Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. Georg Ertl
Einfluss von Monozyten auf Heilungsvorgänge und kardiale Thromboembolien nach einem
Myokardinfarkt
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Tobias Bobinger
aus Erlangen
Würzburg, Februar 2012
Referent: Prof. Dr. med. S. Frantz
Koreferent: Prof. Dr. med. C. Kleinschnitz Dekan: Prof. Dr. med. M. Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 13.06.2012 Der Promovend ist Arzt.
Meinen Eltern
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extrazellulären Matrix (Porter and Turner 2009). Sie sind damit zudem
mitverantwortlich für die Aufrechterhaltung der Architektur der Herzens.
Angiotensin II, TGF-β (transforming growth factor β) und Aldosteron wirken
aktivierend auf Fibroblasten und können somit eine erhöhte Kollagenproduktion
mit nachfolgend entstehender Fibrose auslösen. Bestehende
Kollagenstrukturen können aber auch durch Metalloproteinasen (MMP)
aufgebrochen werden (Opie, Commerford et al. 2006). Diese können in mehr
als 25 verschiedene Typen eingeteilt werden, die jeweils spezifisch für
bestimmte Substrate der Matrix arbeiten (Lambert, Lopez et al. 2008). Zudem
sind diese Metalloproteinasen auch fähig, Zytokine, Chemokine oder
Wachstumsfaktoren in ihrer biologischen Aktivität zu beeinflussen
(Dobaczewski, Gonzalez-Quesada et al. 2009). Produziert werden sie entweder
durch Zellen im Myokard wie Myozyten, Fibroblasten und Endothelzellen oder
durch eingewanderte Zellen wie Makrophagen und neutrophile Granulozyten
(Lindsey 2004). In einer Studie von McGavigan et al. werden nach einem
Herzinfarkt im Serum die Marker für Kollagenauf- und abbau bestimmt. Dabei
zeigt sich ein Verlust von 25% des Kollagens innerhalb der ersten 24 Stunden
nach dem Infarkt. Zudem konnte eine direkte Korrelation zwischen dem initalen
Abbau und den in der Echokardiographie sichtbaren Umbauvorgängen gezogen
werden (McGavigan, Maxwell et al. 2006). Bei den Makrophagen spielt
insbesondere das MMP-9 bei den Umbauvorgängen die größte Rolle. MMP-9
ist unter anderem für die Denaturierung von Gelatin zuständig (Nagase, Visse
et al. 2006). Die Auswirkungen durch MMP-9 nach einem Infarkt kann durch
eine Studie an MMP-9-Knockout-Mäusen demonstriert werden. Hierbei zeigt
sich neben einer geringeren Kollagenakkumulation eine deutlich geringere
Dilatation des linken Ventrikels (Ducharme, Frantz et al. 2000). Zusätzlich wird
auch die Rolle bei der Neubildung von Gefäßen sichtbar, bei der sich jedoch
Unterschiede zwischen Skelett- und Herzmuskel zeigen. Im Skelettmuskel
kommt es nach einer Ischämie beim Wildtyp zu einer Verdopplung der
Kapillardichte, während in MMP-9 Knockout-Mäusen keine Veränderung auftritt
(Johnson, Sung et al. 2004). Im Herzmuskel dagegen führt eine Ausschaltung
von MMP-9 bei Knockout-Mäusen zu einer besseren Neovaskularisation nach
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dem Infarkt (Lindsey, Escobar et al. 2006). Diese Studien lassen MMP-9 als
interessanten Ansatzpunkt erscheinen, doch ist derzeit kein spezifischer MMP-
Inhibitor verfügbar (Lambert, Lopez et al. 2008). Neben
Matrixmetalloproteinasen schütten Makrophagen auch noch eine Reihe anderer
Wachstumsfaktoren und Zytokine aus, die einen fördernden Einfluss auf das
Gefäßwachstum haben. Darunter befinden sich zum Beispiel Thrombospondin-
1, Interferon α, IL-1 (Interleukin-1), TNFα (tumor necrosis factor α) und TGFβ
(transforming growth factor β) (Lambert, Lopez et al. 2008).
In den letzten Jahren hat sich somit deutlich gezeigt, dass die Monozyten eine
Vielzahl von Aufgaben besitzen und gleichzeitig über die Ausschüttung von
Zytokinen und Wachstumsfaktoren in viele Vorgänge bei der Wundheilung
eingreifen. Ihre genaue Aufgabe beim Herzinfarkt ist bis jetzt noch in großen
Teilen unverstanden und bietet dennoch aufgrund des Aufgabenspektrums der
Monozyten eine große Chance, regulierend in die Heilungsvorgänge
einzugreifen und Patienten mit Herzinfarkt bessere Langzeitchancen zu
ermöglichen. An einem Cryomodell durch van Amerongen et al. können schon
die Auswirkungen einer Makrophagendepletion nach einem Infarkt demonstriert
werden. Es kommt neben einer unvollständigen Abräumung der abgestorbenen
Zellen und geringeren Kollagenproduktion auch zu einer deutlich gesteigerten
Mortalität und stärkeren linksventrikulären Umbauvorgängen (van Amerongen,
Harmsen et al. 2007). Allerdings handelt es sich bei dieser Studie um ein
Cryomodell, der Infarkt wird also epikardial und durch eine Vereisung bei -
196°C erzeugt. Diese Vorgänge entsprechen nicht den Vorgängen bei einem
echten Herzinfarkt, der durch einen Verschluss der Koronararterie entsteht.
Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass sich die Vorgänge in
wichtigen Teilen unterscheiden.
In dieser Arbeit wird versucht, die Rolle von Monozyten in Bezug auf
Heilungsvorgänge und, wie sich in den Versuchen zeigt, entwickelnde
Thromboembolien nach einem Myokardinfarkt näher aufzuklären. An den
Mäusen wird durch eine Ligatur ein Infarkt erzeugt. In bestimmten
Zeitabständen zu der Operation erhalten die Mäuse retrobulbär eine Injektion
von Clodronat in der Behandlungsgruppe oder PBS-Lösung in der
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Kontrollgruppe. Clodronat wird in Kombination mit einem Liposom von den
Monozyten aufgenommen. Intrazellulär kommt es nach Zerstörung der
liposomalen Membranen durch Lysosomen zur Freisetzung und Akkumulation
von Clodronat. Auf diese Weise erfolgt eine spezifische Elimination der
Monozyten. Ein Vergleich zwischen der Clodronat-behandelten Gruppe und der
Kontroll-Gruppe zeigt Unterschiede auf, die somit auf Monozyten
zurückzuführen sind.
2. Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
Für die Experimente werden C57BL/60laHsd Mäuse von Harlan-Winkelmann
(Borchen, Deutschland) verwendet. Die Tiere sind weiblich und zum
Versuchszeitpunkt etwa 8-9 Wochen alt. Zum Zeitpunkt der Organentnahme
beträgt das Gewicht der Tiere etwa 19 – 28 g. Während der gesamten
Versuchszeit werden sie tiergerecht nach geltenden Vorschriften versorgt.
Zudem liegt eine behördliche Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche
vor.
2.2 Operation
Um einen Myokardinfarkt zu induzieren, wird in einer Operation die linke
vordere absteigende Koronararterie ligiert (Michael, Entman et al. 1995;
Kumar, Hacker et al. 2005). Im ersten Schritt werden die Tiere in einen Glastopf
gesetzt, der mit Diethylether (Honeywell Speciality Chemicals Seelze GmbH,
Seelze, Deutschland) gefüllt ist und auf diese Weise narkotisiert. Für die
Atemwegssicherung erfolgt eine Intubation der Tiere, für die eine
handelsübliche Venenverweilkanüle (BD VenflonTM Pro, Becton Dickinson,
Heidelberg, Deutschland) des Menschen verwendet wird. Die Versorgung mit
Sauerstoff erfolgt über diese Kanüle mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgerätes
(MouseVentilator, UGO Basile biological research apparatus, Comerio, Italien).
Zudem werden die Extremitäten der Maus in Rückenlage mit Klebestreifen
fixiert. In der Operationsplatte ist zur Verhinderung der Auskühlung ein Heizteil
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integriert. Für die Inhalationsnarkose wird 0,8% Isofluran (Sigma Aldrich
Chemie GmbH, München, Deutschland) und 100%iger Sauerstoff verwendet.
Im nächsten Schritt werden noch Elektroden angebracht und ein
Elektrokardiogramm (cardiofax GEM, Nihon Kohden, Rosbach, Deutschland)
präoperativ abgeleitet. Für die Durchführung der Operation wird Besteck von
der Firma Aesculap (Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Deutschland)
verwendet. Als erster Schritt erfolgt ein Hautschnitt auf Höhe des mittleren bis
unteren Thoraxdrittels etwa auf Höhe des 4. Interkostalraumes. Nun werden der
Musculus cutaneus trunci und die Musculi serratus dorsales und ventrales
durchtrennt. Nach Absetzen des Musculus pectoralis profundus im 4. ICR wird
der Thorax eröffnet. Zum Offenhalten des Thorax wird ein modifizierter
Rippenspreizer verwendet. Auftretende Blutungen werden entweder mit einem
Mikrokoagulator oder einem Tupfer gestillt. Nach der Eröffnung erkennt man
nun das Perikard, welches nun direkt vom Herzen abgesetzt und ein Stück
davon entfernt wird. Aus Erfahrungswerten kann die Arteria coronaria sinistra
nun besser dargestellt werden, wenn zuerst unter das linke Herzohr ein kleiner
Tupfer gelegt wird. Zunächst wird die Arteria coronaria sinistra 1mm apikal des
linken Vorhofes umstochen und darauf mit einem chirurgischen Nahtmaterial
(Vicryl, Ethicon GmbH, Norderstedt, Deutschland) abgebunden. An dem
abgeleiteten Elektrokardiogramm lässt sich nun erkennen, ob durch die Ligation
eine Ischämie eingetreten ist. Nun werden die Muskelschichten und die Faszie
wieder adaptiert und die Haut mit Klammern verschlossen. Bis zum Einsetzen
der Spontanatmung wird die Maus noch unter eine Wärmelampe gelegt.
Während dieser Zeit wird 100% reiner Sauerstoff über die eingeführte
Venenverweilkanüle zugeführt. Die postoperative Schmerztherapie erfolgt über
eine Injektion mit Buprenorphin (Temgesic®, Essex Pharma, München,
Deutschland) mit einer Dosierung von 0,1mg/kg Körpergewicht. Nach dem
Erwachen werden die Mäuse wieder in den Käfig zurückgelegt.
2.3 Makrophagendepletion über die retrobulbäre Inje ktion mit Clodronat
Die Ausschaltung von Makrophagen wird über in Liposomen verpacktes
Clodronat (Cl2MDP) durchgeführt. Dies ist eine gängige Methode und wird
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bereits seit längerem für viele Fragestellungen in Bezug auf die
Makrophagenfunktion durchgeführt (van Rooijen and Sanders 1997).
Als Trägersubstanz für das Clodronat werden Liposomen benötigt. Die
Lipidmoleküle in den Liposomen bestehen aus hydrophilen und hydrophoben
Anteilen. Um den Kontakt zwischen hydrophoben Anteilen und Wasser zu
vermeiden, ordnen sie sich in einer kugelförmigen Doppelschicht um das
wässrige Kompartiment an. Somit stehen im kugeligen Liposom die hydrophilen
Anteile nach außen und die hydrophoben Anteile nach innen. Werden bei der
Herstellung andere hydrophile Moleküle wie etwa auch Clodronat mit aufgelöst,
werden diese Moleküle bei der Bildung der Liposomen mit aufgenommen.
Clodronat stammt aus der Gruppe der Bisphosphonate und wurde
hauptsächlich für die Behandlung von osteolytischen Knochenkrankheiten
entwickelt. Da Clodronat eine hohe Affinität zu Calcium zeigt, reichert es sich im
Knochen an und scheint dort eine direkte Auswirkung auf Osteoklasten zu
besitzen. Diese Zellen sind ebenfalls wie die Makrophagen Bestandteile des
monozytären Phagozytosesystems (van Rooijen and Hendrikx 2010). Die
Liposomen werden von den Makrophagen in Kombination mit dem Clodronat
via Endozytose aufgenommen. Nach Fusion mit den Lysosomen im
Makrophagen erfolgt eine Aktivierung der Phospholipasen und es kommt durch
diese Enzyme zu einer Zerstörung der Phospholipidschicht mit anschließender
Freisetzung des Clodronats in die Zelle (Van Rooijen and Sanders 1994). Da
die Wand dieser Zelle ebenfalls aus einer Phospholipid-Doppelschicht besteht,
kommt es im Folgenden zu einer Akkumulation von Clodronat (van Rooijen and
Hendrikx 2010). Ab einer bestimmten Menge dieser Substanz wird in den
Makrophagen der apoptotische Zelltod eingeleitet (Naito, Nagai et al. 1996; van
Rooijen, Sanders et al. 1996). Zudem besitzt Clodronat nur eine sehr kurze
Halbwertszeit sowohl in der Zirkulation als auch in Körperflüssigkeiten und
somit werden keine anderen Zellen in ihrer Funktion beeinträchtigt (van Rooijen
and Sanders 1997). Der Erfolg dieser Methode bei der Makrophagendepletion
wurde in vielen Studien bewiesen, an der Milz sowohl immunhistochemisch
(van Rooijen and van Nieuwmegen 1984) als auch elektronenmikroskopisch
(van Rooijen, van Nieuwmegen et al. 1985). Aus diesen Gründen scheint die
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Kombination aus Liposomen und Clodronat eine ideales Werkzeug, um die
Funktion der Makrophagen näher zu untersuchen.
