กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 23
การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนมของลกษณะทางกายวภาคของรากขาวGenome-wide Association Study of Root Anatomical Traits in Rice (Oryza sativa L.) พณณชตา เวชสาร1) Meredith Hanlon2) Susan McCouch4) Jonathan Lynch3) Kathleen Brown3)
Phanchita Vejchasarn1) Meredith Hanlon2) Susan McCouch4) Jonathan Lynch3) Kathleen Brown3)
Abstract Root anatomical traits, which include cortical area, aerenchyma area, and xylem
features, influence the absorption and translocation of water and nutrients, oxygen transport and the mechanical strength of the root system. While a number of studies have shown promising functional benefits of anatomical root traits in conferring resource acquisition efficiency, very little is known about the genetic mechanisms underlying natural phenotypic variation of these traits. In this study, we evaluated 336 Oryza sativa accessions selected from the rice diversity panel for 4 root anatomical traits including, root cross-section area, aerenchyma, and xylem features in well-controlled greenhouse environment. Considerable phenotypic variation was observed in all root traits measured among accessions and sub-populations. Broad-sense heritability estimates were relatively high for all traits, suggesting that these traits are under strong genetic control. Genome wide association (GWA) analysis was performed using a set of 44,100 single nucleotide polymorphisms (SNPs) to identify significant loci controlling root anatomical traits. A total of 13 loci significantly associated with anatomical root traits were identified. These identified loci for anatomical root traits may be useful for improving resource acquisition efficiency of rice by marker assisted selection (MAS).
Keywords: rice, root anatomical traits, genome-wide association study
บทคดยอ ลกษณะทางกายวภาคของราก ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA)
พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV)
1) ศนยวจยขาวอบลราชธาน ต ปณ.65 อ.เมอง จ.อบลราชธาน 34000 โทรศพท 0-4534-4104 Ubon Ratchathani Rice Research Center, P.O.BOX 65, Mueang, Ubon Ratchathani 34000 Tel. 0-4534-4104
2) Plant Biology, Pennsylvania State University, University Park, USA. 3) Plant Science, Pennsylvania State University, University Park, USA 4) Plant Breeding and Genetics, Cornell University, Ithaca, USA.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255824
และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) พบวามความสมพนธโดยตรงกบ ความสามารถในการลาเลยงนาและธาตอาหาร การสงผานออกซเจน และความแขงแรงของราก เมอไมนานมาน มการรายงานผลการวจยเกยวกบความหลากหลายทางพนธกรรมและความสาคญของลกษณะทางกายวภาคของรากขาวในการเพมประสทธภาพการลาเลยงนาและธาตอาหาร อยางไรกตามงานวจยทเกยวของและรายงานการคนพบยนหรอกลไกทางพนธกรรมทควบคมลกษณะเหลานยงมอยนอยมาก งานวจยนไดประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาวทสาคญ 4 ลกษณะ ไดแก พนทตดขวางของราก พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา โดยใชกลมประชากรขาว ทเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาวปลก (Oryza sativa L.) จานวนทงสน 336 พนธ ผลการทดลองแสดงใหเหนวาขาวปลก มความหลากหลายทางพนธกรรมของลกษณะทางกายวภาคของรากสง คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (Broad-sense Heritability, hB
2) อยในเกณฑสง โดยมคาอยระหวางรอยละ 70-90 แสดงใหเหนวาลกษณะเหลานไดรบอทธพลจากยนโดยตรง การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนมโดยใชฐานขอมลสนป จานวน 44,100 ตาแหนง พบวาสนปจานวนทงสน 13 ตาแหนง มความสมพนธกบความผนแปรของลกษณะทางกายวภาคของรากขาว ความสาเรจของงานวจยนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชเปนเครองมอชวยในการคดเลอกพนธ (Marker-assisted Selection, MAS) ตอไป
คาสาคญ: ขาว ลกษณะทางกายวภาค การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม
คานา รากเปนอวยวะหลกและมบทบาทสาคญตอการเจรญเตบโตของพช เพราะทาหนาทในการดดซม
