
• Exactitude des résultats (2% à 5%)
• Contrôle qualité intégré aux manipulations
• morphologiques: approche descriptive
normalisée multicritère
taille
aspect du noyau
aspect du cytoplasme
• chimiques
• analytiques
Le résultat de la formule dépend de critères:
Chargement du tube
Perçage du tube et
prélèvement
Segmentation
des aliquotes
1- Mesure par impédance
Principe de la mesure par impédance
• Le passage de cellules en suspension dans
un liquide conducteur à travers un orifice
modifie la résistance électrique entre deux
électrodes ( principe Coulter).
• Cette variation d’impédance est enregistrée
sous forme d’impulsions
La variation d'impédanceElectrode interne
Electrode
externe
Flux de diluant
Vide régulé
Temps
U
Milieu électrolyte
très conducteur
Micro-orifice
60 à 100 µm
Le nombre d ’impulsions
enregistré correspond au
passage des cellules
La hauteur des impulsions est
proportionnelle au volume de
la cellule détectée d’où
identification
Une cellule coupe le champ électrique
* diminution de la conductivité
* augmentation de la résistance électrique
Le tri des impulsions (pulse
edit)
Les impulsions générées sont
triées de façon à ne garder que
celles correspondant à un
passage standard
Le flux de balayage ( sweep flow)
un flux de diluant balaie l ’arrière des
orifices, empêchant les cellules de
retourner dans la zone de détection et
de perturber l ’analyse ( surtout pour
les plaquettes)
La correction de coïncidence
• Lorsque deux cellules traversent
simultanément l’orifice, elles ne génèrent
qu’une seule impulsion de forte intensité :
c’est le passage en coïncidence.
• la fréquence de coïncidence est une loi
statistiquement prévisible
• la correction est effectuée automatiquement
par l’analyseur.
La distribution
Les cellules sont classées en fonction de leur volume dans
différents canaux, ce qui permet la construction des
histogrammes érythrocytaire et plaquettaire
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
N
O
MB
R
E
volume
Un nombre élevé de canaux traduit avec précision la réalité.
* trop faible : ne rend pas compte de la répartition volumétrique vraie
* trop élevé : chaque cellule devient unique
Lkc et Erc 256
Plt 64
4 canaux
8 canaux
16 canaux
Application : les numérations
• Numération des érythrocytes
• Numération des thrombocytes
• Numération des leucocytes
Numération des Globules Rouges
• Comptage et mesure du volume à partir
d'une suspension cellulaire.
• Toute particule d'un volume supérieur à
36 fl est comptée comme un globule
rouge.
• Les impulsions sont triées pour retenir
celles correspondant au passage standard.
• Le résultat est assujeti à une correction
dite "correction de coïncidence".
Electrode interne
Electrode
externe
Flux de diluant
Vide réguléBac de comptage des Rouges/Plt
Analyse érythrocytaire: 7 paramètres
Dilution 1/6250 triple comptage
Mesure entre 24 et 360 fL en 256 canaux
la plage 24 - 36 fL représente les interférences
VGM
Indice de distribution érythrocytaire
• Coefficient de variation calculé à partir de la
courbe érythrocytaire.
• Donne l’étalement de la distribution autour de la
valeur moyenne
• modérément élevé: anisocytose
• indices très élevés: anomalies importantes
( double population, schizocytes, drépanocytes)
L'IDC est une valeur statistique correspondant au CV % calculé
sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose.
50 100 200 100 20050 50 100 200
IDC Normal< 15,5%
IDC Elevé 18 %
IDC très Elevé35 %
L'IDC ou IDR ou RDW
Numération des Plaquettes
Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire.
Les particules de volumes compris entre 2 et 20 fl sont comptées en tant que plaquette.
Le flux de balayage chasse les GR qui pourraient créer des impulsions parasites dans la zone sensible.
