SALESE Lucía 1,2; LIGGIERI Constanza S. 1,3; BRUNO Mariela A. 1,2 * - 1. CIPROVE, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP.
Centro asociado a la CICpBA, Argentina. 2. CONICET, Argentina. 3. CICpBA, Argentina. E-mail: [email protected]
© Latitud – Fundación LATU – Av. Italia 6201 – CP 11500 – Tel. (+598) 2601 3724 – Montevideo, Uruguay – www.latitud.org.uy
Empleo de peptidasas
de Bromelia hieronymi Mez
(Bromeliaceae) para la obtención
de hidrolizados de proteínas alimentarias
Adler-Nissen 1979. Determination of the degree of
hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J. Agric. Food Chem.,
27, 1256e1262.
Bradford 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248e254.
Bruno et al. 2010. Milk clotting and proteolytic activity of an enzyme preparation from
Bromelia hieronymi fruits”. Food Sci.Technol., 43, 695e701.
Carmona et al. 2006. A continuous fluorescence resonance energy transfer angiotensin I-
converting enzyme assay. Nature Protocols, 1, 1971e1976.
Peterson 1979. Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry,
Rosebrough, Farr and Randall. Anal. Biochem. 100:201-220.
Re et al. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26:1231-1237.
Serpen et al. 2012. Solvent effects on total antioxidant capacity of foods measured by
direct QUENCHER procedure. J. Food Compos. Anal., 26: 52-57.
Wiles et al. 1997. Routine analysis of proteins by Kjeldahl and Dumas methods: review
and interlaboratory study using dairy products. J. of AOAC Int., 81, 620e632.
Se obtuvo un extracto proteolítico (EC) a
partir de frutos de B. hieronymi, el cual fue parcialmente purificado por precipitación
etanólica, obteniéndose una preparación denominada PER-Bh que recuperó un 91%
de actividad.
El PER-Bh provocó una degradación visible sobre caseína bovina, proteínas de
lactosuero bovino y aislado proteico de soja, monitoreada por tricine-SDS-PAGE.
El mayor grado de hidrólisis obtenido fue de 49 % para el hidrolizado de caseína a
55 ºC.
Todos los hidrolizados presentaron actividad antioxidante neta respecto de sus
controles, siendo los de caseína de 30 min los más elevados con valores de 9,5±0,86
y 10,5±0,06 mg/ml Trólox para 45 y 55 ºC, respectivamente.
La actividad inhibitoria de la ECA fue máxima para el hidrolizado de lactosuero de
45 ºC, inhibiendo un 76,98%.
Se concluye los hidrolizados de caseína y proteínas de lactosuero serían de utilidad
como ingredientes activos para la formulación de alimentos funcionales.
y = -0,872x + 0,7174R² = 0,997
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
A 7
34
nm
Concentración de Trólox (mg/ml)
Curva de calibración de Trólox
0
10
20
30
40
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
rólis
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
CASEÍNA 45 ºC
-2
0
2
4
6
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
róls
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
LACTOSUERO 45 ºC
0
10
20
30
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
rólis
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
SOJA 45 ºC
0
20
40
60
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
rólis
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
CASEÍNA 55 ºC
-5
0
5
10
15
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
rólis
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
LACTOSUERO 55 ºC
0
5
10
15
20
25
0 50 100 150 200
Gra
do
de
hid
rólis
is (
%)
Tiempo de hidrólisis (min)
SOJA 55 ºC
Figura 1. Grado de hidrólisis (4). Hidrolizados de 0-
180 min, de caseína, proteínas de lactosuero y aislado
de soja, a 45 y a 55 ºC
Tabla 2. Actividad inhibitoria de la ECA (7): hidrolizado de lactosuero
de 180’ (LAC 180’). BE: Blanco de enzima. BS: Blanco de sustrato.
