Ciklofoszfamid monoterápia mellékhatásainak,
következményeinek vizsgálata állatkísérletes
modellen DSC segítségével
PhD értekezés
Dr. Farkas Péter István
PTE KK Radiológiai Klinika
Doktori iskola: Interdiszciplináris Orvostudományok (D93)
Doktori iskola vezetője: Prof. Dr. Sümegi Balázs
Doktori program: Funkcionális fehérjedinamika vizsgálata biofizikai
módszerekkel (B-130)
Doktori Program vezetője: Prof. Dr. Nyitrai Miklós
Témacím: A biológiai makromolekulák termikus analízissel
történő vizsgálata
Témavezető: Prof. Dr. Lőrinczy Dénes DSc
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar
Biofizika Intézet
2017
Tartalomjegyzék
Rövidítés jegyzék ..................................................................................................................................... 1
Bevezetés................................................................................................................................................. 2
Célkitűzések ......................................................................................................................................... 3
Kutatásainkat indukáló problémafelvetés – esetismertetés ................................................................... 4
Ciklofoszfamid ......................................................................................................................................... 6
Farmakodinámia, farmakokinetika...................................................................................................... 6
Alkalmazás ........................................................................................................................................... 9
Mellékhatásai .................................................................................................................................... 10
Ciklofoszfamid vizsgálatunkban kiemelt szerepet kapó hatásai ....................................................... 11
Polineuropátia ............................................................................................................................... 11
Kardiomiopátia, kardiotoxicitás .................................................................................................... 12
Vérplazma alkotóelemire gyakorolt hatás .................................................................................... 13
Differenciál pásztázó kalorimetria (DSC) ............................................................................................... 14
A DSC alapjai ...................................................................................................................................... 14
A DSC működési elve ......................................................................................................................... 15
A DSC görbe értelmezése .................................................................................................................. 17
Kísérleteink és eredményei ................................................................................................................... 20
Kezdő vizsgálat .................................................................................................................................. 20
DSC mérések .................................................................................................................................. 21
Megbeszélés .................................................................................................................................. 25
Következtetés ................................................................................................................................ 25
Az új vizsgálatok kivitelezése ............................................................................................................. 26
Ideg-izom komplex vizsgálata ............................................................................................................ 28
Megbeszélés .................................................................................................................................. 33
Következtetés ................................................................................................................................ 34
Szívizom vizsgálata ............................................................................................................................ 34
Megbeszélés .................................................................................................................................. 37
Következtetés ................................................................................................................................ 37
Plazma és vörösvértest vizsgálata ..................................................................................................... 38
Megbeszélés .................................................................................................................................. 42
Következtetés ................................................................................................................................ 42
Kísérletsorozatunk értékelése ............................................................................................................... 43
Az értekezés összefoglalása .................................................................................................................. 46
Célkitűzéseink teljesülése, az értekezés elért új eredményei ........................................................... 47
Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................................... 48
Irodalomjegyzék .................................................................................................................................... 49
Közlemények és előadások jegyzéke ..................................................................................................... 62
Az értekezés tárgykörébe tartozó közlemények ............................................................................... 62
Értekezés tárgykörébe tartozó előadások: ........................................................................................ 62
Nem a disszertáció tárgykörébe tartozó poszter: ............................................................................. 63
Nem a disszertáció tárgykörébe tartozó előadások: ......................................................................... 63
1
Rövidítés jegyzék
ALL – akut limfoid leukémia
CLL – krónikus limfoid leukémia
CT – komputer tomográfia
ΔHc – tömegre normált kalorimetriás entalpia
DNS – dezoxiribonukleinsav
DSC – Differential Scanning Calorimetry (differenciál pásztázó kalorimetria)
ENMG – elektroneuromiográfia
IgG – immunglobulin G
IgM – immunglobulin M
MESNA – nátrium 2-merkaptoetán-szulfonát
MRI – mágneses rezonancia vizsgálat
NAD – nikotinamid-adenin-dinukleotid
SLE – szisztémás lupus erythematosus
Tm – denaturációs hőmérséklet maximum
vvt – vörösvértest
WHO – World Health Organization (Egészségügyi Világszervezet)
2
Bevezetés
A XXI. században a fejlett országokban a kardiovaszkuláris megbetegedések után a
rosszindulatú daganatok állnak a második helyen a halálokok között. A Központi Statisztikai
Hivatal adatai szerint [1] Magyarországon is vezető halálokként szereplő szív- és érrendszeri
megbetegedések az elhalálozás okaként 2000-ben 48,7 %-ban, 2012-ben 46,4 %-ban
szerepeltek, vagyis minimális csökkenő tendenciát mutattak. Ezzel szemben a második
leggyakoribb halálok, a rosszindulatú daganatos megbetegedések előfordulása 25,4 %-ról 28
%-ra emelkedett, vagyis enyhe emelkedő tendenciát mutat. Ennek hátterében elsősorban a
kardiovaszkuláris megbetegedések területén tapasztalható intenzív egészségügyi fejlődés és
a fokozatosan emelkedő várható élettartam áll. 2014-ben Magyarországon a férfiak
születéskor várható élettartama 72,3 év, nők esetében 79,4 év, teljes lakosságra
vonatkoztatva 76 év [2].
A fenti tendenciákból is adódóan egyre nagyobb hangsúly helyeződik a daganatos
megbetegedések gyógyítására illetve kezelésére. A rosszindulatú térfoglaló folyamatok
túlnyomó többségében elsődleges cél az elváltozás in toto műtéti eltávolítása, azonban ez
sok esetben nem lehetséges, így kulcsszerep hárul daganattípustól függően a besugárzásnak
illetve a kemoterápiának. Mindkét lehetőség veszélyeket és akár igen súlyos mellékhatások
lehetőségét rejti magában.
A kemoterápia alkalmazása során – szakmámban a napi rutin során végrehajtott
transzarteriális kemoemblizáció vagy citosztatikus kezelések esetén – a dózis meghatározás
kiforrott vagy sokszor csak alakulóban lévő nemzetközi ajánlások, standardok alapján
történik, azonban betegre szabott individuális dózis beállítása nem lehetséges. Figyelembe
véve, hogy a legtöbb gyógyszer, kemoterápiás szer farmakokinetikája részben genetikai
alapon, részben a beteg szervezete aktuális általános állapotától függően befolyásolt,
ugyanazon dózis alkalmazása eltérő hatással lehet különböző kezeltek esetén.
Intézetünkben, a PTE Radiológiai Klinikán az onkológiai kezelések során elsősorban
epirubicin, farmorubicin, cisplatin és mitomycin C kerül alkalmazásra, melyeknek külön-külön
is és együttes alkalmazásuk esetén is ismert neurotoxikus illetve kardiotoxikus hatásuk [3, 4,
3
5]. Vizsgálatunkhoz mégsem ezek a szerek közül választottunk, hanem a ciklofoszfamidot,
melynek alapját az adja, hogy az onkoterápia mellett egyéb területeken több
betegségcsoportban, elsősorban immunológiában is kiemelt szerepet játszik és széles
körben, akár hosszantartó terápia részeként kerül alkalmazásra. Kisebb hangsúllyal, de
alkalmazásra kerül többek között bőrgyógyászatban, pulmonológiában is [6, 7]. Ebből
kifolyólag a mellékhatás profilja kiemeltebb szerepet kap és számos klinikai terület
profitálhat kísérleteink eredményéből.
A ciklofoszfamid fontosságát jól mutatja, hogy az Egészségügyi világszervezet (WHO)
által 2015 áprilisában kiadott legfontosabb gyógyszerek listáján is szerepel [8].
Célkitűzések
A dolgozat célja a DSC, mint esetleges klinikai diagnosztikai eszköz megítélése in vitro
kísérleteinkre alapozva. Szeretnénk bizonyítani a módszer alkalmasságát a szisztémásan
alkalmazott ciklofoszfamid terápia szövődményeinek előrejelzésében, várható
mellékhatásainak becslésében.
Állatkísérleteinkben gyógyszeres kezelés hatásainak megítélésére humán dózissal
ekvivalensen intraperitoneálisan alkalmazott ciklofoszfamid terápiát követően külön-külön
vizsgálat alá vetettünk ideg-izom komplexet, szívizomzatot, vérplazmát és vvt szuszpenziót.
Mindezek során szeretnénk megítélni:
- neuropátia, motilitási diszfunkció irányába mutató eltéréseket ideg-izom
komplexen létrejövő módosulások által
- a szívizomzatban kialakuló változásokat, melyek szerepet játszhatnak
kardiomiopátia kiváltásában
- a vér alakos elemein, vörösvérsejteken és vérplazmán detektálható eltéréseket,
mely alapján lehetőség nyílhat indirekt úton történő gyógyszerszint
monitorozásra és a tartós kezelés során létrejövő funkcionális módosulások
becslésére.
- eredményeink alapján a dózis függvényében tapasztalt eltérések prediktív értékét
a lehetséges következményeket illetően.
4
Kutatásainkat indukáló problémafelvetés – esetismertetés
Esetgazda: dr. Könczöl Franciska
Egy 40 éves, érdemben negatív egészségügyi anamnézissel rendelkező betegnél
uterus mióma és jobb oldali ovarium ciszta került felismerésre, melyek műtéti eltávolítását
gyermekvállalást elősegítő indikációval tervezték. Intraoperatíve rosszindulatú jobb ovarium
térfoglaló folyamat igazolódott (szövettani diagnózis: ovarium cisztadenokarcinóma),
melynek folyományaként hiszterektómiára, adnexectómiára és csepleszreszekcióra került
sor. Az onkológiai gondozásba vételt követően hat sorozat ciklofoszfamid + ciszplatin
(Cyclophosphamid 1300 mg + Platidiam 130 mg) citosztatikus adjuváns kezelésben részesült.
6 hónappal későbbi kontroll vizsgálat során panaszként a bal láb zsibbadását jelezte.
Későbbiekben panaszai perzisztáltak, majd mérsékelten progrediáltak, így 6 évvel a
beavatkozást követően gerinc MR vizsgálatot végeztek, azonban panaszait magyarázó eltérés
nem igazolódott. Ezt követően 1 hónappal az elektrofiziológiai vizsgálat szegmentális
polineuropatiát igazolt. Neurológiai vizsgálata során Achilles-ín- és mély talpreflex kiesést,
spinalis ataxiát, disztális taktilis hipesztéziát írtak le. Koponya CT vizsgálata érdemben negatív
eredménnyel végződött. Az évenkénti ideggyógyászati ellenőrzések során változatlan
panaszokat említett, és a kontroll elektrofiziológiai vizsgálat paraneopláziás eredetet vetett
fel. 11 évvel az operációt követő koponya MRI vizsgálat kismértékű vaszkuláris
enkefalopátiát jelzett. Onkológiai kontroll vizsgálatai metasztatikus, recidív folyamatot nem
igazoltak, mely alapján a pácienst gyógyultnak nyilvánították. A malignus elváltozás
felismerését követően 12 évvel a beteg onkológiailag gyógyult, ellenben súlyos
polineuropatiás jelekkel, centrális facialis parézissel jobb oldalon, nystagmussal, kétoldali
alsó végtagi és bal felső végtagi rigorral, az alsó végtagokon térd alatti taktilis hipesztéziával,
paresztéziával járó tünetekben szenved.
Összességében a beteg esetében nem javuló, életét tartósan negatív irányba
befolyásoló, progrediáló érzés- és mozgászavar, neuropátia maradt fenn, mely a rokkantság
mértékét elérő egészségkárosodáshoz vezetett.
5
A kórtörténetet és az alkalmazott gyógyszeres terápia hatásmechanizmusát,
ciklofoszfamid mellékhatás profilját az ismert irodalom alapján vizsgálva történt meg egy kis
egyedszámú állatkísérlet annak a megítélésére, hogy a beteg által kapott citosztatikus
kezelés kiválthatta-e a betegnél tapasztalt súlyos tünettant.
A kezdeti kísérlet eredményei alapján [9, 10] munkacsoportunk úgy gondolta
vizsgálatra érdemes az, hogy a ciklofoszfamid egyéb területen megjelenő káros
mellékhatásainak megítélésére alkalmas-e a módszerünk. Ezt a célt szem előtt tartva
végeztünk nagyobb egyedszámú állatkísérletet immár nem csak ideg-izom komplexet,
hanem szívizmot, vérplazmát és vörösvértest szuszpenziót is vizsgálva azonos feltételek
mellett.
6
Ciklofoszfamid
A ciklofoszfamid – kémiai nevén di-(béta-klóretil)-amino-propilénfoszforsav-
észteramid (C7H15Cl2N2O2P) - citotoxikus, DNS támadáspontú oxazafoszforin-gyűrűt
tartalmazó mustárnitrogén származék (1. ábra), mely a legszélesebb körben alkalmazott
alkilező szer a klinikai gyakorlatban. „Az alkilezés azt a kémiai reakciót jelöli, amikor egy
vegyület alkilcsoportja egy másik vegyület H-atomját kicseréli. Az alkilező vegyületek
kovalens kötést hoznak létre, ha az
elektrofil sajátosságú hidroxilkarbonil-
csoportjukat nukleofil vegyületekhez
képesek kapcsolni” [11]. A sejteken
belül az alkilező szerek a kis és nagy
molekulatömegű - mint a DNS -
molekulák között alakítanak ki kovalens
kötéseket mind a molekula láncokon
belül, mind azok között [12, 13]. Az így létrejött keresztkötések és lánctörések révén károsítja
a géneket, végeredményben gátolva a sejtproliferációt, illetve indukálva az apoptózist [14].
Hatásmechanizmusából adódóan régóta ismert, hogy a ciklofoszfamid jóval hatékonyabb a
gyorsan proliferáló sejtek esetén [15].
Farmakodinámia, farmakokinetika
A ciklofoszfamid in vitro körülmények között hatástalan, a szervezetbe
profarmakonként juttatjuk be intravénásan vagy per os – a gyomor-bél rendszeren keresztül
74 %-a szívódik fel [11]. A szervezetben in vivo, a metabolizmus során inaktív, reaktív és
toxikus vegyület is képződik. A prodrug aktiválásáért a citokróm P450, a máj monooxigenáz
rendszere felelős, mely során több lépcsőben (hidroxi-ciklofoszfamid, aldofoszfamid-
mustárnitrogén) egy reakciósorozat révén jön létre a foszforamid-mustárnitrogén, az aktív
alkiláló termék (2. ábra) [16]. Emellett keletkezik az akrolein is, mint toxikus metabolit és az
egyik gyakori mellékhatás, a hemorrágiás cisztitis kialakulásáért felelős vegyület [17].
1. ábra: A ciklofoszfamid kémiai szerkezete
7
2. ábra: A ciklofoszfamid hatásmechanizmusa [11]
A hidroxi- ciklofoszfamid és az aldofoszfamid-mustárnitrogén transzportforma,
melyek a sejtmebránon jól átjutnak ellentétben az ionos foszforamid-mustárnitrogénnel
[18]. Habár a hatás mértékét nem befolyásolja, de a mikroszomális poliszubsztrát
monooxigenáz rendszer szükséges a ciklofoszfamid aktivitásához. Ezt jól bizonyítja, hogy a
fenobarbitál-előkezelés ugyan kis mértékben emeli a metabolitok szintjét, de a
daganatgátlás mértékét érdemben nem befolyásolja [19].
A ciklofoszfamidra csökkent érzékenységű sejtekben, akárcsak a rezisztens
tumorsejtekben is kimutatható egy inaktiváló reakció, ami az aldofoszfamid-mustárnitrogént
biológiailag inaktív karboxi-ciklofoszfamiddá oxidálja NAD-függő aldehid-dehidrogenázok
segítségével. Ebből adódóan az aldehid-dehidrogenáz gátlásával a citosztatikus/citotoxikus
hatás fokozható, ellenben a terápiás indexet mégiscsak csökkenti, mivel ezzel jelentősen
8
csökken a ciklofoszfamid relatív szelektív hatása a tumoros sejtekre, tekintve, hogy az ép
sejtek aldehid-dehidrogenáz-aktivitása magasabb a daganatos sejtekhez képest [11, 16].
A kialakuló foszforamid-mustárnitrogén makromolekulák elsősorban a DNS-ket
alkilálják, keresztkötéseket létrehozva a DNS láncok között, és ezzel gátolják a sejtek
proliferációját, így a tumor növekedést, illetve elpusztítják az antigén hatására proliferáló
sejteket, akadályozva az immunválaszt, mely miatt hatásosan alkalmazhatóak az autoimmun
betegségek terápiájában is [12,13,14].