Die Herstellung der Lösung erfolgt in dem Labor von Prof. van Rooijen in
Amsterdam. Die einzelnen Schritte werden in zahlreichen Veröffentlichungen
verdeutlicht (Van Rooijen and Sanders 1994). Die gelieferte Clodronatlösung
enthält 5mg Cl2MDP pro ml. In einigen Studien wird gezeigt, dass bei Mäusen
die Dosis von 0,1ml pro Injektion die größte Effektivität bezüglich der Apoptose
von Makrophagen besitzt (Van Rooijen and Sanders 1994). Diese
Injektionsmenge wird deshalb auch bei dieser Versuchsreihe verwendet.
Für diese Studie werden sowohl die Clodronat-Liposom- als auch die PBS-
Lösung (Liposom und Salzlösung gepuffert mit Phosphat) von dem Labor van
Rooijen (Amsterdam, Niederlande) bezogen. Es werden verschiedene
Behandlungsgruppen gebildet. Die Kontrollgruppe der Mäuse erhält eine PBS-
Liposomen-Injektion, die Behandlungsgruppe eine Clodronat-Liposomen-
Injektion. Für die Clodronat-Liposomen-Injektion werden zwei verschiedene
Zeitpunkte getestet. Eine Gruppe wird 2 Tage vor der Operation, am Tag der
Operation, am zweiten sowie vierten Tag nach der Operation behandelt. Die
zweite Versuchsgruppe wird nur am fünften, siebten und neunten Tag nach der
OP behandelt. Die Injektion der Clodronat- oder PBS-Lösung erfolgt in den
retrobulbären Venenplexus.
2.4 Echokardiographie
Am Tag 1, 7 und 28 nach der Operation wird bei allen Tieren eine
Echokardiographieuntersuchung durchgeführt (Tanaka, Dalton et al. 1996). Ob
es sich um die Kontroll- oder Behandlungsgruppe handelt, ist dem Untersucher
nicht bekannt. Vor der Untersuchung werden die Tiere mit einem
Inhalationsgemisch aus 0,8%igem-Isofluran und 100%igem-Sauerstoff
narkotisiert und in Rückenlage mit einem Klebeband festgeklebt. Nun können
sie im Thoraxbereich rasiert und Elektroden für die Ableitung eines EKGs
angelegt werden. Sämtliche Untersuchungen werden an einem Maus-
Echokardiographie-Gerät (Toshiba Aplio Typ SSA-700A, Toshiba Medical
Systems GmbH, Neuss, Deutschland) mit einem 15 MHz-Schallkopf
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durchgeführt. Die Messungen und Berechnungen der Flächen und
Durchmesser wird mit dem Computerprogramm Image Arena Version 2.8.1
(TomTec Imaging Systems, München, Deutschland) durchgeführt. Die
Messungen werden in der kurzen Achse sowohl auf Papillarmuskelebene (PA)
als auch apikal (AP) vorgenommen. Für jede Stelle werden drei Messungen
durchgeführt und dann das Mittelmaß bestimmt. Im B-Mode („brightness
modulation“) kann der Herzventrikel direkt dargestellt werden, indem die Sonde
ungefähr senkrecht zur Körperoberfläche bewegt wird. Auf diese Weise wird im
zweidimensionalen Schnittbild die kleinste, also endsystolische (ESA) und die
größte, also enddiastolische Fläche (EDA) der Herzhöhlen bestimmt. Durch
diese Werte kann nun sowohl für die apikale als auch die Papillarmuskelebene
das „fractional shortening“ (2D-FS) der Fläche berechnet werden.
2D-FS = (EDA-ESA) / EDA
Das „Fractional shortening“ zeigt die Verkleinerung beziehungsweise
Vergrößerung der Fläche des Herzens während des Pumpvorganges an. Im M-
Modus („motion modus“) können Bewegungsabläufe eindimensional dargestellt
werden. Somit kann der enddiastolische (EDD) und endsystolische (ESD)
Durchmesser gemessen werden. Mit diesen Werten kann nun die prozentuale
Verkürzung des Herzdurchmessers (MM-FS) für beide Ebenen während des
Pumpvorganges berechnet werden.
MM-FS = (EDD-ESD) / EDD
Des weiteren werden noch die Werte für die Dicke der Vorderwand (EDVW),
die Hinterwand (EDPW) und die Herzfrequenz gemessen. In die weiteren
Untersuchungen werden nur Tiere mit einer Infarktgröße über 30% einbezogen.
2.5 Gewebeentnahme – Präparation
Nach der letzten Echokardiographie am 28. Tag werden die Tiere in Narkose
getötet und die Herzen entnommen. Nachdem der rechte Ventrikel abgetrennt
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ist, wird der linke Ventrikel in vier gleich große Ringe geteilt. Für die Fixierung
werden die Ringe zunächst in weiße Kassetten eingelegt und in ein Glas mit
frisch angesetztem 20%igem Formalin für 24 Stunden gegeben, danach für 1
Stunde in zweifach demineralisiertes Wasser. Um von dem Gewebe
gleichmäßige Schnitte herstellen zu können, muss es in Paraffin eingebetet
werden. Da Paraffin wasserunlöslich ist, erfolgt zunächst eine Entwässerung in
einer speziellen Entwässerungsmaschine mittels einer aufsteigenden
Alkoholreihe (Bavimed Laborgerätebau GmbH, Birkenau, Deutschland).
70% Ethanol für 1 Stunde
90% Ethanol für 1 Stunde
96% Ethanol für 1 Stunde
96% Ethanol für 2 Stunden
96% Ethanol für 2 Stunden
50/50 Xylol/Ethanol für 1 Stunde
100% Xylol für 1,5 Stunden
100% Xylol für 1,5 Stunden
50/50 Xylol/Paraffin für 1 Stunde
100% Paraffin für 1,5 Stunden
100% Paraffin für 3 Stunden
Im Folgenden können die eingebetteten Ringe mit dem Schlittenmikrotom Hn40
(Reichert-Jung, Leica Microsystems, Nussloch, Deutschland) geschnitten
werden. Die Schnitte werden auf Objektträger (SuperFrost Plus Objektträger, R.
Langenbrinck Labor- und Medizintechnik, Teningen, Deutschland) gezogen und
für mindestens 12 Stunden bei 60°C in einem Wärmesc hrank aufbewahrt.
Hierauf können in dem nächsten Schritt die Schnitte gefärbt werden.
2.6 PSR-Färbung (Pikrosirius-Rot-Färbung)
Die PSR-Färbung ist eine Standardfärbemethode zur Darstellung von Kollagen.
Dieser Farbstoff enthält stark saure sulfonsäurehaltige Gruppen, die sich mit
den basischen Gruppen im Kollagenmolekül verbinden und vorhandenes
Kollagen deshalb in der Infarktnarbe als stark rot erscheinen lassen (Junqueira,
Bignolas et al. 1979). Der unbeschädigte Herzmuskel ohne Infarkt wird als
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gelber Bereich sichtbar, da dort sehr wenig bis kein Kollagen vorhanden ist.
Nachdem die Paraffinschnitte in einer Xylol- und Ethanolreihe entwachst und
rehydriert wurden, erfolgt eine Färbung in der PSR-Lösung für genau 20
Minuten und hierauf eine erneute Entwässerung.
Xylol Behälter I für 5 Minuten
Xylol Behälter II für 5 Minuten
Xylol Behälter III für 5 Minuten
Xylol 50% / Ethanol 50% für 5 Minuten
Ethanol 100% für 5 Minuten
Ethanol 95% für 5 Minuten
Ethanol 50% für 5 Minuten
Spülschritt mit destilliertem Wasser
Färbung in PSR-Lösung für 20 Minuten
Ethanol 50% für 1-2 Minuten
Ethanol 75% für 1-2 Minuten
Ethanol 95% für 1-2 Minuten
Xylol 50% / Ethanol 50% für 5 Minuten
Xylol Behälter 1 für 5 Minuten
Xylol Behälter 2 für 5 Minuten
Xylol Behälter 3 für 5 Minuten
Nach einer Entwässerung wird auf die histologischen Schnitte mittels Entellan
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), einer Lösung von Polymeren in Xylol,
ein Deckglas aufgebracht.
2.7 Masson Trichrom Färbung
Als weitere Färbemethode wird die Masson Trichrom Färbung dazu verwendet,
um Kollagen und Granulationsgewebe nach einem Infarkt nachzuweisen.
Hierfür werden ebenfalls Schnitte verwendet, die zuvor in Paraffin eingebettet
wurden. Zuerst muss auch bei dieser Färbemethode eine Entparaffinierung und
Wässerung über Xylol und Ethanol durchgeführt werden. Die Färbung wird
nach einer bereits im Labor etablierten Vorschrift mit Hilfe des Accustain®-Kits
von Sigma (Accustain® Trichdrome Stains, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
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Steinheim, Deutschland) durchgeführt. Zunächst erfolgt die Färbung der
Präparate für 1 Stunde bei 56°C in einer Bouin-Lösu ng (gesättigte Pikrinsäure,
Formaldehyd, Essigsäure), später für 10 Minuten in Weigert’s
Eisenhämatoxylinlösung (Hämatoxylin, 95% Alkohol, 29% Eisenchlorid,
konzentrierte Salzsäure, destilliertes Wasser) und schließlich für 10-15 Minuten
in Biebrich-Säure-Fuchsin-Lösung (Biebrichlösung, Fuchsinsäure, Essigsäure).
Zwischen jedem Färbeschritt werden die Schnitte mit destilliertem Wasser von
Farbstoffresten abgewaschen. Die weitere Färbung erfolgt für 10 Minuten in
Phosphomolybdicsäure, in Anilinblaulösung für 5 Minuten und in 1% Salzsäure
für 2 Minuten. Im Anschluss werden die Präparate entwässert und mittels
Entellan (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) ein Deckglas aufgebracht und
für die Lichtmikroskopie vorbereitet. Durch diese Färbemethode werden
Kollagenfasern blau, Zellkerne schwarz und Muskulatur rot angefärbt.
2.8 Infarktgrößenbestimmung
Von Tieren aus der Behandlungs- und der Kontrollgruppe wird nach der PSR-
Färbung eine Infarktgrößenbestimmung durchgeführt. Dazu werden diese Bilder
unter dem Mikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland)
mit Kameraaufsatz digital aufgenommen. Es wird darauf geachtet, dass unter
10facher Vergrößerung jeweils der komplette linke Ventrikel zur Abbildung
kommt. Die Aufnahme auf eine digitale Bilddatei erfolgt mit dem Programm
MetaMorph 2.0 (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA). Die weitere
Auswertung erfolgt mit der Software ScionImage (Scion Corporation, Maryland,
USA). Mit diesem Programm wirde sowohl am Endo- als auch Epikard das
gesunde und infarzierte Areal gemessen. Aus diesen Werten wird die
prozentuale Infarktgröße errechnet.
2.9 Infarktexpansionsmessung
An 11 Tieren aus der Clodronat-Gruppe und 9 Tieren aus der PBS-Gruppe wird
eine Infarktexpansionsstudie durchgeführt, wie durch Fraccarollo et al.
beschrieben (Fraccarollo, Galuppo et al. 2002). Dabei werden die Herzen durch
eiskalte Kaliumchloridlösung in der diastolischen Herzphase fixiert. Durch eine
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Hängeeinrichtung ist es möglich, den linken Ventrikel mit 10% Phosphat-
gepuffertem Formalin mit einem konstanten Druck von 7,5mmHg über 2
Stunden zu spülen. Danach werden die Herzen abgehängt, entwässert, in
Paraffin eingebettet und mittels Schlittenmikrotom (Hn40, Reichert-Jung, Leica
Microsystems, Nussloch, Deutschland) 7µm dünne Schnitte von der Spitze bis
zur Basis in einem Abstand von etwa 1mm erstellt. Hierauf erfolgt eine PSR-
Färbung wie bereits unter Punkt 2.6 beschrieben. Nun kann unter dem
Mikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) und einer
Kamera die Aufnahme des vollständigen Herzschnittes erfolgen. Die
Auswertung wird mit Hilfe des Computerprogramms Sigma Scan Pro 5.0
(Systat Software Inc., San Jose, California, USA) durchgeführt. Bei der
Auswertung wird darauf geachtet, dass für jedes Herz der Schnitt mit der
größten Ausdehnung des Ventrikels benutzt wird. Die Infarktgröße wird als
Anteil des infarzierten Bereichs am Gesamtventrikel berechnet. Die
Infarktexpansion kann nun nach folgender Formel (Fraccarollo, Galuppo et al.