Electrode interne
Electrode
externe
Flux de diluant
Vide régulé
Zone sensible Flux de balayage
Analyse plaquettaire : 4 paramètres
Mesures de 2 à 20 fL réparties en 64 canaux
VMP
interférences
Les seuils sont variables, il y a toujours un risque
d ’interférence
Numération leucocytaire
Numération leucocytaire
suspension où les érythrocytes ont été lysés
dilution au 1/250
seuil de mesure 30 fL ( population décomptée à
partir de 35fL)
Remarque : le dosage de l ’hémoglobine
sur la dilution des leucocytes
méthode de Drabkin par spectrophotométrie
Lyse différentielle ou Cytolyse des leucocytes
La membrane devient semi-perméable
Le cytoplasme est libéré
La membrane se rétracte autour du noyau et des granulations
Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations.
La mesure de l’impédance sur cytolyse permet
d’obtenir une formule « 3 populations »
WBC,LY,MO,GR
RBC,HGB,HCT,MCV,MCH,
MCHC,RDC
PLT,PCT,MPV,PDW
24-260 fL
35-360 fL
2-20 fL
Altération des de la morphologie des GB
2- Numération des GB après lyse des GR
4- Calculs : hématocrite, CCMH, TCMH
1- Numération des GR/plaquettes et discrimination par seuil volumétrique
3- Dosage de l’hémoglobine par méthode colorimétrique
Bilan
Détermination de la formule complète
2 Analyse cytométrique tridimensionnelle
Principe de la mesure optique
• Les cellules sont analysées les unes à la suite des
autres grâce à un « gainage fluidique » (cytométrie
de flux )
• La cellule de mesure du cytomètre de flux comprend
un banc optique devant lequel passent les cellules.
• La lumière diffractée est analysée pour donner des
informations sur la taille et la densité intracellulaire
La mesure optique
SOURCECellule photoélectrique
Diluant
Diluant
Diluant
Diluant
EchantillonDiffraction lumineuse
La cellule passe individuellement devant un faisceau lumineux conventionnel (lampe halogène à vapeur de Hg ou de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon, Helium-Neon…)
Diffraction lumineuse
Petits angles = Taille(1-6 )
Grands angles = Densité intracellulaire(8-20 )
Faisceau laser
Grands angles = Densité intracellulaire
Petits angles = Taille
– Volume ou taille cellulaire
• Principe Coulter pour le volume ou mesure optique pour la taille
– Diffraction lumineuse
• Diffraction de la lumière par la cellule
– Conductivité ou Radio Fréquence (RF)
• Structure de la cellule par un courant haute fréquence
– Cytolyse
• Lyse différentielle des cellules
– Cytochimie
• Coloration de la cellule
– Marquage
• Marquage par des anticorps monoclonaux et fluorochromes
les différents paramètres utilisés pour
l’hémogramme automatisé
Impédance/Conductivité/DiffractionCoulter
1- le volume
mesure par impédance2- la diffraction laser
3- la conductivitéSimultanéité des mesures
Conductivité: analyse du noyau et de la composition
chimique du cytoplasme en enregistrant les modifications
subies par un courant haute fréquence traversant la cellules.
