Efecto antibacteriano de una nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada sobre
periodontopatógenos relevantes en el paciente diabético tipo 2: estudio in vitro
Laura Patricia Lloreda Rey
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias de la Salud
Maestría en Investigación en Enfermedades Infecciosas
Bucaramanga
2019
Efecto antibacteriano de una nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada sobre
periodontopatógenos relevantes en el paciente diabético tipo 2: estudio in vitro
Laura Patricia Lloreda Rey
Código 17861016
Trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de Magíster en
Investigación en Enfermedades Infecciosas.
Director:
MSc Laura Viviana Herrera Sandoval
Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas
Co-directores:
PhD, MSc Sandra Milena Leal Pinto
Doctora en nanociencia y nanobiotecnología.
MSc Luz Mery Méndez Díaz.
Magíster en Microbiología.
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias de la Salud
Maestría en Investigación en Enfermedades Infecciosas
Bucaramanga
2019
ii
“Porque todo, absolutamente todo en el cielo y en la tierra, visible e invisible......todo comenzó
en él y para los propósitos de él”.
Colosenses 1:16
“VIVIR CON UN PROPÓSITO ES EL CAMINO”
iii
Dedicatoria
¡A ti padre amado por permitirme seguir disfrutando de esta hermosa experiencia que es vivir!
A mis amados y recordados abuelos, a mi segunda madre, tía lizzeth a quienes con su pérdida
tan temprana enfocaron mis esfuerzos y mi propósito de vida, afianzando mi vocación hacia el
servicio de cada paciente diabético.
A mis padres por su apoyo, comprensión por mis ausencias, valoro cada día de mi vida su
esfuerzo y consejos orientados a lograr mi felicidad.
A Camilo mi hijo, mis oraciones para que encuentre en su profesión, el verdadero sentido de
la vida,” servir con amor”.
A mi esposo Iván Ramiro, a quién agradezco su apoyo, comprensión y compartir mi visión de
futuro.
iv
Agradecimientos
A cada uno de mis docentes por despertar mi interés en la investigación; especialmente a la
Doctora Laura Herrera, Doctora Sandra Leal, Doctora Luz Mery Méndez y Doctora Liliana García,
por su aporte a mi formación no sólo académica sino de vida; espero que nuestro Padre bendiga
su labor para que se vea reflejado en otros su propósito.
Al Doctor Carlos Calderón y su Fundación Santandereana de Diabetes por el acompañamiento
y confianza en este proceso formativo y la oportunidad de pertenecer a su grupo interdisciplinario
logrando llevar a la práctica el saber adquirido.
A cada integrante del grupo de la UDES Y USTA, especialmente los del área de laboratorios
por permitirme entrar en su espacio no sólo físico sino en sus equipos de trabajo; en sus relaciones
de camaradería y en su día a día. ¡Infinitas gracias!
v
Contenido
Pág.
Resumen .................................................................................................................................. 13
Abstract ................................................................................................................................... 15
Introducción ............................................................................................................................ 17
1. Estado del arte ............................................................................................................ 20
1.1. Enfermedad Periodontal (EP) ................................................................................. 20
1.2. Diabetes Mellitus (DM) ............................................................................................... 27
1.3. Terapia Fotodinámica (TFD) ....................................................................................... 30
1.3.1. Fotosensibilizadores. ............................................................................................. 32
1.3.2. TFD como tratamiento bactericida. ....................................................................... 37
2. Objetivos ............................................................................................................................. 40
2.1. Objetivo General .......................................................................................................... 40
2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 40
3. Materiales y Métodos .......................................................................................................... 41
3.1. Tipo de estudio ............................................................................................................. 41
3.2. Materiales ..................................................................................................................... 41
3.2.1. Compuestos. .......................................................................................................... 41
3.2.1.1. Nanoemulsión óleo/agua de ftalocianina de aluminio clorada (NE-PcAlC). 41
3.2.1.2 Vehículo. ........................................................................................................ 42
vi
3.2.1.3. Ftalocianina de aluminio clorada (PcAlC). ................................................... 42
3.2.1.4. Gluconato de clorhexidina 2% (GCX). ......................................................... 42
3.2.2. Cultivos Celulares. ................................................................................................ 42
3.2.3. Microorganismos Periodontopatógenos. ............................................................... 43
3.2.3.1. Preparación del inóculo ................................................................................. 44
3.3. Métodos ........................................................................................................................ 44
3.3.1. Sistema de irradiación para la TFD utilizada. ....................................................... 44
3.4 Ensayo De Citotoxicidad En Células De Mamífero...................................................... 48
3.4.1 Evaluación en controles. ........................................................................................ 48
3.5. Ensayo de Susceptibilidad Bacteriana......................................................................... 48
3.6. Análisis de Datos ......................................................................................................... 50
4. Resultados ........................................................................................................................... 51
4.1. Citotoxicidad Sobre Células De Mamífero .................................................................. 51
4.2. Susceptibilidad De Los Periodontopatógenos .............................................................. 53
5. Discusión ............................................................................................................................. 58
6. Conclusiones ....................................................................................................................... 67
Referencias Bibliográficas ...................................................................................................... 68
vii
Lista de Figuras
Pág.
Figura 1 Nueva clasificación de la enfermedad periodontal y peri-implantar. ............................ 21
Figura 2 Modelo de patogenia de la Enfermedad Periodontal. .................................................... 22
Figura 3 Modelo polimicrobiano de disbiosis de etiología de la Enfermedad Periodontal.. ........ 23
Figura 4 Diagrama de la asociación entre especies subgingivales.. ............................................. 25
Figura 5 Características clínicas de la enfermedad periodontal asociada a DM. ......................... 28
Figura 6 Esquema TFD, activación de FS.................................................................................... 31
Figura 7 Esquema TFD, activación de FS.................................................................................... 32
Figura 8 Estructura Química de Ftalocianina de aluminio clorada (PcAlCl). ............................. 36
Figura 9 Cultivo de células epiteliales VERO. ............................................................................ 43
Figura 10 Sistema de irradiación. Láser LED (400-700nm) ........................................................ 45
Figura 11Condiciones de irradiación del láser LED (400-700nm) .............................................. 45
viii
Lista de Tablas
Pág.
Tabla 1 Clasificación por familia de los agentes fotosensibilizadores. ........................................ 33
Tabla 2 Revisión Condiciones Terapia Fotodinámica sobre periodontopatógenos ...................... 46
Tabla 3 Citotoxicidad de diferentes formulaciones sobre células de mamífero ........................... 53
Tabla 4 Susceptibilidad bacteriana de Porphyromonas gingivalis sobre diferentes
compuestos .................................................................................................................................... 54
Tabla 5 Susceptibilidad bacteriana de Prevotella intermedia sobre diferentes compuestos ......... 56
Tabla 6 Susceptibilidad bacteriana de Aggregatibacter actinomycetemcomitans sobre
diferentes compuestos ................................................................................................................... 56
ix
Lista de Abreviaturas
EP: Enfermedad Periodontal
AAP: Academia Americana de Periodoncia
EFP: Federación Europea de Periodoncia
LPS: Lipopolisacáridos
RAR: Raspaje y Alisado Radicular
DM: Diabetes Mellitus
ADA: Asociación Americana de Diabetes
IDF: Federación Internacional de Diabetes
TFD: Terapia Fotodinámica
FS: Fotosensibilizador
MB: Azul de Metileno
TBO: Azul de Toluidina
ERO: Especies Reactivas de Oxígeno
MAPK: Proteínas Quinasas Activadas por Mitógenos
EEUU: Estados Unidos de América
x
UFC: Unidades Formadoras de Colonias
PcAlC: Ftalocianina de aluminio clorada
NE- PcAlC: Nanoemulsión de Ftalocianina de Aluminio Clorada
GCX: Gluconato de Clorhexidina
CHX: Clorhexidina
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria
CMB: Concentración Mínima Bactericida
(CC50): Concentración Citotóxica 50
(CC90): Concentración Citotóxica 90
BHI.: Medio infusión Cerebro Corazón.
DH: Diámetro Hidrodinámico
IPD: Índice De Polidispersión
DMSO: DiMetilSulfÓxido
PBS: Tampón Fosfato Salino
13
Resumen
Título: Efecto antibacteriano de una nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada sobre
periodontopatógenos relevantes en el paciente diabético tipo 2: estudio in vitro
Autor: Laura Patricia Lloreda Rey
Palabras Clave: fotosensibilizador, periodontopatógenos, citotoxicidad, terapia fotodinámica,
nanoemulsión
Descripción
La enfermedad periodontal (EP) y la diabetes mellitus (DM) son enfermedades crónicas con
una relación bidireccional. El tratamiento convencional para la EP es altamente invasivo, consiste
en la remoción mecánica de agentes microbianos de las superficies dentales. Investigaciones han
propuesto el uso de la terapia fotodinámica (TFD) como modalidad terapéutica prometedora para
el manejo de infecciones de la cavidad bucal. En este sentido, el objeto general fue determinar el
efecto antimicrobiano in vitro de una nanoemulsión de Ftalocianina de Aluminio Clorada (NE-
PcAlCl ) en combinación con la terapia fotodinámica sobre el crecimiento de periodontopatógenos
prevalentes en la enfermedad periodontal del paciente diabético tipo 2.
Metodológicamente, se evaluó el efecto antibacteriano de NE-PcAlCl y PcAlCl-libre contra
Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis y Aggregatibacter actinomycetemcomitans en
condiciones de anaerobiosis mediante el método de microdilución. La actividad citotóxica fue
evaluada en células Vero por el ensayo colorimétrico usando la sal de tetrazolio MTT. Para la TFD
se utilizó una fuente de luz LED a 4.83 julios/cm2 por 2 minutos. Controles sin irradiación fueron
probados bajo las mismas condiciones.
14
Los resultados demostraron efecto antibacteriano de la NE-PcAlCl contra P. intermedia con
CMI de 0,63 µM luego de la TFD, para el caso de P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans no se
encontró efecto de la NE-PcAlCl en las concentraciones evaluadas (> 20 µM) antes y después de
la TFD. Por otro lado, la PcAlCl-libre y en nanoemulsión mostraron ser fototóxicas sobre células
Vero (CC50 de 0,155 y 0,09 µM, respectivamente) sin registrar diferencias significativas entre ellas
(p<0.05). En este sentido, los resultados obtenidos sugieren el potencial uso de la TFD en
combinación con la NE-PcAlCl para la inhibición de P. intermedia, periodontopatógeno altamente
prevalente en el paciente diabético tipo 2.