2002) berechnet werden:
Infarktexpansion = (Fläche Lumen des linken Ventrikels / Fläche gesamter
linker Ventrikel) x (Septum Dicke / Narben Dicke)
2.10 FACS-Analyse
Durch diese Untersuchung können innerhalb kürzester Zeit eine große Menge
von Zellen weiter charakterisiert werden.
Der Laserstrahl des Gerätes trifft direkt auf die Proben in der Küvette und wird
abgelenkt, gestreut und reflektiert. Zudem wird bei Einsatz von
fluoreszenzgekoppelten Antikörpern durch die angeregten Farbstoffe Licht von
verschiedenen Wellenlängen frei. Durch Spiegel und Filter erfolgt eine
Auftrennung in die einzelnen Wellenlängenbereiche und dies kann ebenso
durch Detektoren erfasst werden. (Luttmann, Bratke et al. 2009)
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Abb. 3: Prinzip der FACS-Analyse: Die Zellen werden markiert und in einem laminaren
Probenstrom einzeln durch einen Laser geleitet. Es wird sowohl das durch den
fluoreszenzmarkierten Antikörper emittierte Licht als auch die reflektierte und gestreute
Strahlung des Lasers erfasst. Hierüber lassen sich Aussagen über die Zellgröße, Granularität
sowie Spezifität der Antikörper treffen. Skizze modifiziert nach S. 78 (Luttmann, Bratke et al.
2009)
Abb. 4: Parameter FSC sowie SSC: Das Licht des Lasers trifft auf die Zelle. Neben dem
Streulicht in Verlängerung des Laserstrahls (FSC, Maß für die Zellgröße) wird auch das
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Seitwärtsstreulicht (SSC; Maß für die Granularität) erfasst. Skizze modifiziert nach S. 81
(Luttmann, Bratke et al. 2009)
Ändert der Laserstrahl nach Auftreffen auf eine Zelle durch die Größe oder
Oberflächeneigenschaft in die Verlängerung des Strahls seine Richtung, kann
dies durch eine FSC-Diode (Forwardscatter) erfasst werden und somit auf die
Größe der Zelle geschlossen werden. Wird der Strahl durch intrazelluläre
Strukturen wie etwa den Zellkern um einen 90°-Winke l abgelenkt, kann dies
durch eine SSC-Diode (Sidescatter) ermittelt werden und somit als ein Maß für
die Granularität verwendet werden (Luttmann, Bratke et al. 2009).
Von je 5 Tieren aus der Clodronat- und Kontrollgruppe werden die Monozyten-
und Granulozytenzahlen über FACS-Analyse ermittelt. Dazu werden ungefähr
18 Stunden nach der Clodronat-/PBS-Injektion 50µl Blut aus der Augenvene
gewonnen. Das Blut wird in eine heparinisierte 50µl Kanüle aufgezogen und
somit ungerinnbar gemacht. Im nächsten Schritt wird das Blut mit PBS-Lösung
(phosphatgepufferte Salzlösung) und 0,5% BSA (Albumin aus Rinderserum)
verdünnt. Nun wird es in einem abgedunkelten Raum bei Raumtemperatur mit
folgenden Antikörpern versetzt:
Anti-CD11b-PE 1:400 (BD biosciences, clone M1/70, San Jose, USA)
Anti-F4/80-FITC 1:400 (eBioscience, clone BM8, San Diego, USA)
Anti-Ly6G-Cy5.5 1:10000 (BioLegend, clone 1A8, San Diego, USA)
Anti-Ly6C-Alexa647 1:400 (eBioscience, HK1.4, San Diego, USA)
Nach Zugabe der Antikörper wird die Suspension für weitere 15 Minuten in
einem lichtgeschützten Raum inkubiert. Hierauf wird das Gemisch mit PBS-
Lösung gewaschen und in einem Fixations-Permeabilitationspuffer (Flow
Cytometry Staining Buffer, eBioscience, San Diego, USA) für 30 Minuten
aufbewahrt. Die Proben werden nun in dem Gerät BD FACS Calibur (BD
Biosciences, San Jose, USA) analysiert und mit der Software Cellquest (BD
Biosciences, San Jose, USA) ausgewertet.
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2.11 Mikroskopie der Thrombusformation in FeCl 3-verletzten
Mesenterialarteriolen
Dieser Versuch wird ebenfalls sowohl an Tieren aus der Clodronat- als auch
aus der Placebogruppe durchgeführt, um Auswirkungen des Wirkstoffes auf die
Thrombusformation feststellen zu können. Die Versuchsanordnung wurde vor
kurzem veröffentlicht (Varga-Szabo, Braun et al. 2008). Nach Einleitung einer
Anästhesie wie unter Punkt 2.3 bereits beschrieben, wird durch eine Inzision in
der Mittellinie des Abdomen die Mesenterialarterie aufgesucht und freigelegt.
Als Mikroskop steht ein Axiovert 200 (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,
Deutschland) mit einer 100 Watt Quecksilberhöchstdruckfluoreszenzlampe
(HBO) zur Verfügung. Das Mikroskop hat einen invertierten Aufbau. Dies
bedeutet, dass die Lichtquelle und der Kondensator im oberen Teil, das
Objektiv im unteren Teil angebracht sind. Unter 10facher Vergrößerung ist es
mit diesem Mikroskop möglich, die Arteriolen von etwa 35-60µm Durchmesser
dazustellen. Die entstandenen Bilder werden mit der Kamera (CoolSNAP-EZ,
Visitron Systems GmbH, Puchheim, Deutschland) digital aufgezeichnet und mit
der Software Metavue (MDS Analytical Technologies, Downingtown, USA)
bearbeitet. Im Folgenden wird eine Verletzung simuliert, indem für 10 Sekunden
ein 3mm² großes Filterpapier aufgelegt wird, das zuvor in 20%iger
Eisenchloridlösung (FeCl3) getränkt wurde. Zudem werden die Thrombozyten
an einen Fluoreszenz-Antikörper (DyLight 488-konjugierter anti-GPIX Ig)
gekoppelt, um eine Zusammenlagerung oder Anheftung an die Arteriolenwand
besser sichtbar zu machen. Die Abläufe in den Arteriolen werden nun für
mindestens 30 Minuten oder bis zur vollständigen Okklusion aufgezeichnet.
2.12 Immunhistochemie
Dieses Verfahren dient dazu, das Verteilungsmuster von Proteinen in dem
Gewebe sichtbar zu machen. In dieser Arbeit wird das Verfahren genutzt, um
die Verteilung von Makrophagen, neutrophile Granulozyten, T-Zellen sowie
Defekte an Endokardzellen nach dem Infarkt zu erkennen. Diese Zellen tragen
jeweils bestimmte Oberflächenproteine, sogenannte Antigene, gegen die
spezifische Antikörper eingesetzt werden und somit eine Markierung möglich
22
machen. Dieser spezifische Antikörper wird auch als Primärantikörper
bezeichnet. Um jedoch die Verteilung im Gewebe sichtbar zu machen, muss
zusätzlich ein Sekundärantikörper eingesetzt werden, der direkt gegen den
Primärantikörper gerichtet ist. Bei dem Sekundärantikörper ist von Bedeutung,
dass er gegen Antikörper aus der Tierart gerichtet sein muss, von welcher der
verwendete Primärantikörper stammt. Bei der direkten Nachweismethode
werden Sekundärantikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, die dann
sichtbar gemacht werden können. Oft reicht jedoch dieses Signal nicht aus und
es muss in diesem Fall auf die indirekte Nachweismethode zurückgegriffen
werden, bei der Sekundärantikörper mit einem Enzym-Komplex verwendet
werden. Am häufigsten wird hierbei die Avidin-Biotin-Methode eingesetzt. Avidin
besitzt vier Bindungsstellen für Biotin. Der Biotin-Enzym-Komplex kann über
eine Biotin-Streptavidin-Brücke nahezu irreversibel gebunden werden. In
diesem Versuch wird für die Farbreaktion die Umsetzung von DAB (3,3’-
Diaminobenzidin) durch eine Meerrettich-Peroxidase benutzt. Eine positive
Reaktion zeigt sich durch ein dunkelbraunes Präzipitat.
23
Abb. 5: Skizze Avidin-Biotin-Methode: In dieser Skizze ist die Avidin-Biotin-Methode
dargestellt. Zunächst wird ein spezifischer Antikörper hinzugegeben, der gegen das
gewünschte Antigen gerichtet ist. Zusätzlich wird in einem zweiten Schritt ein
Sekundärantikörper mit einem Enzym-Komplex benutzt, der gegen den Primärantikörper
gerichtet ist. Avidin besitzt 4 Bindungsstellen für Biotin, es erfolgt eine nahezu irreversible
Bindung und die Reaktion kann durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Skizze
modifiziert nach Produktinformation, Vector ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA,
USA)
2.12.1 Immunhistochemie für CD31 und neutrophile Gr anulozyten in
Paraffinschnitten
An Präparaten aus beiden Gruppen wird eine Untersuchung auf Unterschiede
in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten und auf Defekte im Endothel
durchgeführt. Zuerst müssen die Paraffinschnitte nach interner Vorschrift über
Xylol und Ethanol entparaffinisiert und rehydriert werden. Da das Gewebe durch
die vorherige Fixierung in Formalin und durch die Einbettung enorm denaturiert
ist und die Antigene Quervernetzungen aufweisen, werden die Schnitte
zunächst für 10 Minuten bei 95°C in einer Unmasking Solution (Vector
Laboratories, CN H-3300, Burlingame, CA, USA) inkubiert und danach bei
Raumtemperatur abgekühlt. Im Anschluss erfolgt eine dreimalige Waschung mit
PBS-Lösung. Um Störungen durch das Hintergrundsignal bei der Färbung zu
vermeiden, erfolgt im nächsten Schritt eine Absättigung der endogenen
Peroxidase mittels 30-minütiger Inkubation in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung
(H2O2). Nach diesem Schritt erfolgt eine erneute dreimalige Waschung mit 1-
facher-PBS-Lösung. Um bei der späteren Antikörperzugabe unspezifische
Bindungen und damit einen hohen Hintergrund zu verhindern, wird zusätzlich
als Blockierungsschritt für eine 15-minütige Inkubationszeit ein 5%iges
Kaninchenserum (Normal Rabbit Serum, Vector Laboratories, CN S-5000,
Burlingame, CA, USA) verwendet. Auch nach diesem Schritt schließt sich
erneut für 5 Minuten ein dreimaliges Abwaschen mit PBS-Lösung an. Nun wird
auf die Präparate der Clodronat- und Kontrollgruppe der primäre Antikörper
gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Für diese Versuchsreihe wird der
Antikörper „anti mouse CD31“ (Cat 550274, BD Pharmingen, Franklin Lakes,
NJ, USA) zur Darstellung von CD31 und der Antikörper „Linearis primary rat
24
anti mouse neutrophil antibody“ (Cat. LCU 8993, Clone 7/4, Verdünnung 1:100,
Linearis, Wertheim, Deutschland) zur Darstellung der neutrophilen
Granulozyten benötigt. Zur Überprüfung der Ergebnisse werden jeweils auch
Testschnitte mit einem unspezifischen Antikörper inkubiert. Nachdem erneut
dreimalig für 5 Minuten mit 1facher-PBS-Lösung gespült wurde, kann der
biotinylierte Sekundärantikörper Rabbit Anti Rat (BA 4001, Verdünnung 1:500,
Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) auf die
Präparate gegeben und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden.
Auch nach diesem Schritt wird dreimalig für fünf Minuten mit PBS-Lösung
abgewaschen. Nun kann Avidin zusammen mit der Meerrettichperoxidase
(Vectastain ABC Kit, Vector PK 6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA,
USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit den Schnitten inkubiert werden.
Nach dreimaligem Abwaschen wird DAB-Substanz (Vector SK-4100, Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA) auf die Schnitte gegeben. Nach 10
Minuten werden die Reste der DAB-Substanz abgeklopft und gründlich mit
demineralisiertem Wasser gespült. Nun können die Schnitte nach interner
Vorschrift wieder entwässert und mit Enthellan (Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland) eingebettet werden. Nach Trocknung unter einer Abzugsanlage
werden sie unter dem Lichtmikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena,
Deutschland) betrachtet, als digitale Bilddatei aufgenommen und ausgewertet.