นาและแรธาตทอยในดนเพอนาไปใชเปนวตถดบในการสงเคราะหแสงของพชซงชวยใหพชมการเจรญเตบโตและพฒนาไดเปนปกต นอกเหนอจากนรากยงทาหนาทยดเกาะดนเพอชวยพยงคาจนลาตน สะสมอาหาร และขยายพนธไดในพชบางชนด และเปนแหลงสาคญในการผลตฮอรโมนพชหลายชนด เชน ไซโทไคนนและจบเบอเรลลน ซงจะถกลาเลยงไปใชเพอการเจรญพฒนาสวนของลาตน สวนยอด และสวนอน ๆ ของพช อยางไรกตาม การศกษาวจยระบบรากและองคความรเรองรากนนยงมอยนอยมากเมอเปรยบเทยบกบการศกษาลกษณะอน ๆ ในพช ทงนเนองจากรากเปนสวนของพชทยากตอการศกษาเพราะเปนสวนทอยใตดนทาใหการศกษาระบบรากนนมความซบซอน และเปนงานทตองใชแรงงานเพอขดแยกรากและลางทาความสะอาดกอนทจะนามาทาการวเคราะห นอกจากนการศกษาลกษณะบางอยางของรากทไมสามารถมองเหนดวยตาเปลา เชน การศกษาลกษณะทางกายวภาค ตองอาศยการใชเครองมอพเศษตาง ๆ เขามาเกยวของ อกทงยงใชเวลานานกวาจะไดขอมลมาวเคราะห ลกษณะรากบางลกษณะมคาอตราพนธกรรมตา (heritability) กลาวคอเปนลกษณะทผนแปรตามอทธพลของสภาพแวดลอมในดน ดวยเหตน
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 25
จงทาใหการพฒนาองคความรของระบบรากและการนามาใชประโยชนเพอการปรบปรงพนธ มอยอยางจากด
ขาวจดเปนธญพชชนดหนง ทมความหลากหลาย (genetic diversity) และแปรผน (genetic variation) ทางพนธกรรมสง ความหลากหลายทางพนธกรรมบงชวาลกษณะทแตกตางเหลานสงผลใหขาวตางพนธหรอชนดยอย (subspecies) มความสามารถในการเจรญเตบโตและปรบตวภายใตอทธพลของสภาวะแวดลอมไดแตกตางกนไป ดวยเหตนจงมแนวความคดทจะนาเอานาความรเบองตนเหลานมาใชในการกาหนดและคดเลอกลกษณะ เพอใชในการพฒนาและปรบปรงขาวพนธ ใหมใหสอดคลองกบสภาพแวดลอมไดอยางมประสทธภาพ ในชวงทศวรรษทผานมา ผลของการศกษาวจยความหลากหลายทางพนธกรรม ของระบบรากในขาวพบวา มความแตกตางทงในดานของลกษณะทางกายวภาคและสณฐาน (Courtois et al., 2013; Uga et al., 2009; Uga et al., 2008; Lafitte et al., 2001; Kondo et al., 2000) ลกษณะทางกายวภาคของรากทสาคญ ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) (Fig. 1) เปนตน ซงลกษณะทางกายวภาคดงกลาว สมพนธโดยตรงกบความแขงแรงของราก ความสามารถในการชอนไช ประสทธภาพในการลาเลยงนาและธาตอาหารเพอนาไปเลยงสวนตาง ๆ ของพช นอกจากน การพฒนาเนอเยอแอเรงคมาหรอชองอากาศในชนคอรเทกซของราก ชวยใหการหมนเวยนและเคลอนทของออกซเจนสะดวกยงขน เมอตองเผชญกบสภาวะกงขาดออกซเจน (hypoxia) หรอขาดออกซเจน (anoxia) เชน ในภาวะนาทวมขง อยางไรกตามงานวจยทเกยวของ และรายงานการคนพบยนหรอกลไกทางพนธกรรมทควบคมลกษณะเหลานยงมอยนอยมาก และขอมลยงไมเพยงพอทจะนาไปใชในงานปรบปรงพนธขาว
ปจจบนความกาวหนาและวทยาการทางดานจโนมกส (genomics) และอณพนธศาสตร (molecular genetics) ถกนามาใชเพอจาแนกความหลากหลายและแปรผนทางพนธกรรมของขาว จากความแตกตางของลาดบนวคลโอไทดเพยงตาแหนงเดยว หรอทเรยกวา “สนป” (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) กลมประชากรขาวซงประกอบไปดวย ขาวพนธดเดนและพนธพนเมอง ทรวบรวมมาจาก 82 ประเทศทวโลก จานวน 413 พนธ ถกนามาถอดรหสหรอจโนไทปและสรางเปนฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทดทวทงจโนมเปนจานวนทงสน 44,100 ตาแหนง โดยระยะหางเฉลยของแตละ SNP บนจโนม ประมาณ 10 Kb ฐานขอมลนยงถกนามาใชในการศกษาโครงสรางประชากร ของขาวชนด Oryza sativa L. เพอใชเปนเกณฑในการจดจาแนกขาวได 5 กลมประชากรยอย (sub-population) ไดแก aromatic, tropical japonica, temperate japonica, aus และ indica โดยท aromatic, tropical japonica, temperate japonica จดเปนขาวกลม japonica สวน aus และ indica จดเปนขาวกลม Indica (Zhao et al., 2011) เนองจากฐานขอมลชดนเปนฐานขอมลสาธารณะ อนเปนประโยชนอยางมหาศาลในการศกษาววฒนาการ ความหลายทางพนธกรรม และสบคนหายนอยางเปนระบบจากความสมพนธ
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255826
ระหวางลกษณะทสนใจกบขอมลจโนม โดยใชวธทมชอวา “Genome-wide Association Study (GWAS)” หรอ การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม ขอไดเปรยบของ GWAS คอ มความละเอยดและแมนยาสง (high resolution map) อกทงชวยรนระยะเวลาและเพมโอกาสในการคนหาและระบตาแหนงยนเปาหมาย เมอเปรยบเทยบกบการสรางแผนทพนธกรรมแบบดงเดม (traditional linkage mapping) งานวจยนจงมวตถประสงคเพอประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาว และจดทาแผนทพนธกรรมความเชอมโยงในจโนมเพอคนหาตาแหนงสนปหรอยนทคาดวาเกยวของกบลกษณะดงกลาว ความสาเรจของงานวจยนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชในการคดเลอกพนธในระดบจโนม (Genomic Selection, GS) และเปนแนวทางในการปรบปรงพนธขาวไดอยางมประสทธภาพตอไป
อปกรณและวธการ พนธขาว
กลมประชากรขาวทใชในการทดลองนประกอบดวย ขาวพนธพนเมอง (landrace cultivars) และขาวพนธดเดน (elite cultivars) จานวน 336 พนธ ประกอบดวย aromatic 11 พนธ tropical japonica 80 พนธ temperate japonica 76 พนธ aus 52 พนธ indica 67 พนธ และ admixed 50 พนธ ซงถกคดเลอกมาจาก 82 ประเทศทวโลก โดยครอบคลมทกนเวศการปลกขาว กลมประชากรนจดวาเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาว Oryza sativa L. วธปลก