15
Abstract
Title: Antibacterial project of a chlorinated aluminum phthalocyanine nanoemulsion on
relevant periodontopathogens in type 2 diabetic patient: in vitro studio
Author: Laura Patricia Lloreda Rey
Keywords: photosensitizer, periodontopathogens, cytotoxicity, photodynamic therapy,
nanoemulsio
Description:
Periodontal disease (PD) and diabetes mellitus (DM) are chronic diseases with a bidirectional
relationship. Conventional treatment for PE is highly invasive and involves the mechanical
removal of bacterial agents of the dental surface. Investigations have proposed the use of
photodynamic therapy (PDT) as a promising therapeutic modality for the management of
infections of the oral cavity. In this sense, the general purpose was to determine the in vitro
antimicrobial effect of a Chlorinated Aluminum Phthalocyanine (NE-PcAlCl) nanoemulsion in
combination with photodynamic therapy on the growth of periodontal disease in a type 2 diabetic
patient.
Methodologically, the antibacterial effect of NE-PcAlCl and free-PcAlCl were evaluated
against Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter
actinomycetemcomitans in anaerobic conditions by the microdilution method. Cytotoxic activity
was evaluated in Vero cells by colorimetric assay using the MTT tetrazolium salt. For the TFD an
LED light source at 4.83 joules /cm2 was used for 2 minutes. Controls without irradiation were
tested in the same conditions.
16
The results demonstrated the antibacterial effect of NE-PcAlCl against P. intermedia with MIC
of 0.63 µM after PDT. In the case of P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans, no effect of NE-
PcAlCl was found at the concentrations evaluated (> 20 µM) before and after PDT. On the other
hand, PcAlCl-free and nanoemulsion showed to be phototoxic on Vero cells (CC50 of 0.155 and
0.09 µM, respectively) without registering significant differences between them (p <0.05). In this
sense, the results obtained suggest the potential use of PDT in combination with NE-PcAlCl for
the inhibition of P. intermedia, periodontopathogen highly prevalent in the type 2 diabetic patient.
17
Introducción
La cavidad bucal de los humanos es el espacio biológico donde han sido detectadas más de 700
especies diferentes de bacterias; muchas de estas se adhieren a las superficies dentarias para iniciar
la formación de una biopelícula llamada Biofilm. La conformación de esta comunidad microbiana
está compuesta principalmente por grupos bacterianos aerobios y anaerobios que se establecen en
los espacios supra y subgingival respectivamente (Kampoo et al., 2014; Gleiznys et al., 2015;
Larsen & Fiehn, 2017; Xu et al., 2018; Kriebel et al., 2018; Verhulst et al., 2019).
La alteración de estas comunidades polimicrobianas (disbiosis), genera una reacción
inflamatoria exacerbada del hospedero pasando de proporcionada y resolutiva a desproporcionada
e irreversible denominada: Enfermedad Periodontal (EP);(Kinane, et al., 2017). La EP o
Periodontitis, es la respuesta de un complejo inflamatorio e inmunológico desencadenado por la
invasión de las bacterias formadoras de la placa bacteriana dental en el espacio periodontal (Moles
& Dorrego, 2005).
La EP es una condición muy común que afecta 40% a 60% de los adultos; esta patología se
presenta en sus formas más severas en 10% de la población mundial, es decir, representa cerca de
750 millones de personas (Kassebaum et al., 2014; Sanz et al., 2018). Diversos factores de riesgo
están descritos para la adquisición de esta patología periodontal que incluyen: trastornos
inmunitarios, defectos nutricionales, osteoporosis, fármacos inductores del crecimiento gingival,
factores genéticos y diabetes mellitus ((DM);(Pihlstrom, Michalowicz & Johnson, 2005).
La DM es una afección crónica de origen endocrino-metabólico no transmisible caracterizada
por niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia), debido a una incompetencia funcional
de las células beta del páncreas para producir suficiente cantidad de la hormona denominada
18
insulina, o la baja eficiencia de dicha hormona en el transporte de la glucosa del torrente sanguíneo
a todas las células del organismo para transformarse en energía (DM tipo 2);(DeFronzo,
Ferrannini, Alberti, Zimmet, & Alberti, (Eds.)2015; IDF, 2017).
La DM es una de las enfermedades crónicas con mayor impacto en la salud pública. Se ha
estimado que afecta a 425 millones de personas, y su prevalencia está aumentando de forma
continua (Vos et al; 2016; IDF, 2017). La federación internacional de diabetes estima que 425
millones de personas en todo el mundo presentan DM y se espera que este número ascienda a 629
millones en 2045.
La hiperglucemia no controlada, puede provocar daños a largo plazo en varios órganos y
generar complicaciones que incluyen enfermedades cardiovasculares, neuropatía, nefropatía o
enfermedades oculares que acaban en retinopatía y ceguera. Así mismo dentro de estas
complicaciones se encuentra la enfermedad periodontal (EP), la cual es considerada en la
actualidad como la sexta complicación de la DM junto a la mala cicatrización de heridas (Saini,
Saini & Sugandha, 2011; Stanko & Holla, 2014).
La EP es el resultado de la inflamación de los tejidos que soportan y sostienen las piezas
dentales en respuesta al biofilm que se puede formar en el periodonto; puede iniciar con una
gingivitis y luego desarrollarse a una periodontitis crónica que afecta las estructuras de soporte de
los dientes, y finalmente, si no es tratada conlleva a la pérdida de los mismos (Taylor, Graves, &
Lamster, 2014). Otros autores han indicado que la enfermedad periodontal puede ser de mayor
incidencia en pacientes con DM pobremente controlada en comparación con pacientes con DM
bien controlada o sin DM (Kaur et al., 2015; Taboza et al., 2018; Verhulst et al., 2019).
19
Existe una relación bidireccional entre la EP y la DM (Lalla & Papapanou, 2011; Bascones,
Gonzales & Sanz, 2014; Sanz et al., 2018). Los microorganismos responsables de la enfermedad
periodontal en este grupo poblacional han sido ampliamente identificados y por lo general se
encuentran: Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythia, Prevotella intermedia, Treponema.
dentícola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Castrillón et al., 2015).
Por esta razón, el objetivo del tratamiento periodontal en estos pacientes está enfocado en
controlar la disbiosis polimicrobiana en el espacio supra y subgingival (Mealey & Rose, 2008). El
manejo de la enfermedad periodontal incluye diversos enfoques de tratamiento convencionales
que consisten en métodos quirúrgicos y no quirúrgico como la técnica de raspaje y alisado radicular
(RAR);(Sigusch, Beier, Klinger, Pfister & Glockmann, 2001) e intervenciones como la terapia
fotodinámica (TFD), la cual es usada como un agente antimicrobiano contra las biopelículas
microbianas periodontales (Maisch, 2007).
Por consiguiente, es importante considerar la evaluación de nuevos abordajes terapéuticos que
sean menos invasivos y más eficaces como lo es la TFD junto con moléculas innovadoras como
los nanocompuestos para el manejo de la EP, terapias enfocadas en los periodontopatógenos
prevalentes en este grupo poblacional.
20
1. Estado del arte
1.1. Enfermedad Periodontal (EP)
La periodontitis (EP) es un trastorno inflamatorio crónico multifactorial que puede conducir si
no se trata a un daño irreversible de los tejidos de soporte (ligamento periodontal, encía, cemento
y hueso alveolar) que rodean los dientes, con la consiguiente pérdida dentaria (Nazir, 2017).
Estudios epidemiológicos demuestran que la periodontitis afecta 50% de la población adulta del
Reino unido y Estados unidos (White et al., 2012). La prevalencia de EP en Colombia es similar a
la presentada en otros países de Latinoamérica como Chile: 58.3%(Minsal., 2016; Oppermann,
Haas, Rösing, & Susin, 2014). De acuerdo al informe del Estudio de Salud Bucal (ENSAB IV,
2014), en Colombia este porcentaje es: 61.8%; la presentación clínica más frecuente es la
periodontitis moderada con 43.46%, seguida por 10.62% que representa la periodontitis severa.
Desde este punto de vista, la EP es un problema de salud pública a nivel global por su alta
prevalencia que requiere la atención de las ciencias biomédicas para generar conocimiento
aplicado sobre esta patología.
La Enfermedad Periodontal se caracteriza por la inflamación mediada por el hospedero y
asociada a los microorganismos, que produce la pérdida de la unión periodontal (Papapanou et al.,
2018). Esta definición de EP hace parte de la nueva clasificación de las enfermedades y
condiciones periodontales y peri-implantares realizada por la comunidad de académicos y clínicos
de la especialidad, en el marco del workshop mundial sobre la clasificación de enfermedades y
afecciones periodontales y periimplantarias co patrocinado por la Academia Americana de
Periodoncia (AAP) y la Federación Europea de Periodoncia (EFP) (Caton et al., 2018). La nueva
21
clasificación de enfermedades periodontales y afecciones Peri-implantares se resume en la figura
1 que condensa las patologías de acuerdo con las manifestaciones clínicas.
Figura 1 Nueva clasificación de la enfermedad periodontal y peri-implantar, Tomado y modificado de (Caton,
Armitage, Berglundh, Chapple, Jepsen, Kornman & Tonetti, 2018).
22
La EP inicia con la aparición de gingivitis (inflamación localizada de la encía) la cual es
generada por la acumulación de bacterias entre los dientes y la encía; denominada placa dental,
considerada como “biofilm microbiano” debido a que comprende la interacción de múltiples
especies microbianas en estado disbiótico. (Kinane, Stathopoulos & Papapanou, 2017) (figura 2).
Figura 2 Modelo de patogenia de la Enfermedad Periodontal. Tomado y modificado de Meyle & Chapple (Meyle &
Chapple, 2015).
La EP es el resultado de interacciones dinámicas. entre una comunidad microbiana bucal
altamente compleja y el sistema inmune del hospedero, Sin embargo, el modelo fisiopatológico de
esta afección periodontal no está claro (Teles, Teles, Frías-López, Paster, Haffajee, 2013).
23
Existen patrones etiológicos de la EP altamente aceptados: 1. la sinergia polimicrobiana: tiene
en cuenta tanto la extensa investigación sobre patógenos periodontales individuales como los
recientes hallazgos que sugieren que la periodontitis se desencadena por patógenos claves que
pueden alterar la respuesta inmune del hospedero creando en él una incompetencia para controlar
el crecimiento de la biopelícula periodontal (Biofilm). 2. la Disbiosis: donde se genera una pérdida
de la homeostasis microbiana creando un desbalance del equilibrio microbiano. (Figura 3)
Figura 3 Modelo polimicrobiano de disbiosis de etiología de la Enfermedad Periodontal. Modificado y adaptado de
Shaikh y colaboradores (Shaikh, Patil, Pangam & Rathod, 2018).