A gyógyszer beadását követően a plazmakoncentráció 1-2 óra múlva éri el a
maximumát, a 20 %-uk liquorban is kimutatható [20]. A vérben a ciklofoszfamid 10-20 %-a,
míg az aktív metabolit, a foszforamid-mustárnitrogén 33 %-a kötődik plazmafehérjéhez. A
ciklofoszfamid plazma koncentrációjának felezési ideje felnőttekben és gyermekekben
jelentősen eltér, előbbi esetben 7 óra, míg utóbbi csoportban 4 óra [21]. Eliminációjáért
elsősorban a máj felel, de 5-25 %-át a vese választja ki változatlan formában, míg a
metabolitok jelentős része, 60-70 %-a mutatható ki a vizeletben a beadást követő 48 órában
[11, 16, 22, 23]. Igen kis mennyiségben a ciklofoszfamid és metabolitjai a székletben és a
kilélegzett levegőben is kimutatható [24].
Fontos kiemelni, hogy ismételt kezelések során – több napos kezelési séma esetén – a
felezési idő redukálódik, aminek a hátterében maga a ciklofoszfamid által indukált
metabolikus aktiválódás gyorsulása áll. [25, 26, 27].
Tartós kezelés során a gyógyszer iránt relatíve gyakori a rezisztencia kialakulása,
melynek létrejöttében 3 mechanizmus játszik szerepet. Az egyik a daganatban az aldehid-
dehidrogenáz aktiválódása, a másik, hogy a glutation konjugációval semlegesítődés jön létre,
harmadrészt pedig a DNS repair mechanizmus segítségével a DNS-károsodás helyreáll [11,
28, 29].
A ciklofoszfamid metabolizmusa nagymértékű egyéni variabilitást mutathat, mely
részben genetikailag determinált, részben a társbetegségek és kísérő kezelések befolyása
alatt áll, így időben is változhat [30]. Joy és munkatársai kimutatták, hogy a ciklofoszfamid és
4-hidroxi-ciklofoszfamid farmako-kinetikája eltérő autoimmun betegségek (pl.:
glomerulonefritisz) és daganatos betegségek esetén. (A vizsgálatok során a plazma
9
ciklofoszfamid szintjét folyadék kromatográfia - tömeg spektroszkópia segítségével
monitorozták, mely hatékony, de körülményes módszer [31].)
Alkalmazás
A ciklofoszfamid orvosi alkalmazásának lehetőségét a daganatellenes terápiában
citotoxikus szerként először 1958-ban publikálták [32]. Napjainkban a ciklofoszfamid -
roppant hatásos orálisan adagolható immunszuppresszív gyógyszerként - elsődleges
alkalmazási területe a súlyos szervi érintettséggel járó, enyhébb kezelésekre nem reagáló
reverzibilis, illetve életet veszélyeztető komplikációkkal társuló reumatológiai-immunológiai
betegségeknél van (szkleroderma, vaszkulitiszek, SLE) [16]. Több esetben első vonalbeli
kezelésként, de sokszor - a némileg enyhébb mellékhatás spektrummal rendelkező
metotrexát mögött - csak második választásként jön szóba [33, 34, 35]. Hatására jellemző,
hogy a gyulladásos tünetek csökkentése helyett a folyamatot lelassítják, szerencsésebb
esetben megállítják. Kiemelendő, hogy az egyidejű szteroid kezelés esetén a szteroid
szükségletet is csökkenti [11].
Kiváló immunszuppresszív hatása miatt szervátültetések esetén, ritkább esetben
Wegener-granulomatózisban és gyermekkori nefrózisban szintén jól és eredményesen
alkalmazható [36, 37].
A ciklofoszfamid bár mind a B-, mind a T-sejtekre hat, mégis a humorális
immunválaszt gátolja kifejezettebben [38].
Kiemelkedő szerepét emellett a daganatok kezelésében betöltött helyének
köszönheti, nagyobb dózisban az egyik legfontosabb antineoplasztikus szer, a legszélesebb
körben alkalmazott alkilező kemoterapeutikum. A legfontosabb alkalmazási területe a
hematológiai rosszindulatú daganatok kezelése (ALL, CLL, Hodgkin-kór, non-Hodgkin-kór), de
egyes szolid daganatok esetén szintén sikeresen alkalmazzák, gyakran egyéb kemoterápiás
szerekkel kombinálva [39, 40, 41, 42, 43]. Segítségével akár teljes remisszió érhető el Burkitt-
limfómában és gyerekkori akut limfoid leukémiában, de fontos összetevője az
emlődaganatok adjuváns kezelésének is [39, 44, 45]. Szerényebb hatásfokkal a mielóma
multiplex, petefészek és tüdő daganatok terápiájában is részt vesz [46, 47, 48]. Az
előrehaladott, későn felfedezett rosszindulatú folyamatokban a sikeres gyógyszeres
10
kezelések esélye kisebb, mivel a daganatok progressziója során a tumor tömegének
emelkedésével arányosan nő a mutációk gyakorisága és az osztódások okán az eredendően
rezisztens sejtek száma [11]. Ellenben a ciklofoszfamid fontos tulajdonsága, hogy egyidejűleg
képes károsítani a gyorsan és lassan osztódó sejteket [16].
Lokálisan a szer nem alkalmazható, de adható tabletta (per os) és intravénás injekció
formájában. A ciklofoszfamidra érzékeny limfómák terápiájában és hasonlóan károsodott
csontvelő esetén 2–3 mg/kg (75–112 mg/m2) dózisban, rosszul reagáló daganatokban
kétszeres dózist lehet alkalmazni intravénásan 6 napon át, majd 1–5 mg/kg-mal fenntartó,
per os kezelés szükséges. Limfómás betegekben egyszeri nagy dózis – 30 mg/kg –
kifejezetten hatásosan alkalmazható a klinikai állapot javítására [11].
Alkalmazásában kontraindikációt képez a súlyos májkarosodás (májelégtelenség), míg
rossz veseműködés (veseelégtelenség) esetén csak szoros kontroll mellett adható.
Terhesség, szoptatás és leromlott egészségi állapot, gyulladásos góc, szepszis mellett nem
alkalmazható. A fenobarbital és phenytoin egyidejű használata gyógyszer interakció okán
toxicitását emeli [11, 16, 49].
Mellékhatásai
A jótékony hatásai mellett a ciklofoszfamidnak súlyos, akár életveszélyes
mellékhatásai, szövődményei is lehetnek. Akut toxicitása a fehérvérsejtekre nagyon erős, a
trombocitákra enyhe. Gyakori mellékhatása az alopecia, mérsékelt fokú hányás, hányinger,
tüdőfibrózis és kiemelten a vérzéses húgyhólyaggyulladás (10%-ban). Ez utóbbi
megelőzésére N-acetil-cisztein vagy MESNA (HS-CH2-CH2-SO3) adása megoldást jelenthet. A
celluláris immunitást csökkentő hatása esetenként a rosszindulatú folyamat progresszióját, a
metasztázis képzést is elősegítheti. Primer daganatképző hatása is ismert, huzamosabb
alkalmazásából adódóan akut myeloid leukémia, húgyhólyag tumor alakulhat ki. Emellett
súlyosabb mellékhatásai is lehetnek pl. a trombembólia, infertilitás vagy a teratogén
neurotoxikus hatás [11, 50, 51, 52].
11
Ciklofoszfamid vizsgálatunkban kiemelt szerepet kapó hatásai
Polineuropátia
A ciklofoszfamidot perifériás idegkárosodás, polineuropátia kezelésre is használják
IgM ill. IgG monoklonális gammopátiában [53, 54, 55], miközben több esetben is felmerült,
hogy a ciklofoszfamid maga is indukálhatja ezt a betegséget. A ciklofoszfamid
polineuropátiás hatásáról eddig kevés közleményt publikáltak [56, 57]. Ezeknek a többsége is
feltételezésen alapszik, mint például Tschöp és társai által közölt Werlhof-kórban
(autoimmun idiopátiás trombocitopéniás purpura) szenvedő beteg nagy dózisú
ciklofoszfamid terápiát követően kialakult perifériás szenzoros és motorikus
polineuropátiája, melynek etiológiájára egyéb magyarázatot nem találtak [58].
Mindazonáltal, ahogy Könczöl és társai rámutattak, a látszólag enyhébb mellékhatásnak igen
komoly, rokkantsághoz vezető következményei és akár igazságügyi orvosszakértői aspektusai
is lehetnek [9, 10].
A polineuropátia egy polietiológiájú, általában összetett szindrómák részeként
jelentkező, típusosan distalis területeken kezdődő kórkép. Az ehhez vezető betegségek,
kiváltó tényezők számát több százra becsülik, melyek közül a leggyakoribbak a diabetes
mellitus, hipotireózis, B12 vitaminhiány és az alkohol abúzus. A paraneopláziás eredetű
polineuropátia ritka, becslések szerint az összes polineuropátia kevesebb, mint 1%-a,
azonban egy korábbi tanulmány a daganatos betegek 2,5%-ában mutatta ki [59]. A
különböző gyógyszerek, így a feltételezetten ciklofoszfamid indukálta kórkép a toxikus
polineuropátiák közé sorolható. A daganatos betegek polineuropátiáját a kemoterápia során
alkalmazott szerek váltják ki a leggyakrabban [60].
Az érintett területtől függően előfordulhatnak vegetatív, szenzoros vagy motoros
diszfunkciók is, melyek sokszor keverten jelentkeznek ezzel megnehezítve a diagnózis
felállítását. A legbiztosabb diagnózist a célzott biopszia jelenti, de ez a gyakorlatban
rutinszerűen nem elérhető, csak dedikált esetekben alkalmazzák. Amennyiben a klinikum
alapján felmerül, a kórképet elektroneuromiográfia (ENMG) segítségével lehet megerősíteni,
de még emellett sem kerül az esetek 20%-a felismerésre [61].
12
Kardiomiopátia, kardiotoxicitás
Számos citotoxikus szer rendelkezik cardiotoxikus hatással, melyek közül az
antraciklinek (pl.: doxorubicin) emelhetőek ki, de a napi munkánk során az onko-
radiológában egyik leggyakrabban alkalmazott epirubicinnek is ismert ez irányú mellékhatása
[62]. Használatuk relatíve jól ismert mechanizmussal vezethet hosszú távú morbiditáshoz
[63]. Emellett a ciklofoszfamidnak ismert, de kevésbé egyértelmű mechanizmussal
magyarázott kardiotoxikus hatása is van.
Az alkilező szerek közé tartozó ciklofoszfamid súlyos, akár fatális következményekkel
járó szívkárosító hatását már több mint 40 éve leírták csontvelő-transzplantáció kapcsán [64,
65]. Míg a doxorubicin és társai szívkárosító hatása kumulatív jellegű, addig a ciklofoszfamid
nagy dózisú kezelés esetén is csak ritkán okoz akut szívelégtelenséget vagy hirtelen
szívhalált, mivel nem kumulatív jellegű [66].
A ciklofoszfamid indukálta kardiomiopátia patogenezise a szabadgyökök
felszaporodásán és az antioxidánsok lecsökkenésén alapszik [67], patofiziológiája részben
ismert, azonban teljes egészében még napjainkban sem tisztázott. A ciklofoszfamid
metabolitjai oxidatív stresszt és direkt kapilláris endotél károsodást okoznak, melynek
következtében a fehérjék, vörösvértestek és toxikus metabolitok extravazációja jön létre
súlyosan károsítva a szívizmot. A miokardiumban mikrotrombusok, intersticiális bevérzések
és ödéma jelentkezik. Boncolások során a magnagyobbodott szívizom intersticiumában
észlelt kapilláris szintű mikrotrombusok, fibrin lerakódások a ciklofoszfamid indukálta
kardiomiopátiára jellegzetes [68].
A gyakorlatban típusosan a gyógyszer adásától kezdődően az első 48 órában, esetleg
az első 10 nap alatt jelentkeznek a klinikai tünetek, mint a tahiaritmia, hipotenzió,
szívelégtelenség, miokarditisz, perikarditisz, perikardiális tamponád [69]. Ritka komplikáció a
hemorrágiás szívizomgyulladás, mely általában gyors és végzetes lefolyású [68].
A súlyos kardiotoxicitás incidenciája pontosan nem ismert – a magasabb gyógyszer
dózis emeli az előfordulását, de a határérték nem tisztázott - a megjelenő szívelégtelenség
rizikó faktornak tekinthető [70]. Történtek próbálkozások a szívizomban létrejövő változások
13
korai kimutatására szív MRI segítségével, de egyértelmű prediktív eltéréseket nem sikerült
azonosítani [71]. A súlyos kardiotoxicitást kiváltó határérték nem ismert.
Vérplazma alkotóelemire gyakorolt hatás
A vérplazma az extracelluláris folyadéktér - „milieu intérieur” - 25 %-át teszi ki, annak
a mozgó részét képezi, mely ezáltal kapcsolatot teremt szervek, szervrendszerek között.
Összetételét tekintve 90 %-a víz, emellett diffúzibilis anyagok és nem diffúzibilis
plazmafehérjék találhatók benne. A plazmafehérjék között elektroforézis alapján 6 fő frakció
különíthető el – albumin; α1; α2; ß- globulin; γ-gobulin és fibrinogén. Emellett valójában több
mint 200 különböző, funkcióval rendelkező fehérje ismert. Jelentőségüket figyelembe véve
kiemelendőek a transzport-fehérjék pl.: transzferrin, cöruloplazmin, tiroxin kötő globulin,
transzkortin, transzkobalamin, haptoglobin, de a fehérjék többek között befolyásolják a
véralvadást, a folyadékmegoszlást a szervezetben, a sav-bázis egyensúlyt és az immunitást.
Az érpályába adott anyagok, mint például az intravénás gyógyszerek, nagyjából 5 perc alatt
oszlanak el egyenletesen az intravazális térben [72].
A ciklofoszfamid régóta tisztázott egyik mellékhatása az átmeneti fehérvérsejt és
vörösvértest szám csökkenés, mely a szer citotoxikus hatásából adódik [11, 16]. Emellett a
beadott ciklofoszfamid a vér alkotó elemeihez részben kötődik, részben azokon egyéb úton
változásokat hoz létre, ami a vörösvértesteken és az egyéb plazma alkotó elemeken a
biológiai törvényszerűségek okán igen nagy valószínűséggel funkcionális módosulásokat is
kivált, de ezeknek a következményei még napjainkban sem tisztázottak megalapozottan.
14
Differenciál pásztázó kalorimetria (DSC)
Termikus vizsgálati módszer alatt általánosságban az olyan eljárásokat értjük, melyek
képesek a hő hatására lejátszódó átalakulások kimutatására. Melegítés hatására az elemzett
minta fizikai vagy kémiai tulajdonságai változnak, melyeket különböző készülékek
segítségével detektálhatunk, és következtetéseket tudunk levonni a folyamat természetéről.
Az analitikai eljárások között a termikus analitikus eljárások külön csoportot alkotnak,
melyben a vizsgált anyag tulajdonságait az idő vagy a hőmérséklet függvényében követünk,
miközben a minta hőmérsékletét előre meghatározott algoritmus szerint változtatjuk [73].
Ezen csoporton belül helyezkedik a mára már leggyakrabban alkalmazott
termoanalitikai módszer, a számos tudományterület által használt DSC is, melynek alapjait
Watson és O’Neill rakta le az 1960-as években [74, 75]. Eredendően szervetlen anyagok
fizikai tulajdonságainak vizsgálatára fejlesztették ki, majd a gyógyszerkutatásban is jelentős
szerepet kapott [76]. A későbbiekben, mint érzékeny validált analitikai módszer a biológiai
makromolekulák (nukleinsavak, fehérjék, szénhidrátok) szerkezeti változásainak
elemzésében [77], majd kísérleti állatmodell vizsgálatoknál is alkalmazták [78]. Az
ezredfordulót követően a klinikai kutatásokban is egyre nagyobb teret nyert [79, 80, 81, 82],
míg napjainkban már klinikai alkalmazását vizsgálják, mint diagnosztikai vagy követési
módszert, az egyes daganatos betegségekben [81, 83, 84]. Végeredményben kijelenthető,
hogy az orvostudományi kutatásokban a DSC az egyik alapmódszernek számít a biológiai
struktúrákban lezajló változások megítélésében.
A DSC alapjai
A biológiai szervezetben zajló folyamatok során az anyag belső struktúrája
meghatározott, ismert törvényszerűségek alapján változik. Egy rendszer egymással szorosan
összefüggő állapothatározókkal jellemezhető, mint például a hőmérséklet, nyomás, térfogat,
koncentráció, és ezek összességében állapotegyenletekkel írhatók le, melyek információt
adnak a rendszer energiaállapotáról, stabilitásáról, belső rendezettségéről.