ดาเนนการทดลองในสภาพเรอนทดลอง ณ Pennsylvania State University ประเทศสหรฐอเมรกา (40º48’ N, -77º51’ W) วางแผนการทดลองแบบ Randomized Complete Block (RCB) จานวน 3 ซา ปลกขาวในกระถางขนาดบรรจ 10.5 ลตร ( เสนผาศนยกลาง 21 เซนตเมตร สง 40.6 เซนตเมตร) วสดปลกประกอบดวยทรายและเวอรมคไลท ในอตราสวน 4:1 ใหสารละลายธาตอาหารสตร Yoshida (Yoshida et al., 1976) ดวยระบบนาหยดวนละ 1 ครง เกบตวอยางรากเมอขาวมอายครบ 8 สปดาห การประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาว
ประเมนลกษณะทางกายวภาคทสาคญ ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) รากทนามาใชวเคราะหลกษณะทางกายวภาคเปนรากถาวร (nodal roots) โดยการศกษาลกษณะทางกายวภาคจะศกษาทตาแหนง 5 เซนตเมตรโดยวดจากฐานราก ซงในตาแหนงนเปนตาแหนงททอลาเลยงนามการพฒนาอยางเตมท ตวอยางรากจะเกบไวในสารละลายเอทลแอลกอฮอลความเขมขน 70 เปอรเซนต อยางนอย 1 เดอน เพอทาใหรากคงสภาพและงายตอการศกษา รากจะถกนามาตดขวางดวยใบมดโกน (free-hand
sectioning) ใหมความบางทพอเหมาะ จากนนนามาบนทกภาพตดขวางภายใตกลองจลทรรศนทกาลงขยาย 40 เทา ภาพตดขวางของรากจะนามาวเคราะหดวยโปรแกรม RiceRootAnalyzer การวเคราะหขอมลทางสถต
การวเคราะหขอมลทางสถตของลกษณะกายวภาคของรากขาวโดยใชการทดสอบทางสถตชนด Analysis of Variance (ANOVA) โดยขอมลทมคา P-value นอยกวา 0.05 จงถอวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต และการเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) กาหนดนยสาคญทระดบ 95% โดยใชโปรแกรม Minitab (Minitab Inc, University Park, USA) การประเมนคาอตราพนธกรรม
คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (broad-sense heritability, hB2) คอ อตราสวนระหวาง ความผน
แปรทางพนธกรรมทเกดจากการแสดงผลของยนทกรปแบบ กบความผนแปรของลกษณะทปรากฏ ซงคานวณไดจากสมการ
hB2 = σ2
G/ σ2P = σ2
G/ (σ2G + σ2
E)
โดยท σ2G (genotypic variance) คอ ความผนแปรทางพนธกรรม σ2
P (phenotypic variance) คอ ความผนแปรของลกษณะทปรากฏ และ σ2
E (environmental variance) คอ ความผนแปรทเกดสภาพแวดลอม การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม (Genome-wide Association Study, GWAS)
ฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทด จานวน 44,100 SNPs ซงเปนฐานขอมลสาธารณะ ถกนามาใชในการวเคราะหหาความเชอมโยงในจโนม เพอคนหาตาแหนงยนทเกยวของกบความยาวและความหนาแนนของขนราก โดยเลอกวเคราะหแบบ Mixed Linear Model (MLM) (Yu et al., 2006; Zhao et al., 2007; Kang et al., 2008) ดวย Genomic Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT) package บนโปรแกรม R (Lipka et al., 2012) เพอระบ SNP ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจอยางมนยสาคญ (significant SNP) โดยดจากคา Logarithm of Significant Level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 การสบคนหายนคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจ (candidate genes) จะสบคนจากตาแหนงของ significant SNP และพจารณารวมกบคา linkage disequilibrium decay (LD decay) ซง LD decay ในขาวมคาอยระหวาง ประมาณ 50,000 – 100,000 Kb การสบคนหายน การแสดงออกของยน และการเปรยบเทยบหนาทของยนกบพชตนแบบ Arabidopsis (orthologous genes) สามารถสบคนไดจากฐานขอมล GrameneBiomart (www.gramene.com)
ผลการทดลองและวจารณ ลกษณะทางกายวภาคของรากขาว
ผลการทดลองในขาวทง 336 พนธ พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา เมอเปรยบเทยบระหวางพนธ (genotype) และกลม
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 27
sectioning) ใหมความบางทพอเหมาะ จากนนนามาบนทกภาพตดขวางภายใตกลองจลทรรศนทกาลงขยาย 40 เทา ภาพตดขวางของรากจะนามาวเคราะหดวยโปรแกรม RiceRootAnalyzer การวเคราะหขอมลทางสถต
การวเคราะหขอมลทางสถตของลกษณะกายวภาคของรากขาวโดยใชการทดสอบทางสถตชนด Analysis of Variance (ANOVA) โดยขอมลทมคา P-value นอยกวา 0.05 จงถอวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต และการเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) กาหนดนยสาคญทระดบ 95% โดยใชโปรแกรม Minitab (Minitab Inc, University Park, USA) การประเมนคาอตราพนธกรรม
คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (broad-sense heritability, hB2) คอ อตราสวนระหวาง ความผน
แปรทางพนธกรรมทเกดจากการแสดงผลของยนทกรปแบบ กบความผนแปรของลกษณะทปรากฏ ซงคานวณไดจากสมการ