La inflamación no controlada del área periodontal puede surgir cuando las comunidades
microbianas complejas pasan de una entidad comensal a una patógena. La comunicación entre
24
especies constituyentes (Quorum sensing) conduce a una sinergia polimicrobiana entre organismos
metabólicamente compatibles que adquieren especialización funcional dentro de la comunidad en
desarrollo. Los agentes patógenos claves, incluso en baja abundancia, elevan la virulencia de la
comunidad, y la disbiósis resultante impacta la inmunidad del hospedero y así deshabilita aún más
la vigilancia inmune al tiempo que promueve una respuesta inflamatoria general.
Los organismos patógenos se benefician de los sustratos proteicos derivados de la degradación
inflamatoria del tejido. La inflamación y la disbiosis se refuerzan mutuamente y dan origen a una
comunidad patobionte. (Hajishengallis & Lamont, 2012; Hajishengallis, 2015). Con este panorama
toda intervención en el manejo de la EP es compleja debido a su multicausalidad; es por ello que
se requieren estudios clínicos enfocados a estos factores.
Si bien se reconoce este origen multifactorial en el desarrollo de la periodontitis, es relevante
la participación de la microbiota subgingival en la etiología de la EP. En sentido general, se ha
visto que la placa bacteriana subgingival es formada por bacterias anaerobias lo cual es opuesto al
biofilm que forma la placa supragingival (Kriebel et al., 2018). Así mismo, se debe considerar que
el biofilm en la cavidad bucal está formado por una comunidad polimicrobiana que no solo incluye
bacterias sino también hongos levaduriformes, especialmente del género Cándida spp también en
estrecha relación en el quorum sensing (Gleiznys, Zdanavič ienė & Žilinskas, 2015; Le Bars,
Kouadio, N’goran, Badran & Soueidan 2015; Zago et al., 2015; Lohse et al., 2018; Rodrigues et
al., 2019). Esta coordinación microbiana no sólo permite la estructuración del biofilm en una
matriz extracelular, sino también el desarrollo de complejas interacciones que incluyen entre otras,
patogenicidad, resistencia a antibióticos, antifúngicos y antisépticos (Lohse et al., 2018; Kriebel et
al., 2018; Verhulst et al., 2019).
25
Diversos estudios sugieren que los grupos de bacterias, (complejos bacterianos) presentan una
sinergia polimicrobiana en lugar de la acción individual de las mismas. Las especies microbianas
periodontales se asocian íntimamente y reciben el nombre de: complejo amarillo, complejo verde
y un complejo violeta; grupos colonizadores iniciales del espacio subgingival y suelen preceder a
la aparición del complejo naranja y complejo rojo cuyos integrantes son las especies que se
consideran los agentes etiológicos más importantes de la EP; entre ellos están Porphyromonas
gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema dentícola; y Prevotella intermedia (Deng, Szafrański,
Jarek, Bhuju & Wagner, 2017; Meuric et al., 2017; Shaikh, Patil, Pangam & Rathod, 2018) (figura
4).
Figura 4 Diagrama de la asociación entre especies subgingivales. Tomado de Socransky y cols 2003.
26
En Colombia, algunas de las especies bacterianas patógenas que con mayor frecuencia han sido
asociadas con el desarrollo de esta afección periodontal son: Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, Fusobacterium nucleatum,
entre otras. Estos microorganismos invasores deben superar las barreras protectoras externas del
hospedero antes de que puedan encontrar un nicho ecológico adecuado para la colonización; este
fenómeno sólo puede ocurrir en presencia de factores de virulencia tales como fimbrias, cápsulas,
lipopolisacáridos (LPS), ácidos lipotéico, hemaglutininas, gingipainas, proteínas de membrana
externa (Holt et al., 1999; Hajishengallis & Lamont, 2014). De esta manera, la complejidad de la
etiología de la EP y la resistencia de la microbiota subgingival para ser eliminada de manera
definitiva, indican que es perentorio el estudio de los microorganismos comprometidos en esta
afección periodontal y su relación en comunidades microbianas.
El tratamiento convencional para la EP generalmente consiste en la remoción mecánica de
agentes bacterianos ubicados en el espacio supra y subgingival por medio de la técnica de raspaje
y alisado radicular (RAR), además del uso de antimicrobianos son las terapias de primera elección.
(Chitsazi, Shirmohammadi, Shirmohammadi, Kashefimehr & Ghasemi, 2015). Este tratamiento
es eficaz, pero no es ideal teniendo en cuenta que es altamente invasivo, lo que conlleva a un mayor
riesgo de ocasionar bacteriemia (Mealey & Rose, 2008). El tratamiento convencional RAR
presenta limitaciones físicas como el acceso restringido a espacios interproximales y de
furcaciones para la eliminación de los depósitos de placa bacteriana y cálculo dental (Jain et al.,
2013). Por lo tanto, son requeridas terapias coadyuvantes menos invasivas, de menor riesgo
infeccioso y biológico entre otros, para los pacientes con compromiso sistémico como son los
diabéticos.
27
1.2. Diabetes Mellitus (DM)
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica, caracterizada por un aumento del nivel
sanguíneo de la glucosa (hiperglucemia) según la Asociación Americana de Diabetes. (ADA). La
clasificación actual de la diabetes se basa en los mecanismos fisiopatológicos y etiológicos. La
DM tipo 1 es el resultado de la destrucción autoinmune de las células β pancreáticas, que
generalmente conduce a una deficiencia absoluta de la secreción de insulina. En contraste, la DM
tipo 2, es ocasionada por la pérdida progresiva de la secreción de insulina de las células β que
conlleva a la resistencia a la insulina (ADA, 2018).
La incidencia de DM se encuentra en aumento a nivel mundial con grandes diferencias en la
prevalencia de acuerdo al país (You & Henneberg, 2016). Se estima que alrededor de 425 millones
de personas en todo el mundo padecen esta condición, las cuales representan 8.8% de los adultos
con edades comprendidas entre 20 a 79 años (IDF, 2017). Diversos estudios observacionales
sugieren una condición multifactorial que incluye componentes genéticos, nutricionales y
medioambientales (Maahs, West, Lawrence, & Mayer, 2010). De todos los casos de DM
diagnosticados en la actualidad, cerca de 90% corresponden a DM tipo 2 (Holman, Young, &
Gadsby, 2015).
La alta prevalencia de DM a nivel mundial, genera varios retos para el cuidado y manejo de la
salud bucal, debido a que pacientes con esta condición presentan múltiples complicaciones de este
espacio que incluyen caries, lesiones de la mucosa e infecciones a repetición (Indurkar, Maurya,
& Indurkar, 2016; Nazir et al., 2018). (Figura 5) Así mismo dentro de estas complicaciones se
encuentra la enfermedad periodontal (EP), la cual es considerada en la actualidad como la sexta
28
complicación de la DM junto a la mala cicatrización de heridas (Saini, Saini & Sugandha, 2011;
Stanko & Holla, 2014). La evidencia científica refiere que existe una relación bidireccional entre
la EP y la DM (Lalla & Papapanou, 2011; Bascones, Munoz & Bascones, 2015; Sanz et al., 2018).
Figura 5 Características clínicas de la enfermedad periodontal asociada a DM.
1. Periodontitis. 1A: vista clínica; 1B: radiografía. 2. Caries dental. 2A: vista clínica de la
caries dental, 2B: radiografía 3. Hiposalivación 4. Candidiasis oral: vista clínica de la candidiasis
29
oral, ubicada en el paladar. 5. Cáncer oral. 5A: sitio bucal; 5B: sitio palatino 6. Periodontitis apical:
6A: fístula causada por periodontitis apical; 6B: radiografía correspondiente de la lesión en el
vértice del diente. 7. Trastornos temporomandibulares. 7A: ubicación del dolor en pacientes con
trastornos temporomandibulares, 7B: medida de apertura limitada de la mandíbula, 8. Peri-
implantitis. 8A: vista clínica; 8B: radiografía. Tomado de Verhulst y colaboradores (Verhulst et
al., 2019
Diversas investigaciones han evaluado el impacto de la DM en el tejido periodontal, la mayor parte
de ellos muestra que la hiperglicemia crónica puede alterar de manera significativa la salud de este
territorio comprometiendo su fisiología a distintos niveles. La pérdida de inserción periodontal
parece estar estrechamente vinculada al control metabólico de la DM; es así como la presencia de
un pobre control metabólico de esta enfermedad medida a través de los niveles plasmáticos de
hemoglobina glicosilada(HbA1c) se asocia con una mayor prevalencia, severidad y extensión de
la EP (Llambés, Arias & Caffesse, 2015). Por tanto, son importantes los estudios hacia la EP siendo
la comorbilidad bucal más prevalente asociada a la DM y cuyo desarrollo genera deterioro en la
calidad de vida de estos pacientes.
Dentro de los microorganismos relacionados con la enfermedad periodontal en pacientes
diabéticos, se incluyen: P. gingivalis, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia y T.
dentícola, (Castrillón et al., 2015) Además, un pobre control glucémico se ha asociado con un
aumento de bacterias del complejo rojo en el biofilm subgingival (Aemaimanan, Amimanan, &
Taweechaisupapong, 2013; Deng et al., 2017; Meuric et al., 2017; Shaikh, Patil, Pangam &
Rathod., 2018). Así mismo, los pacientes con diabetes no controlada tipo 2 asociada a periodontitis
crónica, presentan diferencias significativas en la biodiversidad subgingival en comparación con
30
sujetos no diabéticos (Casarin et al., 2013). De este modo, es oportuna una intervención
terapéutica que busque el equilibrio de los microorganismos vinculados en la disbiosis bucal con
especial énfasis en la microbiota subgingival y así mejorar el control de las patologías relacionadas
con la EP como es la DM.
1.3. Terapia Fotodinámica (TFD)
La TFD es un procedimiento no invasivo usado para tratar diferentes enfermedades
superficiales o locales (Kwiatkowski et al., 2018). Esta terapia se fundamenta en la combinación
de un agente fotosensibilizador que al ser activado por una fuente de luz a una longitud de onda
específica y en presencia de oxígeno molecular, ejerce un efecto fototóxico asociado directa o
indirectamente con la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) como el anión
superóxido (O2-), radical hidroxilo (OH), peróxido de hidrógeno y O2 singlete principalmente, las
cuales reaccionan con organelas celulares, proteínas y/o ADN ocasionando muerte de las células
ya sea por apoptosis o necrosis (Pérez et al.,2019);(Gursoy, Ozcakir, Tanalp, & Yılmaz, 2013)
(Dai. Huang & Hamblin, 2009). La figura 6 esquematiza la TFD.