15
A DSC érzékeny a strukturális és konformációs változások detektálásában a biológiai
és biokémiai folyamatokban, kifejezetten szenzitív a fehérjék termikus denaturációjának
kimutatásában és alkalmas globális és szubmolekuláris változások jellemzésére [85, 86]. A
termodinamikai analízis segítséget nyújt több tulajdonság meghatározásában, mint pl. a
hőkapacitás, szerkezeti stabilitás, transzformációk, konformációs változások, olvadási pontok
[87].
A biológiai minták különböző kémiai vegyületek vagy makromolekulák formájában
vannak jelen a hőmérséklet függvényében a sejtekben, szövetekben, így a hőmérséklet
változtatásával egy bizonyos ponton a halmazállapot illetve a szerkezet változni fog. Ez a
változás a különböző anyagokra jellemző és bizonyos külső hatásokra, vagy patológiás
eltérések esetén egyedi képet mutatnak. A hőmérsékletváltoztatás által indukált
átalakulásokat hőjelenség kíséri, ezeket figyelve a felszabaduló vagy elnyelt hőenergiát
mérhetjük és segítségével beazonosíthatjuk az anyag szerkezetét. Ehhez csak össze kell
hasonlítani a már korábban - hasonló módon mért - tiszta kémiai anyagok termikus
tulajdonságaival [76, 87].
A DSC működési elve
Az általunk használt készülék
működése a hő-áram mérés elvén alapszik. A
vizsgálóeszköz 2 db azonos térfogatú, térben
elválasztott mintatartó cellát tartalmaz, az
egyik a mérő cella, amibe a vizsgált anyagot
helyezzük, a másik a referencia cella, és
mindkettő egy fűthető-hűthető hőelnyelő
blokkban helyezkedik el (3. ábra). Ha a
vizsgált anyag folyékony halmazállapotú,
leülepedését megakadályozandó a cellák
cellatetőbe beépített haránt irányú tálcákat
tartalmaznak. A referencia cellába mindig az
adott vizsgálatnak megfelelő inert anyagnak kell kerülnie, ami a mérés alatt nem mutathat
szerkezeti változást. Ez általában a minta puffer-oldata.
3. ábra: Hőáramos DSC készülék sematikus elrendezése (Forrás: Setaram kézikönyv)
16
A megtöltött cellák hőkapacitásának egyeznie kell. A mérések kiértékeléséhez
szükséges a műszeralapvonal felvétele, amit mindkét cella üres állapotában, vagy puffer-
oldattal való feltöltésük mellett végzett méréssel kapunk meg, és az adott műszerre
jellemző. A mi méréseink során, mivel a makromolekulák denaturációja irreverzibilis, a
denaturált minta ismételt denaturációja szolgáltatja a referencia jelet (a műszer
alapvonalát), amit kiértékeléskor levonunk az első felfűtés adataiból.
A mérések során a cellák egyidejű, teljesen szinkron programozott felfűtése történik,
mely során a két cella hőmérséklete teljesen azonos módon változik egészen addig, míg az
egyik cellában nem jön létre valamilyen, az emelkedő hőmérséklet kiváltotta változás. Ekkor
a két cella között hőmérséklet-különbség jön létre és annak előjelétől és nagyságától
függően energiát kell az egyik cellába táplálnunk, hogy a program-hőmérsékletet mindkét
cella azonos módon kövesse, s köztük a hőmérséklet különbség zérus maradjon. A készülék
az ehhez szükséges fűtőáram változást detektálja, és ebből vonatkoztatva rögzíti kimeneti
jelként a hőteljesítményt/hőáramot az idő vagy hőmérséklet függvényében (4. ábra). Állandó
nyomás és hermetikus zárás mellett az így nyert hőáram görbe alatti terület (idő szerinti
integrálja) megadja a kalorimetrikus entalpiát (5. ábra). Ez az energia megfelel vagy a
konformáció illetve szerkezeti változáshoz szükséges, vagy a folyamat során felszabaduló
energiának. Grafikus feldolgozással a minta állandó nyomásra vonatkoztatott hőkapacitását
is megkaphatjuk.
Fontos megjegyezni, hogy a termikus analízis csak arra ad választ, hogy egy gondosan
megtervezett kísérleti sor esetén az általunk elvégzett beavatkozások, vagy a különböző
károsodások megváltoztatták-e a mintánk szerkezetét (a hőkapacitás változás ennek
4. ábra: Hőteljesítményt leíró egyenlet [88.]
5. ábra: kalorimetrikus entalpiát leíró egyenlet
A hőteljesítmény (Watt) leírható
az alábbi egyenlettel:
Q/t=R·I2
R állandó, így elegendő a fűtőáramot
mérni (I) azonos körülmények között
dH/dt = Cp·dT/dt
ahol:
dH: kalorimetrikus entalpia változás
Cp: a minta hőkapacitás
dT/dt: a fűtési / hűtési sebesség
17
egyértelmű jele), de hogy melyik részén, annak eldöntésére kiegészítő vizsgálatok
szükségesek. A kapott jel erőssége a megváltozott anyag mennyiségével arányos –
kiemelendő azonban, hogy a minta tömegének növelésével nem kapunk többletinformációt
sőt, a kapott görbék inkább mű- illetve melléktermékekkel terheltté válnak, vagyis bizonyos
határon túl előnytelen.
A DSC görbe értelmezése
A DSC mérés révén kapott hőelnyelési görbék
szemléltetik a vizsgált anyag fizikai és kémiai
sajátosságainak megváltozását. A megszokott szemlélet
és jelölések mellett a vizsgálat során bekövetkező
endoterm folyamat lejátszódásakor a termogramon egy
negatív csúcsú görbét kapunk (6. ábra). Ekkor a minta
hőmérséklete a referencia celláéhoz képest elmarad,
mivel a betáplált hőenergia egy része a kémiai
szerkezet átalakulásához szükséges, például kötések
felbomlásához, vagyis nem a belső energiát növeli –
ezért ez egy hőelvonó folyamat. A referenciával való azonos hőmérséklet fenntartásához
plusz energiát kell a mérő cellába táplálnunk, vagyis a referencia cellával közölt össz-hőáram
kisebb a mérő cellába folyóhoz képest, ezt mutatja a negatív irányú kitérés. Exoterm –
hőtermelő folyamat – esetén a mérő cellában lezajló reakció során felszabaduló energia
hővé alakul, így a referencia cella hőmérséklete elmarad a mintáétól. Ezt kompenzálandó a
befolyó hőáramot növelni kell a referencia cellába, ezt demonstrálja a pozitív csúcs. Jól
láthatóan ebben az esetben a hőáram változását a referencia cella szemszögéből ábrázoltuk,
de ez nem törvényszerű, a mérőcellára vonatkoztatva az ábrázolást egy endoterm reakció
pozitív csúcsként jeleníthető meg. (7. ábra). Ebből adódóan a görbék értékelése előtt fontos
meghatározni melyik szemszögből kerültek ábrázolásra a mért adatok.
6. ábra: Termogram (Forrás: SETARAM kézikönyv)
18
30,0 40,0 50,0 60,0 70,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Tm
F-aktin (kontrol)
Tm = 62.9
oC
Hőáram, mW
Hőmérséklet, oC
7. ábra: F-aktin DSC termogramja. A DSC görbe maximumához tartozó hőmérsékletet (Tm) tekintjük a
termikus stabilitás mértékének. (endoterm folyamat a növekvő hőáram irányában)
A DSC-termogram alapesetben több fázisra bontható, amint az, az alábbi konkrét
példán keresztül végigkövethető (8. ábra). Kezdetben a minta és referencia cella a hőt
egyenletesen felveszi, melegszik, így azonosan nő a belső energiájuk és nincs
hőmérsékletkülönbség a referencia oldathoz képest – ez az 1. plató fázis (az ábrán az első két
Tm között, közel vízszintes szakasz). További hevítésre a hőáram csökken T1-től, negatív csúcs
ábrázolódik. Mivel a referencia cella szemszögéből történt az ábrázolás ez egy endoterm
folyamatot demonstrál – a minta hőmérséklete alacsonyabb a referenciáénál a benne lezajló
szerkezet változás miatt, így többletenergiát kell betáplálni a hőegyensúly fenntartásához –
ez a cellákat tartó úgynevezett hőelnyelő blokkban lévő platina fűtőellenállás révén valósul
meg. A folyamat megfelel biológiai, kémia kötések felszakításának, átrendeződésének, ami
energiatöbbletet igényel. A görbe negatív irányú maximumát akkor éri el, amikor a
makromolekulák felének szerkezete átalakult, innentől egyre kevesebb plusz hőmennyiséget
igényel a rendszer időegység alatt. Amint az összes molekula szerkezet átalakulása lezajlott
(T2 után) nincs szükség többletenergiára, a cellák hőmérséklete azonos módon változik, és
elkezdődik a 2. plató fázis (ami a denaturált állapot). Az első és második plató alapvonala
19
közti különbség a natív és denaturált minta közti hőkapacitás különbséget adja, és
egyértelműen jelzi a szerkezet megváltozásának jellegét: merevebb vagy lazább lett.
A biológiai minták termogramja egyedi és mivel az emberi szervezetben lezajló káros
folyamatok patomorfológiai változásokkal járnak, ezen strukturális eltéréseket észlelve
különbség tehető a fiziológiás és patológiás ill. megváltozott szerkezetű – és ezáltal a biológia
törvényszerűségei szerint feltehetően megváltozott, módosult funkciójú - szövetek között
[90, 91].
8. ábra: Rostos porcszövet denaturációs görbéje és paraméterei (A szerzők engedélyével [89])
- a denaturáció kezdete (T1) és vége (T2)
- denaturációhoz szükséges energia (H=kalorimetriás entalpia)
- denaturáció maximális hőmérséklete (Tm= a minta 50%-a átalakul más konformációba)
- félértékszélesség (T1/2: ha kicsi, akkor nagyon erős a kölcsönhatás/kooperativitás az adott termikus egységen belül, ha nagy, akkor igen laza. Tehát a denaturáció során létrejövő új állapot merevebb, vagy lazább szerkezetű lesz)
- a natív és denaturált állapot alapvonala közti különbség a két állapot hőkapacitás (Cp) különbségét adja.
20
Kísérleteink és eredményei
Kutatásaink céljának ciklofoszfamid által indukált biológiai eltérések kimutatását
tűztük ki DSC segítségével annak reményében, hogy eredményeink alapján a későbbiekben
más nemzetközi tanulmányok eredményére is támaszkodva klinikai alkalmazhatóságát
bizonyítsuk. Vizsgálatainkhoz etikai engedélyt kértünk, engedélyszáma: BA02/2000-4/2012.
A DSC, mint vizsgálati módszer klinikai alkalmazhatóságát már számos publikáció
bizonyította az elmúlt években [89, 92-97].
Kutatásainkhoz kifejlett tengerimalacokat (Cavia porcellus) használtunk, mely során
intraperitoneálisan injektáltunk ciklofoszfamidot. Az intraperitoneális gyógyszerbevitel
kisemlősök esetében széles körben elfogadott módszer [98], mely emberekre vonatkoztatva
egyenértékűnek tartható az intravénás alkalmazással.
Kezdő vizsgálat
A DSC módszer alkalmazásának gondolata egy konkrét, a bevezetésben ismertetett
igazságügyi orvosszakértői eset megoldásának kapcsán merült fel [9, 10]. Ennek
megválaszolása érdekében a kísérletek során tengerimalacok intraperitoneálisan, az emberi
terápiás dózis testtömeg kilogrammra arányosan számított mennyiségű (5 mg/kg)
ciklofoszfamidot kaptak egymást követő 2-5 alkalommal, illetve több nap szünettel a humán
protokollnak megfelelően. Kontrollként gyógyszert nem kapott állat szerepelt (1. táblázat).
Az állatok aether ad narcosimmal telített kamrában exitáltak, és a hátsó végtagokból
az ülőideg (nervus ischiadicus) és lábszárizom (m. gastrocnemius) kipreparálása történt, az
idegekből egységesen 2 cm hosszú, az izmokból azonos anatómiai helyről 0,5x0,5x2 cm-es
mintavétel történt, melyek a kalorimetriás feldolgozásig (a minta vételét követően 12 órán
belül) steril fiziológiás konyhasóoldatban voltak tárolva 4 oC-on.
21
Testtömeg
(gramm)
Ciklofoszfamid kezelés időpontja / nap
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1. 490 (k) Exit
2. 572 X X Exit
3. 526 X X X Exit
4. 462 X X X d.e.X
d.u.Exit
5. 686 X X X X X X Exit
1. táblázat: Kísérleti állatok (tengerimalac) ciklofoszfamid (5 mg/testtömeg) kezelésének (X) és a
mintavételek (exit) időrendi beosztása, k=kontroll.
DSC mérések
A mérések rövid időn, minden esetben 12 órán belül elvégzésre kerültek, a
kalorimetriás vizsgálatokat megelőzően az állatokból kipreparált minták fiziológiás
sóoldatban háromszor átmosásra kerültek a zavaró szennyeződések, szövetmaradékok
eltávolítása érdekében.
A termikus analízis
SETARAM Micro DSC-II
kaloriméterrel (9. ábra) történt
0 és 100 oC között 0,3 K/perc
melegítési ütem mellett. A
kísérletetekben hagyományos
Hastelloy-cellákban (V=1 mL)
történt a denaturáció,
melyekben átlagosan összesen (minta + puffer) 950 µL mintatérfogat volt. A vizsgált
szövetdarabok tömege 250-400 mg között volt. Referenciaként izotóniás sóoldat szerepelt. A
referencia- és mintaedények tömege ± 0,1 mg pontossággal megegyezett, így az edények
hőkapacitása között nem volt szükséges korrekciót alkalmazni. A hőabszorpciós görbe alatti
területből történt a kalorimetriás entalpia meghatározása kétpontos illesztésű SETARAM
integrálás segítségével, majd a vizsgálati eredmények (a különböző minták denaturációs
hőmérsékletei, a kalkulált entalpia értékei) összehasonlítása történt.
9. ábra: PTE ÁOK Biofizikai Intézet SETARAM Micro DSC-II kalorimétere
22
A kontroll egészséges gastrocnemius izom denaturációja (10. ábra) az aktomiozin
oldatok [99-102] és a nyúl psoas izomrostok [103-105] esetén mért három átalakulási
hőmérsékletű hőabszorbciós görbékhez hasonlít. Az előbb említett irodalmak alapján az első
denaturációs csúcs a miozin fej, a második a miozin rúd, míg a harmadik az aktin termikus
denaturációjával hozható kapcsolatba. A citosztatikummal kezelt állatok mintáinak termikus
denaturációja a DSC görbék alapján jó közelítéssel a kapott terápiás dózis függvényében
változott (10. ábra).
10. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok musculus gastrocnemius hődenaturációs görbéi. Számozás a 2. táblázat szerint.
23
A 2. táblázat alapján a miozin fej (Tm1 értékek) tűnik a legérzékenyebbnek (ez egy
ATPase) a kezelési dózisra. Az első dózis sokk hatásként értelmezhető a kiugróan magas Tm1
miatt, míg a további dózisok közel azonos mértékű változást eredményeztek. A miozin rúd
(Tm2 értékek) és az aktin (Tm3 értékek) a második és negyedik adag citosztatikumra adott a
kontrollhoz képest jelentősen eltérő eredményt. A kalorimetriás entalpia, amely a szerkezeti
változásokat szintén jól monitorozza, hasonlóképp dózisfüggést mutat. A mérések
korlátozott száma (csak egy kezelési sorozat elvégzése történt a kontrollal együtt öt
egyedből álló csoporton) miatt természetesen statisztikailag igazolt összefüggés nem volt
kimutatható, de a tendencia jól látható. A kemoterápiás kezelésnek tehát lehet a
mozgatórendszerre károsító hatása.
Minta:
m. gastrocnemius
Termikus paraméterek
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔH/Jg-1
kontroll (1) 50,3 57,5 67,56 3,77
kezelt (2) 54,27 57,09 67,4 1,6
kezelt (3) 48,9 68,79 68,79 3,38
kezelt (4) 49,2 57,83 67,95 2,62
kezelt (5) 48,9 55,8 68,26 3,57
2. táblázat: Tengeri malac m. gastrocnemius izmának termikus denaturációs paraméterei a kezelési idő
függvényében. (Tm-k denaturációs hőmérséklet maximumok, ΔH tömegre normált kalorimetriás entalpia.)