hB2 = σ2
G/ σ2P = σ2
G/ (σ2G + σ2
E)
โดยท σ2G (genotypic variance) คอ ความผนแปรทางพนธกรรม σ2
P (phenotypic variance) คอ ความผนแปรของลกษณะทปรากฏ และ σ2
E (environmental variance) คอ ความผนแปรทเกดสภาพแวดลอม การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม (Genome-wide Association Study, GWAS)
ฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทด จานวน 44,100 SNPs ซงเปนฐานขอมลสาธารณะ ถกนามาใชในการวเคราะหหาความเชอมโยงในจโนม เพอคนหาตาแหนงยนทเกยวของกบความยาวและความหนาแนนของขนราก โดยเลอกวเคราะหแบบ Mixed Linear Model (MLM) (Yu et al., 2006; Zhao et al., 2007; Kang et al., 2008) ดวย Genomic Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT) package บนโปรแกรม R (Lipka et al., 2012) เพอระบ SNP ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจอยางมนยสาคญ (significant SNP) โดยดจากคา Logarithm of Significant Level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 การสบคนหายนคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจ (candidate genes) จะสบคนจากตาแหนงของ significant SNP และพจารณารวมกบคา linkage disequilibrium decay (LD decay) ซง LD decay ในขาวมคาอยระหวาง ประมาณ 50,000 – 100,000 Kb การสบคนหายน การแสดงออกของยน และการเปรยบเทยบหนาทของยนกบพชตนแบบ Arabidopsis (orthologous genes) สามารถสบคนไดจากฐานขอมล GrameneBiomart (www.gramene.com)
ผลการทดลองและวจารณ ลกษณะทางกายวภาคของรากขาว
ผลการทดลองในขาวทง 336 พนธ พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา เมอเปรยบเทยบระหวางพนธ (genotype) และกลม
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255828
ประชากรยอย (sub-population) มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญยง (P-value < 0.001) แตไมพบความแตกตางระหวางจานวนซา (replication) (Table 1, Fig. 2) ตารางท 2 (Table 2) แสดงคาเฉลยและคาเบยงมาตรฐานของขอมลลกษณะทางกายวภาคของรากขาวโดยจาแนกตามกลมประชากรยอย ไดแก aus, indica, tropical japonica, temperate japonica, aromatic และ admixted เมอเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) พบวา ขาว tropical japonica มคาเฉลยสงทสดในทกลกษณะททาการประเมน
พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) เปนตวบงชถงความสามารถในการหยงรากและการชอนไชของราก (Materechera et al., 1992; Ray et al., 1996; Cairns et al., 2009) และแปรผนโดยตรงกบความลกของดนทรากหยงได กลาวคอ รากทมขนาดใหญสามารถหยงลงดนไดลกกวา ลกษณะเชนน ถอวาเปนหนงในกลไกทสาคญในการเผชญกบสภาวะแลง จากผลการวเคราะหทางสถต พบวา ขาว tropical japonica มขนาดของรากใหญทสด สวนขาว indica มขนาดของรากเลกทสด (Table 2) ซงมความสอดคลองกบผลการทดลองของ Lafitte et al. (2001) ขาว tropical japonica เปนขาวทปลกในสภาพไรหรอทดอนทไมมนาขง การทขาวชนดนมขนาดรากทใหญโดยธรรมชาตนน อาจเปนกลไกการปรบตวภายใตสภาวะแวดลอมทมความเสยงตอการเกดภยแลง ในทางตรงกนขาม ขาว indica เปนขาวทปลกในพนทนานาฝนสวนใหญ เมอประสบปญหาฝนทงชวง หนาดนทแหงและแขง กอปรกบชนดนดาน (hardpan) ทเกดขน ขาว indica ซงมรากขนาดเลกกวาอาจจะมประสทธภาพในการชอนไชไดดกวา
การพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาในรากขาว เรยกวา lysigenous aerenchyma formation ซงเกดจากการตาย (Programmed Cell Death, PCD) และสลายตวของเซลล (cell lysis) เกดเปนชองอากาศในชนคอรเทกซของราก (Kawai et al., 1998; Parlanti et al., 2011) การพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาถอเปนกลไกพนฐานในการปรบตวภายใตสภาวะกงขาดออกซเจน (hypoxia) หรอขาดออกซเจน (anoxia) ซงแอเรงคมาจะชวยใหการผานเขา-ออกของออกซเจนสะดวกยงขน (Justin and Armstrong, 1987; Colmer, 2003; Suralta and Yamauchi, 2008) นอกจากนยงพบวาปจจยจากสภาวะเครยดอน ๆ เชน ปรมาณฟอสฟอรสและไนโตรเจนในดนตา อณหภมสง และสภาวะแลง ยงเปนตวกระตนใหเกดการพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาไดอกดวย (Drew et al., 1989; Przywara and Stepniewski, 2000; Bouranis et al., 2003; Evans, 2003; Zhu et al., 2010; Lynch, 2011) จากผลการวเคราะหทางสถตพบวา ขาว tropical japonica มพนทของแอเรงคมามากทสด สวนขาว indica มพนทของแอเรงคมานอยทสด (Table 2) ซงจากผลการทดลองนสามารถอธบายไดวา เนองจากการพฒนาเนอเยอแอเรงคมาในขาวโดยธรรมชาต เกดจากการตายและสลายตวของเซลลแมไมไดรบการกระตนจากปจจยแวดลอมภายนอก ฉะนน ขาว tropical japonica ทมขนาดรากใหญกวา จงมแนวโนมทพนทของแอเรงคมาจะมากกวาดวย จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) สมพนธโดยตรงกบประสทธภาพในการลาเลยงนา (Kondo et al.,
