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El dioxido de carbono supercritico (SCCO2), Co2 por encima este de su temperatura y presión
critica (), a sido usado para la extracción, cromatografía y como solvente para catálisis química
debido a que este es amigable con la naturaleza, inflamables, baja toxicidad y alta disponibilidad.
La capacidad para manipular las porpiedades físicas del solvente por el cambio simple de presión y
temperatura es único en sistemas supercriticos. La catálisis enzimática se ha conducido en SCCO2,
en lugar de en los medios convencionales para hacer las reacciones enzimáticas más ecológicos. El
uso de enzimas en solventes orgánicos a incrementado recientemente como intento de los
químicos para amplicar las aplicaciones de la biocatalisis.
Muchos sustratos asi como muchos productos de reacciones, tienen baja solubilidad en agua
haciendo las reacciones biocataliticas en fase acuosa difíciles para emplear. Pero usando enzimas
en solventes no acuosos esto hace posible superar la barrera, pero su uso en solventes organicos
esta limitado por la actividad catalítica relativamente baja en comparación con reacciones en
agua. Por lo tanto, además de la investigación en curso en sistemas libres de solventes, la síntesis
en fluidos supercriticos (SCF), puede ser potencialmente preferida como nueva alternativa para
reacciones catalizadas con enzimas. Las enzimas empleadas en mas trabajos donde participanfluidos supercriticos mas específicamente, dióxido de carbono, son lipasas. Las lipasas son mas
bien enzimas estables que pueden convertir un rango general de sustratos en particular en
hidrólisis y reacciones de esterificación.
Metodologia de superficie de respuesta es una colleccion de técnicas estadísticas y matematicas,
utiles para el desarrollo la mejora y optimización de procesos. Asi medir el desempeño o las
características de calidad se llama la respuesta. Las variables de entrada son algunas veces
llamadas variables independiente, y y son sujetas al control por científicos e ingenieros. El campo
de la metodología de superficie de respuesta consiste en la estrategia experimental para explorar
el espacio de el proceso o variables independientes, modelos estadísticos empíricos paradesarrollar una relación adecuada entre la aproximación los métodos de producción y las variables
de proceso y optimización de encontrar los valores de las variables del proceso que producen
deseable los valores de la respuesta [5]. La identificación y adaptación de experimentación los
datos de un modelo de superficie de respuesta apropiadas requiere un poco de uso de los
fundamentos estadísticos del diseño experimental, un modelo de regresión técnicas y métodos de
optimización. Los tres de estos temas generalmente se combinan en RSM.
Los primeros informes sobre la enzima reacciones catalizadas en SCCO2 se en 1985 por Randolph
et al., Hammond et al. y Nakamura et al. [25]. La ventaja de usar SCF para las reacciones
enzimáticas se ha demostrado por Mori et al. [6] y Kamat et al. [7], por ejemplo, mejorado
velocidad de reacción, el control de selectividad por las presiones, etc [1]. Las enzimas son capaces
de catalizar las reacciones diferentes en un enantioselectiva manera. Enantioselectividad es una
propiedad muy útil de enzimáticas acción, lo que permite la producción de sustancias
enantiopuro. Lo Se ha demostrado que las enzimas muchas veces se ven fuertemente afectados
por la elección del solvente [8]. Los disolventes pueden modificar la conformación de la enzima y
por lo tanto alterar su eficiencia catalítica o especificidad que puede aumentar la regio-y
enantioselectividades de reacciones.
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El efecto biológico de los compuestos quirales es dependiente de una de los enantiómeros, por lo
que es importante producir en enantioméricamente forma pura. Debido a su capacidad para
catalizar reacciones, en lo orgánico como así como en sistemas acuosos, lipasas conducen a la
síntesis enantioselectiva de la amplia variedad de compuestos [9]. Quiral?-Hidroxi cetonas
especialmente benzoins son importantes en muchas unidades estructurales biológicamente
compuestos activos y se trata de bloques de construcción versátil en síntesis asimétrica [10]. Es
importante para obtener enantiopuros benjuí de racémica benzoil-benjuí. Para ello, la enzima,
temperatura y la presión effectswere estudiado para la síntesis de benjuí en SCCO2 y después de
90 minutos, la conversión del 50% con un enantiómero más de 62% fueron realizadas por Candida
cylindracea (CCL) en nuestro estudio anterior [11]. Este es el primer estudio para obtener las
condiciones óptimas para exceso enantiomérico máximo de benjuí en SCCO2 los medios de
comunicación con RSM. Con el fin de aumentar en exceso enantiomérico, DMAP (4 -
dimetilaminopiridina) y trietilamina a la reacción mezcla en condiciones óptimas.