Muestra Pendiente % Inhibición
ECA 2,04 0
BE 0,90 55,79
BS 1,84 9,89
LAC 180’ 0,47 76,98
0
2
4
6
8
10
12
BE 0 5 10 30 60 90 180
EQU
IVA
LEN
TES
DE
TRÓ
LOX
(M
G/M
L)
BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)
CASEÍNA
45 ºC 55 ºC
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
BE 0 5 10 30 60 90 180
EQU
IVA
LEN
TES
DE
TRÓ
LOX
(M
G/M
L)
BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)
LACTOSUERO
45 ºC 55 ºC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
BE 0 5 10 30 60 90 180
EQU
IVA
LEN
TES
DE
TRÓ
LOX
(M
G/M
L)
BE (BLANCO DE ENZIMA), HIDROLIZADOS (0-180 MIN)
SOJA
45 ºC 55 ºC
Figura 3.a. Actividad antioxidante (6). Las barras horizontales corresponden a ±DS.
Figura 3.b. Curva de calibración.
Antioxidante de referencia: Trólox.
Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae) es una especie nativa de Argentina que posee elevadas cantidades de proteasas
cisteínicas. Estas enzimas pueden ser empleadas para la obtención péptidos bioactivos a partir de proteínas alimentarias. El
objetivo del presente trabajo fue obtener un extracto enzimático a partir de frutos inmaduros de dicha especie, emplearlo en la producción de hidrolizados de proteínas
alimentarias y evaluar la presencia de actividades biológicas en los mismos.
Frutos inmaduros de
Bromelia hieronymi Mez
Bromeliaceae
Obtención del
extracto crudo (EC):
0,4 mg fruto/mL buffer
Precipitado etanólico
redisuelto (PER)
Preparación de los sustratos
proteicos
Aislado de soja (5,545 mg/mL).
Caseína bovina (9,104 mg/mL ,
Sigma)
Proteínas de lactosuero bovino
(7,96 mg/mL)
Hidrólisis de proteínas alimentarias
Condiciones de hidrólisis:
Proporción enzima:sustrato: 1:9
Temperaturas: 45 y 55 ºC
Agitación: 200 rpm
Tiempo de reacción: 0-180 min
Detención de las hidrólisis: shock
térmico (100 ºC, 10 min)
Controles: BS (tiempo cero de
hidrólisis); BE (control sólo con enzima).
Caracterización de los hidrolizados
4. Grado de hidrólisis (TNBS, Adler Nissen, 1979; Figura 1)
5. Tricine-SDS PAGE (Bruno et al., 2010; Figura 2)
6. Actividad antioxidante: método “quencher” empleando
ABTS (Serpen et al., 2012; Figura 3, a y b)
7. Actividad inhibitoria de la ECA (Carmona et al., 2006;
Tabla 2).
Caracterización de los extractos: EC y PER
(Tabla 1)
1. Actividad caseinolítica (Bruno et al., 2010)
2. Proteínas (Bradford, 1976)
3. Actividad antioxidante: método del ABTS
(Re et al., 1999)
Determinación de la concentración
proteica en hidrolizados
Método de Lowry (Peterson, 1979)
Método de Kjeldahl (Wiles et al.,
1997)
Muestra
Actividad
enzimática (Ucas/mL)
Proteínas (mg/mL)
Actvidad
antioxidante (mg/mL Trólox)
EC 16,46 ± 0,26 2,03 ± 0,07 3,32 ± 0,02
PER 13,63 ± 0,28 1,84 ± 0,53 0,56 ± 0,02
Tabla 1. Caracterización de los extractos: EC y PER (1, 2, 3)
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625 0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR
CASEÍNA 45 ºC
0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR
CASEÍNA 55 ºC
0’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP
SOJA 45 ºC
5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR
SOJA 55 ºC
0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’MPLR
LACTOSUERO 45 ºC
0’ 5’ 10’ 30’ 90’60’ 180’ MP LR
LACTOSUERO 55 ºC
Figura 2. Tricine-SDS PAGE (5). Hidrolizados de caseína, soja y lactosuero de 45 y 55 ºC.
Tiempos de hidrólisis: 0-180’. Patrones de peso molecular: multipeptídico (MP) y “Low Range” (LR).
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
3,496
6,512
14,437
16,950
26,625
Top Related