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 29
2000; Uga et al., 2008) และเสถยรภาพการใหผลผลตภายใตสภาวะแลง (Zimmermann, 1983; Tyree et al., 1994; Comas et al., 2013) ความสามารถในการลาเลยงนาและสภาพนานาของราก (root hydraulic conductivity) สามารถอธบายไดดวยทฤษฎ Poiseuille-Hagen กลาวคอ ความตานทานภายในทอลาเลยงนาแปรผกผนกบขนาดของทอลาเลยง ฉะนน ทอลาเลยงนาขนาดใหญจะมความตานทานในทอลาเลยงตา (low axial resistance) สามารถลาเลยงนาไดดกวาทอลาเลยงนาขนาดเลก (Fukai and Cooper, 1995; Uga et al., 2008) อยางไรกตาม ทอลาเลยงนาทมขนาดใหญนน มความเสยงในการเกดคาวเทชน (cavitation) หรอปรากฏการณการเกดโพรงอากาศ โดยเฉพาะอยางยงภายใตสภาวะแลง ซงโพรงอากาศเหลานจะไปขดขวางชองทางในการลาเลยงนา (Richards and Passioura, 1989; Sperry and Saliendra, 1994; Tyree et al., 1994; Alder et al., 1996; Gallardo et al., 1996; Comas et al., 2013) จากผลการวเคราะหทางสถต พบวา ขาว tropical japonica มจานวนทอลาเลยงนามากทสด และขนาดของทอลาเลยงนาใหญทสด (Table 2) การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม
ผลการทดลอง พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนามคาอตราพนธกรรมอยางกวาง อยในเกณฑสง โดยมคาอยระหวางรอยละ 70-90 (Table 3) คาอตราพนธกรรมเปนดชนชวดอทธพลของพนธกรรมตอลกษณะปรากฏ กลาวอกนยหนงคอ คาอตราพนธกรรมสงแสดงใหเหนวาลกษณะนนไดรบอทธพลจากยนมาก นอกจากน คาอตราพนธกรรมยงสามารถใชเปนแนวทางในการคดเลอกและปรบปรงพนธไดอกดวย การสรางแผนทพนธกรรมแสดงรปแบบความเชอมโยงในจโนม โดยใชฐานขอมลสนป จานวน 44,100 ตาแหนง เครองหมายสนปซงกระจายตวครอบคลมทง 12 โครโมโซมและกระจายทวทงจโนมขาว โดยระยะหางเฉลยของแตละสนปบนจโนม ประมาณ 10 Kb ซงถอวามความละเอยดสง จากผลการวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม พบสนป จานวนทงสน 13 ตาแหนง ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทางกายวภาคของรากขาวอยางมนยสาคญ (Table 3, Fig. 3-6) โดยพจารณาจากคา logarithm of significant level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 ซงสามารถแจกแจงตามลกษณะทศกษาไดดงน พนทตดขวางของรากจานวน 1 ตาแหนง บนโครโมโซม 1 พนทแอเรงคมาจานวน 4 ตาแหนง บนโครโมโซม 2 และ 9 จานวนทอลาเลยงนา จานวน 7 ตาแหนง บนโครโมโซม 2 4 10 และ 12 และขนาดของทอลาเลยงนาจานวน 1 ตาแหนง บนโครโมโซม 5
สรปผลการทดลอง การวจยนเปนครงแรกททาการประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาวในเชงลก โดย
ทาการศกษาในกลมประชากรทมขนาดใหญ ซงถอเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาวปลก (Oryza sativa L.) จานวนทงสน 336 พนธ และไดนาเอาวธทมชอวา “Genome-wide Association Study (GWAS)” หรอ การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม มาชวยในการสบคนและระบตาแหนงสนปทคาด
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255830
วาสมพนธกบลกษณะทางกายวภาคของราก ผลการทดลองชใหเหนถงความแตกตางอยางชดเจนของลกษณะทางกายวภาคของราก ซงถอเปนลกษณะเฉพาะตามฐานพนธกรรม ยกตวอยางเชน ขาว tropical japonica หรอ ขาวไร มกมรากขนาดใหญ แอเรงคมามาก มทอลาเลยงนาจานวนมากและขนาดของทอลาเลยงนาใหญกวาขาวในกลม indica ขอมลทไดจะเปนประโยชนอยางยงตอนกปรบปรงพนธ เพอชวยในการคดเลอกพอและแมพนธ ทมลกษณะทตองการ และชใหเหนความสาคญของการใชฐานพนธกรรมทหลากหลาย เพอใหงานปรบปรงพนธมประสทธภาพยงขน จากการศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม คนพบสนปทคาดวาเกยวของกบความผนแปรของลกษณะทางกายวภาค จานวนทงสน 13 ตาแหนง องคความรทไดนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชในการคดเลอกพนธ ในระดบจโนม (Genomic Selection, GS) และเปนแนวทางในการปรบปรงพนธขาวไดอยางรวดเรวและมประสทธภาพตอไป
เอกสารอางอง Alder, N., J. Sperry and W. Pockman. 1996. Root and stem xylem embolism, stomatal conductance, and leaf
turgor in Acer grandidentatum populations along a soil moisture gradient. Oecologia. 105: 293-301. Bouranis D., S. Chorianopoulou, V. Siyiannis, V. Protonotarios and M. Hawkesford. 2003. Aerenchyma
formation in roots of maize during sulphate starvation. Planta. 217:382-391. Cairns J.E., A. Audebert, C.E. Mullins and A.H. Price. 2009. Mapping quantitative trait loci associated with
root growth in upland rice (Oryza sativa L.) exposed to soil water-deficit in fields with contrasting soil properties. Field Crop. Res. 114:108-118.