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2. Materiales y métodos
C. cylindracea lipasa fue adquirido de Fluka. otros productos químicos se obtuvieron de Merck. La
hidrólisis enantioselectiva de benzoil-benjuí se llevó a cabo en el reactor supercrítico de lotes de
líquidos. Esquema del reactor SCCO2 se muestra en la fig. 1. Se compone de reactor con un
volumen interno de 10 ml, 690 bar de presión máxima y 150 ◦ C de temperatura máxima, regulada
por un termostato. 30 mg benzoyl-benzoin, el benjuí y el enzima se disolvieron 30 mg en 2 ml de
DMSO (dimetilsulfóxido) y 8 ml de fosfato de potasio (pH 50 mM, 7), respectivamente, luego se
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mezcla y poner en el 10 ml de SCF del reactor y se ajustó el pH mediante la adición de HCl y NaOH
soluciones. Se wasmeasured antes de comenzar el experimento, y también medida
aftercompleting el experimento. Progreso de la reacción Se vigilancia followedby cuidado con
TLCanalysisupto50% de conversión [11]. Al final de la reacción de la mezcla se extrajo con acetato
de etilo para separar el benjuí y el benjuí de benzoilo. Actividad de la enzima de C. cylindraceawas
probado a diferentes temperaturas (35-45 ◦ C) a 90 bar y 90 minutos el tiempo de incubación en
SCCO2. Se midió la actividad mediante el empleo de ácido oleico y esterificación oleil alcohol con
la titulación. Los experimentos se llevaron a cabo con enzima / sustrato (w / w): 1,5% y ácido /
alcohol relación molar de 1.33 / 1 a 50 ◦ C. La velocidad del agitador fue de 200 rpm. En las
condiciones dadas oleil alcohol, ácido oleico y cylindracea C. se mezclaron y después de 90
minutos de la muestra fue tomada de la mezcla de reacción y se titula con NaOH 0,1 N [11].
Exceso enantiomérico de benjuí se determinó mediante análisis por HPLC. La columna se aplica a
partir de las industrias Daicel tipo CHIRALCEL OD (0.46cm x 25 cm). Los compuestos fueron
detectados con UVdetector a 254 nm. El columnwas funcionar a roomtemperature. La fase móvil
fue n-hexane/2-propanol (9:1, v / v). Caudal se establece en 0,8 ml / min y el volumen de inyecciónfue de 10? L. DMAP y trietilamina son los peligrosos y comercialmente aditivos disponibles que se
utilizan para aumentar la resolución cinética [12]. Efecto de las bases (DMAP y trietilamina) fue
investigado por la adición de 5 mg de DMAP y trietilamina 1 ml de mezcla de reacción a
condiciones óptimas [11].
3. Diseño experimental y optimización de RSM
RSM consiste en un grupo de técnicas empíricas dedicadas a la evaluación de las relaciones
existentes entre un grupo de control factores experimentales y las respuestas medidas de acuerdo
a uno más criterios [13,14]. RSM utiliza un diseño experimental como como el diseño centralcompuesto para ajustar un modelo de mínimos cuadrados la técnica. Si el modelo propuesto es el
adecuado, según lo revelado por la la comprobación de diagnóstico proporcionado por un análisis
de varianza (ANOVA) y los gráficos de residuos, gráficos de contorno no puede ser utilizada para
estudiar la respuesta y encontrar el óptimo. Como la temperatura conocida, presión y pH son
parámetros importantes para la síntesis de compuestos químicos en el medio SCCO2
[15-19]. Los efectos de tres variables (T, P y pH) en el enantiómero el exceso de benjuí en SCCO2
fueron estudiados mediante el uso de RSM. El diseño experimental más comunes utilizados en
RSM es el centro de compuesta de diseño (CCD), que tiene previsibilidad igual en todos los
direcciones desde el centro [20]. De acuerdo con la central compuesto diseño, el número total decombinaciones es 2k 2 + k n0, donde k es el número de variables independientes y n0 el número
de repeticiones de los experimentos en el punto central [21]. El alcance y la los niveles de las
variables investigadas en este estudio se presentan en la Tabla 1. Sobre la base de los
experimentos preliminares de los valores de temperatura, la presión y el pH se define teniendo en
cuenta la degradación de la enzima con la temperatura y el pH y las enzimas cambiar
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4. Resultados y discusión
4.1. El diseño experimental con RSM
Sobre la base de los experimentos preliminares, el efecto de
la temperatura,
la presión y el pH en exceso enantiomérico de benjuí seEstudió con RSM y la aplicación de RSM arrojaron los
siguientes ecuación de regresión, que es una relación
empírica entre los valores de exceso enantiomérico de
las variables de la prueba de benjuí codificada unidad. La
siguiente es la ecuación polinómica de segundo orden
que muestra la superficie de respuesta instalado:
donde Y es la respuesta, es decir, exceso enantiomérico de
benjuí,
y x1, x2 y x3 se codifican los valores de la temperatura de la
prueba los valores,
presión y pH, respectivamente.