Tekintettel arra, hogy a mozgató rendszer (izom) működése nem csak annak
szerkezeti tulajdonságától, hanem a beidegzettségétől is függ, ezért az izom működtetéséért
felelős ischiadicus idegen is történtek mérések.
A 11. ábra alapján az ideg denaturációs hőáram görbéje szintén dózisfüggő lefutású.
24
11. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok nervus ischiadicus hődenaturációs görbéi, számozás a 3. táblázat alapján.
A 3. táblázatban feltüntetett termikus adatok alapján az alkalmazott kemoterápiás
dózisok többsége szerkezeti változást okozott (vagy a Tm vagy H alapján).
Minta
n. ischiadicus
Termikus paraméterek
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔH/Jg-1
kontroll (1) 53,9 61,08 63,54 1,06
kezelt (2) 55,35 61,44 65,25 1,72
kezelt (3) 54,83 60,21 63,1 0,93
kezelt (4) 54,1 60,50 65,13 1,65
kezelt (5) 52,86 66,7 66,74 0,86
3. táblázat: Tengerimalac n. ischiadicusa hődenaturációs értékei a kemoterápiás kezelési idő függvényében.
(Tm-k denaturációs hőmérséklet maximumok, ΔH tömegre normált kalorimetriás entalpia.)
Az ideg összességében nagyobb érzékenységet mutatott a kemoterápiás kezelésre,
mint az általa beidegzett izom.
25
Megbeszélés
Számtalan endogén és exogén ok idézhet elő polyneuropathiát [106-110]. A malignus
daganatos betegségek kapcsán kialakuló neuropathiák etiológiájaként sokszor
paraneoplasiás jelenség merül fel először, azonban bizonyítottnak tekinthető, hogy
túlnyomó részéért az alkalmazott kemoterápiás gyógyszeres kezelések lehetnek a felelősek,
bár ezek direkt neurotoxikus hatása csak részben bizonyított [60]. A kezdő vizsgálat
alapgondolatát egy ovarium adenokarcinómából meggyógyultnak nyilvánított
ciklofoszfamiddal kezelt fiatal nőbetegnél kialakult kevert típusú polineuropátia igazságügyi
orvosszakértői véleményezése adta. Állatkísérlettel sikerült igazolni a ciklofoszfamid neuro-
és miotoxikus hatását, mely során rosszindulatú tumoros betegeknél alkalmazott protokollal
és dózissal ekvivalens ciklofoszfamidot kaptak a tengerimalacok, majd leölésük után a nervus
ischiadicusból és m. gastrocnemiusból vett minták differenciál scanning /pásztázó
kalorimetriás vizsgálata történt. A kalorimetriás vizsgálat alkalmas a különböző típusú és
mértékű izom károsodások igazolására a nemzetközi irodalomban közölt adatok alapján
[111, 112]. Ezelőtt kalorimetriás méréseket még nem alkalmaztak perifériás idegek
vizsgálatára.
Következtetés
Mivel a vizsgálat elsősorban egy célzott klinikai esetre próbált választ találni, így csak
viszonylag kisszámú mérés elvégezése történt, ezáltal önmagában ennek alapján szignifikáns
eredmény nem prezentálható. Elmondható azonban, hogy a cikofoszfamid hatására mind a
perifériás idegekben, mind az izmokban kalorimetriával jól mérhető és igazolható szerkezeti
változások jöttek létre. Emellett kijelenthető, hogy a változások mértéke függ az alkalmazott
cikofoszfamid dózisától. Ezen eredmények megbízható támpontot nyújtottak a konkrét, nem
szokványos eset körültekintő megoldásához és egyúttal stabil alapot biztosítottak további
vizsgálataink megtervezéséhez és kivitelezéséhez.
26
Az új vizsgálatok kivitelezése
A kis egyedszámú kezdő vizsgálat bíztató eredményeire alapozva terveztük meg a
kísérletsorozatunk folytatását, mely során az egyedszámot több mint tízszeresére emeltük és
immár többfajta oltási sémát alkalmaztunk, melyet az 5. táblázat demonstrál. A kísérlet
során használt tengerimalacok tömege között a két szélsőértéket tekintve (230 g és 1200 g)
közel ötszörös az eltérés, de az állatok többségét nézve is relatíve nagy szórás volt
tapasztalható (4. táblázat), így a kezdő vizsgálattal megegyezően minden tengerimalacnak
egyedi abszolút dózist, külön-külön testtömegre számolva 5 mg/ testtömeg kilogramm
ciklofoszfamidot adagoltunk intraperitoneálisan – ami megfelelt az intravénás humán
terápiás alkalmazásnak.
A DSC méréseket a kezdő vizsgálattal megegyező körülmények és paraméterek
mellett végeztük el.
Csoport testtömeg (g) átlagos testtömeg (g)
1 724 670 630 600 550 634,8
2 686 566 870 1200 680 800,4
3 626 320 620 690 480 547,2
4 732 810 550 530 642 652,8
5 890 800 690 830 710 784
6 556 560 720 260 310 481,2
7 550 230 330 510 850 494
8 660 620 630 240 310 492
9 260 300 420 540 600 424
10 800 820 720 820 630 758
11 800 (E*) 820 (E*) 820 720 630 758
Kontroll 724 280 630 410 466 502
4. táblázat: A vizsgált tengerimalacok testtömege. E* jelenti a vizsgálat befejezése előtti exitálást.
A kísérletben 11 különálló csoporton – 5-5 egyeddel, n=55, n=5/csoport - 11
különböző oltási sémát állítottunk fel, melyek során 1-6 alkalommal ismételtük a
gyógyszerbeadást részben egymást követő napokon, részben több nap szünettel (5.
táblázat). Megjegyzendő, hogy a 6 kezelést kapó csoportból 2 tengerimalac a kísérlet
befejezése előtt, az ötödik kezelés után elpusztult, melynek oka nem tisztázott.
27
Eredményeink értékeléséhez kontroll csoportot alkalmaztunk, mely során ciklofoszfamiddal
nem kezelt tengerimalacok (n=5) vizsgálatát végeztük el ugyanolyan módszerrel és
körülmények között.
Kezelések
száma
Ciklofoszfamid kezelés időpontja / nap
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Kontroll Exit
1 inj. X Exit
1 inj. X Exit
1 inj. X Exit
2 inj. X X Exit
2 inj. X X Exit
2 inj. X X Exit
2 inj. X X Exit
3 inj. X X X Exit
4 inj. X X X d.e.X
d.u.Exit
5 inj. X X X X d.e.X
d.u.Exit
6 inj. X X X X X X Exit
5. táblázat: A vizsgálati csoportok (n=5/csoport) oltási sémája (X) és a mintavétel időpontjai (Exit)
Az állatok leölése altató éterrel telített kamrában történt, melyet követően több
lokalizációból végeztünk mintavételt:
- kipreparálásra került anatómiailag ekvivalens helyekről mindkét oldali musculus
gastrocnemiusból 0,5 x 0,5 x 2 cm-es, a nervus ischiadicusból 2 cm hosszú darab.
- eltávolításra került a szív bal kamra izomzatából 0,5 x 0,5 x 0,5 cm-es darab.
- EDTA tartalmú (1,5 mg/ml vér) vérmintavételi vákuumcső segítségével perifériás vért
gyűjtöttünk, majd 15 percig centrifugáltuk (1600g) 4C-on elkülönítve a plazma
frakciót és a sejtes elemeket (vvt).
Az ideg és izom mintákat 4 C-on steril izotóniás sóoldatban tároltuk (max. 12 óra) a
mérések elvégzéséig.
A továbbiakban a tengerimalacokból 4 különböző lokalizációból nyert minták vizsgálati
eredményeit és értékelését külön-külön mutatjuk be.
28
Ideg-izom komplex vizsgálata
A kezdő vizsgálat kiterjesztése annak eredményeit volt hivatott
alátámasztani/megerősíteni, illetve finomítani az oltási sémák számának növelésével.
Az állatokat 7 nagyobb csoportra osztottuk, mely során a kontroll csoport mellett a
kezelések száma alapján (1-6) soroltuk be őket. Habár funkcionális egységet képeznek, de az
eltérő szöveti tulajdonságok okán külön vizsgáltuk a nervus ischiadicust és a musculus
gastrocnemiust. Mivel minden tengerimalac esetén mindkét oldali ideg-izom komplex
kipreparálásra került, így minden esetben dupla méréseket végeztünk, külön jelölve a jobb
és bal oldali mintákat.
A nervus ischiadicus vizsgálata során kapott mérési eredményeinket az alábbi
táblázatok mutatják be, az adatokat a jobb átláthatóság érdekében kettéosztottuk, a legfelső
sorban a kontroll értékeket mindkét táblázatban szerepeltetjük összehasonlítás végett (6. és
7. táblázat).
A n. ischiadicus
kezelése
Termikus paraméterek
jobb bal
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 53.41 61.15 63.29 5.48 54.67 61.44 64.21 5.88
egy injekció (5)
1i-E 53.41 61.74 65.35 3.94 53.41 61.04 66.28 3.37
1i-3d-E 53.06 59.88 62.72 3.5 52.93 59.89 63.64 3.19
1i-5d-E 54.46 61.12 65.54 3.9 54.65 62.01 67.06 3.64
két injekció (5)
2i-E 54.14 61.25 65.04 4.09 53.65 61.27 65.00 4.27
2i-3d-E 53.7 61.42 65.1 3.52 53.84 61.22 65.24 3.88
2i-5d-E 52.99 60.84 65.27 3.43 53 61.1 71.96 3.88
1i-3d-1i-3d-E 54.17 60.37 64.5 2.13 53.35 61.2 64.85 2.35
6. táblázat: tengerimalac nervus ischiadicus hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés után (Tm:
denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban a szürke
dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladó, míg a vastagon kiemelt értékek szignifikáns
különbséget jeleznek (p<0,05, n=5).
29
A n. ischiadicus
kezelése
Termikus paraméterek
jobb bal
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 53.41 61.15 63.29 5.48 54.67 61.44 64.21 5.88
három injekció (5)
2i-5d-1i-3d-E 53.83 59.58 64.03 5.26 53.88 60.21 64.51 4.67
négy injekció (5)
2i-5d-1i-3d-1i-E) 53.66 59.96 65.01 3.95 53.91 60.2 65.03 4.26
öt injekció (5)
2i-5d-1i-3d-2i-E 52.98 60.69 64.6 3.32 54.99 60.66 64.8 3.01
hat injekció (5-2E)
2i-5d-1i-3d-3i-E 52.42 61.84 64.6 5.41 53.37 61.46 65 3.51
7. táblázat: tengerimalac nervus isciadicus hődenaturációs értékei 3-6-szori ciklofoszfamid kezelés után (Tm:
denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban a szürke
dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek szignifikáns
különbséget jeleznek (p<0,05, n=5).
A ciklofoszfamid kezelés dózisfüggő hatásait a perifériás idegre a 12. ábra szemlélteti.
A hőáram maximum csökkenése együtt jár a denaturációs hőmérséklet alacsonyabb
tartományba történő eltolódásával a dózis függvényében. A táblázat értékeiből kiolvasható
egy meglepő nem várt eltérés is. Az eredmények alapján a kezelés jól láthatóan jobban
érintette a bal oldali ideget. Erre az egyik lehetséges nyilvánvaló válasz az lehet, hogy az
injektálást végző orvos jobb kezes volt, mely által a ciklofoszfamid konzekvensen minden
esetben a has bal oldalán került injektálásra, így ha kismértékben is, de hosszabb és
esetlegesen némileg erősebb hatást válthatott ki ezen az oldalon.
A jobb oldali idegek esetében a Tm3 – mal jellemezhető termikus domén és a teljes
kalorimetriás entalpia mutatja a kezelés dózis függését, míg a Tm1 és Tm2 változásaiban csak
enyhe, mérsékelt tendencia figyelhető meg injektálások számának és a kezelések után eltelt
idő függvényében, az is csak 1-2 injektálás során. Két kezelésig az injekciózás között eltelt idő
is szignifikáns hatású(csökken). Ennél több kezelés csak az általunk végzett legtöbb, 6-szori
injektálást követően figyelhető meg szignifikáns dózis dependencia Tm1 -ben. Ezzel szemben
ugyanezek az adatok a bal oldali idegek esetén azt mutatják, hogy a termikusan
30
elkülöníthető szerkezeti domének termikus stabilitásának erős dózis függését Tm1 és Tm3 is
csak két injekcióig követi. A kontroll vizsgálatokhoz képest a kalorimetriás entalpia dózis
függése gyakorlatilag minden esetben egyértelmű, de a második és harmadik injekció hatása
az előzőekhez képest nő.
12. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok nervus ischiadicus hődenaturációs görbéi
A PTE ÁOK Biofizika Intézetben korábban már több aspektusból történt harántcsíkolt
izomzat DSC-vel történő vizsgálata [111-116], ezáltal már jelentős előnyt adó
tapasztalatokkal rendelkeztünk a musculus gastrocnemius vizsgálata során kapott mérési
adatok kiértékelésében (8. és 9. táblázat).
31
m. gastrocnemius
kezelése
Termikus paraméterek
jobb bal
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 50.19 56.95 67.32 2.86 49.73 56.77 68.15 3.15
egy injekció (5)
1i-E 50.07 56.78 66 1.92 50.18 56.93 64.91 2.17
1i-3d-E 49.54 56.62 66.92 2.34 49.80 56.55 66.8 2.3
1i-5d-E 49.95 56.81 66.5 2.48 50.33 56.93 66.71 2.21
két injekció (5)
2i-E 49.91 56.74 67.77 2.68 49.91 56.89 67.33 2.45
2i-3d-E 50.23 56.55 66.71 2.40 50.29 56.5 66.44 2.33
2i-5d-E 49.69 56.9 67.39 2.60 50.19 56.7 67.64 2.77
1i-3d-1i-3d-E 49.89 56.64 65.61 2.26 49.89 56.71 67.47 2.63
8. táblázat: tengerimalac musculus gastrocnemius hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés
után (Tm: denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban
a szürke dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek
szignifikáns különbséget jeleznek (p<0,05, n=5).
m. gastrocnemius
kezelése
Termikus paraméterek
jobb bal
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 50.19 56.95 67.30 2.86 49.73 56.77 68.15 3.15
három injekció (5)
2i-5d-1i-3d-E 50.89 56.48 64.37 2.87 50.96 56.54 64.65 2.66
négy injekció (5)
2i-5d-1i-3d-1i-E) 49.97 56.44 66.64 2.56 50.35 56.71 66.18 2.50
öt injekció (5)
2i-5d-1i-3d-2i-E 49.97 56.10 68.02 3.75 49.98 56.38 66.26 3.43
hat injekció (5-2E)
2i-5d-1i-3d-3i-E 50.39 56.35 65.84 2.20 50.40 56.50 65.40 2.40
9. táblázat: tengerimalac musculus gastrocnemius hődenaturációs értékei 3-6-szori ciklofoszfamid kezelés
után (Tm: denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban
a szürke dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek
szignifikáns különbséget jeleznek a kontrollhoz képest (p<0,05, n=5).
32
Az állatokból kipreparált musculus gastrocnemius hődenaturációs görbéit a 13. ábrán
láthatók:
13. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok musculus gastrocnemius hődenaturációs
görbéi
A denaturációs hőáram görbéje 3 jól elkülöníthető szakaszra osztható. A korábbi
vizsgálatok alapján a középső szakasz megfelel a miozin rúd, az alacsonyabb denaturációs
csúcs a miozin fej, míg a legmagasabb az aktin és aktin-miozin komplex termikus
denaturációjának. A hődenaturációs görbék jól demonstrálják a ciklofoszfamid kezelés
okozta változásokat a dózis függvényében. A táblázatban jelzett termikus paraméterek a
nervus ischiadicushoz hasonlóan a károsodás bal oldali dominanciáját mutatják.
33
A kemoterápia áltál kiváltott szerkezeti eltéréseket denaturációs hőmérsékleti pontok
(Tm) és kalorimetriás entalpiák (ΔHc) módosulásának tendenciája szemlélteti, mely alapján a
jobb izomban minden kezelés során elsősorban az aktin filamentumok érintettsége
rajzolódik ki (Tm3) hasonló jellegű entalpiaváltozás mellett. A bal oldali izmok esetén már a
miozin fej is érintett (Tm3) szignifikánsabb entalpia dózisfüggés mellett. Mindez fiziológiailag
az aktomiozin komplex romló funkcióját okozza, mely végül rosszabb mozgási képességet
eredményez. A vizsgálati adatokból kiemelendő, hogy a 6 kezelést kapó csoportból 2 egyed
az ötödik injektálást követő időszakban ismeretlen okból exitált.