Colmer T. 2003. Long‐distance transport of gases in plants: a perspective on internal aeration and radial oxygen loss from roots. Plant, Cell & Environment 26:17-36.
Comas L.H., S.R. Becker, V.M. Cruz, P.F. Byrne and Dierig D.A. 2013. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front Plant Sci 4:442. DOI: 10.3389/fpls.2013.00442.
Courtois B., A. Audebert, A. Dardou, S. Roques, T. Ghneim-Herrera, G. Droc, J. Frouin, L. Rouan, E. Goze, A. Kilian, N. Ahmadi and M. Dingkuhn. 2013. Genome-wide association mapping of root traits in a japonica rice panel. PLoS One 8:e78037. DOI: 10.1371/journal.pone.0078037.
Drew M.C., C.J. He and P.W. Morgan. 1989. Decreased ethylene biosynthesis, and induction of aerenchyma, by nitrogen-or phosphate-starvation in adventitious roots of Zea mays L. Plant Physiology 91:266-271.
Evans D.E. 2003. Aerenchyma formation. New Phytologist 161:35-49. Fukai S. and M. Cooper. 1995. Development of drought-resistant cultivars using physiomorphological traits in
rice. Field Crops Research 40:67-86. Gallardo M., J. Eastham, P. Gregory and N. Turner. 1996. A comparison of plant hydraulic conductances in
wheat and lupins. Journal of experimental botany 47:233-239.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 31
Justin S. and W. Armstrong. 1987. The anatomical characteristics of roots and plant response to soil flooding. New Phytologist:465-495.
Kang H.M., N.A. Zaitlen, C.M. Wade, A. Kirby, D. Heckerman, M.J. Daly and E. Eskin. 2008. Efficient control of population structure in model organism association mapping. Genetics 178:1709-1723.
Kawai M., P. Samarajeewa, R. Barrero, M. Nishiguchi and H. Uchimiya. 1998. Cellular dissection of the degradation pattern of cortical cell death during aerenchyma formation of rice roots. Planta 204:277-287.
Kondo M., A. Aguilar, J. Abe and S. Morita. 2000. Anatomy of nodal roots in tropical upland and lowland rice varieties. Plant production science 3:437-445.
Lafitte H., M. Champoux, G. McLaren and J. O’Toole. 2001. Rice root morphological traits are related to isozyme group and adaptation. Field Crops Research 71:57-70.
Lipka A.E., F. Tian, Q. Wang, J. Peiffer, M. Li, P.J. Bradbury, M.A. Gore, E.S. Buckler and Z. Zhang. 2012. GAPIT: genome association and prediction integrated tool. Bioinformatics 28:2397-2399.
Lynch J.P. 2011. Root phenes for enhanced soil exploration and phosphorus acquisition: tools for future crops. Plant Physiol 156:1041-9. DOI: 10.1104/pp.111.175414.
Materechera S., A. Alston, J. Kirby and A. Dexter. 1992. Influence of root diameter on the penetration of seminal roots into a compacted subsoil. Plant and Soil 144:297-303.
Parlanti S., N.P. Kudahettige, L. Lombardi, A. Mensuali-Sodi, A. Alpi, P. Perata and C. Pucciariello. 2011. Distinct mechanisms for aerenchyma formation in leaf sheaths of rice genotypes displaying a quiescence or escape strategy for flooding tolerance. Ann Bot 107:1335-43. DOI: 10.1093/aob/mcr086.
Przywara G. and W. Stępniewski. 2000. Influence of flooding and different temperatures of the soil on gas-filled porosity of pea, maize and winter wheat roots. development 7:15.
Ray J., L. Yu, S. McCouch, M. Champoux, G. Wang and H. Nguyen. 1996. Mapping quantitative trait loci associated with root penetration ability in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 92:627-636.
Richards R. and J. Passioura. 1989. A breeding program to reduce the diameter of the major xylem vessel in the seminal roots of wheat and its effect on grain yield in rain-fed environments. Crop and Pasture Science 40:943-950.
Sperry J. and N. Saliendra. 1994. Intra‐and inter‐plant variation in xylem cavitation in Betula occidentalis. Plant, Cell & Environment 17:1233-1241.