2.12.2 Immunhistochemie nach CD11b, CD18 und CD25
In dieser Studie wird zudem die Einwanderung von inflammatorischen Zellen in
das Infarktgebiet in beiden Gruppen untersucht. Dabei wird eine abgewandelte
Methode der unter Punkt 2.11.1 geschilderten immunhistochemischen
Untersuchung durchgeführt. Als Primärantikörper werden hier folgende
Substanzen benutzt:
Rat Anti-Mouse CD11b (clone M1/70, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)
Rat Anti-Mouse CD25 (clone 7D4, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)
Rat Anti-Mouse CD18 (clone C71/16, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)
Rat Anti-Mouse CD31 (clone MEC 13.3, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)
25
Nach Aufbringen des sekundären biotin-konjugierten Antikörper erfolgt die
Inkubation mit einem HRP-Komplex (streptavidin-Meerrettich/horseradish-
peroxidase, Code K1016, DAKO Deutschland GmbH, Hamburg). Als Enzym
wird hier ebenfalls eine Peroxidase verwendet, als Farbstoff jedoch AEC (3-
amino-9-ethyl-carbazol, Nr. AEC01, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland). Das Zytoplasma von positiven Zellen färbt sich bei dieser
Methode rot bis rot-bräunlich. Als Gegenfärbung wird Hämatoxylin-Lösung
verwendet (Gill Nr. 1, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland).
Wie auch bei vielen anderen immunologischen Verfahren üblich, ist es auch
hier ratsam, einen Antikörper für eine ubiquitär vorhandene Struktur
mitzutesten. Aus diesem Grund wird auch hier ein Antikörper gegen CD31
verwendet.
2.13 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Der ELISA ist ein sehr häufig angewandter Immunoassay, bei dem quantitative
Aussagen getroffen werden. Er erlaubt es, mithilfe eines Enzymmarkers eine
genaue Aussage über die Antigenkonzentration anhand des Substratumsatzes
zu treffen.
26
Abb. 6: Prinzip des ELISA: Auf eine Platte mit dem entsprechenden Antikörper wird das
Antigen gegeben. Zusätzlich wird ein zweiter Detektionsantikörper mit Enzym hinzugefügt. Das
Signal wird nun durch enzymatischen Substratumsatz generiert. Skizze modifiziert nach S. 136
(Luttmann, Bratke et al. 2009)
Zuerst muss der entsprechende Antikörper an eine feste Phase gebunden
werden, das sogenannte „Coaten“. Die Menge der hinzu gegebenen Antikörper
ist somit bekannt. Die Bindung an die Platte entsteht hauptsächlich durch
hydrophobe Wechselwirkungen und ist relativ pH-unabhängig (Luttmann,
Bratke et al. 2009). Da durch freie Proteinbindungen eine hohe
Hintergrundaktivität entstehen kann, müssen diese Stellen abgeblockt werden.
In diesem Versuch wird dafür 0,5% BSA (Rinderserum) mit PBS-Lösung
verwendet. Nun kann das Analysat auf die Platte gegeben werden und sich an
den Antikörper binden. Beim Sandwich-ELISA wird nun ein
Detektionsantikörper hinzugegeben, der spezifisch gegen den Primärantikörper
gerichtet ist. Um diese Verbindung später in einem Photometer sicht- und
auswertbar zu machen, ist an den Detektionsantikörper ein Enzym gebunden.
Nach Zugabe einer Substratlösung und Einhaltung einer Inkubationszeit von 30
Minuten erfolgt eine enzymvermittelte Umsetzung des Substrates, die dann
photometrisch gemessen werden kann. Um eine genaue Standardkurve zu
erhalten, ist es wichtig, dass zwischen den einzelnen Inkubationsschritten
mehrere Waschschritte erfolgen, um ungebundenes Antigen oder Enzyme
auszuwaschen.
In dieser Studie wird mithilfe des Sandwich-ELISA der Gehalt an
Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) nach dem Infarkt in den verschiedenen
Versuchsgruppen gemessen. Dabei wird der kommerzielle Quantikine®-ELISA
(Mouse MMP-9 Immunoassay, Cat. MMPT90, R&D Systems, Abdingdon, UK)
verwendet. Dieser Assay enthält bereits mitgelieferte Mikrotiterplatten (96-Well-
Format), die mit den Antikörpern besetzt sind. Somit entfällt das „Coating“ als
Arbeitsschritt.
27
2.14 Molekulare Analysen
Um weitere Aufschlüsse über Veränderungen am Herzmuskel und die
Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen zu können, wird eine real-time
PCR (rt-PCR) aus Myokardgewebe durchgeführt. Zunächst wird die RNA aus
dem Gewebe extrahiert, daraufhin in cDNA (komplementäre DNA)
umgeschrieben und dann quantitativ mittels rt-PCR der Gehalt an TGF
(transformal growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) und
Collagen-1 gemessen. Dieses Verfahren wurde vor kurzem auch in einer Arbeit
von Frantz et al. beschrieben (Frantz, Hu et al. 2004).
2.14.1 RNA-Isolierung aus dem Gewebe
Für dieses Verfahren ist es sehr wichtig, dass die verwendeten Materialen
RNAse-frei gehalten werden. Die verwendeten Gläser werden nach folgender
laborinternen Vorschrift gereinigt.
Lagerung über Nacht in 1%iger SDS-Lösung (Natriumlaurylsulfat)
Abspülen einmal mit H2O, dann zweimal mit demineralisiertem H2O
Inkubation für 20 Minuten in 3% H2O2
Abspülen mit DEPC-H2O (Diethylpyrocarbonat), hierauf abtrocknen lassen
Für eine Inaktivierung von RNasen wird zusätzlich im weiteren Versuchsablauf
nur DEPC-Wasser verwendet. Die Extraktion wird mittels Trizol®-Reagenz
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), einer Mischung aus Guanidinthiocyanat und
Phenol durchgeführt. Diese Methode wurde 1987 zum ersten Mal beschrieben
(Chomczynski and Sacchi 1987; Chomczynski and Sacchi 2006). Es kommt zu
einer Auflösung des Gewebes, die RNasen werden jedoch schnell und effektiv
inaktiviert und somit die RNA erhalten. In die, wie oben beschrieben,
gereinigten Gläser wird 1ml Trizol vorgelegt. Ein Stück des Mausherzmuskels
wird in das Glas gegeben und danach mit einem Handrührstab manuell
vorhomogenisiert. Durch einen Homogenisierungsstab (Ultra Turrax Stab,
Janke&Kunkel-IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) erfolgt bei 1500rpm für
etwa 20-30 Sekunden eine maschinelle Homogenisierung. Nach Inkubation für
28
5 Minuten wird 600µl Chloroform (Trichlormethan/Chloroform, Carl Roth,
Karlsruhe, Deutschland) hinzugegeben. Durch Chloroform und eine
anschließende Zentrifugation (Biofuge fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland)
kann nun eine Phasentrennung erfolgen, eine wässrige obere Phase mit der
RNA und eine mittlere und untere organische Schicht mit DNA, Proteinen und
dem verbliebenen Trizol®-Reagenz. Die wässrige obere Phase mit der RNA
wird entnommen und in ein anderes Gefäß gegeben. Durch Zugabe von 0,5ml
Isopropanol (2-Propanol, Merck, Darmstadt, Deutschland) und anschließender
Zentrifugation kann die RNA aus der wässrigen Phase weiter aufgereinigt
werden. Das am unteren Rand gebildete Pellet kann in einer Mischung aus
75%Ethanol/DEPC-Wasser aufgenommen und gewaschen werden. Nach einer
erneuten Zentrifugation wird der Überstand erneut abpipettiert, das Pellet
getrocknet und in 10µl DEPC-Wasser aufgelöst. Für die c-DNA-Messung wird
die Konzentration der erhaltenen RNA in einem Photometer (Ultraspec 3000,
GE Healthcare Europe, München, Deutschland) ermittelt.
2.14.2 cDNA Herstellung
Da die extrahierte RNA nicht direkt als Vorlage in einer PCR (Polymerase chain
reaction) eingesetzt werden kann, muss sie zunächst durch eine reverse
Transkriptase in eine komplementäre DNA umgeschrieben werden. Das Enzym
reverse Transkriptase besitzt als Funktion unter anderem eine RNA-abhängige
DNA-Polymerase und kann somit aus der vorhandenen RNA mithilfe dNTPs
(desoxy-Nukleotidtriphosphate) und einem geeigneten Puffer die cDNA
herstellen. Für diesen Vorgang benötigt sie ein Startmolekül, einen
sogenannten Primer, der sich als Startpunkt zunächst an die RNA binden kann.
Bei dieser Studie wird als Primer eine Mischung aus Oligodesoxythymidin-
Nukleotiden (besteht aus etwa 15-20 Desoxythymidinen) und einem random
Hexamer-Oligonukleotid (6 zufällig zusammengesetzte Nukleotide) verwendet.
Durch diese Mischung wird gewährleistet, dass in der cDNA
höchstwahrscheinlich alle RNA-Moleküle repräsentiert sind (Jansohn and
Aigner 2007). Alternativ können auch sequenzspezifische Primer verwendet
werden, um nur einen Teil der RNA zu DNA umzusetzen. Nachdem die Primer
29
an die RNA gebunden haben, kann die Reverse Transkriptase mit der Synthese
beginnen.
In diesem Versuch wird die extrahierte RNA vor der cDNA-Synthese zunächst
mit einer DNAse behandelt, um DNA-Reste in der Lösung zu beseitigen. Zu 1µl
Reaktionspuffer und 1µl DNase (beide AMP-D1, Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim, Deutschland) werden 1µg RNA-Lösung und destilliertes Wasser in
ein RNAse-freies PCR-Tube gegeben. Nach einer Inkubation für 15 Minuten bei
Raumtemperatur wird 1µl Stop-Solution (AMP-D1, Sigma Aldrich Chemie
GmbH, Steinheim, Deutschland) hinzu pipettiert und erneut für 10 Minuten bei
70°C inkubiert. Hierauf wird die Lösung auf Eis abg ekühlt. Für die cDNA-
Synthese wird in jedes Tube 4µl Reaktionspuffer, 1µl Reverse-Transkriptase-
Enzym (iScript, BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) und 4µl
destilliertes Wasser gegeben.
30
Abb. 7: cDNA-Synthese: Die Reaktion beginnt zunächst mit der Bindung des Primer-Moleküls
an die RNA-Matrize. In den nächsten Schritten verlängert die Reverse-Transkriptase den Primer
entlang der RNA und es entsteht eine komplementäre DNA. Skizze modifiziert nach S. 166
(Jansohn and Aigner 2007)
Die Synthese erfolgt nach Herstellerangaben in einem PCR-Gerät
(Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mit folgendem
Ablauf:
5 Minuten bei 25°C
30 Minuten bei 42°C
5 Minuten bei 85°C
Abkühlung auf 4°C
Falls die Proben nicht direkt am gleichen Tag weiter in der rt-PCR verarbeitet
wurden, werden sie bei -20°C aufbewahrt.
2.14.3 Realtime-PCR (rt-PCR)
Grundlage dieser Methode ist die PCR (Polymerase-Kettenreaktion), mit
welcher Abschnitte einer DNA amplifiziert werden können. Durch die real-time-
PCR ist es zusätzlich möglich, über Einbringen von sequenzspezifischen
Sondenmoleküle und nachfolgenden Fluoreszenzmessungen eine Aussage
über die Menge der ursprünglichen DNA/RNA zu treffen.
Bei der PCR erfolgt zunächst eine Erhitzung der cDNA auf 94°C, so dass es zu
einer Trennung der 2 DNA-Stränge kommt. Nach einer Abkühlung auf 50-60°C
können sich die spezifischen Primer an den jeweiligen Strang anlagern
(Annealing). Eine Temperaturerhöhung auf 72°C sorgt nun für ideale
Bedingungen für die TAQ-DNA-Polymerase, die nun von den Primern
ausgehend eine Kopie für den jeweiligen DNA-Strang erstellt. Im Folgenden
wird die Temperatur wieder auf 94°C erhöht. Nun kön nen sich die mittlerweile 2
Doppelstränge wieder auseinanderlagern. Dieser Ablauf wiederholt sich immer
wieder aufs neue und sorgt für einen exponentiellen Anstieg der DNA-Menge.
Zusätzlich kommen bei der RT-PCR sog. Sondenmoleküle zum Einsatz. Diese
binden sich während der Annealing-Phase an die Sequenz zwischen den
Primern. Bei den in diesen Versuchsaufbau verwendeten Taq-Man-Sonden ist
31
auf der 5`-Seite der Sonde der Reporter-Fluoreszenzfarbstoff, auf der 3`-Seite
der sogenannte Quencher enthalten. Dieser Quencher unterdrückt
normalerweise eine messbare Fluoreszenzemission. Während der
Elongationsphase jedoch erreicht die TAQ-DNA-Polymerase die Sonde und
somit wird durch die 5`-3`-Exonukleaseaktivität der Polymerase das 5`-Ende
der Sonde hydrolytisch gespalten und der Quencher vom Reporter getrennt.