Un resumen del análisis de varianza se presentan en la Tabla
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3. El análisis de varianza de modelo de regresión cuadrática
demuestra que el modelo es Altamente significativa como se
desprende de Fisher F-prueba de valor que con un 28,36
Baja probabilidad probability valor (Pmodel> F <0,0001). Esteresultado indica que es estadísticamente significativa en el
nivel de confianza del 99,999%. la bondaddel ajuste del
modelo se verificó mediante el coeficiente de determinación
(R2) [22]. En este caso, el valor del coeficiente de
determinación (R2 = 0,9623) indica que sólo 3.77% no
synthes is was de benjuí explicada por el modelo. El valor del
coeficiente de determinación ajustado
R2 adj (0,9284) también es alta para abogar por los
significados de alta del modelo. Falta de ajuste es la variación
de los datos alrededor de una cocina equipada modelo [20].
La falta de ajuste F-valor de 0,99 implica la falta de ajuste es
no significativo en relación con el error puro.
El significado de cada coeficiente se determinó por valor de F
y P-(problemas) valor (Tabla 3). Los valores de "Prob> F" a
menos de 0,0500 indican que los términos del modelo son
significativas. Correspondientes valores de p sugieren que,
entre las variables de prueba utilizados en este estudio, x2
(presión),
x3 (pH), x2
1 (temperatura) 2, x2
2 (presión) 2 y x2
3 (pH) 2 son
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términos significativos del modelo con los valores de p
inferiores a 0,05. pH, plazas de la temperatura, la presión de
las plazas y las plazas de pH tiene la mayor efecto en exceso
enantiomérico de benjuí. Otras interacciones se encuentranpara ser insignificante.
El coeficiente de determinación (R2) del modelo fue 0,9623,
lo que indica que el modelo de una representación adecuada
de las relaciones entre los parámetros seleccionados. Los
resultados del análisis mostraron que los valores
experimentales fueron significativamente de acuerdo con los
valores previstos y también sugirió que el modelo de laecuación. (4) fue satisfactoria y precisa (Fig. 2).
Las parcelas del modelo de segundo grado con una variable
mantiene en constante nivel y las otras dos variables con los
rangos experimentales se shownin Figs. 3-5.Symmetrical
forma indica que una there was interacción significativa entre
los parámetros (P, T y pH; Figuras 3-5)..
Fig. 3 representa la interacción entre la presión y la
temperatura. El exceso enantiomérico mayor al aumentar la
presión de 70 bar a 80 bar y temperaturas desde 35 hasta 40
◦ C. El máximo ee se obtuvo un 60%. A temperatura y presión
constante aumento provoca un cambio en la conformación de
la enzima. Es posible mencionar que SCCO2 presión
afectaría a la estructura de la enzima, el cambio de su
actividad específica. Las interacciones entre Las moléculas
de CO2 y la enzima, cerca de la región crítica, se
incrementan y habilitada para estimular cambios en la
conformación de la enzima. Como resultado de esta
interacción los sitios activos de la enzima aparecen y catalizar
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la síntesis enantioselectiva de benjuí a cierta presión.
A altas presiones enantioselectividad disminuye debido a la
formación de los carbamatos que nos lleva a la inactivación
de los enzima [17,23]. En la literatura se han obtenidoresultados similares. Presión podría inducir a la modificación
de la estructura y función de las partículas de la enzima que
conduce a un cambio en la actividad de la enzima, aunque el
papel de las moléculas SCCO2 durante el paso de catalizador
aún no está bien entendido. Ikushima et al. [23] informó sobre
el posible efecto de las moléculas de CO2 en la actividad de
la lipasa. Los investigadores estudiaron estructuras
secundarias
de una enzima en SCCO2 y las interacciones que operan
entre
de dióxido de carbono y moléculas de la enzima. Se encontró
que SCCO2
medio en la región crítica próximo, debe ser un disparador
para la activación
de la enzima que causa el movimiento de los grupos de lasuperficie
y la creación de un sitio activo, produciendo
una maquinaria estereoselectiva.