Megbeszélés
A ciklofoszfamid egy igen széles körben használt gyógyszer relatíve súlyos
mellékhatás spektrummal, melyek közül komoly hosszú távú következményekkel járhat a
perifériás ideg- és izomkárosodás, a polineuropátia kialakulása. Habár a
kemoterapeutikumok neurotoxikus hatása csak részben bizonyított [60], a ciklofoszfamid
esetén ennek lehetőségét már korábban is felvetették [9]. Az általunk alkalmazott DSC
vizsgálati módszer igazoltan alkalmas izomkárosodás kimutatására [111, 112], míg maga az
ideg károsodásának a kimutatására is történtek már vizsgálatok kisebb esetszámban
kísérletes jelleggel [9, 10].
A tengerimalacokon végzett kísérleteink során onkológiai indikációval adott
testtömeg kilogrammra vonatkoztatott dózist és protokollt alkalmaztunk, majd a leölésüket
követően első lépésként a nervus ischiadicust és musculus gastrocnemiust vizsgáltuk DSC
módszerrel.
Eredményeink alapján kijelenthető, hogy a termikus paraméterekben megmutatkozó
eltérések egyértelműen igazolják a ciklofoszfamid károsító hatását perifériás ideg és némileg
kisebb mértékben harántcsíkolt izom esetén [117]. Az eltérés a szöveti érzékenység
különbségével magyarázható elsősorban, de végeredményben mindkettő funkcionális
károsodáshoz vezet, hatásuk a gyakorlatban összeadódhat, melynek a mértéke az általunk
alkalmazott dózis függvényében változik.
Érdekesség, hogy a vizsgálataink során egyértelmű oldalkülönbséget detektáltunk,
mely a bal oldali ideg és izom fokozottabb érintettségét igazolta. Ennek a hátterét jelenleg
nem tudjuk magyarázni (megjegyzendő, hogy az injekciók beadása az oltó jobb kezessége
34
miatt mindig a bal oldali testtájon történt!), de érdemes ezt az aspektust is vizsgálni, mivel
ha a későbbiekben a kezelt humán betegpopulációban is hasonló predominancia igazolható,
akkor ezt a kivizsgálás illetve kontroll eredmények értékelése során célszerű figyelembe
venni.
Következtetés
A munkánkat elindító kezdő vizsgálat eredményét megerősítve és alátámasztva [9,
10] a nagyobb számú (n=55) állatkísérletünkben differenciál pásztázó kalorimetria
segítségével detektált szignifikáns termokémiai változások alapján egyértelműen igazolható
a ciklofoszfamid dózisfüggő perifériás ideg- és izomkárosító hatása [117]. Mindezek alapján a
ciklofoszfamid egyéb területeken kifejtett negatív hatása szintén felmerül, melyek
felderítése további vizsgálatokat indokol. Az oldalkülönbség szintén további megfontolásra
érdemes kérdéseket vet fel.
Szívizom vizsgálata
A kísérleteink tervezésénél a szívizom vizsgálatát egyértelműen az alapozta meg,
hogy a ciklofoszfamid illetve számos más citosztatikus szer egyik legsúlyosabb, olykor fatális
kimenetelű mellékhatása a kardiotoxicitás. A folyamat patofiziológiája relatíve jól ismert [67,
68], azonban a kiváltó dózisérték, prediktív eltérések, jelek nem tisztázottak [70, 71], így
figyelembe véve a lehetséges következmények súlyát, vizsgálata csaknem szükségszerűen
indokolt.
A vizsgált egyedeket – azonosak az ideg/izom vizsgálat kísérleti állataival – az ideg-
izom komplex vizsgálathoz hasonlóan 7 nagyobb csoportba osztottuk a kezelések számának
megfelelően. Mivel a legnagyobb igénybe vételnek a bal kamra van kitéve, a mintát belőle
vettük. Mérési eredményeinket a jobb átláthatóság miatt ismét két táblázatban jelenítjük
meg (10. és 11. táblázat).
35
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHcal/Jg-1
kontroll (5) 56.06 58.97 62.01 2.1
egy injekció (5)
1i-E 55.98 56.76 60.75 1.39
1i-3d-E 55.48 59.01 62.96 1.6
1i-5d-E 55.85 58.7 61.64 1.73
két injekció (5)
2i-E 56.38 59.12 61.81 1.66
2i-3d-E 56.56 59.2 61.95 1.96
2i-5d-E 56.19 59.08 61.53 1.75
1i-3d-1i-3d-E 55.19 59.03 63.12 1.82
10. táblázat: tengerimalac bal karma szívizomzat hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés után
(Tm: denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban a
szürke dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek szignifikáns
különbséget jeleznek a kontrollhoz képest (p<0,05, n=5).
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHcal/Jg-1
kontroll (5) 56.06 58.97 62.01 2.1
három injekció (5)
2i-5d-1i-3d-E 55.77 58.33 61.34 1.6
négy injekció (5)
2i-5d-1i-3d-1i-E 49.86 55.88 60.6 1.8
öt injekció (5)
2i-5d-1i-3d-2i-E 55.72 58.57 61.65 1.4
hat injekció (5-2E)
2i-5d-1i-3d-3i-E 55.79 58.73 61.36 1.69
11. táblázat: tengerimalac bal kamra szívizomzat hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés
után (Tm: denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban
a szürke dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek
szignifikáns különbséget jeleznek a kontrollhoz képest (p<0,05, n=5).
A ciklofoszfamid dózisfüggő hatása, a denaturációs hőmérsékletek eltolódása és az
entalpia csökkenése jól megfigyelhető a bal kamra hődenaturációs görbéin (14. ábra).
36
14. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok bal kamra szívizomzat hődenaturációs
görbéi
Az eredményeink elemzéséhez itt is felhasználjuk a korábbi, vázizomzat vizsgálata
során szerzett tapasztalatokat és következtetéseket [111-116]. Akárcsak a harántcsíkolt váz
izom esetében a szívizomzatnál is 3 szakaszra bontható a denaturációs görbe.
Tapasztalataink alapján az 58 C körüli olvadási pont (pl. a kontrollnál a középső csúcs) a
miozin rúd, az alacsonyabb átmenet a miozin fej, míg a legmagasabb, 62 C feletti csúcs az
aktin ill. aktomiozin komplex denaturációjának felel meg. Mindezek módosulása a beadott
ciklofoszfamid mennyiség tekintetében a görbék lefutásával (alakjával) és a hőáram
maximumok elmozdulásával jellemezhető.
A fenti táblázatokban szereplő értékekből kiolvasható, hogy 1-2 ciklofoszfamid
kezelés már befolyásolja a Tm1-t, Tm3-t és a kalorimetriás entalpiát, mely alapján
megállapítható, hogy miozin fej és az aktin érzékenyebb a kezelésre. A kalorimetriás entalpia
azonban jobban függ a dózistól és a kezelések között eltelt időtől. A nagyobb számú, 3 vagy
37
több kezelés során a Tm2, Tm3 és a kalorimetriás entalpia változása képes monitorozni a
kifejtett hatást, mely során főként a miozin rúd és az aktin érintett. A teljes folyamatot
tekintve kijelenthető, hogy elsősorban a miozin fejek és az aktin filamentumok szenvednek
változást (Tm1, Tm3), ami rosszabb aktomiozin komplex funkciót okoz, ezáltal
végeredményben a szív pumpa funkciója csökken.
Megbeszélés
A ciklofoszfamid okozta szívizomkárosodás, hemorrágiás szívizomgyulladás az
irodalomban ismert, de a mechanizmusa csak részben tisztázott és mértékadó dózis-határ
értéket eddig nem sikerült megállapítani [70]. Figyelembe véve a gyógyszer széleskörű
használatát és a lehetséges szövődmények adott esetben fatális kimenetelét, a folyamat
pontosabb megismerése fontos szerepet játszik. A ciklofoszfamid hatását a szívizomra eddig
DSC vizsgálattal nem tanulmányozták, melyet a kutatócsoportunk kísérletes körülmények
között tengerimalacokon végzett el.
Vizsgálataink során onkológiai indikációval adott testsúlykilogrammra vonatkoztatott
dózist és protokollt alkalmaztunk, majd az állatok leölését követően a szív bal kamrájából
kimetszett mintát vizsgáltuk DSC módszerrel.
A korábbi vizsgálataink során szerzett tapasztalatokat is felhasználva eredményeink
alapján elmondható, hogy a többszöri ciklofoszfamid adás először a miozin fejet és az aktint
károsítja, majd a dózist növelve végül a teljes aktomiozin komplex károsodást szenved, mely
valószínűleg jelentős szerepet játszik a kialakuló klinikai képben [118].
Emellett az is kijelenthető, hogy az egyszeri ciklofoszfamid számottevő
szívizomkárosító-hatást nem produkált, mely további egyértelmű bizonyítéka a dózis
dependenciának, annak ellenére, hogy a korábbi vizsgálatokban kumulatív jelleget nem
mutattak ki [66].
Következtetés
Vizsgálatunkkal és eredményeinkkel remélhetőleg egy lépéssel közelebb kerültünk a
ciklofoszfamid indukálta kardiomiopátia patofiziológiai megértéséhez és tisztázásához,
emellett sikerült egy újabb támpontot adni a becsült dózis-határ érték felállításához.
38
Plazma és vörösvértest vizsgálata
A vér vizsgálatát azért tartottuk indokoltnak, mert jól tükrözi az egész szervezetet ért
hatásokat, de talán még ennél is fontosabb, hogy a napi klinikai rutinban az egyik legjobban
és legegyszerűbben vizsgálható biológiai minta, mely információt nyújthat a beteg
szervezetéről. A vér DSC-vel történő vizsgálatára egyre bővülő irodalom áll rendelkezésre
számos különböző patológiai eltérések esetén [119-126]. Amennyiben sikerül szignifikáns
eltéréseket találnunk, kiváltképp, ha azok az alkalmazott dózissal korrelálnak, kezünkbe
kaphatjuk egy új módszer lehetőségét, mely képes monitorozni, esetlegesen előre jelezni a
szervezet egyéb területein zajló folyamatokat, illetve súlyosságukat. Ha ez sikerül, esély nyílik
megelőzni vagy mérsékelni a gyógyszer indukálta mellékhatásokat és súlyos
következményeket.
kezelések Termikus paraméterek
plazma vörös vértest
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 59.9 62.27 84.7 0.78 68.72 75.25 84.51 4.7
egy injekció (5)
1i-E 62.5 87.5 92.3 0.81 53.8 68.9 74.2 5.24
1i-3d-E 58.12 66.85 79.31 0.51 67.85 73.4 84.52 5.41
1i-5d-E 62.37 83.43 91.4 0.81 68.43 75.92 83.97 5.46
két injekció (5)
2i-E 58.7 65.39 79.39 0.7 68.46 74.72 82.51 4.88
2i-3d-E 60.48 66.16 81.56 0.57 66.46 73.07 81.25 4.76
2i-5d-E 59.95 64.41 82.15 0.46 68.47 74.83 81.56 4.55
1i-3d-1i-3d-E 55.8 66.03 80.11 0.45 68.25 72.56 79.85 4.18
12. táblázat: tengerimalac vérplazma és vvt hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés után (Tm:
denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban a szürke
dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek szignifikáns
különbséget jeleznek a kontrollhoz képest (p<0,05, n=5).
39
A kísérletben résztvevő állatok 12 csoportot alkottak, a kontroll mellett 11 csoport
tagjai kaptak ciklofoszfamidot 1-6 alkalommal mely alapján 7 nagyobb csoportot lehet
elkülöníteni hasonlóan a többi vizsgálatunkhoz. A mért termikus adatokat, ahogy eddig is 2
táblázatban prezentáljuk az áttekinthetőség miatt, egymás mellett szerepeltetve a
vérplazma és vvt-k eredményeit (12. és 13. táblázat).
kezelések Termikus paraméterek
plazma vörös vértest
Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1 Tm1/°C Tm2/°C Tm3/°C ΔHc/Jg-1
kontroll (5) 59.9 62.27 84.7 0.78 68.72 75.25 84.51 4.70
három injekció (5)
2i-5d-1i-3d-E 55.41 62.01 67.27 0.60 67.30 73.28 79.76 3.97
négy injekció (5)
2i-5d-1i-3d-1i-E) 59.77 65.53 72.02 0.27 70.76 72.48 83.46 5.50
öt injekció (5)
2i-5d-1i-3d-2i-E 57.85 68.71 72.80 0.16 - 71.80 - 4.20
hat injekció (5-2)
2i-5d-1i-3d-3i-E 55.65 59.66 64.75 0.70 68.63 74.86 - 3.41
13. táblázat: tengerimalac vérplazma és vvt hődenaturációs értékei 1-2-szeri ciklofoszfamid kezelés után (Tm:
denaturációs hőmérséklet maximum, ΔHc: tömegre normált kalorimetriás entalpia). A táblázatban a szürke
dőlt értékek a kétszeres standard deviációt meghaladják, míg a vastagon kiemelt értékek szignifikáns
különbséget jeleznek a kontrollhoz képest (p<0,5, n=5).
A ciklofoszfamid vérplazmán okozott hatásait hődenaturációs görbék szemléltetik a
dózis függvényében (15. ábra) – a könnyebb átláthatóság érdekében a kontroll mellett csak 3
különböző (1,3 és 5 kezelés utáni) denaturációs görbét ábrázoltunk, melyekből az egész
folyamat trendje kiolvasható. A Tm1 (amely az irodalom szerint a fibrinogén denaturációjának
felel meg [81, 127, 128] valamint Tm3 (globulinok denaturációja) esetében az első kezelés
kivételével a denaturációs hőmérsékleti pontok az alacsonyabb tartományba tolódtak, míg a
maximális hőáram csökkenő tendenciát mutatott minden kezelésre. A Tm2 –vel jellemezhető
denaturáció, amely a plazma albumin komponensétől származik [81, 127, 128] minden
kezelés után szignifikánsan magasabb a kontrollnál. A vizsgált vérplazma mintákban,
általánosságban feltételezhetjük, hogy minden esetben legalább 3 különböző termikus
40
szerkezeti egység van jelen (dekonvolúció nélkül). A ciklofoszfamidos kezelés által erősebben
befolyásolt domének a Tm2 és Tm3 értékeinek eltolódásával jellemezhetők, melyek közül a
szignifikáns mértékűeket (p<0,05) a 12. és 13. táblázatban megvastagítva jelöltünk. A
ciklofoszfamid terápia elkezdésére, az első injektálás után kifejezett, szignifikáns emelkedés
tapasztalható a denaturációs hőmérsékleti maximumokban (Tm), melyeket a kezelés után
eltelt idő és a kezelések száma döntően befolyásol. A kalorimetriás entalpia csökkenése csak
a második kezelést követően válik szignifikáns mértékűvé. A harmadik injektálástól viszont
már a Tm1, a Tm3 és a Hc termikus paraméterekben szignifikáns csökkenés jelenik meg.
15. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok vérplazma hődenaturációs görbéi
A vörösvértestek esetében egy érdekes különbséget tapasztaltunk, méghozzá a
kontroll csoport hődenaturációs görbéjében, mely alapján 4 lépésre elkülöníthető
denaturáció lép fel (16. ábra). Az első egy alacsony hőmérsékleten (57 OC) megjelenő, kis
hőkapacitás változású olvadási pont, mely (azonosítási adatok hiánya miatt) nem is szerepel
41
a táblázatokban (12. és 13. táblázat). Ezt követi 3 endoterm reakció (69, 76 és 84 OC-on).
Ezek az átalakulások a kezelések számának növekedésével alacsonyabb hőmérsékletre
tolódnak, míg a ötödik kezelés után gyakorlatilag már csak egy endoterm reakció játszódik le
a rendszerben.
16. ábra: Különböző dózisú ciklofoszfamiddal kezelt tengerimalacok vvt hődenaturációs görbéi
Ez a felismerés fontos szereppel játszhat az orvosi kezelések megtervezése során, a
klinikumban, és humán felhasználáskor szoros kontrollt tesz szükségessé. Az első csoportban
(injektálást követő napon exit) a magasabb hőmérsékletű két endoterm reakció Tm-je
szignifikánsan csökkent. Ezzel szemben a két kezelésen átesett csoportokban csak a Tm3
csökkent szignifikánsan, míg a Tm1 és Tm2 értékeiben ingadozás volt tapasztalható. A 3 és 4
dózis ciklofoszfamidot kapott csoportokban az összes olvadási hőmérséklet (kivéve a hatodik
kezelést) szignifikánsan csökkent. A kalorimetriás entalpiák az első és negyedik injektálást
42
követően szignifikáns növekedést, a többiben csökkenést mutatnak, melyben jóval
egyértelműbb szerepe van az exit előtt eltelt időnek.