Nun kann am Ende der Elongation durch Licht der Wellenlänge 488nm die
Fluoreszenz des Farbstoffes gemessen werden. Diese Messung kann in jedem
einzelnen Reaktionszyklus erfolgen. Die Intensität ist somit direkt proportional
zu den neu gebildeten Strängen und erlaubt direkte Rückschlüsse auf die
Ausgangsmenge an Nukleinsäure. Überschreitet das Signal zum ersten Mal
das Hintergrundrauschen, wird dies als CT-Wert (Cycle treshold) bezeichnet. Ist
sehr viel DNA in der Probe vorhanden, wird also auch dieser CT-Wert früher
erreicht und lässt somit einen Rückschluss auf die Ausgangsmenge zu.
32
Abb. 8: Prinzip der PCR: Durch Erhitzung wird die DNA in eine einzelsträngige DNA überführt.
Im nächsten Schritt (Annealing) kommt es zur Anlagerung der Oligonucleotid-Primer. Hierauf
synthetisiert die DNA-Polymerase die komplementären Stränge. Da diese Schritte mehrfach
wiederholt werden, kommt es zu einer exponenziellen Amplifikation. Skizze modifiziert nach S.
154 (Jansohn and Aigner 2007)
33
Abb. 9: Darstellung der RealTime-PCR: Die Besonderheit bei der rtPCR umfasst die
Verwendung einer Sonde mit Quencher und Reporterfarbstoff. Normalerweise kommt es durch
die Verbindung zu keiner Emission. Wird jedoch im Laufe der PCR-Reaktion die Verbindung
zwischen beiden getrennt, erfolgt eine Emission und es kann ein fluoreszentes Signal
gemessen werden. Dieses Signal ist proportional zur Menge der zu untersuchenden
Zielsequenz. Skizze modifiziert nach S. 180 (Jansohn and Aigner 2007)
Um eine quantitative Aussage zu erreichen, wird mit den Proben eine
Standardreihe in der RT-PCR mit gemessen. Diese wird erstellt, indem von
einer Probe mit bekannter Molekülkonzentration mehrfach eine Verdünnung
(109, 108, 107, 106, 105, 104) hergestellt wird. Anhand dieser Verdünnungen mit
bekannter Konzentration können die Testproben eingeordnet und somit
absolute Konzentrationswerte bestimmt werden.
Um einen Vergleich verschiedener Proben zu ermöglichen, wird die
Konzentration jeweils in ein Verhältnis zu einem Referenz-Gen gesetzt. Hierfür
wird auf sogenannte „Housekeeping“-Gene zurückgegriffen. Diese spielen eine
essentielle Rolle im Zellstoffwechsel, sind also unter den Versuchsbedingungen
unverändert aktiviert und spiegeln somit die Gesamtproteinproduktion einer
Zelle wieder. Dadurch ist es möglich, das Zielprodukt direkt mit dem Produkt
des Housekeeping-Gens zu verrechnen und somit relative Werte zu erhalten,
34
die unabhängig von der Gesamtproteinproduktion der Proben sind. Erfolgt die
Berechnung der absoluten Werte anhand der CT-Werte, so werden die Werte
der Referenz-Gene von denen der Zielgene subtrahiert, bei Anwendung der
Standardreihe werden die Konzentrationsgradienten der Zielgene durch
diejenigen der Referenzgene geteilt.
In diesem Versuch wird als Housekeeping-Gen das 18S-Protein verwendet, ein
Bestandteil der zytoplasmatischen Ribosomen. Von dem 18S-Protein wird nun
eine Standardreihe (109, 108, 107, 106, 105, 104) erstellt und mitgemessen. Je
Probe werden zu den 5µl der cDNA, 12,5µl Mastermix (TaqMan® Universal
PCR Mastermix kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1,25µl
Sondenmix und 6,25µl Wasser gegeben. Der Sondenmix besteht aus 18S
(Hs99999901_s1), Kollagen-1 (Mm00483888_m1), VEGF (Mm00437304_m1)
und TGF-β (Mm00441724_m1, alle von Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). Die Lösung wird in Dreifachbestimmung in eine 96er-PCR-Platte (BioRad
Laboratories, München, Deutschland) pipettiert und anschließend in einem
iCycler (BioRad Laboratories, München, Deutschland) eine RT-PCR
durchgeführt. Durch die Dreifachbestimmung ist es möglich, bereits im Vorfeld
Ausreißerwerte zu erkennen und von der Berechnung auszuschließen.
2.15 Statistische Analysen
Sämtliche statistischen Auswertungen werden mit dem Computerprogramm
StatView Version 5.1 (Abacus Conceps Inc., Berkeley, CA, USA) durchgeführt.
Die absoluten Unterschiede zwischen den Gruppen werden mit ANOVA,
erweitert nach der David J. Fisher Regel, verglichen. P<0,05 wird als signifikant
betrachtet. Bei allen Versuchen mit Mehrfachmessungen wird der mittlere
Standardfehler errechnet. Die Berechnung der Mortalitätsraten erfolgt mit dem
log-rank Test. Die Sammlung der experimentell und sonographisch
gewonnenen Daten wird mit Hilfe von Microsoft Excel (Microsoft Office,
Microsoft, USA) durchgeführt.
35
3. Ergebnisse
3.1 Auswirkungen der Injektion von Clodronat auf Im munzellen
In dieser Studie werden die Auswirkungen von Monozyten auf Vorgänge nach
einem Myokardinfarkt untersucht. Dabei erhalten die Mäuse entweder eine
Injektion von Clodronat-Liposom in der Behandlungsgruppe oder von PBS-
Liposom in der Kontrollgruppe. Mittels einer immunhistochemischen
Untersuchung wird der Unterschied in der Einwanderung von inflammatorischen
Zellen drei Tage nach dem Myokardinfarkt in das Infarktgebiet untersucht (siehe
Abb. 10). CD11b und CD18 werden als Marker für die Monozyten sowie CD25
für T-Zellen verwendet. Dabei zeigt sich in der Behandlungsgruppe eine
deutlich erniedrigte Einwanderung von Monozyten, die T-Zellen dagegen
bleiben nahezu unverändert.
36
Abb. 10: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf Monozyte n und T-Zellen: CD11b und CD18 werden als Marker für die Einwanderung von Monozyten in das Infarktgebiet verwendet. Hier zeigt sich eine deutliche Abschwächung in der mit Clodronat behandelten Gruppe. CD25 dient als Marker für T-Zellen, hierbei zeigt sich kein Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen.
An je 5 Tieren aus der Behandlungs- und Kontrollgruppe wird auch eine FACS-
Analyse durchgeführt, um unter anderem mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten
Antikörpern einen Unterschied in der Monozytenanzahl im peripheren Blut
zwischen den beiden Gruppen erkennen zu können. Dabei zeigt sich in der
Clodronat-Gruppe mit einem Anteil von 0,6±0,2% an der Leukozytenzahl eine
37
signifkante Verminderung gegenüber der Kontrollgruppe mit 3,2±1,3% (siehe
Abb. 11).
Abb.11: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf den Mono zytenanteil im peripheren Blut: Prozentualer Anteil der Monozyten an der Gesamtleukozytenanzahl im peripheren Blut. Der Unterschied zwischen der Clodronat-Liposomgruppe (0,6±0,2%) ist gegenüber der PBS-Gruppe signifikant. (3,2±1,3%)(p=<0.05)
6 Tiere aus der Behandlungsgruppe und 4 Tiere aus der Kontrollgruppe werden
einer immunhistochemischen Färbung auf neutrophile Granulozyten unterzogen
und danach ausgezählt. Hierbei zeigt sich eine signifikant verringerte
Einwanderung von diesen Zellen in das Infarktgebiet in der Clodronatgruppe
(159±43 Zellen) gegenüber der Kontrollgruppe (318±49 Zellen).
Abb. 12: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf neutroph ile Granulozyten im Infarktareal: Auszählung der eingewanderten neutrophilen Granulozyten in das Infarktgebiet.
38
Dabei zeigt sich ein signifikanter (p=0,04) Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe (159±43 Zellen) gegenüber der Kontrollgruppe (318±49 Zellen) (p=0.04)
3.2 Auswirkung der Injektion von Clodronat auf die Mortalitätsrate
In einem weiteren Schritt werden in der Behandlungsgruppe zwei verschiedene
Gruppen gebildet. In der 2 Tage-MI-Gruppe wird das Clodronat-Liposom zwei
Tage vor der Operation, am Tage der Operation sowie zwei und vier Tage nach
der Operation gespritzt. In der 5 Tage-MI-Gruppe erfolgt die Gabe erst 5 Tage
nach dem Myokardinfarkt. Dabei wird über den Verlauf von 28 Tagen an 35
Mäusen die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen den Gruppen
untersucht. Hier zeigt sich ein signifikant verringertes Überleben (p=0,007)
sowohl der 2 Tage-MI-Gruppe (33%) als auch in der 5 Tage-MI-Gruppe (38%),
in der Kontrollgruppe dagegen von 92% (Abb. 13). Tot aufgefundene Tiere
werden auch durch die Eröffnung des Brustkorbes auf eine Ruptur hin
untersucht. Dies wird nur einmal in der 2 Tage-MI-Gruppe, somit bei Beginn der
Clodronat-Liposom-Gabe 2 Tage vor dem Infarkt, gefunden.
Abb. 13: Mortalitätsrate: Diese Abbildung zeigt das Überleben (in %) der Mäuse in den 3 Behandlungsgruppen. Dabei zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p=0,007) zwischen der 2 Tage-MI-Gruppe (33%), 5 Tage-MI-Gruppe (38%) und der Kontrollgruppe (92%) (p=0.007)
3.3 Echographische Messungen an den Mäusen
Nach einem Myokardinfarkt kommt es zu Umbauvorgängen am gesamten
Ventrikel. Durch eine Echokardiographie am 1., 7. und 28. Tag nach dem Infarkt
werden die Tiere deshalb auf diese Veränderungen hin untersucht. Die
39
Messungen erfolgen sowohl auf der Höhe der Papillarmuskeln (PA) als auch
apikal (AP). In diese Auswertung werden nur Tiere einbezogen, die 28 Tage
überleben und deren Infarktgröße mindestens 30% beträgt. Ausgewertet
werden sowohl Tiere aus der 2 Tage-MI-Gruppe als auch 5 Tage-MI-Gruppe.
Sowohl in der Kontroll- als auch in der Behandlungsgruppe kommt es zu einer
Vergrößerung der linksventrikulären Innenflächen, die jedoch bei den
Clodronat-Liposom behandelten Tieren gegenüber PBS-Liposom
abgeschwächt war. Bei der enddiastolischen Fläche auf papillärer Ebene (EDA-
PA) und bei der endsystolischen Fläche auf apikaler Ebene (ESA-AP) wurde
sogar bei der 2 Tage-MI-Gruppe das Signifikanzniveau erreicht. Die
Verkürzungsfraktion fällt auf apikaler Ebene bei der 2-Tag-MI-Gruppe ebenfalls
signifikant höher aus. Wird das Clodronat erst später nach dem Infarkt
gegeben, wie bei der 5 Tage-MI-Gruppe, zeigte sich kein Unterschied zwischen
den Gruppen.
Da in den Clodronat-Gruppen sehr viele Tiere mit starken Veränderungen an
der Ventrikelstruktur starben und nicht in die Auswertung miteinbezogen
werden, können aus diesen Ergebnissen keine weiteren Schlüsse gezogen
werden. Bei den echokardiographischen Untersuchungen fiel jedoch auf, dass
sich bei den meisten Clodronat-behandelten Tieren ein Thrombus im linken
Ventrikel entwickelt hatte (Abb. 18). Dieser wird bei keinem Tier aus der PBS-
Liposom-Gruppe gefunden.
Tag 1 Tag 28 PBS-Lipo. Clodronat-
Lipo. PBS-Lipo. Clodronat-Lipo.
ESA-PA [mm²]
9,58±1,15 9,16±1,49 26,42±3,48 19,75±1,61
EDA-PA [mm²]
13,25±1,15 10,75±1,65 31,42±2,29 24,17±1,75*
ESA-AP [mm²]
10,75±1,13 10,17±0,9 31,0±2,58 20,67±2,48*
EDA-AP [mm²]
12,75±0,71 11,83±1,1 32,83±2,38 23,58±3,27
ESD-PA [cm]
0,40±0,02 0,36±0,01 0,57±0,04 0,53±0,01
EDD-PA [cm]
0,47±0,01 0,42±0,02
0,64±0,02 0,59±0,01
40
ESD-AP [cm]
0,41±0,02 0,41±0,02 0,65±0,03 0,53±0,03*
EDD-AP [cm]
0,45±0,01 0,44±0,02 0,67±0,03 0,57±0,04
2D-FS PA [%]
28,0±3,4 14,6±3,7 17,1±5,7 18,4±1,7
2D-FS AP [%]
16,3±4,1 13,0 ±1,5 5,8±1,2 11,7±1,7*
Abb. 14: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchungen an PBS-Liposom oder Clodronat-Lipsom Injektion 2 Tage vor dem Myokardinfarkt, am OP-Tag sowohl 2 und 4 Tage nach dem Infarkt. (* Signifikanzniveau erreicht, ESA: endsystolische Fläche, EDA: enddiastolische Fläche, EDD: enddiastolischer Durchmesser, ESD: endsystolischer Durchmesser, AP: apikal, PA: papillär, FS: fractional shortening – Verkürzung in %) Am 28. Tag wird bei EDA-PA, ESA-AP, ESD-AP und 2D-FS-AP das Signifikanzniveau erreicht (p<0,05)
Tag 1 Tag 28 PBS-Lipo. Clodronat-Lipo. PBS- Lipo. Clodronat-Lipo.