Suralta R.R. and A. Yamauchi. 2008. Root growth, aerenchyma development, and oxygen transport in rice genotypes subjected to drought and waterlogging. Environmental and Experimental Botany 64:75-82. DOI: 10.1016/j.envexpbot.2008.01.004.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255832
Tyree M.T., S.D. Davis and H. Cochard. 1994. Biophysical perspectives of xylem evolution: Is there a tradeoff of hydraulic efficiency for vulnerability to dysfunction. International Association of Wood Anatomists Journal 14:335-360.
Uga Y., K. Ebana, J. Abe, S. Morita, K. Okuno and M. Yano. 2009. Variation in root morphology and anatomy among accessions of cultivated rice (Oryza sativa L.) with different genetic backgrounds. Breeding Science 59:87-93.
Uga Y., K. Okuno and M. Yano. 2008. QTLs underlying natural variation in stele and xylem structures of rice root. Breeding Science 58:7-14.
Yoshida S., D. Forno, J. Cock and K. Gomez. 1976. Routine procedure for growing rice plants in culture solution. Laboratory manual for physiological studies of rice:61-66.
Yu J., G. Pressoir, W. Briggs, V. Bi, M. Yamasaki, J. Doebley, M. McMullen, B. Gaut, D. Nielsen and J. Holland. 2006. A unified mixed-model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness. Nature genetics 38:203-208.
Zhao K., M.J. Aranzana, S. Kim, C. Lister, C. Shindo, C. Tang, C. Toomajian, H. Zheng, C. Dean and P.Marjoram. 2007. An Arabidopsis example of association mapping in structured samples. PLoS Genetics 3:e4.
Zhao K., C.W. Tung, G.C. Eizenga, M.H. Wright, M.L. Ali, A.H. Price, G.J. Norton, M.R. Islam, A. Reynolds, J. Mezey, A.M. McClung, C.D. Bustamante and S.R. McCouch. 2011. Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nat Commun 2:467. DOI: 10.1038/ncomms1467
Zhu J., K.M. Brown and J.P. Lynch. 2010. Root cortical aerenchyma improves the drought tolerance of maize (Zea mays L.). Plant Cell Environ 33:740-9.
Zimmermann M.H. 1983. Xylem structure and the ascent of sap. Springer-Verlag.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 33
Table
1 An
alysis
of va
rianc
e (AN
OVA)
table s
howin
g F an
d P va
lues fo
r the e
ffects
of ge
notyp
e, sub
-popu
lation
, and
replic
ation o
n roo
t ana
tomica
l tra
its in
336 O
. sati
va ac
cessi
ons u
sed in
this stu
dy.
Abbre
viation
De
scrip
tion
Geno
type
Sub-p
opula
tion
Repli
catio
n F
P F
P F
P RX
SA
Root
cross-
secti
on ar
ea, m
m2 16
.003
<0.00
1 11
5.989
<0
.001
0.833
0.4
35
AA
Total
aeren
chym
a area
, mm2
14.89
3 <0
.001
103.6
76
<0.00
1 0.1
60
0.852
MX
V Nu
mber
of me
ta-xyl
em ve
ssels
9.640
<0
.001
139.7
80
<0.00
1 0.6
86
0.504
MX
A Me
dian m
eta-xy
lem ve
ssel a
rea, m
m2 5.9
06
<0.00
1 77
.055
<0.00
1 1.0
60
0.347
Table
2 Su
mmary
of m
ean a
nd st
anda
rd de
viation
(SD)
value
s for
root a
natom
ical tr
aits de
tected
in ea
ch su
b-pop
ulation
. Diffe
rent le
tters
indica
te sig
nifica
nt dif
feren
ces a
mong
sub-p
opula
tions
by th
e Dun
can’s
Multi
ple Ra
nge T
est (D
MRT)
at P<
0.05.
AUS =
aus;
IND =
indica
; TRJ
= tro
pical
japon
ica; T
EJ =
tempe
rate j
apon
ica; A
ROMA
TIC =
aroma
tic; A
DMIX=
admix
ture.
The r
ice di
versity
pane
l con
sists
of 52
aus,
67
indica
, 11 a
romati
c, 76
temp
erate
japon
ica, 8
0 trop
ical ja
ponic
a, an
d 50 a
dmixe
d acc
ession
s.
Varia
bles
AUS
IND
TRJ
TEJ
AROM
ATIC
ADMI
X Me
an
SD
Mean
SD
Me
an
SD
Mean
SD
Me
an
SD
Mean
SD
RX
SA
1.018
0.1
86bc
0.8
38
0.169
d 1.1
57
0.207
a 0.8
96
0.179
cd
1.077
0.3
24ab
1.0
59
0.182
ab
AA
0.407
0.1
01bc
0.3
46
0.089
c 0.5
04
0.104
a 0.3
61
0.120
bc
0.388
0.0
81bc
0.4
29
0.096
b MX
V 6.0
61
0.616
b 5.0
44
0.568
c 6.8
12
1.11a
5.0
46
0.694
c 5.8
03
0.631
b 6.0
23
1.098
b MX
A 0.0
0178
0.0
0048
bc
0.001
39
0.000
35d
0.002
08
0.000
52a
0.001
43
0.000
34d
0.001
53
0.000
37cd
0.0
0185
0.0
0035
ab
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255834
Table
3 S
umma
ry of
signifi
cant
assoc
iation
s be
tween
gen
etic m
arkers
and
root
anato
mical
traits,
listin
g the
asso
ciated
trait,
SNP
nam
e, ch
romoso
me, p
osition
, P va
lue, a
dditiv
e con
tributio
n to t
he ph
enoty
pe, a
nd br
oad-s
ense
herita
bility (
h B2 ).