Megbeszélés
Kutatásunkban a széles körben használt ciklofoszfamid okozta hatásokat vizsgáltuk a
vérplazma összetevőin és a vörösvértesteken. Eredményeink alapján kijelenthető, hogy az
állatmodellünkön humán protokollal ekvivalensen alkalmazott ciklofoszfamid kezelés
hatására mind a vörösvértesteken, mind a vérplazmában DSC-vel detektálható változások
figyelhetők meg [129]. A kimutatott eltérések feltételezhetően részben a ciklofoszfamid
plazma koncentrációjával állnak összefüggésben, részben a szer által a plazma összetevőkön
(az irodalmi adatok alapján elsősorban a fibrinogén, albumin és globulinokon) és
vörösvérsejteken kiváltott biológiai hatásokkal, melyek a biológiai törvényszerűségek alapján
nagy valószinűséggel működésbeli következményekkel is járnak. Ezen módosulások a
különböző mellékhatásokban feltételezhetően szerepet játszanak, így az eltérés mértéke
prediktív értékű annak súlyosságát és lefolyását illetően.
Figyelembe véve, hogy a ciklofoszfamid plazma szintjének relatíve gyors és informatív
meghatározása a napi gyakorlatban nehézkes, a módszer ez irányú alkalmazása új
lehetőségekkel kecsegtet. Mindemellett a ciklofoszfamid ismert és nem kívánt, olykor fatális
mellékhatásainak pontosabb előrejelzése szintén fontos, mely feltételezéseink szerint a vér
összetevőin kiváltott hatások mértékével, illetve minőségével várhatóan korrelálhat. Ennek
pontosabb megítélése még további vizsgálatok tárgyát képezheti, főleg annak tükrében,
hogy a módszerünk (DSC) klinikai alkalmazhatóságának megvalósítása egyéb területeken már
folyamatban van és a publikációk száma egyre növekszik.
Következtetés
Vizsgálatainkkal egyértelműen bizonyítható a ciklofoszfamid indukálta változások
detektálhatósága DSC segítségével a vörösvértesteken és a plazma elemein, mely új
lehetőséget teremt a várt hatások és nem kívánt mellékhatások megítélésében, valamint
előrejelzésében. A DSC klinikai alkalmazásának folyamata ígéretes, így további kutatások
révén újabb hasznos és értékes információt nyerhetünk ezzel a vizsgáló eljárással.
43
Kísérletsorozatunk értékelése
Vizsgálatainkban ciklofoszfamid okozta hatásokat, általa kiváltott változásokat
igyekeztünk kimutatni egy már ismert, de még nem elterjedt módszerrel, a differenciáló
pásztázó kalorimetriával.
A ciklofoszfamid perifériás idegre (nervus ischiadicus) kifejtett hatását a kezdeti, kis
egyedszámú vizsgálat már előrevetítette [9, 10], amit kiterjesztett vizsgálataink
megerősítettek [117]. Habár a Tm1 és Tm2 denaturációs hőmérsékleti maximumok mutattak
kismértékű eltéréseket, ami a bal oldali Tm1 esetén tendenciózusnak bizonyult, de
egyértelmű igazolással a Tm3 - mal jellemzett termikus domén szolgált szignifikáns
emelkedésével. A perifériás ideg esetén az igazán meggyőző eredményt a kalorimetriás
entalpia számítása hozta a hődenaturációs görbéből, mely markáns dózis dependencia
mellett egyértelmű szignifikáns csökkenést mutatott a kontroll csoporthoz viszonyítva. A
relatíve nagymértékű entalpiaváltozás erős strukturális változásra, eltérésre utal, mely
figyelembe véve az idegszövet kifejezett érzékenységét megalapozottan magyarázza a
funkcióbeli károsodást.
A harántcsíkolt izomzat (musculus gastrocnemius) értékeléséhez jelentős tapasztalati
eredmények álltak rendelkezésre [112-116]. A ciklofoszfamid károsító hatását az entalpia
változása mellett elsősorban Tm1 és Tm3 értékek változásai mutatják, mely a perifériás
ideghez viszonyítva mérsékeltebbek, de egy irányú csökkenő tendenciát mutatnak. Az
eredmények a miozin fejek és az aktin filamentumok érintettségét támasztják alá,
összességében az aktomiozin komplex funkciókárosodásával [117]. Fontos kiemelni, hogy
funkcionális egységként kell kezelnünk a vizsgált aktomiozin komplexet és az azt beidegző
nervus ischiadicust, ami a károsodásuk okozta funkciócsökkenés hatványozódásával jár.
Megjegyzendő, hogy a perifériás ideg és izom vizsgálata során bemutatott
oldalkülönbség feltételezhetően technikai okokkal magyarázható, ellenben - amennyiben
további vizsgálatok és humán klinikai esetek is mutatnak ilyen jellegű diszkrepanciát -
további, ez irányba érzékenyített vizsgálat szükséges a hátterének kimutatására.
44
A szívizomzat denaturációs görbéje nagyban megegyezik a harántcsíkolt izoméval, így
hasonlóan értékes alapinformációkkal rendelkeztünk a vizsgálata során. Az eredmények
alapján a harántcsíkolt izommal összehasonlítva a szívizom már kisebb dózisú kezelésre (1-2)
is érzékeny, szignifikánsabb eltérést mutat Tm1 és Tm3 denaturációs hőmérsékleti
maximumokban, míg a dózis emelésével (3-4) Tm2 és Tm3 mutat jól detektálható változást. A
Tm2 csökkenése a miozin rudak károsodását jeleníti meg. A kalorimetriás entalpia a dózis
emelésével fokozódó csökkenést mutat, demonstrálva ezzel a szerkezeti károsodásokat. A
teljes vizsgálatot tekintve ebben az esetben is dominánsan a miozin fejek és az aktin
filamentumok sérülnek, de a miozin rudak sem maradnak intaktak. Összességében az
aktomiozin komplex funkciója, ezáltal a pumpa funkció számottevően csökken. A
kalorimetriás entalpia jelezte szerkezeti módosulások feltehetően aktívan hozzájárulnak a
szívizom-károsodás, adott esetben a hemorrágiás szívizomgyulladás kialakulásához [118].
A ciklofoszfamid kis mennyiségű, egyszeri alkalmazásának a hatása legszembetűnőbb
a vérplazma alkotóelemein, ahol az első kezelést követően egyértelmű növekedés
tapasztalható a denaturációs hőmérsékleti maximumokban [129]. Egyszeri kezelést követően
az idő múlásával az eltérés fennmarad, ami egyértelműen a ciklofoszfamid tartós hatásáról
tanúskodik, vagyis a kezelés leállításától nem várható gyors regeneráció. Újabb kezelésekre a
hőmérsékleti maximumok szignifikáns csökkenést mutatnak, mely a biológiai funkciók
károsodását feltételezi. A fibrinogén denaturációjának megfeleltethető Tm1 eltérések
feltételezik a fibrinogén diszfunkcióját, vagy csökkent funkcióját, ezáltal a véralvadási
rendszer károsodását demonstrálja. Ez a klinikai gyakorlatban a vérzéses, illetve
trombembóliás szövődmények lehetőségét vetíti előre. A Tm2 szemben a Tm1 és Tm3 –mal a
kontroll csoporthoz viszonyítva, a kezelések alatt csaknem végig szignifikánsan emelkedett,
mely eltérés az albumin funkciózavarára utal, ami befolyásolhatja többek között a plazma
kolloid ozmotikus nyomását, a vér kötő- és szállító funkcióját, csökkentheti az antioxidáns
hatást és a szervezet aminosav tartalékát.
A funkcióbeli károsodásokat erősíti meg a kétszeri injektálástól a többszöri kezelések
során az egyre nagyobb mértékű kalorimetriás entalpia csökkenés, ami a szerkezeti
átalakulások, módosulások egyre kifejezettebb mértékét demonstrálja.
45
A vörösvértestek esetében az eredmények nem mutatnak ilyen mértékű egyirányú
tendenciát, mind a denaturációs hőmérsékleti maximumokban (Tm), mind a kalorimetriás
entalpia eltérésekben ingadozás figyelhető meg, a különbségek számos esetben szignifikáns
mértékűek, de irányuk változó. Kiemelhető azonban, hogy nagyobb számú kezelés (5-6)
hatására az endoterm reakciók száma egyre csökken. Ez alapján itt is felvethető a
funkciókárosodás, ami elsősorban a vér oxigén szállítási kapacitását érintheti, ez azonban az
eredmények alapján kevésbé megalapozott. Igazolására a humán klinikai gyakorlatban
hosszabb távú ciklofoszfamid kezelést kapó betegek ez irányú célzott vizsgálata javasolható.
Általánosságban megállapítható és az eredményeink alapján alátámasztható a
ciklofoszfamid indukálta károsodások dózis dependenciája, mely azonban az érintett szöveti
típustól függően változó mértékű és hatású. A vérplazma alkotóelemein és a szívizmon
markáns eltérések bizonyítottak, így várhatóan ehhez kapcsolódóan várhatóak a
legkomolyabb funkcionalitásbeli eltérések is. A perifériás idegen és izmon is egyértelmű a
károsító hatás, de itt elsősorban hosszabb távon válik szignifikánssá. A vörösvértesteken
szintén tapasztalhatóak jól detektálható eltérések, de az eredmények kevésbé kongruensek,
így azok funkcióbeli manifesztálódása bizonytalan, de feltételezhető.
46
Az értekezés összefoglalása
Munkánkat egy konkrét napi igazságügyi probléma megoldása inspirálta, mely során
kísérletes körülmények között sikerült megalapozott választ adni egy jogi és orvosi
konzekvenciával járó kérdésre a kemoterápiás kezelést követően.
Figyelembe véve a rosszindulatú daganatos megbetegedések emelkedő tendenciáját
a kemoterápiás kezelések okozta mellékhatások egyre markánsabb előfordulása várható. A
gyógyszerszintek direkt meghatározása a napi rutinban körülményes és sokszor
nehézségekbe ütközik. A beadott dózisokból csak durva következtetéseket lehet levonni egy-
egy adott betegnél, mivel a farmakokinetika több okból kifolyólag egyéni variációkat
mutathat. Fontos kiemelni, hogy a kemoterápiás szerek többségénél a terápiás és toxikus
szint igen közel esik egymáshoz, vagy akár fedhetik is egymást. A DSC vizsgálat segítségével
azonban lehetőség nyílhat az indirekt hatások kimutatására.
Saját klinikai munkásságomban, az intervenciós onko-radiológiában a szelektív
transzarteriális citosztatikus kezelések és kemoembolizációk során, valamint azokat
követően fontos szerepet játszhatna, ha relatíve egyszerűen meghatározható vagy
megbecsülhető lenne a kemoterápiás gyógyszer szintje, és ebből kifolyólag az adott
szelektívnek szánt beavatkozás szisztémás hatása. Az adatok ismeretében következtetést
lehetne levonni a terápia várható hatásának, a beavatkozás sikerességének és a kezelés
folytatásának megítélésében. Ugyanilyen lényeges az esetleges mellékhatások, a toxikus
következmények előrejelzése, mely szintén befolyásolja a beteg további sorsát és kezelését.
Eredményeink alapján a vér DSC-vel történő vizsgálatával minderre lehetőség nyílhat.
A kutatásunkhoz kiválasztott kemoterápiás szer – ciklofoszfamid – alkalmazása
esetén jól detektálható dózis dependens eltéréseket sikerült kimutatni mind az ideg-izom
komplex, mind a szívizom esetében és a vér alkotóelemeinél is. Eredményeinket szinkron
értékelve kiolvasható, hogy milyen dózis esetén alakulnak ki olyan mértékű eltérések a vér
alkotóelemein, melyek már nagy valószínűséggel a szívizmon vagy a perifériás idegeken és a
harántcsíkolt izmokon létrejövő károsodásokat jelezheti.
47
Célkitűzéseink teljesülése, az értekezés elért új eredményei
Vizsgálatainkkal megalapozottan megerősítésre került, hogy a ciklofoszfamid hosszú
távú alkalmazása során számítani kell perifériás neuropátia és motilitási diszfunkció
létrejöttére az ideg-izom komplexen, melynek hátterében strukturális módosulások állnak.
Egyértelmű szerkezeti változások jönnek létre a szívizomzatban, melyek többek
között a pumpa-funkció romlása által nagy valószínűséggel szerepet játszik a ciklofoszfamid
kezelések szövődményeként ismert kardiomiopátia kialakulásában.
A vér alakos elemein, vörösvértesteken és vérplazmán DSC segítségével szintén jól
kimutatható változások alakulnak ki. A termogramok eltérése jól jellemezhetően dózis
dependenciát mutat, így indirekt információt nyújt az aktuális és kumulatív gyógyszerszintről
a keringésben. Emellett a bizonyított szerkezeti átalakulások mértéke feltehetően korrelál a
funkcionális módosulásokkal, diszfunkciókkal, de az ez irányú pontosabb megállapításokhoz
további vizsgálatok, humán alkalmazás során történő mérések szükségesek.
A DSC-vel detektálható eltérések prediktív értékűek a dózis dependens
mellékhatások, szövődmények megítélésben.
Mindezek alapján a megfelelő humán standardizációkat követően a DSC alkalmasnak
tartható a napi klinikai kezelések során a betegek szoros követésében, a mellékhatások
megelőzésében, mérséklésében.
48
Köszönetnyilvánítás
Ezúton szeretnék köszönetet mondani munkahelyi vezetőimnek, Dr. Bogner Péter
professzor úrnak, a Radiológiai Klinika igazgatójának és Dr. Battyáni István tanár úrnak, az
Intervenciós Radiológia tanszékvezetőjének a tudományos értekezés megírására való
ösztönzésükért, segítségükért és hasznos tanácsaikért.
Köszönöm Dr. Nyitrai Miklós egyetemi tanár úrnak, a doktori program vezetőjének,
hogy befogadott, a kutatáshoz lehetőséget adott és munkámban támogatott.
Őszinte köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Lőrinczy Dénes
professzor úrnak, odaadó lelkesedéséért, fáradhatatlan biztatásáért kutatásunk során. A
kalorimetriás mérések kivitelezésében és értékelésében nyújtott segítsége nélkül
vizsgálatunk nem tudott volna megvalósulni. Önzetlensége örök példa marad számomra.
Köszönöm Dr. Barthó Lóránd professzor úrnak az állatkísérletekhez nyújtott tevőleges
támogatását, és külön köszönet illeti Dr. Könczöl Franciska egyetemi docenst, az
állatkísérletek kivitelezésében és a preparatív munka végzésében nyújtott pótolhatatlan
segítségéért.
Hálás köszönettel tartozom családomnak, feleségemnek és gyermekeinknek
türelmükért és megértésükért. Támogatásukkal, biztatásukkal elengedhetetlenül
hozzájárultak munkám elkészültéhez.
49
Irodalomjegyzék
1. Központi Statisztikai Hivatal: A haláloki struktúra változása Magyarországon, 2000-
2012, 2014. május,
https://www.ksh.hu/docs/hun/xftp/idoszaki/pdf/halalokistruk.pdf, letöltve:
2017.01.02.
2. Központi Statisztikai Hivatal: Születéskor várható élettartam, nemenként (2003-
2014) http://www.ksh.hu/docs/hun/eurostat_tablak/tabl/tps00025.html, letöltve:
2017.01.02.
3. Verstappen CC, Heimans JJ, Hoekman K, Postma TJ: Neurotoxic complications of
chemotherapy in patients with cancer: clinical signs and optimal management. Drugs,
2003, 63(15):1549-1563.
4. Floyd JD, Nguyen DT, Raymond L. Lobins RL, Bashir Q., Doll DC, Perry MC:
Cardiotoxicity of Cancer Therapy, Journal of Clinical Oncology, 2005, 23:30, 7685-
7696.
5. Yeh ETH, Bickford CL: Cardiovascular Complications of Cancer Therapy: Incidence,
Pathogenesis, Diagnosis, and Management, Journal of the American College of
Cardiology 2009, (53) 24: 2231-2247.
6. Cozzi PJ, Hall JB: Cyclophosphamide in the treatment of pulmonary diseases: survey
of use, training, and practitioner knowledge base. Chest, 1999, 116(5):1159-62
7. Kim J, Chan JJ: Cyclophosphamide in dermatology, Australasian Journal of
Dermatology, 2017 (58)1: 5-17.