ESA-PA [mm²] 9,22±0,62 7,71±0,83 18,50±0,67 15,40±0,94 EDA-PA [mm²] 11,11±1,06 9,88±0,90 22,44±1,25 20,23±1,20 ESA-AP [mm²] 9,0±0,39 7,88±0,64 17,50±0,17 17,08±1,22 EDA-AP [mm²] 10,89±0,59 10,08±0,63 21,67±0,67 20,42±1,25 ESD-PA [cm] 0,36±0,01 0,33±0,02 0,49±0,02 0,48±0,02 EDD-PA [cm] 0,42±0,01 0,39±0,01 0,55±0,02 0,55±0,01 ESD-AP [cm] 0,37±0,02 0,35±0,02 0,51±0,04 0,48±0,02 EDD-AP [cm] 0,40±0,01 0,40±0,01 0,54±0,03 0,52±0,02 2D-FS PA [%]
16,5±2,7 22,7±2,9 17,4±1,6 23,7±2,8
2D-FS AP [%]
17,2±1,1 22,5±3,1 19,2±1,7 16,7±2,0
Abb. 15: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchungen an PBS-Liposom oder Clodronat-Lipsom Injektion 5 Tage nach dem Myokardinfarkt (* Signifikanzniveau erreicht, ESA: endsystolische Fläche, EDA: enddiastolische Fläche, EDD: enddiastolischer Durchmesser, ESD: endsystolischer Durchmesser, AP: apikal, PA: papillär, FS: fractional shortening – Verkürzung in %) Es zeigen sich keine signifkante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen.
41
Abb. 16: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchung für die enddiastolische Fläche (mm²) auf Papillarmuskelhöhe (EDA-PA) in der Behandlungs- und Kontrollgruppe. (Tiere werden 2 Tage vor der Operation, am Tag der Operation sowie 2 und 4 Tage nach der Operation behandelt) Hier wird am 28. Tag ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gemessen. (PBS-Liposom 31,42±2,29 gegen Clodronat-Liposom 24,17±1,75) (p<0.05)
0
5
10
15
20
25
30
35
Tag 1 Tag 7 Tag 28
ED
A-A
P (
mm
²)
PBS-Liposom - 2Tag-MI-Gruppe
Clodronat-Liposom - 2Tag-MI-Gruppe
Abb. 17: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchung für die enddiastolische Fläche (mm²) auf apikaler Ebene (EDA-AP) sowohl in der Behandlungs- als auch Kontrollgruppe. (Tiere werden ebenfalls 2 Tage vor der Operation, am Tag der Operation sowie 2 und 4 Tage nach der Operation behandelt) Hier kann zwar am 28. Tag ein Trend zu einer geringeren Fläche bei der Clodronat-Gruppe festgestellt werden, allerdings keine Signifikanz. (PBS-Liposom 32,83±2,38 gegen Clodronat-Liposom 23,58±3,27)
42
Abb. 18: Bild aus einer echokardiographischen Untersuchung. Sichtbarer Thrombus im linken Ventrikel bei einem mit Clodronat behandelten Tier
3.4 Auswirkungen der Injektion von Clodronat auf da s Gerinnungssystem
Wie bereits in Abbildung 18 beobachtet, zeigt sich in der Clodronat-Gruppe
bereits 24 Stunden nach dem Myokardinfarkt echokardiographisch ein
Thrombus. Da dieser auch durch Veränderungen am Koagulationssystem
entstehen kann, wird die Plättchenaggregation an kleinen Arteriolen nach einer
Verletzungsinduktion mit Eisenchlorid durch eine Fluoreszenzmikroskopie
beobachtet. Diese Untersuchung wird an 6 Mäusen aus der Kontroll- und 5
Mäusen aus der Behandlungsgruppe durchgeführt. In der Abbildung 19 ist zu
erkennen, dass zwischen der Behandlungs- und Kontrollgruppe kein
wesentlicher Unterschied besteht. Innerhalb von 5 Minuten nach der Verletzung
kann bei beiden die Bildung eines kleinen Thrombozytenaggregates, später
innerhalb von 30 Minuten ein Verschluss des kompletten Gefäßes gesichtet
werden.
43
Abb. 19: Bild der Plättchenaggregation in kleinen Arteriolen nach einer Verletzungsinduktion mittels Eisenchlorid, beobachtet unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zwischen der Behandlungsgruppe (Clodronat-Gabe) und der Kontrollgruppe (PBS-Liposom) zeigen sich keine Unterschiede.
3.5 Auswirkungen der Makrophagendepletion auf Heilu ngsvorgänge am
Herzmuskel
Eine entscheidende Aufgabe von Makrophagen bei der Wundheilung ist unter
anderem das Abräumen von nekrotischen Kardiomyozyten und Zellabfall. Um
dieses Material sowie Kollagenfasern und Granulationsgewebe darstellen zu
können, eignet sich insbesondere die Masson-Trichrom-Färbung. Hierbei wird
nicht nur ein Herzschnitt drei und sechs Tage nach dem Infarkt gefärbt, sondern
44
auch zum Vergleich ein Herz mit einer durchgeführten Schein-OP (SHAM-OP).
Dies bedeutet, dass alle Schritte der Operation, wie unter Punkt 2.2
beschrieben, durchgeführt werden, allerdings das Gefäß nicht ligiert wird.
Hierbei wird deutlich, dass in den mit Clodronat behandelten Mäusen auch noch
sechs Tage nach dem Infarkt eine Vielzahl von unabgeräumten Zellabfall
vorhanden ist. Zudem zeigt sich sechs Tage nach dem Infarkt in dieser Gruppe
deutlich mehr Granulationsgewebe als in der PBS behandelten Gruppe.
Zwischen den beiden SHAM-operierten Tieren zeigt sich kein Unterschied.
Abb. 20: Bild zeigt eine Masson-Trichrom-Färbung zu Darstellung von Zellabfall und Granulationsgewebe an Herzen drei und sechs Tage nach dem Infarkt aus beiden Behandlungsgruppen. Zusätzlich wird für beide Behandlungsgruppen zum Vergleich eine Schein-operierte Maus (SHAM) mit Clodronat-Liposom oder PBS-Liposom behandelt und gefärbt.
Neben dem Abräumen von abgestorbenen Kardiomyozyten und Zellmüll
produzieren die Makrophagen auch Metalloproteinasen, die unter anderem für
die Degradierung der extrazellulären Matrix zuständig sind. Von besonderem
Interesse ist die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9), deren Auswirkungen auf
die Infarktheilung schon in mehreren Studien demonstriert wurden (Ducharme,
45
Frantz et al. 2000). Durch einen ELISA-Assay wird die Veränderung von MMP-9
durch eine Behandlung mit Clodronat untersucht. Dabei ergibt sich ein
signifikant erhöhtes MMP-9 bei der Behandlungsgruppe (4,2±0,1) verglichen mit
der Kontrollgruppe (1,1±0,04).
Abb.21: Mittels ELISA-Assay wird MMP-9 in den beiden Gruppen gemessen. Dabei ergibt sich ein signifikanter Unterschied (p=0,04) zwischen der Behandlungsgruppe (4,2±0,1) und der Kontrollgruppe (1,1±0,04)
Weitere wichtige Faktoren in der Wundheilung sind die Bildung einer Narbe
sowie die Neubildung von Gefäßen. Für die Untersuchung wird aus dem
Gewebe von 7 Tieren aus der Behandlungs- und 5 Tieren aus der
Kontrollgruppe eine RT-PCR durchgeführt, in der neben Collagen-1 auch TGF
und VEGF gemessen wird. TGF bleibt zwischen den Gruppen nahezu
unverändert (Behandlungsgruppe: 0,5±0,1; Kontrollgruppe: 0,8±0,1). Collagen-
1 ist durch die Clodronat-Behandlung signifikant reduziert (Behandlungsgruppe:
0,8±0,2; Kontrollgruppe: 2,4±0,2). VEGF, ein sehr wichtiger Parameter für die
Neovaskularisierung, ist hingegen signifikant erhöht in den Clodronat-
behandelten Tieren (Behandlungsgruppe: 0,3±0,1; Kontrollgruppe: 0,1±0,1).
46
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
TGF
TG
F (
ng) Behandlungsgruppe - Clodronat-
Liposom
Kontrollgruppe - PBS-Liposom
Abb. 22: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. TGF zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen Behandlungsgruppe (0,5±0,1) und Kontrollgruppe (0,8±0,1) (p=n.s.).
Abb. 23: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. Die Collagen-1 Produktion ist in der Behandlungsgruppe (0,8±0,2) gegenüber der Kontrollgruppe (2,4±0,2) signifikant (p<0,001) verringert.
47
Abb. 24: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. Die VEGF-Produktion ist in der Behandlungsgruppe (0,3±0,1) gegenüber der Kontrollgruppe (0,1±0,1) signifikant erhöht (p=0.04).
3.6 Auswirkungen der Clodronatgabe auf die Infarkte xpansion
Veränderungen in der Architektur des linken Ventrikels sind ein entscheidender
Anpassungsfaktor nach einem akuten Myokardinfarkt. Aus diesem Grund
werden auch die Unterschiede in der Infarktexpansion an 12 Mäusen aus der
Clodronat- und 7 Mäusen aus der PBS-Gruppe untersucht. In diesem
Versuchsteil werden den Mäuse 2 Tage vor der OP, am Tag der OP sowie 2
und 4 Tage nach der OP Clodronat injiziert. Die Infarktgrößen zwischen den
beiden Gruppen sind nahezu identisch (Behandlungsgruppe: 49,36±3,6;
Kontrollgruppe: 45,34±4,49) und somit auch untereinander vergleichbar. Bei der
Infarktexpansion zeigte sich kein signifikanter Unterschied
(Behandlungsgruppe: 0,79±0,1; Kontrollgruppe: 0,72±0,2).
48
0
10
20
30
40
50
60
Infarktgröße
Infa
rktg
röß
e (in
%)
Behandlungsgruppe - Clodronat-Liposom
Kontrollgruppe - PBS-Liposom
Abb. 25: Die Grafik demonstriert die ermittelte Infarktgröße in den beiden Gruppen. Hierbei sind die Gruppen somit vergleichbar, es zeigt sich kein signifikanter Unterschied. (Behandlungsgruppe: 49,36±3,6; Kontrollgruppe: 45,43±4,49)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Infarktexpansion
Infa
rkte
xpan
sion
sind
ex
Behandlungsgruppe - Clodronat-Liposom
Kontrollgruppe - PBS-Liposom
Abb. 26: Skizze zeigt die errechnete Infarktexpansion. Dabei findet sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe (0,79±0,1) und der Kontrollgruppe (0,72±0,2)(p=n.s.).
3.7 Auswirkungen der Clodronatinjektion auf die End othelzellen nach
einem Myokardinfarkt
Als eindrucksvoller Befund kann in den echokardiographischen
Untersuchungen nach dem Infarkt in mit Clodronat behandelten Tieren ein
großer Thrombus im linken Ventrikel beobachtet werden. Diese Veränderungen
können auch an Tieren mit einer kleinen Infarktgröße gefunden werden. Durch
Untersuchungen der Plättchenaggregation an kleinen Arteriolen können zudem
49
Einflüsse des Koagulationssystems ausgeschlossen werden. Da sich die
Thromben bereits in den ersten 24 Stunden nach dem Infarkt entwickeln,
können Auswirkungen durch das Remodeling nahezu ausgeschlossen werden.
Im weiteren Verlauf wird deshalb durch eine immunhistochemische Färbung mit
CD31 das Endothel angefärbt. Während in der Clodronat-Gruppe ein Defekt im
Endothel sichtbar wird, kann dieser in der Kontrollgruppe sowie bei SHAM-
operierten Tieren nicht beobachtet werden.
Abb. 27: Übersicht zeigt mikroskopische Aufnahmen nach einer Anfärbung eines Herzens sowohl aus der Kontroll- als auch Behandlungsgruppe. Die beiden linken Abbildungen veranschaulichen das sichtbar infarzierte Herz nach einer PBS-Färbung. Die rechte Aufnahme demonstriert die Endothelfärbung mit dem Defekt bei dem Clodronat behandelten Herzen.