31
Figura 6 Esquema TFD, activación de FS. Tomado y modificado de Mahmoudi y Colaboradores (Mahmoudi,
Bahador, Pourhajibagher & Alikhani, 2018).
32
Figura 7 Esquema TFD, activación de FS. (realizado por autor)
1.3.1. Fotosensibilizadores.
Un FS es un compuesto químico que al absorber radiación en una longitud de onda establecida es
capaz de inducir una alteración química o física en un organismo (Konopka & Goslinski, 2007).
Estos compuestos en general, deben caracterizarse por ser químicamente puros y de composición
conocida, generar toxicidad nula en condiciones de oscuridad y ser citotóxico solo en presencia de
luz, presentar alta tasa de retención en órgano blanco, ser eliminado rápidamente del organismo
para evitar toxicidad sistémica, generación de oxígeno singlete o anión superóxido, tener una
absorción de luz en el rango de 600-800 nm para una mayor penetración en los tejidos y no
provocar fotosensibilidad cutánea (Detty, Gibson, & Wagner, 2004; Zhang et al., 2018).
33
A través del tiempo se han estudiado y optimizado de diversas moléculas con propiedades
fotosensibilizantes (Gursoy et al., 2013). Numerosos compuestos fotoactivos naturales y sintéticos
han sido descritos para ser utilizados como FSs. Los agentes fotosensibilizadores se clasifican en
familias, según su estructura química y su naturaleza catiónica, aniónica o neutra (tabla 1).
Además, por sus propiedades de distribución, selectividad y excreción, se pueden clasificar como
de primera, de segunda y tercera generación.
Tabla 1
Clasificación por familia de los agentes fotosensibilizadores.
Familia Nombre Presentación
Comercial
Utilización y uso
común
Dosimetría,
Propiedades
Fotoquímicas y
Fotofísicas
Porfirinas
Hematoporfirina Fotofrin®
Fotosan®
Fotocan®
Diferente tipo de
tumores
2 mg/kg a 150
J/cm²
Prodroga ALA Levulan ® Tumores y
lesiones
20% ALA a 150
J/cm²
Benzoporfirina Visudine® Trastornos
neurovasculares,
degeneración
macular,
coriorretinopatías
y lesiones
cutáneas
Aplicaciones
sencillas de una
inyección de 6
mg/kg a 100
J/cm²
Texafirinas Antrin®, Lutex
o Optrin TM
Algunas formas
de cáncer,
enfermedades
oculares,
coronarias y placa
ateromatosa
Soluble en agua,
se activa
aproximadamente
a 730 nm
Termoporfinas Foscan® Diferente tipo de
tumores
0,15 mg/kg a 660
nm
Purpirinas Purlitina ® Cáncer de células
escamosas y
Activa a 660 nm
34
Clorinas
sarcoma de
Kaposi
El mono-L-
aspartil-clorina o
NPe6
____________
Lesiones de tipo
oftálmico
2,5 y 3,5 mg/kg a
100 J/cm² o 664
nm
Talaporfina de
sodio
Fotoclorina
LS 11
Fotoclor ®
Cáncer, lesiones
cutáneas
Tratamiento de
tumores en perros
y gatos y cáncer
de esófago en
humanos
Amplio espectro
de absorción
(400-664 nm)
0,15 mg/kg con
dosis de luz de 48
horas a 150 J/cm²
Ftalocianinas Ftalocianinas de
aluminio y cinc
Fotosens ® Lesiones
cutáneas, tumores
de cabeza y cuello
Activa entre 650-
850 nm y a 100
J/cm²
Tomado y modificado por Taylor. Cedeño, Robledo, (2011)
La primera generación de FSs, en cabeza de Hematoporfirina y derivados, presentaba
desventajas debido a su naturaleza química que incluía: una mezcla de diversas moléculas, larga
vida media que ocasionaba fotosensibilización prolongada de la piel y longitudes de onda de
activación cortas que dificultaban la penetración del tejido (Zhang et al., 2018). Estas desventajas
asociadas con los FSs de primera generación llevaron al desarrollo de nuevos compuestos no
porfirinoides denominados “FS de segunda generación”, los cuales presentaban una mejora en la
eficacia de las moléculas.
Los agentes fotosensibilizadores de segunda generación –benzoporfirinas, benzofenotiazinas,
clorinas y ftalocianinas – tienen mayor absorción de luz y afinidad por el tejido blanco, selectividad
por espacios celulares, como la mitocondria, y mayor excreción, lo que minimiza los efectos de
fotosensibilidad prolongada. Sin embargo, pueden presentar acumulación en órganos como el
hígado, el riñón y el bazo (Dougherty, Gomer, Henderson, 1998).
35
Con el fin de mejorar la selectividad de los agentes fotosensibilizadores y minimizar su
toxicidad, surgieron los de tercera generación, que son aquéllos conjugados con anticuerpos
dirigidos contra el antígeno tumoral, a moléculas de LDL o de folato, cuyos receptores se expresan
en células tumorales (Detty M, Gibson SL, Wagner SJ. 2004) o están dirigidos a las vías
metabólicas de los microorganismos.
Entre los más estudiados de la segunda generación, se encuentran las fenotiazinas (compuestos
sintéticos no porfirínicos), ftalocianinas, el azul de metileno (MB) y azul de toluidina (TBO). Estas
moléculas han sido utilizadas por excelencia en la TFD, debido a que exhiben características
deseables para el uso farmacológicos que incluyen: baja citotoxicidad y ausencia de mutagénesis
en el tejido huésped, amplio espectro de bioacumulación, altos coeficientes de excitación,
fotoestabilidad y bajos costos (Berg, Weyergang, Vikdal, Norum, & Selbo, 2014).
Los derivados de ftalocianina han atraído una atención considerable, principalmente porque
presentan algunas características óptimas para la TFD como la absorción de luz a 660–770 nm, el
alto rendimiento para la generación de oxígeno singlete y la acumulación rápida y prolongada
dentro de las células cancerosas. (Chan, Marshall, Svensen, Bedwell, Hart. 1990). Sin embargo,
la mayoría de los derivados de ftalocianina exhiben una alta hidrofobicidad, lo que limita su
eficacia clínica por diferentes razones, como la pérdida de actividad fotodinámica, o los problemas
farmacocinéticos que pueden surgir de la agregación de moléculas, así como la mala distribución
de los tejidos.
En el caso de la Ftalocianina de aluminio clorada (PcAlCl), molécula perteneciente a la familia
de Ftalocianinas (Figura 8) es una molécula compuesta por cuatro unidades de isoindol unidas por
átomos de nitrógeno y presenta una geometría bidimensional con un sistema de anillos que consta
36
de 18 electrones π. Las anteriores características le brindan una naturaleza anfifílica con una amplia
capacidad de formación de ERO después de su fotoactivación y lo convierten en un FS por
excelencia, debido a que estas propiedades potencian su actividad sobre especies bacterianas de
naturaleza Gram positiva y Gram negativa (Konopka & Goslinski ,2007). la ftalocianina de
aluminio y la hipericina, tienen acción directa sobre proteínas quinasas activadas por mitógenos
(MAPK) que cumple un papel importante en la progresión del ciclo celular inducido por mitógenos
a través de G1, la regulación del desarrollo embriogénico, el movimiento celular y la apoptosis, ya
que MAPK fosforila las proteínas inductoras de la necrosis, como la Bcl (Células B Linfoma 2)
que es una proteína proapoptótica.
Figura 8 Estructura Química de Ftalocianina de aluminio clorada (PcAlCl). Tomado de Zhang y colaboradores
(Zhang., Jiang., Longo., Azevedo., Zhang., & Muehlmann, 2018)
37
1.3.2. TFD como tratamiento bactericida.
La TFD ha sido utilizada ampliamente como un tratamiento alternativo en infecciones
bacterianas frente al emergente aumento de resistencia a antibióticos. Lo anterior, debido a que el
mecanismo de acción de los FSs se basa principalmente en la producción de ERO, donde diferentes
estructuras celulares y vías metabólicas bacterianas se convierten en blancos terapéuticos
(Konopka & Goslinski, 2007; Dai, Huang & Hamblin, 2009).
Dentro de los mecanismos de acción descritos de la TFD mediado por la generación de las
ERO se incluyen: la inhibición de la estructura de la membrana plasmática celular por inactivación
de sistema de transporte, el bloqueo de actividad enzimática y la peroxidación de lípidos de la
membrana celular bacteriana (Rajesh, Koshi, Philip, & Mohán, 2011). Además, estos radicales
libres tienen la capacidad de causar rupturas de doble hélice en el ADN de estos microorganismos,
lo que ocasiona la muerte celular por estrés oxidativo (Javed & Romanos, 2013).
Diversos estudios han demostrado que la TFD, es efectiva para la eliminación de
microorganismos Gram positivos y Gram negativos, sin la generación de algún tipo de resistencia
bacteriana y con el mantenimiento de la arquitectura de los tejidos del hospedero y la microbiota
normal acompañante (Raghavendra, Koregol & Bhola, 2009). Se ha reportado el éxito de esta
terapia en la eliminación de microorganismos que han desarrollado resistencia a potentes
antimicrobianos como Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina, el cual es el principal
agente etiológico de infecciones intrahospitalarias en EEUU (Embleton et al., 2005).
En el campo de la odontología, la aplicación de la TFD ha sido efectiva para el tratamiento y
prevención de la caries dental. Experimentalmente se ha demostrado la inhibición de bacterias
Gram-positivas como Streptococcus subrings, Streptococcus mutants, Streptococcus sanguinis,
38
importantes agentes etiológicos de esta patología, usando el TBO como fotosensibilizador.
(Paulino, Ribeiro, Thedei, Tedesco, & Ciancaglini, 2005; Zanin, Goncalves, Junior, Hope &
Pratten, 2005).
En endodoncia, la TFD antimicrobiana es utilizada como un complemento eficaz al tratamiento
de desinfección endodóntica convencional. Diversos estudios han evidenciado su efectividad para
eliminar bacterias aeróbicas y anaeróbicas incluyendo Enterococcus faecalis, P. gingivalis, A.
actinomycetemcomitans y P. intermedia en lesiones endodónticas primarias, así como en casos de
fracaso del tratamiento endodóntico ((Hiranmayi, Sirisha, Rao & Sudhakar, 2017; Garcez, Nuñez,
Hamblin, & Ribeiro, 2008; Mesquita et al., 2018).