8. WHO Model List of Essential Medicines (April 2015)
http://www.who.int/selection_medicines/committees/expert/20/EML_2015_FINAL_
amended_JUN2015.pdf?ua=1, letöltve: 2015.11.11.
9. Könczöl F, Wiegand N, Nőt LG, Lőrinczy D: Examination of the cyclophosohamide-
induced polyneuropathy on guinea pig sciatic nerve and gastrocnemius muscle with
differential scanning calorimetry. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2014.
115: 2239-2243.
10. Könczöl F, Farkas N: A tumor meggyógyult, és a beteg? Orvosi Hetilap, 2013, (154.)
13: 509–514.
50
11. Gyires K., Fürst Zs.: A farmakológia alapjai. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2011.
12. Shulman-Roskes EM, Noe DA, Gamcsik MP, et al. The partitioning of phosphoramide
mustard and its aziridinium ions among alkylation and P-N bond hydrolysis reactions.
Journal of Medicinal Chemistry 1998; 41: 515-529.
13. Povirk LF, Shuker DE. DNA damage and mutagenesis induced by nitrogen mustards.
Mutation Research 1994; 318: 205-26.
14. Kondo N, Takahashi A, Ono K, Ohnishi T: DNA damage induced by alkylating agents
and repair pathways. Journal of Nucleic Acids, 2010 (2010): 1-7.
15. Bruce WR, Meeker BE, Valeriote FA. Comparison of the sensitivity of normal
hematopoietic and transplanted lymphoma colony-forming cells to
chemotherapeutic agents administered in vivo. Journal of the National Cancer
Institute 1966; 37: 223-45.
16. De Jonge ME, Huitema AD, Rodenhuis S, Beijnen JH: Clinical pharmacokinetics of
cyclophosphamide. Clinical Pharmacokinetics. 2005. 44(11):1135-64.
17. Cox PJ: Cyclophosphamide cystitis: identification of acrolein as the causative agent.
Biochemical Pharmacology. 1979, 28: 2045-2049.
18. Boyd VL, Robbins JD, Egan W, Ludeman SM: 31P nuclear magnetic resonance
spectroscopic observation of the intracellular transformations of oncostatic
cyclophosphamide metabolites. Journal of Medicinal Chemistry 1986; 29 (7): 1206-
1210.
19. Jao JY, Jusko WJ, Cohen JL: Phenobarbital effects on cyclophosphamide
pharmacokinetics in man. Cancer Research. 1972, 32: 2761-2764.
20. Yule SM, Price L, Pearson AD, Boddy AV: Cyclophosphamide and ifosfamide
metabolites in the cerebrospinal fluid of children. Clinical Cancer Research. 1997,
3(11): 1985-92.
21. Williams ML, Wainer IW, Granvil CP, Gehrcke B, Bernstein ML, Ducharme MP:
Pharmacokinetics of (R)- and (S)-cyclophosphamide and their dechloroethylated
metabolites in cancer patients. Chirality 1999. 11(4): 301-308.
22. Joqueviel C, Martino R, Gilard V, Malet-Martino M, Canal P, Niemeyer U: Urinary
excretion of cyclophosphamide in humans, determined by phosphorous-31nuclear
magnetic resonance spectroscopy. Drug Metabolism and Disposition. 1998. 26: 418-
428.
51
23. Wang D, Wang H: Oxazaphosphorine bioactivation and detoxification The role of
xenobiotic receptors. Acta Pharmaceutica Sinica B 2012. 2(2): 107–117.
24. Bagley CM, Bostick FW, DeVita VT: Clinical pharmacology of cyclophosphamide.
Cancer Research. 1973; 33: 226-233.
25. Hassan M, Svensson USH, Ljungman P, Björkstrand B, Olsson H, Bielenstein M, Abdel-
Rehim M, Nilsson C, Johansson M, Karlsson MO: A mechanism based
pharmacokinetic-enzyme model for cyclophosphamide of 4-
hydroxycyclophosphamide and phosphoramide mustard autoinduction in breast
cancer patients. British Journal of Clinical Pharmacology 1999. 48: 669-677.
26. Huitema ADR, Mathot RAA, Tibben MM, et al. A mechanism-based pharmacokinetic
model for the cytochrome P450 drug-drug interaction between cyclophosphamide
and thioTEPA and the autoinduction of cyclophosphamide. Journal of
Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2001. 28: 211-230.
27. Petros WP, Broadwater G, Berry D, et al. Association of high-dose cyclophosphamide,
cisplatin, and carmustine pharmacokinetics with survival, toxicity, and dosing weight
in patients with primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 2002. 8: 698-705.
28. Richardson ME, Siemann DW: DNA damage in cyclophosphamide-resistant tumor
cells: the role of glutathione. Cancer Research 1995. 55: 1691-1695.
29. Gamcsik MP, Dolan ME, Andersson BS, Murray D: Mechanisms of resistance to the
toxicity of cyclophosphamide. Current Pharmaceutical Design 1999. 5: 587-605
30. McDonald GB, Slattery JT, Bouvier ME, Ren S, Batchelder AL, Kalhorn TF, Schoch HG,
Anasetti C, Gooley T: Cyclophosphamide metabolism, liver toxicity, and mortality
following hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2003; 101: 2043-2048.
31. Joy MS, La M, Wang J, Bridges AS, Hu Y, Hogan SL, Frye RF, Blaisdell J, Goldstein JA,
Dooley MA, Brouwer KLR, Falk RJ: Cyclophosphamide and 4-
hydroxycyclophosphamide pharmacokinetics in patients with glomerulonephritis
secondary to lupus and small vessel vasculitis. British Journal of Clinical
Pharmacology. 2012; 74: 445-455.
32. Arnold H, Bourseaux F, Brock N: Chemotherapeutic action of a cyclic nitrogen
mustard phosphamide ester (B 518-ASTA) in experimental tumours in rats. Nature.
1958. 181: 931.
52
33. Chighizola C, Ong VH, Denton CP: Cyclophosphamide as Disease-modifying Therapy
for Scleroderma. International Journal of Clinical Rheumatology, 2011. 6(2): 219-230.
34. De Groot K, Rasmussen N, Bacon PA, Tervaert JW, Feighery C, Gregorini G, Gross WL,
Luqmani R, Jayne DR: Randomized trial of cyclophosphamide versus methotrexate for
induction of remission in early systemic antineutrophil cytoplasmic antibody-
associated vasculitis. Arthritis & Rheumatology. 2005. 52(8): 2461-2469.
35. Takada K, Illei GG, Boumpas DT: Cyclophosphamide for the treatment of systemic
lupus erythematosus. Lupus. 2001. 10: 154-161.
36. Langford CA: Cyclophosphamide as induction therapy for Wegener's granulomatosis
and microscopic polyangiitis. Clinical and Experimental Immunology, 2011. 164
(Suppl. 1.): 31-34.
37. Mielcarek M, Furlong T, O'Donnell PV, Storer BE, McCune JS, Storb R, Carpenter PA,
Flowers ME, Appelbaum FR, Martin PJ: Posttransplantation cyclophosphamide for
prevention of graft-versus-host disease after HLA-matched mobilized blood cell
transplantation. Blood, 2016. 127 (11): 1502-1508.
38. Hurd ER, Giuliano VJ: The effect of cyclophosphamide on B and T lymphocytes in
patients with connective tissue diseases. Arthritis and Rheumatism, 1975. (18) 1: 67-
75.
39. Kobos R, Shukla N, Renaud T, Prockop SE, Boulad F, Steinherz PG: High-dose
cyclophosphamide for the treatment of refractory T-cell acute lymphoblastic
leukemia in children. Journal of Pediatric Hematology and Oncology. 2014. 36(5):
265-270.
40. Thompson PA, Tam CS, O'Brien SM, Wierda WG, Stingo F, Plunkett W, Smith SC,
Kantarjian HM, Freireich EJ, Keating MJ: Fludarabine, cyclophosphamide, and
rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated
chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016. 127(3): 303-309.
41. Thakar K, Novero A, Das A, Lisinschi A, Mehta B, Ahmed T, Liu D: CEPP regimen
(cyclophosphamide, etoposide, procarbazine and prednisone) as initial treatment for
Hodgkin lymphoma patients presenting with severe abnormal liver function.
Biomarker Research. 2014. 2: 12.
53
42. Veal GJ, Cole M, Chinnaswamy G, Sludden J, Jamieson D, Errington J, Malik G, Hill CR,
Chamberlain T, Boddy AV: Cyclophosphamide pharmacokinetics and
pharmacogenetics in children with B-cell non-Hodgkin's lymphoma. European Journal
of Cancer. 2016. 55: 56-64.
43. Valero V: Combination docetaxel/cyclophosphamide in patients with advanced solid
tumors. Oncology. 1997. 11(Suppl 8): 34-36.
44. Sullivan MP, Ramirez I: Curability of Burkitt's lymphoma with high-dose
cyclophosphamide-high-dose methotrexate therapy and intrathecal
chemoprophylaxis. Journal of Clinical Oncology. 1985. 3(5): 627-636.
45. Gebbia V, Boussen H, Valerio MR: Oral metronomic cyclophosphamide with and
without methotrexate as palliative treatment for patients with metastatic breast
carcinoma. Anticancer Research. 2012. 32(2): 529-36.
46. Sonneveld P, Broijl A: Treatment of relapsed and refractory multiple myeloma.
Haematologica. 2016. 101 (4): 396-406.
47. Grunberg SM: Cyclophosphamide and etoposide for non-small cell and small cell lung
cancer. Drugs. 1999. 58 Suppl. 3: 11-15.
48. Handolias D, Quinn M, Foo S, Mileshkin L, Grant P,Dutu G, Rischin D: Oral
cyclophosphamide in recurrent ovarian cancer. Asia-Pacific Journal of Clinical
Oncology. 2016. 12(1): 154-160.
49. Martin-Suarez I, D'Cruz D, Mansoor M, Fernandes AP, Khamashta MA, Hughes GR:
Immunosuppressive treatment in severe connective tissue diseases: effects of low
dose intravenous cyclophosphamide. Annals of the Rheumatic Diseases. 1997. 56(8):
481-487.
50. Martin F, Lauwerys B, Lefèbvre C, Devogelaer JP, Houssiau FA: Side-effects of
intravenous cyclophosphamide pulse therapy. Lupus. 1997. 6(3): 254-257.
51. Sitzia J, Huggins L: Side effects of cyclophosphamide, methotrexate, and 5-
fluorouracil (CMF) chemotherapy for breast cancer. Cancer Practice 1998. 6(1): 13-
21.
52. Dan D, Fischer R, Adler S, Förger F, Villiger PM: Cyclophosphamide: As bad as its
reputation? Long-term single centre experience of cyclophosphamide side effects in
the treatment of systemic autoimmune diseases. Swiss Medical Weekly. 2014. 23:
144:w14030.
54
53. Niemeijer ND, Alblas G, van Hulsteijn LT, Dekkers OM, Corssmit EP: Chemotherapy
with cyclophosphamide, vincristine and dacarbazine for malignant paraganglioma
and pheochromocytoma: systematic review and meta-analysis. Clinical
Endocrinology. 2014. 81(5): 642-651.
54. Notermans NC, Lokhorst HM, Franssen H, Van der Graaf Y, Teunissen LL, Jennekens
FG, Van den Berg LH, Wokke JH: Intermittent cyclophosphamide and prednisone
treatment of polyneuropathy associated with monoclonal gammopathy of
undetermined significance. Neurology. 1996. 47(5): 1227-1233.
55. Hamidou MA, Belizna C, Wiertlewsky S, Audrain M, Biron C, Grolleau JY, MussiniJM:
Intravenous cyclophosphamide in refractory polyneuropathy associated with IgM
monoclonal gammopathy: anuncontrolled open trial. American Journal of medicine
2005. 118(4): 426-430.
56. Kemp G, Rose P, Lurain J, Berman M, Manetta A, Roullet B, Homesley H, Belpomme
D, Glick J: Amifostine pretreatment for protection against cyclophosphamide-induced
and cisplatin-induced toxicities: results of a randomized control trial in patients with
advanced ovarian cancer. Journal of Clinical Oncology, 1996. 14: 2101–2112.
57. Spitzer TR, Cirenza E, McAfee S, Foelber R, Zarzin J, Cahill R, Mazumder A: Phase I-II
trial of high-dose cyclophosphamide, carboplatin and autologous bone marrow or
peripheral blood stem cell rescue. Bone Marrow Transplant 15 1995. 537-542.
58. Tschöp K, Rommel F, Schmidkonz P, Emmerich B, Schulze J: Neuropathy after
cyclophosphamide high dose chemotherapy in a Morbus Werlhof patient. Deutsche
Medizinische Wochenschrift 2001; 126(12): T17-T20.
59. Martyn CN, Hughes RAC: Epidemiology of peripheral neuropathy. Journal of
Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 1997. 62(4): 310–318.
60. Leitsch, M. M., Sherman, W. H., Brannagan, T. H. 3rd.: Distal acquired demyelinating
symmetric polyneuropathy progressing to classic chronic inflammatory demyelinating
polyneuropathy and response to fludarabine and cyclophosphamide. Muscle Nerve,
2013. 47, 292–296.
61. Misra UK, Kalita J, Nair PP: Diagnostic approach to peripheral neuropathy. Annals of
Indian Academy of Neurology. 2008. 11: 89–97.
55
62. Coukell A, Faulds D: Epirubicin - a review of its pharmacodynamic and
pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in the management of breast
cancer. Drugs 1997. 53: 453-482.
63. Schimmel KJ, Richel DJ, van den Brink RB, Guchelaar HJ: Cardiotoxicity of cytotoxic
drugs. Cancer Treatment Review 2004. 30:181-191.
64. Santos GW, Sensenbrenner LL, Burke PJ, Mullins GM, Blas WB, Tutschka PJ, Slavin RE:
The use of cyclophosphamide for clinical marrow transplantation. Transplantation
Proceedings 1972. 4: 559-564.
65. Mills BA, Roberts RW: Cyclophosphamide-induced cardiomyopathy: a report of two
cases and review of the English literature. Cancer. 1979. 43(6):2223-2226.
66. Taniguchi I.: Clinical significance of cyclophosphamide-induced cardiotoxicity. Internal
Medicine, 2005. 44(2): 89-90.
67. Asiri Y.A.: Probucol attenuates cyclophosphamide-induced oxidative apoptosis, p53
and Bax signal expression in rat cardiac tissues. Oxidative Medicine and Cellular
Longevity, 2010. 3(5): 308–316.
68. Dhesi S, Chu MP, Blevins G, Paterson I, Larratt L, Oudit GY, Kim DH:
Cyclophosphamide-Induced Cardiomyopathy: A Case Report, Review, and
Recommendations for Management. Journal of Investigative Medicine High Impact
Case Reports. 2013: 1–7.
69. Shanholtz C.: Acute life-threatening toxicity of cancer treatment. Critical Care
Clinincs. 2001. 17: 483-502.
70. Brockstein BE, Smiley C, Al-Sadir J, Williams SF: Cardiac and pulmonary toxicity in
patients undergoing high-dose chemotherapy for lymphoma and breast cancer:
prognostic factors. Bone Marrow Transplant. 2000. 25:885-894.
71. Eitel I, Kubusch K, Strohm O, Desch S, Mikami Y, de Waha S, Gutberlet M, Schuler G,
Friedrich MG, Thiele H: Prognostic value and determinants of a hypointense infarct
core in T2-weighted cardiac magnetic resonance in acute reperfused ST-elevation-
myocardial infarction. Circulation: Cardiovascular Imaging; 2011. 4: 354-362.
72. Fonyó A (ed.): Az orvosi élettan tankönyve. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1999
73. Szakács H, Dr. Varga Cs, Nagy R: Polimerek méréstechnikája, Pannon Egyetem, 2012.
74. Watson ES, O’Neill MJ: Differential microcalorimeter. United Patients 1966; 2: 1-10.
56
75. Watson ES, O’Neill MJ, Justin J, Brenner N: A Differential Scanning Calorimeter for
quantitative differential thermal analysis. Analytical Chemistry 1964. 36: 1233-1238.
76. Bruylants G, Wouters J, Michaux C: Differential scanning calorimetry in life science:
thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.
Current Medicinal Chemistry. 2005. 12: 2011-2200.
77. Lőrinczy D, Belágyi J: Effects of nucleotide on skeletal muscle myosin unfolding in
myofibrils by DSC. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995. 217:
592-598.
78. Dergez T, Lőrinczy D, Könczöl F, Farkas N, Belágyi J: Differential scanning calorimetry
study of glycerinated rabbit psoas muscle fibres in intermediate state of ATP
hydrolysis. BMC Structural Biology. 2007. 7: 41-51.