4. Diskussion
Nach einem Myokardinfarkt werden auch am Herzen Reparaturvorgänge
ausgelöst, die in die Phase der Inflammation, der Proliferation sowie der
endgültigen Narbenbildung unterteilt werden können. Durch diese Maßnahmen
soll die Funktion des Gewebes erhalten bleiben (Frantz, Bauersachs et al.
2009). Entzündungszellen spielen insbesondere in der ersten Phase eine
entscheidende Rolle (Frangogiannis 2008), hierunter auch vor allem die
Monozyten. In dieser Studie wird die zentrale Bedeutung von Monozyten auf die
Heilungsvorgänge nach einem Myokardinfarkt untersucht. Die Ausschaltung
50
von Monozyten erfolgt über Clodronat-Liposom, eine bereits seit vielen Jahren
erfolgreich benutzte Methode (van Rooijen and Hendrikx 2010). In dieser Studie
zeigt sich durch eine FACS-Untersuchung in der Behandlungsgruppe eine
Reduktion der Monozyten im peripheren Blut, zudem liegt immunhistochemisch
drei Tage nach dem Infarkt in der Behandlungsgruppe eine deutliche Reduktion
der Monozyten im infarzierten Gewebe vor. Die Depletion von Monozyten
konnte somit durch die Verwendung von Clodronat-Liposom erreicht werden.
In den Echokardiographieuntersuchungen fällt bei den Clodronat-behandelten
Tieren schon am ersten Tag nach dem Infarkt ein Thrombus auf, der einen sehr
großen Anteil des Lumens einnimmt. Im Vergleich zwischen den Gruppen wird
deutlich, dass dieser Thrombus ausschließlich bei infarzierten Tieren auftritt und
bei keinem einzigen Schein operierten Tier zu finden ist. Ebenso ist in der PBS-
Liposom-Gruppe kein einziges Tier mit einem Thrombus zu erkennen. Ein
Zusammenhang mit der Infarktgröße kann nicht gefunden werden. Diese
Beobachtung geht einher mit einer deutlich erhöhten Mortalität in der
Behandlungsgruppe, die wohl auf diese Thrombusformation sowie
nachfolgende thromboembolische Ereignisse zurückzuführen ist.
Wie oben beschrieben, werden thromboembolische Ereignisse nicht in der
Gruppe der Schein operierten Tiere mit Clodronat-Behandlung gesehen, so
dass eine direkte schädigende Auswirkung der Operation auf das
Gerinnungssystem ausgeschlossen werden kann. Für eine weitere Klärung der
Ursache wird auch die Thrombozytenaggregation näher untersucht. In einem
Versuch wird mittels Verletzungsinduktion durch Eisenchlorid mehrere Tiere
sowohl aus der Kontroll- als auch Behandlungsgruppe unter einem Mikroskop
bezüglich einer Okklusion beobachtet. Hierbei kann kein Unterschied zwischen
den Gruppen gefunden werden. Durch diese Untersuchungen können somit
Veränderungen am Koagulationssyndrom als Ursache ausgeschlossen werden.
Nach aktueller Recherche der wissenschaftlichen Literatur gibt es derzeit auch
keinen nachgewiesenen Zusammenhang zwischen der Gruppe der
Bisphosphonate, zu denen Clodronat gehört, und der Entwicklung von
Thromben sowie nachfolgenden thromboembolischen Ereignissen, so dass
51
davon ausgegangen werden kann, dass die Entstehung dieser Thromben auf
die Depletion von Monozyten und nicht auf direkte Effekte des Medikaments
Clodronat-Liposom zurückzuführen ist.
In den echokardiographischen Untersuchungen zeigte sich der Thrombus
bereits innerhalb der ersten 24 Stunden. Später ablaufendes Remodeling im
Rahmen des Heilungsvorganges kann somit als Ursache ebenfalls
ausgeschlossen werden. Zur weiteren Klärung wurden sowohl aus der Kontroll-
als auch der Behandlungsgruppe histologische Schnitte mit CD31 zur
Darstellung des Endothels gefärbt. Bereits 24 Stunden nach dem Infarkt und
auch vor der Bildung eines Thrombus lässt sich bei den Clodronat-behandelten
Tieren an der Endothelschicht ein Defekt nachweisen. Auch bei zeitlich
späteren Färbungen zeigt sich diese Lücke weiterhin. Zusammenfassend kann
nun davon ausgegangen werden, dass dieser Endothelschichtdefekt auf die
Depletion von Monozyten, wohl insbesondere der Ly-6Clo-Monozyten
zurückzuführen ist.
Monozyten können in eine Gruppe mit Ly-6Chi mit einer hohen Expression von
Ly-6C sowie Ly-6Clo mit einer niedrigen Expression von Ly-6C unterteilt werden
(Auffray, Sieweke et al. 2009). Ly-6Clo-Monozyten nehmen im Blutstrom eine
sogenannte Wächterfunktion über das Endothel sowie das umliegende Gewebe
wahr. In einer Arbeit wurde gezeigt, dass insbesondere die Ly-6Clo-Gruppe für
den schnellen Austritt in das entzündete Gewebe innerhalb einer Stunde nach
Eintritt der Verletzung von entscheidender Bedeutung ist und zugleich für eine
Art Kontrollfunktion über den Heilungsvorgang verantwortlich sind (Auffray,
Fogg et al. 2007). Vorstellbar ist nun natürlich, dass bei Fehlen dieser Gruppe
Endotheldefekte nicht erkannt sowie behoben werden und damit im weiteren
Verlauf bei Adhäsion von Thrombozyten eine Thrombusbildung erfolgt.
Diese Beobachtung hat durchaus klinische Konsequenzen. Bei einem Teil der
Patienten mit Myokardinfarkt kommt es innerhalb der ersten Tage zur
Entwicklung eines Thrombus im linken Ventrikel. In einer Studie aus dem Jahr
1998 wird die Häufigkeit mit etwa 5% angegeben. Risikofaktoren stellen
insbesondere ein Infarkt im Bereich der Vorderwand sowie eine niedrige
Ejektionsfraktion dar (Asinger, Mikell et al. 1981; Keren, Goldberg et al. 1990;
52
Chiarella, Santoro et al. 1998). Ausgehend von dieser Thrombusbildung sind
die Patienten nun insbesondere durch thromboembolische Ereignisse wie einen
Schlaganfall gefährdet (Stratton and Resnick 1987). Die Häufigkeit von
Infarkten in anderen Organen ausgehend von einem linksventrikulären
Thrombus werden sehr kontrovers diskutiert, im Schnitt aber mit etwa 5%
angegeben (Johannessen, Nordrehaug et al. 1984). In Autopsien werden
verständlicherweise sehr viel mehr embolische Ereignisse als in klinischen
Studien entdeckt, da ein bestimmter Anteil der Thromboembolien ohne klinische
Symptomatik verläuft (Simpson, Oberman et al. 1980).
Bei ähnlicher Infarktgröße bildet sich bei einem bestimmten Patientenkollektiv
ein Thrombus, bei anderen dagegen nicht. Die genauen Mechanismen sind
beim Menschen bisher noch nicht verstanden. Nun zeigt sich, dass
Unterschiede in der Anzahl sowie Funktion der Monozyten hierfür verantwortlich
sein können. Klinische Studien mit der Messung der verschiedenen Monozyten-
Subtypen CD14+CD16- sowie CD14+CD16+ bei Patienten mit der Entwicklung
eines linksventrikulären Thrombus können deshalb ausgehend von den
Erkenntnissen dieser Studie neue Therapieoptionen aufzeigen.
.
Neben der Entwicklung eines linksventrikulären Thrombus werden in dieser
Studie auch Veränderungen in den langfristigen Heilungs- und
Reparaturvorgängen untersucht.
Durch die Depletion der Monozyten kommt es drei und sechs Tage nach dem
Infarkt zu einem deutlich verringerten Abräumen des Zellabfalles verglichen mit
der Kontrollgruppe. Dieser Effekt wurde auch an einem Cryo-Infarkt-Modell
beobachtet, das kürzlich veröffentlicht wurde. Dort ließ sich ein deutlicher
Unterschied sogar noch 28 Tage nach dem Infarkt nachweisen (van
Amerongen, Harmsen et al. 2007). Bei diesem Cryo-Modell wurde jedoch eine
Vereisung bei -196°C durchgeführt (van Amerongen, H armsen et al. 2007), die
nicht den physiologischen Vorgängen bei einem Myokardinfarkt entspricht.
Zudem waren die betroffenen Areale des Herzens sehr klein und aufgrund der
Methodik hauptsächlich epikardial gelegen. Zurückführen lässt sich die
eingeschränkte Abräumfunktion auf den Ausfall der Ly-6Chi-Monozyten, die für
53
Phagozytose, Proteolyse sowie die Initiierung der Inflammationsreaktion
verantwortlich sind.
Neben der Phagozytose sind für die langfristige Reparatur einer Narbe auch die
extrazelluläre Matrix von besonderer Bedeutung. Für die Organisation dieses
Bereiches nehmen die Matrixmetalloproteinasen sowie deren Inhibitoren einen
besonderen Platz ein. Diese Enzyme besitzen eine spezifische
Proteaseaktivität und haben somit einen bedeutenden Anteil am Remodeling
nach einem Myokardinfarkt. Die Ausschüttung erfolgt durch Entzündungszellen,
unter anderem Monozyten (Creemers, Cleutjens et al. 2001; Spinale 2007). Ein
bedeutendes Mitglied mit Bedeutung für den Myokardinfarkt ist die
Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9). Bereits vor einigen Jahren wurde gezeigt,
dass es bei MMP-9-Knockout-Mäusen zu einem abgeschwächten
linksventrikulären Umbauvorgang und somit einer weniger ausgeprägten
Dilatation kommt (Ducharme, Frantz et al. 2000). Auch beim Menschen stellte
sich heraus, dass es eine direkte Korrelation zwischen MMP-9-Plasmaspiegeln
und den nachfolgenden Remodeling-Vorgängen gibt (Kelly, Cockerill et al.
2007). MMP-9 hat somit einen bedeutenden Einfluss auf die
Reparaturvorgänge nach einem Infarkt. In dieser Studie zeigt sich eine deutlich
erhöhte Aktivität von MMP-9 in der Behandlungsgruppe gegenüber der
Kontrollgruppe. Die Menge von MMP-9 kann somit nicht alleine auf Monozyten
zurückgeführt werden. Die Ausschüttung dieses Zytokins erfolgt auch durch
andere Zellen wie neutrophile Granulozyten (Lindsey 2004) sowie Myozyten,
Fibroblasten und Endothelzellen (Lindsey, Escobar et al. 2006) und ist für
diesen Effekt verantwortlich.
Bei der langfristigen Organisation einer Narbe spielt insbesondere die
Fibrosierung eine wichtige Rolle. Es wurde deshalb TGF-β (transforming growth
factor β) untersucht, das eines der Schlüsselmediatoren im Übergang von der
Entzündungsphase zur Fibrosierung darstellt (Bujak and Frangogiannis 2007;
Frangogiannis 2008). Es besitzt daher eine entscheidende Rolle im Remodeling
(Frangogiannis 2006; Porter and Turner 2009), aber zudem auch für die
Neovaskularisation (Roberts, Sporn et al. 1986; Nah and Rhee 2009). In dieser
Studie zeigt sich unter Monozytendepletion eine verringerte, jedoch nicht
54
signifikante Abnahme von TGF-β. Neben Monozyten sind an der Freisetzung
auch hier noch andere Zellen beteiligt, die zur Produktion beitragen und dieses
Ergebnis erklären.
Im Rahmen der Narbenbildung nimmt in dem infarzierten Bereich der Anteil von
Kollagen immer weiter zu. Die Narbe bildet sich somit durch eine zunehmende
Vernetzung der Kollagenfasern. Dies führt jedoch auch zu einer erhöhten
Steifheit des Ventrikels und trägt folglich zur diastolischen Dysfunktion bei
(Dobaczewski, Gonzalez-Quesada et al. 2009). Aktivierte Myofibroblasten
spielen bei der Wundorganisation eine wichtige Rolle und sind die
Hauptproduktionsquelle für Kollagen (Cleutjens, Verluyten et al. 1995). Für die
Aktivierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten sind jedoch verschiedene
Faktoren nötig. Aus mehreren Studien ist bekannt, dass Makrophagen für die
Umwandlung besonders wichtig sind und einen Großteil der benötigten
Faktoren freisetzen (Desmouliere, Geinoz et al. 1993). In Übereinstimmung mit
dieser Aussage zeigte eine Studie von Yano et al., dass eine Vermehrung von
Makrophagen mit M-CSF (macrophage colony stimulating factor) zu einer
vermehrten Akkumulation von Kollagen führt (Yano, Miura et al. 2006). Auch in
den molekularen Analysen in dieser Studie ist der Anteil von Collagen-1 in der
Infarktnarbe nach Monozytendepletion signifikant verringert und ist somit auf
den Ausfall der Monozyten zurückzuführen.