Adicionalmente, estudios antimicrobianos han demostrado la inhibición de E. faecalis,
posterior al uso de la TFD con partículas de MB, observándose una disminución en el número de
colonias de esta bacteria en los canales de la raíz infectados de dientes humanos extraídos en
comparación con los protocolos tradicionales de endodoncia y tratamiento de irrigación
reduciendo la población microbiana de E. faecalis en un orden de 2 y 1 log10 UFC (Unidades
Formadoras de Colonia) (Siddiqui, Awan & Javed ,2013).
Finalmente, una de las grandes ventajas de la TFD frente al uso de antibióticos es su amplio
efecto sobre diversas especies bacterianas (Fekrazad, Nejat & Kalhori, 2017). Este hallazgo ha
sido vital para el tratamiento de la EP debido a que la TFD actúa como un desestabilizador de estas
comunidades disbióticas, afectando su equilibrio en etapas tempranas de formación del biofilm
dental (Soukos & Goodson, 2011).
El amplio espectro de acción de la TFD como coadyuvante de la terapia base periodontal, ha
mostrado una mejoría tanto en los parámetros clínicos y acción bactericida frente a los
39
microorganismos periodontopatógenos prevalentes en pacientes diabéticos (Dalvi, Hanna, &
Gattani, 2019). Sin embargo, los beneficios de la RAR junto con la TFD a largo plazo están en
discusión debido a las múltiples condiciones y propiedades de FS y la fuente de luz (Xue et al.,
2017). Por lo cual es relevante realizar estudios con nuevas tecnologías con el fin de generar
avances en las intervenciones con esta terapia y consolidar este tratamiento en la enfermedad
periodontal.
Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto antibacteriano de una
nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada en combinación con la terapia fotodinámica in
vitro sobre periodontopatógenos relevantes en la población diabética tipo 2 (P. gingivalis, P.
intermedia y A. actinomycetemcomitans).
40
2. Objetivos
2.1. Objetivo General
Determinar el efecto antimicrobiano in vitro de una nanoemulsión de Ftalocianina de Aluminio
Clorada en combinación con la terapia fotodinámica sobre el crecimiento de periodontopatógenos
prevalentes en la enfermedad periodontal del paciente diabético tipo 2.
2.2. Objetivos Específicos
● Determinar la citotoxicidad in vitro de la nanoemulsión de Ftalocianina de Aluminio
Clorada como agente fotosensibilizador activado por la terapia fotodinámica sobre células
de mamífero.
● Establecer el efecto antimicrobiano in vitro de la nanoemulsión de Ftalocianina de
Aluminio Clorada en combinación con la terapia fotodinámica sobre Porphyromonas
gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans y Prevotella intermedia.
41
3. Materiales y Métodos
3.1. Tipo de estudio
La siguiente investigación utilizó el modelo experimental in vitro, debido a que evaluó efecto
antimicrobiano de una nanoemulsión de ftalocianina de aluminio clorada en combinación de la
terapia fotodinámica en bacterias tratadas (grupo de experimentación) y sin tratamiento (grupo de
control).
3.2. Materiales
3.2.1. Compuestos.
3.2.1.1. Nanoemulsión óleo/agua de ftalocianina de aluminio clorada (NE-PcAlC).
Fue donada por el Doctor Luis Alexandre Muehlmann de la Universidad de Brasilia. El método
de emulsificación espontánea fue usado para la preparación de la nanoemulsión siendo Cremofor
ELP, un surfactante no iónico disuelto en PBS, la fase acuosa (75%) y aceite de ricino la fase
oleosa (25%) en la cual se encuentra conjugada la PcAlCl. Adicionalmente, fue realizada la
caracterización coloidal y fisicoquímica según descrito por Muelhmann y colaboradores. En
general, la nanoemulsión usada para este estudio contenía 40 uM de PcAlCl, coloidalmente
presentó un diámetro hidrodinámico (DH) 25.08 nm, índice de polidispersión (IPD) de 0.131 y
potencial zeta de -6.24mV. A nivel físico químico, fue demostrada la generación de ERO luego de
la activación del FS con una energía entre 0.1 a 6.0 julios/cm2, así como la absorción de luz (676
nm) y emisión de la fluorescencia (excitación 350 nm, emisión 680 nm). La estabilidad de la
42
nanoemulsión se evidenció a diferentes temperaturas (4, 25 y 37°C) durante un año (Muelhmann
y colaboradores 2015).
Para los experimentos de actividad antibacteriana se evaluaron concentraciones desde 20 µM
a 0.16 µM realizando diluciones seriadas 1:3, en células Vero concentraciones de 13.31µM a 0.006
µM realizando diluciones seriadas 1:3 fueron probadas.
3.2.1.2 Vehículo.
El vehículo de la nanoemulsión fue preparado siguiendo el protocolo descrito para la
nanoemulsión de PcAlCl empleando la misma fase acuosa y oleosa, pero sin el fotosensibilizador.
Las propiedades coloidales fueron mantenidas: DH 24.75 nm, IPD <0.08 y potencial zeta -2.77mV.
3.2.1.3. Ftalocianina de aluminio clorada (PcAlC).
Fue obtenida comercialmente de Sigma-Aldrich.USA. Se prepararon soluciones stock en
dimetilsulfóxido (DMSO, Merck) a partir de las cuales, se realizaron soluciones de trabajo en
medio de cultivo antes de cada ensayo. El FS siempre fue protegido de la luz. La PcAlCl fue
evaluada en las mismas concentraciones que la nanoemulsión.
3.2.1.4. Gluconato de clorhexidina 2% (GCX).
Utilizado como compuesto de referencia. El GCX fue adquirido comercialmente de Ultradent
y diluido en medio de cultivo a las concentraciones de 2117 µM a 1 µM en diluciones seriadas 1:3.
3.2.2. Cultivos Celulares.
Células epiteliales derivadas de riñón de mono verde africano (VERO, ATCC CCL-81)
(Figura 9) fueron cultivadas en medio DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA)
43
suplementado con Suero Fetal Bovino inactivado al 10% (SFBi) (Gibco, Thermo Fisher Scientific,
USA), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Gibco, Thermo Fisher Scientific,
USA), e incubadas en condiciones estándar de cultivo a 37°C, 95% de humedad y 5% de CO2.
Figura 9 Cultivo de células epiteliales VERO. (Tomado por el autor).
3.2.3. Microorganismos Periodontopatógenos.
Para el desarrollo de las pruebas de actividad antimicrobiana se trabajó con microorganismos
anaerobios considerados “fastidiosos”. Para su uso en los experimentos (cepas de trabajo) se
consideraron cultivos en primer pase de recuperación (pase 6 aprox), a partir de la cepa de
referencia se incubaron según condiciones referidas para el microorganismo y dada su variabilidad
en el crecimiento y dificultades en la obtención del mismo se consideró como tiempo de incubación
el necesario para obtener el crecimiento característico de las colonias.
44
Los microorganismos a estudio fueron cepas ATCC: P gingivalis (ATCC 33277), A.
actinomycetemcomitans (ATCC 25175) y P. intermedia (ATCC 25611), presentadas
comercialmente en formato vial, registradas para pase de iniciación posterior al pase número 5. Se
incubaron 37°C, ambiente 5% CO2 en atmósfera de anaerobiosis (AnaeroGen, Thermo Scientific)
y fueron crecidas en placas de medio Columbia (Scharlau, USA), suplementado con 7% de sangre
humana.
3.2.3.1. Preparación del inóculo
Se realizó el ajuste inicial del inóculo de cada cepa estudiada a la escala de McFarland 0.5 de
concentración equivalente a 1.5x108 UFC/mL, en medio infusión cerebro corazón (BHI)( Oxoid,
UK) Posteriormente, cada inóculo fue diluido 1:20 en medio de cultivo, garantizando una
concentración final en cada pozo de 7.5 x 106 UFC/ mL.
3.3. Métodos
3.3.1. Sistema de irradiación para la TFD utilizada.
La terapia fotodinámica (TFD) fue realizada utilizando un láser LED (400-700 nm) fabricado
por el Grupo de nanoestructuras semiconductoras y magnéticas del Instituto de Física de la
Universidad de Brasilia y donado por el profesor Ricardo bentes Azevedo de la Universidad de
Brasilia)(Figura 10) Los modelos biológicos estudiados fueron irradiados durante dos minutos
(4.83 julios/cm2) a 10 centímetros de distancia de la placa objetivo según revisión bibliográfica
por el grupo de estudio( Fekrazad, R., Nejat, A., & Kalhori, K. A, 2017; Akram, Z., Raffat, M. A.,
Saad Shafqat, S., Mirza, S., & Ikram, S. 2019) Controles sin irradiación fueron evaluados
respectivamente. (Figura 11). (Tabla 2)
45
Figura 10 Sistema de irradiación. Láser LED (400-700nm) fabricado por el Grupo de nanoestructuras
semiconductoras y magnéticas del Instituto de Física de la Universidad de Brasilia (Tomado por el autor).
Figura 11 Condiciones de irradiación del láser LED (400-700nm). Las células VERO y los periodontopatógenos
fueron irradiadas durante dos minutos (4.83 julios/cm2). a 10 centímetros de distancia de la placa objetivo. (Tomado
por el autor).
46
Tabla 2
Revisión Condiciones Terapia Fotodinámica sobre periodontopatógenos
47
Elaboración propia con base a la revisión de la literatura
48
3.4 Ensayo De Citotoxicidad En Células De Mamífero
Células Vero (3x105 cel/mL) fueron incubadas en placas fondo plano de 96 pozos a 37°C, 5%
CO2 y 95% de humedad durante 24 horas hasta la formación de la monocapa. Posteriormente,
fueron expuestas durante 24 horas a los diferentes compuestos: NE-PcAlCl, vehículo, PcAlCl
libre, y clorhexidina(GCX), se aplicó la TFD y luego de 24 horas se determinó la viabilidad celular
empleando la sal de tetrazolio MTT (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA) en proporción 5
mg/mL. Los cristales de formazán fueron disueltos en DMSO. Posteriormente, la densidad óptica
fue determinada por espectrofotometría en un lector de microplacas para absorbancia (iMark BIO-
RAD) a una longitud de onda de 595 nm. El porcentaje de citotoxicidad fue calculado mediante la
siguiente ecuación: ((DO grupo control – DO grupo tratado) / DO grupo control) x 100. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado en experimentos independientes.