79. Zapf I, Fekecs T, Moezzi M, Tizedes G, Pavlovics G, Kálmán E, Horváth PO, Ferencz A:
Differential scanning calorimetry of blood plasma in breast cancer patients. Magyar
Onkológia. 2012. 56: 274-279.
80. Garbett NC, Miller JJ, Jenson AB, Chaires JB: Calorimetric analysis of the plasma
proteome. Seminars in Nephrology. 2007. 27: 621-626.
81. Garbett NC, Mekmaysy CS, DeLeeuw L, Chaires JB: Clinical application of plasma
thermograms: utility, practical approaches and considerations. Methods. 2015. 76:
41-50.
82. Wiegand N, Vámhidy L, Lőrinczy D. Differential scanning calorimetric examination of
ruptured lower limb tendons in human. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry
2010. 101: 487-492.
83. Fekecs T, Zapf I, Ferencz A, Lőrinczy D: Differential scanning calorimetry (DSC)
analysis of human plasma in melanoma patients with or without regional
lymph node metastases. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2012. 108:
149–152.
84. Zapf I, Fekecs T, Ferencz A, Tizedes G, Pavlovics G, Kálmán E, Lőrinczy D: DSC analysis
of human plasma in breast cancer patients. Thermochimica Acta. 2011. 524 :88–91.
85. Visegrády B, Lőrinczy D, Hild G, Somogyi B, Nyitrai M: A simple model for the
cooperative stabilisation of actin filaments by phalloidin and jasplakinolide. FEBS
Letters. 2005. 579(1): 6-10.
57
86. Levitsky DI, Nikolaeva OP, Orlov VN, Pavlov DA Ponomarev MA, Rostkova EV:
Differential scanning calorimetric studies on myosin and actin. Biochemistry
(Moscow). 1998. 63(3): 322-333.
87. Spink CH. Differential scanning calorimetry. Methods in Cell Biology. 2008. 84: 115-
41.
88. Edidin M: Rotational and translational diffusion in membranes. Annual Review of
Biophysics and Bioengineering. 1974. 3:179-201.
89. Bálint G, Than P, Domán I, Wiegand N, Horváth G, Lőrinczy D: Calorimetric
examination of the human meniscus. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry
2009. 95: 759–761.
90. Celej MS, Dassie SA, González M, Bianconi ML, Fidelio GD: Differential scanning
calorimetry as a tool to estimate binding parameters in multiligand binding proteins.
Analytical Biochemistry. 2006. 350: 277-284.
91. Brandts JF, Lin LN: Study of strong to ultratight protein interactions using differential
scanning calorimetry. Biochemistry 1990. 29: 6927-6940.
92. Wiegand N, Vámhidy L, Patczai B, Dömse E, Than P, Kereskai L, Lőrinczy D: Differential
scanning calorimetric examination of transverse carpal ligament in carpal tunnel
disease. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2009; 95:793–796.
93. Wiegand N, Vámhidy L, Patczai B, Dömse E, Than P, Kereskai L, Lőrinczy D. Differential
scanning calorimetric examination of the degenerated human palmar aponeurosis in
Dupuytren disease. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2009. 95: 797–800.
94. Wiegand N, Vámhidy L, Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of
ruptured lower limb tendons in human. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry.
2010. 101: 487–92.
95. Wiegand N, Vámhidy L, Kereskai L, Lőrinczy D: Differential scanning calorimetric
examination of the ruptured achilles tendon in human. Thermochimica Acta. 2010.
498: 7–10.
96. Naumov I, Wiegand N, Patczai B, Vámhidy L, Lőrinczy D: Differential scanning
calorimetric examination of the human hyaline cartilage of the femoral head after
femoral neck fracture. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2011. 102: 1–7.
58
97. Naumov I, Lőrinczy D, Vámhidy L, Than P, Wiegand N. Differential scanning
calorimetric examination of the interfacial membrane in failed hip joint
replacements. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2012. 109: 783–787.
98. Turner PV, Brabb T, Pekow C, Vasbinder MA: Administration of Substances to
Laboratory Animals: Routes of Administration and Factors to Consider. Journal of the
American Association for Laboratory Animal Science. 2011. 50(5): 614–627.
99. Lőrinczy D, Belágyi J.: Effects of nucleotide on skeletal muscle myosin unfolding in
myofibrils by DSC. Biochemical and Biophysics Research Communications. 1995. 217:
592–598.
100. Belágyi J, Lőrinczy D: Internal motions in the catalytic domain of myosin heads in
muscle fibres effects of ADP and ATP. Biochemical and Biophysics Research
Communications. 1996. 219: 936–940.
101. Lőrinczy D, Belágyi J: Comparative study of myosins in solutions and supramolecular
complexes. Effect of nucleotides. Thermochimica Acta. 1997. 296: 161–168.
102. Lőrinczy D, Hartvig N, Belágyi J: Nucleotide analogue induces global and local
changes in muscle fibres. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2001. 64: 651–
658.
103. Dergez T, Könczöl F, Farkas N, Belágyi J, Lőrinczy D: DSC study of glycerol-extracted
muscle fibers in intermediate states of ATP hydrolysis. Journal of Thermal Analysis
and Calorimetry. 2005. 80: 445–449.
104. Lőrinczy D, Belágyi J: Intermediate states of myosin head during ATP hydrolysis cycle
in psoas muscle fibres by EPR and DSC (a review). Journal of Thermal Analysis and
Calorimetry. 2007. 90: 611–621.
105. Dergez T, Lőrinczy D, Könczöl F, Farkas N, Belágyi J: Differential scanning calorimetry
study of glycerinated rabbit psoas muscle fibres in intermediate state of ATP
hydrolysis. BMC Structural Biology. 2007. 7: 41–50.
106. Singleton JR, Smith AG: The diabetic neuropathies: practical and rational therapy.
Seminars in Neurology. 2012. 32(3): 196-203.
107. Chopra K, Tiwari V: Alcoholic neuropathy: possible mechanisms and future
treatment possibilities. British Journal of Clinical Pharmacology. 2012. 73(3): 348–
362.
59
108. Manji H: Drug-induced neuropathies. Handbook of Clinical Neurology. 2013. 115:
729-742.
109. Rudnicki SA, Dalmau J: Paraneoplastic syndromes of the peripheral nerves. Current
Opinion in Neurology. 2005. 18(5): 598-603.
110. Koike H, Takahashi M, Ohyama K, Hashimoto R, Kawagashira Y, Iijima M, Katsuno M,
Doi H, Tanaka F, Sobue G: Clinicopathologic features of folate-deficiency neuropathy.
Neurology. 2015. 84(10): 1026-1033.
111. Gazsó I, Kránicz J, Bellyei Á, Lőrinczy D.: DSC analysis of the abnormalities of human
leg skeletal muscles: a preliminary study. Thermochimica Acta. 2003. 402: 117–122.
112. Wiegand N, Vámhidy L, Patczai B, Dömse E, Kereskai L, Lőrinczy D: Differential
scanning calorimetric examination of the human skeletal muscle in a compartment
syndrome of the lower extremities. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry
2009. 98: 177–182.
113. Könczöl F, Lőrinczy D, Vértes Zs, Hegyi Gy, Belagyi J: Intermonomer cross-linking
affects the thermal transitions in F-actin. Journal of Thermal Analysis and
Calorimetry. 2010. 101: 549-553.
114. Türmer K, Könczöl F, Lőrinczy D, Belágyi J: AMP.PNP affects the dynamical
properties of monomer and polymerized actin. A DSC and an EPR study. Journal of
Thermal Analysis and Calorimetry. 2012. 108: 95-100.
115. Könczöl F, Belagyi J, Lőrinczy D: Thermal and dynamic behaviour of the actin
monomer in case of different cations. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry.
2013. 111: 1717-1723.
116. Lőrinczy D.: The „Green Issue" of JTAC as a great idea of Judit Simon. . Journal of
Thermal Analysis and Calorimetry. 2015. 120: 13-22.
117. Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the peripheral nerve and muscle
damage in cyclophosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of
Thermal Analysis and Calorimetry. 2016. 126: 47-53.
118. Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the left ventricle damage in cyclo-
phosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of Thermal Analysis
and Calorimetry. 2017. 127: 1181–1185.
60
119. Szalai Zs, Molnár FT, Lőrinczy D: Role of differential scanning calorimetry (DSC) in
the staging of COPD: A new approach to an old definition problem. Journal of
Thermal Analysis and Calorimetry. 2017. 127: 1231–1238.
120. Moezzi M, Ferencz A, Lőrinczy D: Evaluation of blood plasma changes by
differential scanning calorimetry in psoriatic patients treated with drugs.
Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2014. 116: 557–562
121. Moezzi M, Zapf I, Fekecs T, Nedvig K, Lőrinczy D, Ferencz A: Influence of oxidative
injury and monitoring of blood plasma by DSC on patients with psoriasis. Journal of
Thermal Analysis and Calorimetry. 2016. 123: 2037-43.
122. Ferencz A, Fekecs T, Lőrinczy D: Differential scanning calorimetry, as a new method
to monitor human plasma in melanoma patients with regional lymph node or distal
metastases. In book: Skin Cancer Overview, Editor: Xi Y., InTech. 2011; 141–151.
Available: http://www.intechopen.com/books/skin-cancer-overview/differential-
scanning-calorimetry-as-a-new-method-to-monitor-human-plasma-in-melanoma-
patients-with-
123. Todinova S, Krumova S, Gartcheva L, Robeerst C, Taneva SG: Microcalorimetry of
Blood Serum Proteome: A Modified Interaction Network in the Multiple Myeloma
Case. Analytical Chemistry. 2011. 83: 7992–7998
124. Krumova S, Rukova B, Todinova S, Gartcheva L, Milanova V, Toncheva D, Taneva SG:
Calorimetric monitoring of the serum proteome in schizophrenia patients.
Thermochimica Acta. 2013. 572: 59–64.
125. Rai SN, Pan J, Cambon A, Chaires JB, Garbett NC: Group Classification based on
High-Dimensional Data: Application to Differential Scanning Calorimetry Plasma
Thermogram Analysis of Cervical Cancer and Control Samples. Open Access Medical
Statistics 2013. 3:1-9.
126. Garbett NC, Merchant ML, Chaires JB, Klein JB: Calorimetric Analysis of the Plasma
Proteome: Identification of Type I Diabetes Patients With Early Renal Function
Decline. Biochimica and Biophysica Acta 2013. 1830(10): 4675-4680.
127. Michnik A: Blood plasma, serum and serum proteins microcalorimetric studies
aimed at diagnosis support. In book: Thermal Analysis in Medical Application, Editor:
Lőrinczy D., Akadémiai Kiadó, Budapest, Hungary 2011. 171–190.
61
128. Garbett NC, Mekmaysy CS, Helm CW, Jenson AB, Chaires JB. Differential scanning
calorimetry of blood plasma for clinical diagnosis and monitoring. Experimental and
Molecular Pathology. 2009. 86: 186-191.
129. Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the blood plasma and red blood cells
in cyclophosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of Thermal
Analysis and Calorimetry. 2017. 127:1239–1243.
62
Közlemények és előadások jegyzéke
Az értekezés tárgykörébe tartozó közlemények
Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the peripheral nerve and muscle damage in cyclophosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2016. 126: 47-53.
IF: 1,781
Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the left ventricle damage in cyclo-phosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2017. 127: 1181–1185.
IF: 1,781
Farkas P, Könczöl F, Lőrinczy D: Examination of the blood plasma and red blood cells in cyclophosphamide monotherapy with DSC in animal models. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2017. 127:1239–1243
IF: 1,781
Farkas P, Lőrinczy D: New possibilities of application of differential scanning calorimetry - new clinical diagnostic methods on the horizon? Temperature. 2017. 4(2): 1-3.
Értekezés tárgykörébe tartozó előadások:
Farkas Péter I. - Könczöl Franciska - Lőrinczy Dénes:
Examination of the cyclophosphamide induced polyneuropathy on guinea pig sciatic nerve, gastrocnemius and heart muscle as well as in blood samples with DSC.
12th Conference on Calorimetry and Thermal Analysis and 5th Czech – Hungarian – Polish – Slovakian Thermoanalytical Conference Zakopane, Lengyelország, 2015.
63
Nem a disszertáció tárgykörébe tartozó poszter:
Farkas P., Járay Á., Rostás T., Battyáni I.: Retenciós típusú appendicocele – XI. Lélek Imre Emlékülés, Modern Képalkotó Diagnosztikai Konferencia és Továbbképzés, Hévíz, 2013
Nem a disszertáció tárgykörébe tartozó előadások:
Farkas P., Járay Á.: A vese kontrasztanyagos ultrahang vizsgálata – Területi Radiológus Továbbképzés, Pécs, 2013.
Farkas P., Járay Á., Bugya T., Battyáni I.: A transzplantált vese kontrasztanyagos UH vizsgálata – kezdeti tapasztalataink - 26. Soproni Ultrahang Napok, Sopron, 2013.
Farkas P., Járay Á., Battyáni I.: Vesebetegségek és CEUS: indikációk – A vese kontrasztanyagos ultrahang vizsgálata – II. CEUS tanfolyam, Pécs, 2013.
Farkas P., Harmat Z.: Ultrahang diagnosztika az urológiában I-II-III. - Magyar Urológia Szakmai Kollégium Szakorvosi felkészítő továbbképző program, Pécs, 2014.
Farkas P., Járay Á.: UH kontrasztanyagok; CEUS vizsgálatok kivitelezése, lehetséges arte fact-ok – Kötelező Szintentartó Tanfolyam, Pécs, 2014.
Farkas P., Járay Á.: Kontrasztanyagos UH vizsgálatok I-II. + esetbemutatás
Ultrahang-diagnosztika tanfolyam, Szeged, 2015.
Farkas P.: Urolithiasis diagnosztikája – Ultrahang – Magyar Urológia Szakmai Kollégium Szakorvosi felkészítő továbbképző program, Pécs, 2015.
Farkas P., Harmat Z., Battyáni I.: A kontrasztanyagos ultrahangvizsgálat lehetőségei és korlátai a vese daganatok diagnosztizálásában
27. Soproni Ultrahang Napok, Sopron, 2015.
64
Farkas P., Harmat Z., Rostás T., Battyáni I.: Urológiai intervenciós radiológia
16. Pécsi Intervenciós Radiológiai Szimpózium Pécs, 2015.
Farkas P., Járay Á.: A kontrasztanyagos UH képalkotás fizikai alapjai.
Farkas P., Járay Á.: A vese CEUS vizsgálata.
Farkas P.: Workshop I.
Farkas P.: Workshop II.
3. CEUS tanfolyam, Pécs, 2015.
Farkas P., Járay Á.: Kontrasztanyagos UH vizsgálatok I-II. + esetbemutatás
Ultrahang-diagnosztika tanfolyam, Szeged, 2016.
Bányai D., Koppán M., Mátrai G., Farkas P.: Vesedaganat várandós asszonyban
Tanulságos esetek fóruma, PTE ÁOK, Pécs, 2016.
Farkas P.: A kismedence és a prosztata képalkotó diagnosztikája
Magyar Urológia Szakmai Kollégium Szakorvosi felkészítő továbbképző program, Pécs, 2016.
Farkas P.: UH diagnosztika az érsebészetben.
Farkas P.: Endovascularis technikák, klinikai esetek.
Érsebészeti aktualitások - Kötelező szinten tartó továbbképző kurzus /érsebészet/ Pécs, 2016
Farkas P.: Kismedencei térfoglaló folyamatok diagnosztikája a legkorszerűbb képalkotó vizsgálatok (CT, MR, PET) tükrében
Magyar Urológusok Társasága XXI. Kongresszusa, Debrecen, 2016.
Farkas P., Járay Á.: Kontrasztanyagos UH vizsgálatok I-II. + esetbemutatás
Ultrahang-diagnosztika tanfolyam, Szeged, 2017.
65
Farkas P., Járay Á.: A kontrasztanyagos UH képalkotás fizikai alapjai.
Farkas P., Járay Á.: A vese CEUS vizsgálata.
Farkas P.: Workshop I.
Farkas P.: Workshop II.
4. CEUS tanfolyam, Pécs, 2017.
Farkas P.: Képalkotó diagnosztikai lehetőségekhere és péniszdaganatok esetében
Magyar Urológia Szakmai Kollégium Szakorvosi felkészítő továbbképző program, Pécs, 2017.
Farkas P.: Uro-onkológia: vese, húgyhólyag és heredaganatok radiológiája.
A has és kismedence képalkotó diagnosztikája - radiológus rezidens tanfolyam, Pécs, 2017.
Top Related