Trait
SNP N
ame
Chrom
osome
Po
sition
P v
alue
Addit
ive Ef
fect
h B2 Ro
ot cro
ss-se
ction a
rea (m
m2 ) id1
0098
30
1 14
8121
45
1.01E
-05
0.088
0.8
826
Aeren
chym
a area
(mm2 )
id200
7602
2
1943
9265
6.4
4E-05
-0.
031
0.874
1
id200
7562
2
1934
5017
6.5
2E-05
0.0
32
id200
7538
2
1925
7864
8.3
5E-05
0.0
32
id900
2411
9
7873
780
5.79E
-05
0.044
Numb
er of
meta-
xylem
vesse
ls id2
0074
27
2 18
6458
76
9.15E
-05
-0.33
0 0.8
121
id4
0020
13
4 46
8905
7 2.0
8E-06
0.5
45
id400
2031
4
4737
102
6.24E
-05
-0.44
7
id1
0004
371
10
1586
1545
9.7
0E-07
-0.
670
id100
0430
5 10
15
7659
37
2.03E
-05
0.607
id1
2007
213
12
2180
9458
8.6
3E-05
0.2
41
id120
0722
6 12
21
8368
87
8.96E
-05
-0.27
6
Meta-
xylem
vesse
l area
(mm2 )
id501
3826
5
2802
9809
8.6
3E-05
-0.
0002
4 0.7
106
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 35
Fig. 1 Image of rice root cross-section showing aerenchyma lacunae, epidermis, endodermis,
cortex, stele and xylem vessels.
indica tropical japonica aus
Fig. 2 Representative images of root cross-sections showing phenotypic difference in stele root
anatomical triats.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255836
Fig. 3
Gen
ome-w
ide as
sociati
on st
udy o
f root
cross-
section
area
(RXS
A) ac
ross 3
36 O
. sati
va ac
cessi
ons.
Freq
uenc
y distr
ibution
of ro
ot an
atomic
al tra
its ac
ross 3
36 O
. sati
va ac
cessi
ons (
left pa
nel).
Man
hatta
n plots
resul
ting fro
m the
GWA
S resu
lts for
root
anato
mical
traits
(right
pane
l). Th
e red
horizo
ntal lin
e dep
icts th
e sign
ifican
t thres
hold
(P ≤
10-4 ).
The X
axis s
hows
the S
NPs o
n eac
h chro
mosom
e, y a
xis is
the –lo
g 10 (P
-Value
) for
the a
ssocia
tion. Bure
au of
Rice
Res
earch
and D
evelo
pmen
t
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 37
Fig. 4
Gen
ome-w
ide as
sociati
on st
udy o
f aere
nchym
a area
(AA)
acros
s 336
O. s
ativa
acce
ssion
s. Fr
eque
ncy d
istribu
tion of
root
anato
mical
traits
acros
s 336
O. s
ativa
acce
ssion
s (left
pane
l). M
anha
ttan p
lots re
sulting
from
the G
WAS r
esults
for ro
ot an
atomic
al tra
its (rig
ht pa
nel).
The r
ed
horizo
ntal lin
e dep
icts th
e sign
ifican
t thres
hold
(P ≤
10-4 ).
The X
axis s
hows
the S
NPs o
n eac
h chro
mosom
e, y a
xis is
the –l
og10
(P-Va
lue) fo
r the
assoc
iation
.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255838
Fig. 5
Gen
ome-w
ide as
sociati
on st
udy o
f num
ber o
f meta
-xylem
vesse
ls (M
XV) a
cross
336 O
. sati
va ac
cessi
ons.
Freq
uenc
y distr
ibution
of ro
ot an
atomic
al tra
its ac
ross 3
36 O
. sati
va ac
cessi
ons (
left pa
nel).
Man
hatta
n plots
resul
ting fro
m the
GWA
S resu
lts for
root
anato
mical
traits
(right
pane
l). Th
e red
horizo
ntal lin
e dep
icts th
e sign
ifican
t thres
hold
(P ≤
10-4 ).
The X
axis
shows
the S
NPs o
n eac
h chro
mosom
e, y a
xis is
the –
log10
(P-Va
lue) fo
r the a
ssocia
tion.
Bureau
of R
ice R
esea
rch an
d Dev
elopm
ent
กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 39
Fig. 6
Gen
ome-w
ide as
sociati
on st
udy o
f meta
-xylem
vesse
l area
(MXA
) acro
ss 33
6 O. s
ativa
acce
ssion
s. Fr
eque
ncy d
istribu
tion of
root
anato
mical
traits
acros
s 336
O. s
ativa
acce
ssion
s (left
pane
l). M
anha
ttan p
lots re
sulting
from
the G
WAS r
esults
for ro
ot an
atomic
al tra
its (rig
ht pa
nel).
The
red ho
rizonta
l line d
epicts
the s
ignific
ant th
resho
ld (P ≤
10-4 ).
The X
axis s
hows
the S
NPs o
n eac
h chro
mosom
e, y a
xis is
the –lo
g 10 (P
-Value
) for
the a
ssocia
tion. Bure
au of
Rice
Res
earch
and D
evelo
pmen
t
Top Related