3.4.1 Evaluación en controles.
Células sin tratar fueron utilizadas como controles negativos y GCX como compuesto de
referencia. Luego del tratamiento, las células fueron irradiadas como se describió anteriormente e
incubadas por 24 horas bajo las mismas condiciones descritas. Controles sin irradiación fueron
evaluados.
3.5. Ensayo de Susceptibilidad Bacteriana
Para determinar la susceptibilidad de los microorganismos de interés frente a los compuestos:
NE-PcAlCl, vehículo, PcAlCL libre y GCX, se utilizó el método de microdilución en caldo (placa
de 96 pozos) según protocolo previamente establecido con algunas modificaciones para el grupo
de microorganismos en estudio (Tavares et al, 2018). Para ello los compuestos evaluados se
49
diluyeron en las concentraciones mencionadas anteriormente (50 uL) y estuvieron en contacto
directo con el inóculo (50 uL) de cada microorganismo en estudio; ulteriormente se incubaron en
condiciones anaerobias: 37°C con una atmósfera de 5% de CO2 durante 24 horas para favorecer
el crecimiento previo a la exposición a la TFD (irradiación de las placas). Las condiciones de
irradiación están descritas en el capítulo de sistemas de irradiación para la TFD utilizada. Como
controles se utilizaron placas que no fueron irradiadas; luego estas se re incubaron durante 24 horas
en atmósfera de anaerobiosis para realizar la lectura final y determinar la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI).
Con el objetivo de establecer la CMI, se realizó la lectura visual a las 24 horas de incubación post
aplicación de TFD. La CMI se definió como la mínima concentración de un compuesto que inhibe
el crecimiento visible de un microorganismo y para ello se consideró como tal la presencia de
turbidez o cambio de transparencia en el medio; se comparó con los controles positivos en los
cuales se esperaba crecimiento visible y continuo.
Adicionalmente, se determinó la Concentración Mínima Bactericida (CMB), para ello se
realizó la siembra en agar Columbia suplementado del contenido de pozos a la izquierda y derecha-
mínimo tres de la MIC, estos se incubaron durante 48 horas a 37°C, en condiciones de anaerobiosis
para posteriormente realizar la lectura respectiva. Se consideró que la CMB se encontraba en la
concentración a partir de la cual se observaba crecimiento característico de las colonias en el agar.
LA CMB es definida como la mínima concentración de un compuesto que elimina el 99,9% de los
microorganismos viables.
50
Siembras de controles positivos y negativos respetando las condiciones de incubación
mencionadas anteriormente, también se realizaron para validar los hallazgos visibles. Los
anteriores ensayos se realizaron por triplicado para cada cepa bacteriana.
3.6. Análisis de Datos
Se utilizó el Software estadístico MsxlfitTM (ID Business Solution, Guildford, UK) para
calcular la concentración citotóxica 50 (CC50) y 90 (CC90) de cada compuesto mediante análisis
de regresión sigmoidal. Las CC50 y CC90 fueron descritos utilizando medidas de tendencia central
y dispersión como promedio y desviación estándar, respectivamente. Las comparaciones entre
grupos con distribución normal se realizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). Una
prueba de Tukey fue realizada para evaluar la existencia de diferencias entre los distintos
compuestos sobre células de mamífero en presencia de TFD. Se utilizó el test de Wilcoxon para la
comparación de grupos con distribución no normal en presencia y ausencia de TFD. Se estableció
un nivel de confianza del 95% en todos los casos. El análisis estadístico fue realizado mediante el
software libre R versión 3.3.3. Se determinó como nivel de significancia estadística un valor de
p<0.05.
51
4. Resultados
A continuación, se presentan los resultados de la actividad biológica de la nanoemulsión de
ftalocianina de aluminio clorada (NE-PcAlCl,) frente a periodontopatógenos y la citotoxicidad de
los compuestos evaluados como parte del trabajo “Efecto antibacteriano de una nanoemulsión de
ftalocianina de aluminio clorada sobre periodontopatógenos relevantes en el paciente diabético
tipo 2: estudio in vitro”
4.1. Citotoxicidad Sobre Células De Mamífero
La citotoxicidad de los diferentes compuestos de NE-PcAlCl, vehículo, PcAlCL libre y GCX
evaluados sobre células de mamífero (VERO, ATCC CCL-81) se muestra en la tabla 2. En términos
generales, no hubo actividad citotóxica en las placas sin irradiar (controles) de los compuestos en
estudio como era lo esperado, excepto en el compuesto de referencia. El vehículo no evidenció
citotoxicidad tanto con TFD como sin ella. La TFD potenció el efecto citotóxico de las soluciones
que contenían PcAlCl.
La NE-PcAlCl en combinación con TFD evidenció CC50 de 0,09 ± 0,03 µM, probando con
este resultado ser el compuesto con mayor efecto citotóxico de los evaluados. En contraste células
sin el tratamiento de TFD no mostraron efecto citotóxico en la máxima concentración evaluada (>
0,49 µM).
Un hallazgo similar se observó para PcAlCl libre, con CC50 0,155 ± 0,087 µM y > 0,49 µM,
en presencia y ausencia de TFD, respectivamente; es por ello que este compuesto demuestra ser el
segundo con mayor efecto citotóxico de los estudiados.
52
Por otra parte, las soluciones que no contienen fotosensibilizadores: vehículo y GCX
presentaron CC50 similares con y sin la TFD. El vehículo no mostró efecto sobre las células a la
máxima concentración evaluada (CC50 > 0,49 µM). El compuesto de referencia evidenció CC50
3,2 ± 0,6 µM y 2,4 ± 0,4 µM en presencia y ausencia de TFD, respectivamente.
La CC50 de GCX determinada en ausencia de TFD fue sometido a la prueba de Shapiro–Wilk,
evidenciando una distribución no normal. Por tanto, para la comparación entre las CC50 de GCX
en presencia y ausencia de TFD se aplicó la prueba no paramétrica de Wilcoxon. Las CC50 de
GCX no presentaron diferencias estadísticamente significativas independiente del uso de la TFD
como era lo esperado (p= 0.247). Sin embargo, cabe anotar que este compuesto mostró un
definitivo efecto citotóxico con y sin irradiación.
Las CC50 determinadas sobre los diferentes compuestos en presencia de la TFD fueron
sometidos a la prueba de Shapiro–Wilk, evidenciando una distribución normal. Por tanto, para la
comparación entre grupos se aplicó un ANOVA, seguido de prueba de Tukey. La CC50 de NE-
PcAlCl y PcAlCl libre luego de la TFD no presentaron diferencias estadísticamente significativas
(p= 0.100).
Comparaciones de CC50 entre NE-PcAlCl y PcAlCl libre en ausencia de TFD, no fueron
posibles debido a la naturaleza de los datos. A su vez, el compuesto GCX presentó diferencias
estadísticamente significativas respecto a NE-PcAlCl (p < 0.05), por lo cual, la nanoemulsión
evaluada presentó un efecto tóxico mayor en comparación al compuesto de referencia.
53
Tabla 3
Citotoxicidad de diferentes formulaciones sobre células de mamífero
Compuestos
(µM)
TFD* SIN TFD
CC50 CC90 CC50 CC90
NE-PcAlCl 0,09 ± 0,03 > 0,49 > 0,49 > 0,49
Vehículo > 0,49 > 0,49 > 0,49 > 0,49
PcAlCl libre 0,15 ± 0,08 > 0,49 > 0,49 > 0,49
GCX 3,2 ± 0,6 465,74 ± 24,4 2,4 ± 0,4 190,7 ± 0,00
* Terapia Fotodinámica, CC50: Concentración citotóxica 50; CC90 Concentración citotóxica 90
4.2. Susceptibilidad De Los Periodontopatógenos
La susceptibilidad bacteriana de los periodontopatógenos al tratamiento de las diferentes
formulaciones fue determinada según un protocolo previamente establecido con algunas
modificaciones (Tavares et al, 2018). Para efectos de este estudio, todos los periodontopatógenos
evaluados presentaron concentraciones iguales de CMI y CMB en cada enfoque de tratamiento de
TFD.
Para P. gingivalis, se observó que NE-PcAlCl y el vehículo no mostraron actividad
antibacteriana a las concentraciones evaluadas; presentando concentraciones > 20 µM en la CMI
y CMB independiente de la TFD.
54
PcAlCl libre fue el compuesto más activo frente a este periodontopatógeno en combinación de
la TFD presentó un fuerte efecto fototóxico con concentraciones de 1,66 µM. (Tabla 3).
El compuesto de referencia (GCX) no presentó actividad antibacteriana o fototóxica en
presencia o ausencia de TFD frente a este microorganismo; y fue menos eficiente frente a este
patógeno 200 veces en comparación con la PcAlCl libre.
El índice de selectividad de la PcAlCl libre para P. gingivalis es 0.09; por lo tanto, este
compuesto no es selectivo frente a esta bacteria. (Tabla 4).
Tabla 4
Susceptibilidad bacteriana de Porphyromonas gingivalis sobre diferentes compuestos
Compuestos
(µM)
TFD SIN TFD
CMI CMB CMI CMB
NE-PcAlCl > 20 > 20 > 20 > 20
Vehículo > 20 > 20 > 20 > 20
PcAlCl libre 1,66 1,66 > 20 > 20
GCX 330,78 330,78 330,78 330,78
* TFD: Terapia Fotodinámica, CMI: Concentración Mínima Inhibitoria; CMB: Concentración Mínima Bactericida
55
Para P. intermedia, se evidenció el efecto fototóxico de las formulaciones que contienen
PcAlCl en conjunto con la TFD; se observó que el vehículo no mostró actividad fototóxica para
este microorganismo en las concentraciones evaluadas tanto con TFD como sin ella como era lo
esperado.
El compuesto de referencia (GCX) no mostró diferencia con y sin la aplicación de la TFD. La
GCX es 526 veces menos eficiente frente a este patógeno en comparación con la NE-PcAlCl y 50
veces menos eficiente que la PcAlCl libre; con la claridad de su toxicidad en la concentración
evaluada.
La NE-PcAlCl en presencia de la TFD evidenció un mejor efecto fototóxico con
concentraciones de 0,63 µM en la CMI y CMB. El índice de selectividad de la NE-PcAlCl es 0,1,
por consiguiente, este compuesto no es selectivo frente a este microorganismo.
Un hallazgo similar se observó con la PcAlCl libre en presencia de la TFD con concentraciones
de 6,63 µM para CMI y CMB. El índice de selectividad de la PcAlCl libre es 0,02, por ende, este
compuesto no es selectivo frente a este periodontopatógeno.