Als Vorgang in der Kaskade von Reparaturvorgängen spielt auch die
Neubildung von Gefäßen eine wichtige Rolle. Neben TGF-β spielt dabei auch
VEGF (vascular endothelial growth factor) als Botenstoff eine bedeutende Rolle
(Thomas 1996). Dieser Wachstumsfaktor wird von verschiedenen Zellen nach
einem Infarkt ausgeschüttet und führt zur Neubildung von Gefäßen
(Frangogiannis 2008). In einigen Modellen wurde gezeigt, dass insbesondere
die Anzahl von Makrophagen in dem betroffenen Areal positiv mit der
Entstehung von Gefäßen korreliert ist (Manoonkitiwongsa, Jackson-Friedman et
al. 2001). Aus diesem Grund wurde auch die Auswirkung einer
Monozytendepletion auf die Menge von VEGF untersucht. In dieser Studie zeigt
sich jedoch eine signifikante Erhöhung von VEGF in der Behandlungsgruppe.
Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass nach der
55
Untersuchung von Nahrendorf et al. insbesondere Monozyten aus der Gruppe
der Ly-6Clo eine große Menge von VEGF beinhalten (Nahrendorf, Swirski et al.
2007). Somit kann ein Überwiegen dieser Zellen in der Behandlungsgruppe für
die große Menge von VEGF verantwortlich sein. Ob durch dieses Menge dieses
Wachstumsfaktors auch tatsächlich mehr Gefäße entstehen oder ob es sich
nur um eine zeitabhängige Auswirkung der Clodronatgabe auf die Depletion
bestimmter Zellgruppen handelt, muss noch durch weitere Untersuchungen
geprüft werden.
Durch Umbauvorgänge nach einem Infarkt kann sich am Herzen eine
linksventrikuläre Dilatation ausbilden, die zu einer erhöhten Rate an
Herzinsuffizienz sowie folglich reduziertem Gesamtüberleben führt (Pfeffer and
Braunwald 1990). Der Einfluss von Monozyten auf diesen Vorgang lieferte bis
jetzt in der Literatur kein klares Ergebnis. Die Studie von Maekawa et al. an
Patienten nach Reperfusion zeigte bei Monozytose als Ergebnis eine
verschlechterte linksventrikuläre Funktion (Jugdutt 2002; Maekawa, Anzai et al.
2002), während Hojo et al. an Patienten nach Myokardinfarkt eine positive
Korrelation zwischen Gehalt an Monozyten sowie VEGF und der
linksventrikulären Funktion fand (Hojo, Ikeda et al. 2000). In einer Studie am
Menschen konnte sogar durch die Injektion einer aktivierten
Makrophagensuspension ein Verbesserung der Ventrikelfunktion erreicht
werden (Leor, Rozen et al. 2006). In diesen Studien wurde jedoch nur der
Gehalt an Monozyten gemessen und keine Unterscheidung zwischen den
einzelnen Subgruppen getroffen. Auch in den Versuchsreihen zu dieser Studie
wurden durch die Clodronatgabe alle Monozytensubtypen entfernt, es zeigt sich
somit übereinstimmend mit den Ergebnissen aus den Literatur keine
signifikante Veränderung der Infarktexpansion. In einer kürzlich veröffentlichten
weiterführenden Studie durch Tsukioka et al. wurde nun die unterschiedliche
Mobilisation der Monozytensubtypen beim Menschen nach einem
Myokardinfarkt untersucht. Dabei fand sich, dass insbesondere der Anstieg der
CD14+CD16-Monozyten negativ mit der Kontraktilität der linken Ventrikels
assoziiert ist (Tsujioka, Imanishi et al. 2009). CD14+CD16-Monozyten
entsprechen Ly6C+-Monozyten bei der Maus. Unterstützt wird diese
56
Beobachtung auch durch ein Mausmodell mit einer Ly-6Chi-Monozytose , die
ein deutlich schlechteres linksventrikuläres Remodeling aufwiesen (Panizzi,
Swirski et al. 2010).
Durch diese Studie kann der entscheidende Einfluss der Monozyten auf die
Reparaturvorgänge nach einem Myokardinfarkt gezeigt werden. Insbesondere
die Verteilung der einzelnen Subtypen scheint einen wichtigen Stellenwert zu
haben. Durch die Depletion von Monozyten kommt es neben der Verringerung
der Abräumvorgange auch zu einer verringerten Bildung von Kollagenfasern.
Zudem wird gezeigt, dass es aufgrund eines Endotheldefektes zur Bildung
eines linksventrikulären Thrombus kommt. Diese Komplikation ist auch beim
Menschen bekannt und stellt ein deutliches Risiko für ein thrombembolisches
Geschehen mit Infarktbildung in anderen Organen wie zum Beispiel dem Gehirn
mit Folge eines Schlaganfalles dar. Dieses neue Wissen kann somit dazu
beitragen, Therapieoptionen zu entwickeln, um einen optimalen
Heilungsprozess nach einem Myokardinfarkt anzustoßen und somit
thrombembolische Ereignisse zu verhindern.
57
5. Zusammenfassung
Beim Myokardinfarkt führt die Unterbrechung der Blutversorgung zur Nekrose
von Myozyten. Hierauf werden im Rahmen der Entzündungsreaktion
verschiedene Reaktionen angestoßen, die dazu dienen sollen, die Integrität und
Funktion des Herzens zu erhalten. Einen wichtigen Anteil an der
Inflammationsreaktion haben die Monozyten, deren Funktion in diesem
Rahmen bis jetzt nur wenig erforscht ist. In dieser Studie wurde die Rolle von
Monozyten auf die Heilungsvorgänge nach einem Infarkt untersucht. Durch die
Gabe von Clodronat-Liposom wurden in der Behandlungsgruppe die Monozyten
ausgeschaltet. Es zeigte sich, dass die Mortalität in der Behandlungsgruppe
aufgrund der Bildung eines linksventrikulären Thrombus deutlich erhöht ist.
Dieser war bereits innerhalb der ersten 24h in den echokardiographischen
Untersuchungen sichtbar. Veränderungen im Gerinnungssystem konnten als
Ursache ausgeschlossen werden. Durch eine CD-31-Färbung wurde deutlich,
dass in den infarzierten Herzen der Behandlungsgruppe ein Defekt im
Endokard entstanden war, der als Ursache für die Entstehung der Thromben
gewertet werden kann. Zudem wurde in der Behandlungsgruppe neben einem
verschlechterten Abräumvorgang eine signifikant erniedrigte Kollagen-1-
Produktion, ein erhöhtes MMP-9, ein leicht erniedrigtes TGF sowie erhöhtes
VEGF gemessen. In dieser Studie wurde somit gezeigt, dass Monozyten ein
essentieller Bestandteil der Heilungsvorgänge nach einem Infarkt sind. Durch
eine eingeschränkte Monozytenfunktion wird zudem aufgrund von Defekten im
Endothel die Bildung eines linksventrikulären Thrombus und folgender
thromboembolischer Ereignisse begünstigt.
58
6. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Entwickung und Differenzierung von Monozyten und Makrophagen S. 4
Abb. 2: Balance zwischen den Monozyten-Subtypen nach einem Infarkt S. 5
Abb. 3: Prinzip der FACS-Analyse S. 19
Abb. 4: Parameter FSC und SCC bei der FACS-Analyse S. 19
Abb. 5: Grundprinzip der Avidin-Biotin-Methode S. 22
Abb. 6: Grundprinzip der ELISA-Methode S. 25
Abb. 7: cDNA-Synthese S. 30
Abb. 8: PCR-Synthese S. 32
Abb. 9: Besonderheit der rtPCR S. 33
Abb. 10: Auswirkung der Clodronatinjektion auf Monozyten und T-Zellen S. 36
Abb. 11: Auswirkung der Clodronatinjektion auf Monozyten im peripheren Blut
S. 37
Abb. 12: Auswirkung der Clodronatinjektion auf neutrophile Granulozyten S. 37
Abb. 13: Auswirkung der Clodronatinjektion auf die Mortalitätsrate S. 38
Abb. 14: Ergebnisse der echographischen Messungen bei der 2 Tage Gruppe
(Injektion von Clodronat 2 Tage vor dem Infarkt) S. 39
Abb. 15: Ergebnisse der echographischen Messungen bei der 5Tage Gruppe
(Injektion von Clodronat 5 Tage nach dem Infarkt) S. 40
Abb. 16: Ergebnisse der echographischen Messungen für die enddiastolische
Fläche auf Papillarmuskelhöhe (EDA-PA) S. 41
Abb. 17: Ergebnisse der echographischen Messungen für die enddiastolische
Fläche auf apikaler Ebene (EDA-AP) S. 41
Abb. 18: sichtbarer Thrombus in der echographischen Untersuchung S. 42
Abb. 19: Plättchenaggregation in den kleinen Arteriolen nach einer
Verletzungsinduktion mittels Eisenchlorid S. 43
Abb. 20: Masson-Trichrom-Färbung mit Darstellung von Zellabfällen und
Granulationsgewebe S. 44
Abb. 21: Darstellung der Ergebnisse des MMP-9-ELISA S. 45
Abb. 22: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für TGF-β S. 46
Abb. 23: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für Collagen-1 S. 46
59
Abb. 24: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für VEGF S.47
Abb. 25: Darstellung der Infarktgröße bei den Tieren für die
Infarktexpansionsmessung S. 48
Abb. 26: Darstellung der Ergebnisse der Infarktexpansionsmessung S. 48
Abb. 27: mikroskopische Aufnahme des Endothels nach PSR-Färbung sowie
Färbung von CD31 S. 49
60
7. Literaturverzeichnis
Asinger, R. W., F. L. Mikell, et al. (1981). "Incidence of left-ventricular
thrombosis after acute transmural myocardial infarction. Serial evaluation
by two-dimensional echocardiography." N Engl J Med 305(6): 297-302.
Auffray, C., D. Fogg, et al. (2007). "Monitoring of blood vessels and tissues by a
population of monocytes with patrolling behavior." Science 317(5838):
666-670.
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634.
Danksagung
Herzlichen Dank allen, die mir bei der Erstellung sowie während der Arbeiten im
Labor zur Seite gestanden haben.
Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Stefan Frantz für die
Überlassung des Themas sowie die konstruktive und zuverlässige
Unterstützung bei allen auftretenden Fragen und Problemen während der Arbeit
im Labor sowie bei der schriftlichen Anfertigung der Dissertation. Ebenso gilt ein
großer Dank auch dem Team der Arbeitsgruppe. Die gute Stimmung sowie
positive Einstellung hat sicherlich auch zu einem großen Teil für meine
Begeisterung für die Forschung beigetragen.
Ein Dank besonders an Frau Helga Wagner, die mich von Beginn an in das
exakte Arbeit mit allen Geräten im Labor einführte und somit sicherlich die
Grundlagen für eine genaue Arbeit legte, es aber mit ihrer Art auch schaffte,
mich genau für diese Arbeit im Labor zu begeistern. Ebenso ein Dank an Frau
Barbara Bayer, Frau Nadja Blömer sowie Frau Charlotte Dienesch, die mich
insbesondere bei den tierexperimentiellen Versuchen unterstützten und bei
allen Versuchen zur Seite standen und stets aufmunternde Worte insbesondere
bei Rückschlägen fanden. Vielen Dank auch an Herrn Prof. Dr. med. Christoph
Kleinschnitz für die Übernahme des Referates.
Zum Abschluss möchte ich auch bei meinen Eltern bedanken, die mich
während der gesamten Zeit unterstützt und gefördert haben. Ohne deren
Unterstützung wäre diese Arbeit sowie mein Studium sicher nicht möglich
gewesen.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Tobias Bobinger
Geburtsdatum 09.05.1982
Geburtsort Günzburg
Schulausbildung
1988-1992 Grundschule Dürrlauingen
1992-2001 St.-Thomas Gymnasium Wettenhausen
Zivildienst
2001-2002 Rettungsdienst BRK Dillingen/Donau
Berufsausbildung und Berufstätigkeit
2002-2004 Rettungsdienst BRK Günzburg/Donau
Ausbildung zum staatl. examinierten Rettungsassistenten
Hochschulausbildung
10/2004-09/2006 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität
Bochum, vorklinische Semester
08/2006 Ärztliche Vorprüfung (1. Staatsexamen)
10/2006-11/2010 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-
Universität Würzburg, klinische Semester
11/2010 2. Staatsexamen
Praktisches Jahr
1. Tertial Neurologie, Universitätsklinikum Würzburg
2. Tertial Innere Medizin, Strong Memorial Hospital, University of
Rochester, NY, USA
3. Tertial Chirurgie, Kantonsspital Winterthur, Schweiz
Berufstätigkeit nach der Hochschulausbildung
Seit 02/2011 Assistenzarzt in der Abteilung für Neurologie am
Universitätsklinikum Erlangen
Würzburg, den 03.02.2012
Tobias Bobinger
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