De una manera correspondiente, los otros autores señaló
que enantioselectividad
dependía de la presión en la hidrólisis enzimática
la 3-hidroxi-5-fenil-4-pentenoicacidethylester [17]. enantioselectividad
aumento de la presión y en el 103 el valor máximo de barras
se alcanzó. Después de la enantioselectividad se redujo con
de presión. Ellos pensaban que por encima de 103 bar la
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enantioselectividad
lo que indica una disminución de la inactivación directa de la
enzima por la formación
de los carbamatos. Formación de carbamatos lleva a lainactivación de la enzima. Estos efectos predominó una
presión superior a 103 bar.
Del mismo modo, la esterificación de alcohol por
trifluorometilo lipasewas
examinado [1] y se encontró que el 55 ◦ C,
enantioselectividad
disminuye cuando la presión (8-19MPa)
aumentó. Propusieron
que el gran cambio en la densidad podría cambiar
significativamente la interacción
de CO2 y la enzima, provocando la formación de los
carbamatos de
de dióxido de carbono y los grupos amino libres en la
superficie de la enzima.
Estas interacciones pueden cambiar la conformación de laenzima en
respuesta a la presión.
Ikushima et al. [23] utiliza la transformada de Fourier infrarroja
(FTIR)
espectroscopia de supervisar la conformación de la enzima
durante SCCO2
esterificación. En un rango limitado de presión de 7,7 8.5MPa,dramática
cambios en la C. cylindracea lipasa ocurrido para aumentar la
velocidad de las reacciones de esterificación. El rango de
presión en la que el
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enzima cataliza la producción de compuestos ópticamente
activos
coincidió con el rango de presión en la que el repentino
conformacionallos cambios se llevó a cabo [23]. En la esterificación del ácido
n-valérico
y citronelol en SCCO2, Ikushima [24] observó un fuerte
aumento
en la velocidad de reacción a presiones cercanas a la región
crítica de CO2.
En la figura. 4, los efectos de la temperatura y el pH en
enantiomérica
el exceso se muestra. A valores de pH bajos (hasta pH 7)
enantiomérica
el exceso de aumento de hasta 40 ◦ C, luego disminuyó
debido a la inactivación
de la enzima en función de la temperatura. La actividad
enzimática se
determina como 0,044, 0,0398 y 0,038 mol de éster / g deenzimas para la 35,
40 y 45 ◦ C, respectivamente, a 90 bar.
La disminución de exceso enantiomérico por la temperatura
también puede
atributo de densidad decreciente por la temperatura a presión
constante.
Disminución de la densidad de los resultados de bajainteracción entre el CO2
y la enzima. En particular, en condiciones supercríticas, las
pequeñas variaciones
en el resultado de la presión en los valores de alta densidad
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y, en consecuencia
es posible en gran medida varían todos los dependientes de
la densidad de otras propiedades.
Este comportamiento también está bien documentada poralgunos autores
[3]. El aumento de la densidad también provoca un aumento
en supercríticos
poder disolvente en fase y, en consecuencia, hay una mayor
interacción
entre la enzima y el CO2.
Fig. 5 representa el efecto del pH y la presión sobre los
enantiómeros
el exceso de benjuí. Exceso enantiomérico pasado por
amaximum
y luego disminuyó al aumentar la presión. A pH 7 y
80 bares de presión llevó al exceso enantiomérico máximo.
Los valores óptimos de las variables mediante la resolución
de la ecuación. (4) conel experto en diseño de software se obtuvieron a
40 ◦ C, 78,9 bar y
pH 6,4 al 62% (R-benjuí). Con el fin de verificar este
resultado, la síntesis
de benjuí en SCCO2 se llevó a cabo en condiciones óptimas,
el 63%
(R-benjuí) de enantiómeros valuewas exceso obtenido
experimentalmente
de acuerdo con la predicción del modelo.
En condiciones óptimas (a 40 ◦ C, 78,9 bar y pH 6,4), la
efectos de las bases añadido al medio de
reacción como DMAP (4 -
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dimetilaminopiridina) y trietilamina en exceso enantiomérico
fueron investigados. La adición
de DMAP considerablemente mejorada
el exceso enantiomérico (80% S-benjuí), mientrasque trietilamina había
efecto negativo en ee. Es interesante
que DMAP cambiado también el
steroselectivity como S-benjuí.
5. conclusiones
RSM éxito podría optimizar las condiciones de reacción para
maximizar el exceso enantiomérico de benjuí. Las
condiciones óptimas
fueron 40 ◦ C, 78,9 bar y pH 6,4, el más alto enantiomérica
exceso de benzoinwas 62% (R-benjuí). En las condiciones
óptimas
DMAP fue añadido al medio de reacción y el exceso
enantiomérico
alcanzó el 80% (S-benjuí). Este estudio es el
compromiso de seguirLos estudios con otros hidroxi-cetonas en medio de
reacción SCCO2.
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