Lo anterior, coloca en manifiesto la utilidad de vehiculizar la PcAlCl, debido a que el efecto
fototóxico en presencia de la TFD aumenta en una magnitud de diez en la nanoemulsión evaluada.
(Tabla 5).
56
Tabla 5
Susceptibilidad bacteriana de Prevotella intermedia sobre diferentes compuestos
Compuestos
(µM)
TFD SIN TFD
CMI CMB CMI CMB
NE-PcAlCl 0,63 0,63 > 20 > 20
Vehículo > 20 >20 > 20 > 20
PcAlCl libre 6,63 6,63 >20 >20
GCX 330,78 330,78 330,78 330,78
* TFD: Terapia Fotodinámica, CMI: Concentración Mínima Inhibitoria; CMB: Concentración
Mínima Bactericida
Respecto A. actinomycetemcomitans, se observó que la NE-PcAlCl y el vehículo no son activos
en las concentraciones evaluadas frente a este periodontopatógeno independiente de la TFD.
(concentraciones > 20 µM en la CMI y CMB).
PcAlCl libre evidenció un fuerte efecto fototóxico con concentraciones de 13,3 µM para CMI
y CMB. El índice de selectividad de la PcAlCl libre para A. actinomycetemcomitans, 0.01, en
consecuencia, este compuesto no es selectivo frente a esta bacteria.
57
El GCX fue la segunda molécula más activa o fototóxica tanto en presencia de la TFD como
sin ella.
Finalmente, el compuesto de referencia CGX y el vehículo evidenciaron concentraciones
similares en la CMI y CMB en todos los microorganismos evaluados independiente de la
aplicación de la TFD. (Tabla 6).
Tabla 6
Susceptibilidad bacteriana de Aggregatibacter actinomycetemcomitans sobre diferentes
compuestos
Compuestos
(µM)
TFD SIN TFD
CMI CMB CMI CMB
NE-PcAlCl > 20 >20 > 20 > 20
Vehículo > 20 > 20 > 20 > 20
PcAlCl
libre
13,3 13,3 > 20 > 20
GCX 2646,25 2646,25 2646,25 2646,25
* TFD: Terapia Fotodinámica, CMI: Concentración Mínima Inhibitoria; CMB: Concentración Mínima Bactericida
58
5. Discusión
La periodontitis (EP) es una enfermedad que se produce como resultado de la acumulación
disfuncional y estructural de biopelículas bacterianas en la superficie del diente (Biofilm); actúa
como un estímulo nocivo que media la respuesta inmune del hospedero debilitando así las
estructuras de soporte del diente sano. (Sanz et al., 2017). La EP y la DM son afecciones crónicas
comunes, que han sido relacionadas (Bascones, Muñoz & Bascones, 2014).
Los mecanismos que sustentan los vínculos entre estas dos condiciones no se comprenden
completamente en la actualidad, no obstante, se han descrito aspectos del funcionamiento del
sistema inmune y diferencias significativas en la biodiversidad microbiana subgingival
representada por microorganismos como P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia T. dentícola y
A. actinomycetemcomitans (Casarin et al., 2013; Castrillón et al., 2013) que crean una comunidad
disbiótica cuya alta resistencia mecánica y fisiológica a ser eliminada ha sido demostrada (Matos
Cruz R, Bascones-Martínez, 2011); este es un dilema aún por resolver.
El potencial invasivo de algunas bacterias del biofilm subgingival sobre las células epiteliales
gingivales y el tejido conectivo subepitelial, así como su capacidad para colonizar zonas de difícil
acceso influyen en el éxito del desbridamiento mecánico como terapia periodontal. (Akincibay,
Örsal, Şengün, & Tözüm. 2008); adicionalmente puede implicar un mayor riesgo de ocasionar
bacteriemia en pacientes diabéticos (Mealey & Rose, 2008). Por lo tanto, para evitar la
recolonización bacteriana son necesarias el uso de terapias coadyuvantes. El desbridamiento
mecánico suele combinarse con la terapia antibiótica, local o sistémica. Sin embargo, la aparición
de resistencias bacterianas, reacciones alérgicas y la alteración del equilibrio bacteriano pueden
limitar sus indicaciones. (Ardila, Granada & Guzmán. 2010).
59
De esta manera, la TFD se convierte en una estrategia útil y no invasiva para el tratamiento de
la EP. Numerosos compuestos fotoactivos naturales y sintéticos como fenotiazinas, ftalocianinas,
el azul de metileno (MB) y azul de toluidina (TBO), entre otros, han sido estudiados (Berg et al.,
2014). En el caso de la PcAlCl, vehículos como nanoemulsiones, liposomas y nanopartículas
poliméricas, han sido investigados a fin de mejorar la internalización y efectividad en sustratos
biológicos. Es así como Muelhmann y colaboradores sintetizaron una nanoemulsión de PcAlCl
altamente estable, que permitió la conservación de las propiedades coloidales y fisicoquímicas del
FS (Muelhmann et al., 2015). En este sentido, y teniendo en cuenta que las nanoemulsiones son
consideradas vehículos ideales para el transporte de fármacos de uso tópico debido a la alta
permeabilidad, estabilidad y facilidad de ser absorbida por la piel, y considerando el pequeño
tamaño de gota (<30 nm) que, además la hace un sistema estable cinéticamente contra la
agregación, floculación y coalescencia por varios años; en este trabajo se seleccionó esta
nanoemulsión de PcAlCl para ser evaluada contra periodontopatógenos e inicialmente contra la
línea celular Vero ampliamente utilizada como modelo de referencia en estudios de investigación
y desarrollo de nuevas moléculas bioactivas. (Perryman et al., 2018).
Los resultados de toxicidad in vitro demostraron un efecto fototóxico y no selectivo (IS <1) de
la NE-PcAlCl y el FS libre, luego de la TFD sobre estas células no tumorales con CC50 0,09 ± 0,03
y 0,15 ± 0,08 uM respectivamente. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el
efecto fototóxico entre la NE-PcAlCl y la PcAlCl libre (p= 0.100). Estudios de viabilidad celular
realizados en otras líneas celulares tumorales han demostrado resultados similares con este FS
(Hernández et al., 2012; Muelhmann, 2015). Hernández y colaboradores, evaluaron la
internalización y las actividades fototóxicas in vitro de PcAlCl encapsulada en liposomas
ultradeformables (UDL PcAlCl) sobre monocitos humanos derivados de leucemia monocítica
60
aguda (THP-1); demostrando una mayor fototoxicidad de la PcAlCl liposomal comparado con la
PcAlCl libre (CC50 1.35 ± 0.01 versus 22.50 ± 0.33 nM respectivamente) luego de la aplicación de
la TFD (17 julios/cm2). Adicionalmente, estudios realizados en células tumorales (MCF-7) y no
tumorales (MCF-10A) de cáncer de mama con el mismo sistema de nanoemulsión de PcAlCl
probado en este trabajo, demostraron mayor selectividad del FS por las células cancerígenas que
por las células sanas mostrando CC50 de 3.0 y 6 nM, luego de la TFD (4.4 julios/cm2) (Muelhmann
et al., 2015). Así mismo, nanopartículas de PcAlCl con DH entre 201-206 nm demostraron ser
citotóxicas sobre células cancerígenas (4T1) y no cancerígenas (NIH/3T3) de mama murinas en
oscuridad. Luego de la aplicación de la TFD, concentraciones de 0.25 uM del FS (PcAlCl)
indujeron fototoxicidad en todas las líneas celulares 4T1, NIH/3T3, MCF-7 y MCF-10A probadas
(Muelhmann et al., 2014).
Consecuentemente, diferentes estudios han demostrado el efecto fototóxico de este FS tanto en
líneas tumorales como no tumorales, este efecto se atribuye principalmente al carácter lipofílico
del mismo el cual le permite con facilidad atravesar membranas biológicas para llegar a su blanco
terapéutico. Además, el vehiculizar la PcAlCl facilita igualmente la internalización y por tanto la
efectividad. Los FS se caracterizan por su acción selectiva sobre células tumorales, sin embargo,
este estudio demostró la fototoxicidad de la PcAlCl en células Vero.
En adición, la citotoxicidad de diferentes FS se ha evaluado sobre queratinocitos epiteliales
derivados de tejido gingival humano (HGEK) y fibroblastos gingivales humanos (GFB) (Bao et
al., 2014). Soukos y colaboradores determinaron que HGEK y GFB expuestos a TBO no
presentaron disminución en la viabilidad a la concentración de 2.0 µg/mL y 5.0 µg/mL,
respectivamente (Soukos et al, 1996). Así mismo, Xu y colaboradores evaluaron el efecto de Azul
61
de Metileno (MB) a 50 μg/ mL en combinación con luz roja a 665 nm sobre GFB. Estos autores
concluyeron que la combinación del MB y luz no exhibió ningún efecto citotóxico significativo
sobre la viabilidad y la actividad mitocondrial celular (Xu et al, 2009). A su vez, diversos estudios
han demostrado que la dosis requerida del FS y radiación necesaria para ocasionar la muerte
bacteriana es menor que la dosis necesaria para causar daño a los HGEK y GFB (George & Kishen,
2007). Por tanto, el uso de FS en combinación con la TFD es una alternativa terapéutica de gran
interés en la actualidad.
En cuanto al compuesto de referencia GCX usado en este trabajo, se evidenció toxicidad
independiente de la TFD; CC50 3.2 ± 0,6 versus 2,4 ± 0,4 µM con y sin el abordaje de la misma
respectivamente; (p= 0.247). Así mismo, se ha descrito la citotoxicidad de GCX sobre fibroblastos
de piel humana normal con CC50 de 1,7 µM (Pitucha et al., 2016). Estas concentraciones fueron
similares a las determinadas en este estudio sobre células VERO.
Este compuesto también ha demostrado alta toxicidad en otras líneas celulares como las HeLa;
Cabral Romero & Hernández-Delgadillo, (2016); evidenciaron que GCX al 0.12%, dañó
completamente la monocapa de estas células a los cinco minutos de exposición basado en el ensayo
de viabilidad celular MTT, resultado similar a lo encontrado en el ensayo de Lessa y colaboradores
con células odontoblásticas (MDPC-23).