Diffraction : Surface,granulations
V
o
l
u
m
e
Conductivité
noyau
3 mesures physiques pour la formule complète
Analyse en 3D
Exploration
réalisée sur
plus de 8000
cellules
Analyse en 256 canaux ( 16 millions de positions unitaires)
Le scattergramme DF1 (Abbott)
Taille/Cytolyse/Cytochimie
(Activité peroxydasique) Bayer
Combinaison cytochimique
Recherche de l ’activité myéloperoxydasique
in situ (MPO)
• les lymphocytes sans peroxydase ne sont
pas colorés (-)
• les monocytes sont faiblement colorés (+)
• les granulocytes neutrophiles sont fortement
colorés (+++)
Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)Diffraction lumineuse enregistrée sous deux angles différents (Bayer)
Traitement des cellules ; révélation de l'activité peroxydasique
Matrice PEROX
Cellule photoélectrique
Lentille
Miroir semi-
transparent
Miroir semi-
transparent
Lentille
Petit angle 2/3=
Taille
Grand angle 5/15=
Activité Peroxydasique
Analyse des Globules blancs
neutrophiles
lymphocytes monocytes éosinophilesLUC: grandes cellules sans peroxydase
( GL stimulés ou blastes agranuleux des LA ou GLHB des MNI)
débris cellulaires
Formule sur
7000 cellules
large unstained cells
N
E
Mo
LUC
débris
L
Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase) Canal basophiles
Traitement des cellules ; Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles
Histogramme Basophiles
Cellule photoélectr
ique
Lentille
Miroir semi-
transparent
Miroir semi-
transparent
Lentille
Petit angle 2/3=
Taille
Grand angle 5/15=
Densité chromatinienne
Laser
DENSITE/SEGMENTATION
TAILLE
Neutrophiles
Eosinophiles
LUC
Débris
Ly
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Diagramme PEROX diagramme BASO
TAILLE
BASOS
Noyaux monolobés
Noyaux Polylobés
Mo
Taille/Cytolyse/Cytochimie
(Coloration des Eo.) Abx Horiba
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Volume
Absorbance
Bruit de
fond
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. Ly Mo+Ba
Ne
Eo
LyA
GCI
GCI Basophiles
Noyaux GB
Volume
Nombre
Histogramme Ba
Matrice LMNE
- ADN: noyau
- ARN : réticulocytes /plaquettes réticulées
- Récepteurs membranaires : CD4/CD8
3 Le marquage spécifique
Diffraction lumineuse + Marquage
ADN/ARN
Abbott
Marquage de l’ADN à l'iodure de propidium
Numération
Taille
Complexité.
Laser ARGON
7
0
90 Pol.PMT2
Lobularité
Granulations
Eosinophiles
90 Dépol.
PMT1
PMT3
Viabilité Blcs
Erythroblastes
Les noyaux nus des cellules lysées et les noyaux des cellules mortes sont marqués par l'iodure de propidium
Analyse de la fluorescence:
Marquage des noyaux accessibles
Noyaux nus
Leucocytes non viables
Leucocytes viables
Marquage fluorescent sur ARN
Numération
Taille
Complexité.
Laser ARGON
7
0
PMT2
RéticulocytesPMT1
PMT3
Filtre FL1 auto commutable
Réticulocytes
Fluorescence vs Complexité
Réticulocytes : coloration au bleu de méthylène
Mesure des réticulocytes
Pré-traitement: coloration
au BCB et décoloration de
l ’hémoglobine
Réticulocytes en %
réticulocytes en nombre absolu
volume moyen
indice de maturation
Diffraction lumineuse /FluorescenceSysmex
• cytolyse différentielle des
cellules nucléées autres que les
polynucléaires basophiles.
• Comptage des PB par
diffraction optique
• Lyse des globules rouges et des
plaquettes.
• les membranes des globules blancs
sont rendues perméables au
fluorochrome. Fixation du
fluorochrome sur l’ARN et l’ADN
cellulaires.
• Comptage par diffraction à petit angle,
grand angle et intensité de
• fluorescence (3D).
4- BilanFrançais Anglais Unités
Nb érythrocytes Erc RBC 103/mm 3 ou 1012/L
Concentration en
Hémoglobine
Hb HGB g/dL
Hématocrite Ht HCT L/L
VGM VMC MCV fL
TCMH TCMH MCH pg
CCMH CCMH MCHC L/dl de GR
Indice de distribution
érythrocytaire
IDC
IDR
RDW %
Nb plaquettes plt PLT 109/L
Volume plaquettaire moyen VMP MPV fL
Thrombocrite TCT PCT L/L
Indice de distribution
plaquettaire
IDP PDW %
Nb de leucocytes Lkc WBC 109/L
Nb de neutrophiles Ne Ne 109/L
Nb de lymphocytes Ly Ly 109/L
Nb de monocytes Mo Mo 109/L
Nb d’éosinophiles Eo Eo 109/L
Nb de basophiles Ba Ba 109/L
Les alarmes
• Les messages quantitatifs
anomalies par rapport à des valeurs seuils
• Les messages globaux
ex: données erronées
• les messages de suspicion
anomalies morphologiques, cellules immatures,
blastes, poïkilocytose, agrégats plaquettaires,
plaquettes géantes…
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