Existen numerosos informes cuestionando la seguridad del GCX como enjuague bucal, el cual es
comúnmente utilizado en la práctica clínica odontológica, por las evidencias de sus efectos
citotóxicos sobre diferentes líneas celulares. En un estudio In vitro con fibroblastos humanos
expuestos al GCX 0.12% durante 30 segundos, se evidenció citotoxicidad para estas células. Al
respecto se consideró la afectación de diversas funciones celulares tales como la proliferación y la
62
síntesis de proteínas por este compuesto. (Li, et al., 2014). Otros trabajos han demostrado que la
TFD, es efectiva para la eliminación de microorganismos Gram positivos y Gram negativos, sin la
generación de algún tipo de resistencia bacteriana y con el mantenimiento de la arquitectura de los
tejidos del hospedero (Raghavendra, Koregol & Bhola. 2009; Gursoy, Ozcakir & Yilmaz, 2013).
En este estudio, no se demostró un efecto antibacteriano de la NE-PcAlCl luego de la TFD contra
P. gingivalis. En contraste, la PcAlCl libre mostró un efecto fototóxico contra este
periodontopatógeno luego de la TFD (CMI 1,66 µM). De acuerdo con lo anterior, se requieren
mayores investigaciones para considerar este sistema de nanoemulsiones y el FS como una
estrategia de intervención contra este patógeno clave en la EP. El bajo potencial fototóxico
encontrado frente a este microorganismo puede estar relacionado con componentes estructurales
de P. gingivalis, como la cápsula, la cual podría proteger a esta bacteria de la interacción con el
FS, limitando el subsecuente efecto fototóxico (How et al., 2016). Esta cápsula también conocida
como antígeno K se considera un factor importante de virulencia de P. gingivalis (Brunner et al.,
2010) y se encuentra asociada con la resistencia a la fagocitosis mediada por leucocitos
polimorfonucleares (Bostanci et al., 2012) y una mayor capacidad de adhesión a células epiteliales
gingivales (Dierickx et al., 2003).
A su vez, los cultivos planctónicos de P. gingivalis, utilizados en este estudio, podrían expresar
normalmente genes relacionados con mecanismos oxidativos como el gen HtrA, el cual codifica
una serina proteasa periplásmica que confiere protección contra la oxidación, específicamente con
el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Yuan et al., 2008; Lo et al., 2009) bloqueando el principal
mecanismo de acción de la TFD.
63
Por tanto, futuras investigaciones podrían evaluar Biofilms en combinación de esta
nanoemulsión con TFD para validar los hallazgos. Así mismo las diferencias observadas en el
poder inhibitorio entre NE-PcAlCl y PcAlCl libre, podrían explicarse debido al vehículo o sistema
de nanemulsiones y su eficacia en la internalización del FS; también a la ausencia de consensos
acerca de las condiciones de TFD óptimas, la cual no permitiría evidenciar los mejores resultados
de este enfoque en el microorganismo de interés.
En la literatura existen diversos reportes de FS en combinación con TFD sobre P. gingivalis.
no obstante, según nuestra revisión, sistemas de nanoemulsiones que contienen PcAlCl sobre este
patógeno no han sido evaluados. Se ha demostrado que la TFD empleando MB al 0.01% en
conjunto con un láser de diodo (665 nm) ocasionó la disminución de esta bacteria en un orden de
3.8 ± 1.3 log10 (Braham, Herron, Street & Darveau, 2009). Los hallazgos anteriores, han sido
confirmados, empleando el mismo FS con un láser de diodo con una longitud de onda en el rango
de (650–675 nm), observándose una erradicación de > 99.9% (Street, Pedigo, & Loebel, 2010).
De igual forma, se ha explorado el uso de TBO sobre este periodontopatógeno. Se ha observado
una disminución significativa de P. gingivalis empleando de TBO en combinación de fuentes de
irradiación con luz roja (láser He/Ne, 632 nm) (Bhatti et al., 1997), diodos láser (Nastri et al., 2010)
y láser de galium y arsénico (Mathur et al., 2016) y diodos de láser LED (Moslemi et al., 2018). A
su vez se ha evaluado el FS rosa de bengala la combinación con un láser azul LED, que redujo
completamente el crecimiento de esta bacteria (Uekubo et al., 2016) y Radachlorin, un derivado
de clorofila α, el cual presentó una reducción del 33 % sobre P. gingivalis (Moslemi et al., 2018)
Por otra parte, la NE-PcAlCl presentó un mayor efecto fototóxico sobre P. intermedia en
comparación con la PCAlCl libre (6 veces), luego de la TFD. Este agente es una bacteria anaerobia
64
obligada que ha sido descrita como un microorganismo altamente adaptable al estrés oxidativo
(dos Santos et al., 2007) y se ha observado la inducción de expresión de proteínas asociados a
funciones reguladoras antioxidantes y redox en respuesta al estrés oxidativo (Santos et al., 2012).
Algunos FS se han utilizado para la eliminación de este microorganismo sin éxito. Se ha observado
la nula actividad de TBO en combinación de diodo láser sobre esta bacteria (Nastri et al., 2010) y
la reducción de 26.2 % empleando un láser de galium y arsénico (Mathur et al., 2016). Por tanto,
los resultados obtenidos en este estudio son promisorios ya que evidencian la optimización del FS
transportado en el sistema de nanoemulsión para el control de este microorganismo.
En contraste, no se observó efecto inhibitorio luego de la exposición de A.
actinomycetemcomitans con la NE-PcAlCl o libre luego de la TFD. Estos resultados estarían
relacionados con la producción por este microorganismo de enzimas como oxidasa y catalasa, las
cuales pueden ejercer un efecto protector a condiciones de estrés oxidativo generados por la TFD
(AOM, 2015). Así mismo, A. actinomycetemcomitans es considerado altamente resistente a la
mayoría de los tratamientos; por tanto, su control es un reto. Sin embargo, se ha reportado que el
uso de MB 0.01% en combinación con un láser de diodo (665 nm) ocasiona una disminución
estadísticamente significativa para esta bacteria (Chan & Lai, 2003). Además, el uso del láser de
diodo (670 nm) en combinación con MB mejora la erradicación de esta bacteria en > 99.9% (Street
et al., 2010). A su vez, se ha observado que TBO en combinación con la TFD ocasiona una
disminución de > 99.9% (Nastri et al., 2010) y 61.54% en combinación con láser de diodo AlGaInP
(aluminum-gallium-indium-phosphide) (Mattiello et al., 2011) y el FS curcumina a una
concentración de 5 mg/mL en combinación con un láser LED redujo la población bacteriana en un
65% (Najafi et al., 2016). Por tanto, la poca actividad observada de la NE PcAlCl sugiere la
evaluación de otras condiciones de TFD para confirmar estos hallazgos.
65
En este sentido, una variable a considerar en el uso de la TFD como enfoque antimicrobiano
es la fuente de irradiación e intensidad y duración del tratamiento. En este trabajo se aplicó la TFD
sobre los distintos microorganismos y células de mamífero utilizando solo un parámetro de
irradiación (4.83 julios/cm2) y un tiempo establecido (2 minutos).
Este estudio utilizó como fuente de irradiación una luz LED, la cual presenta algunas ventajas
en comparación con otras fuentes de luz disponibles para TFD, que incluyen un menor costo,
ausencia de procesos destructivos mediados por la temperatura y facilidad en la consecución
(Pieslinger et al., 2006). Así mismo, se ha descrito una relación directamente proporcional entre el
porcentaje de supervivencia y dosis de luz aplicada. Células de carcinoma nasofaríngeo CNE-1
presentan mayor efecto fototóxica dependiente de la dosis de irradiación alcanzando una reducción
del 50 % en la viabilidad con dosis de luz de 10 julios/cm2 durante 20 minutos (Defu et al., 2012).
Por tanto, futuras evaluaciones requieren evaluar el uso de otros FS con la nanoemulsión, bajo
distintas condiciones de TFD, con el fin de optimizar y mejorar los resultados obtenidos sobre de
los diferentes periodontopatógenos.
En general, el amplio espectro de acción de la TFD como coadyuvante de la terapia base
periodontal, especialmente en campo abierto, ha mostrado una mejoría tanto en los parámetros
clínicos y acción bactericida frente a los microorganismos periodontopatógenos (Dalvi, & Gattani,
2019). No obstante, los beneficios de la RAR junto con la TFD a largo plazo están sujetos a
discusión por las múltiples propuestas de condiciones y propiedades tanto de fotosensibilizadores
como del láser (Xue, D et al; 2017). Por tanto, nuevos estudios se requieren para evaluar las
mejores condiciones de TFD que permitan el control de los microorganismos asociados a la
enfermedad periodontal.
66
Finalmente, los objetivos planteados en este trabajo se cumplieron a cabalidad. Se logró
determinar citotoxicidad y la actividad antimicrobiana de la NE-PcAlCl sobre
periodontopatógenos relevantes en la población diabética tipo 2 en combinación con la TFD. En
este sentido, los resultados obtenidos sugieren el potencial uso de la TFD en combinación con la
NE-PcAlCl para la inhibición de periodontopatógenos, en especial P. intermedia la cual presentó
la mayor susceptibilidad a este enfoque de tratamiento; Sin embargo, se pueden realizar estudios
posteriores para evaluar otros fotosensilizadores en nanosistemas direccionados al biofilm y sus
patógenos claves en el desarrollo de la EP en los pacientes en cuestión.
67
6. Conclusiones
▪ La TFD evaluada potenció el efecto citotóxico de las soluciones que contenían PcAlCl
sobre la línea celular utilizada, que plantea su potencial como agente antitumoral.
▪ La TFD evaluada mostró baja capacidad antibacteriana en dos de los microorganismos en
estudio como son P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans, los cuales son
periodontopatógenos disbióticos claves en la patogenia de la EP, siendo reportados
altamente resistentes a los tratamientos convencionales.
▪ La TFD con NE-PcAlCl mostró eficacia antibacteriana en P. intermedia, patógeno clave
en la comunidad polimicrobiana disbiótica precursora de la EP en el paciente diabético
tipo 2.
▪ La TFD funciona con el fotosensibilizador seleccionado, sin embargo, se requieren
optimizar los parámetros o condiciones de esta intervención para mejores resultados en el
modelo de EP.
▪ Los resultados promisorios obtenidos de la NE PcAlCl sobre P. intermedia, podrían ser
utilizados en futuras investigaciones para estudiar los agentes de la EP y el modelo de
comunidad disbiótica como es el Biofilm; optimizando las condiciones de la TFD como
son el tiempo, distancia y parámetros de irradiación.
▪ El aporte determinante de este estudio se fundamenta en el conocimiento y manejo de los
microorganismos anaerobios como son los agentes de la EP, cuya complejidad operativa
es bien conocida, por ende, este proyecto logra su mayor diferenciación e importancia.
68
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