UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS–GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
JESSIKA GONÇALVES DOS SANTOS
APLICAÇÃO DE ULTRASSOM EM MANGAS ‘TOMMY ATKINS’
MINIMAMENTE PROCESSADAS: ASPECTOS FISIOLÓGICOS E DE
QUALIDADE
FORTALEZA–CE
2013
JESSIKA GONÇALVES DOS SANTOS
APLICAÇÃO DE ULTRASSOM EM MANGAS ‘TOMMY ATKINS’
MINIMAMENTE PROCESSADAS: ASPECTOS FISIOLÓGICOS E DE
QUALIDADE
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós–Graduação em
Bioquímica, do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do
Título de Mestre em Bioquímica. Área
de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientadora: Dra. Maria Raquel
Alcântara de Miranda.
Coorientador: Dr. Fabiano André
Narciso Fernandes.
FORTALEZA–CE
2013
iv
Dedico este trabalho a minha
mãe, companheira absoluta
de todos os momentos. Aos
meus familiares e amigos.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente e antes de qualquer coisa agradeço a Deus, pois
sem Ele nada é possível. Por ter guiado meus caminhos e me conduzido
a esta conquista.
Ao afeto, compreensão e paciência da minha querida mãe,
Terezinha, grande incentivadora e que sempre tinha um “colinho” pra
oferecer em momentos de dificuldade.
A minha família, que sempre será meu porto seguro. Em especial a
minha sobrinha Kévina e minha irmã Neila, cuja amizade, apesar das
diferenças, foi ficando cada vez mais importante.
A minha orientadora, Dra. Maria Raquel Alcântara de Miranda, pela
confiança, apoio, motivação, muitos ensinamentos e atenção.
Ao professor Dr. Fabiano André Narciso Fernandes, por me
receber em seu laboratório no Departamento de Engenharia Química da
UFC, pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho, pelos conhecimentos
repassados, disponibilidade, simpatia e paciência.
Ao Dr. Ebenézer de Oliveira Silva pela gentileza de compartilhar
sua experiência ao aceitar participar desta banca.
A todos os companheiros do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia
Pós–Colheita de Frutos, pelo acolhimento, carinho, ótima convivência e
por todas as dúvidas tiradas. Lugar mais do que especial onde cultivei
grandes amizades que levarei para toda a vida.
Aos colegas dos demais laboratórios que em algum momento me
auxiliaram, e principalmente pelas amizades conquistadas, em especial
às meninas do laboratório de Bioenergética.
Aos amigos que estão perto e àqueles que estão longe.
Ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Ceará pelo Programa de Pós–Graduação e sua
contribuição para a minha formação.
A CAPES, pela concessão da bolsa.
Aos demais, que de alguma forma contribuíram para a
concretização deste estudo.
vi
"Para realizar grandes
conquistas, devemos não
apenas agir, mas também
sonhar; não apenas planejar,
mas também acreditar."
Anatole France.
"Aqui, no entanto, nós não
olhamos para trás por muito
tempo. Nós continuamos
seguindo em frente,
abrindo novas portas e
fazendo coisas novas porque
somos curiosos... e a
curiosidade continua nos
conduzindo por novos
caminhos. Siga em frente."
Walt Disney.
vii
RESUMO
Atualmente é crescente a busca por uma alimentação mais saudável e
com isso surge a possibilidade da inclusão de frutos e hortaliças nos
hábitos alimentares. A manga é um fruto bastante consumido e produzido
no Brasil e os minimamente processados (MP) representam praticidade
porque são produtos que já vem prontos para consumo, sem perda de
tempo com operações de descasque, corte, etc. Durante as etapas de
processamento há um estresse dos tecidos, que leva à geração de
radicais livres que podem causar a degradação do fruto, por isso, se faz
necessário a utilização de tratamentos capazes de minimizar as perdas
de qualidade. Nesse contexto surge o ultrassom (US) que é uma
tecnologia emergente com potencial de exploração e utilização. As ondas
ultrassônicas provocam principalmente a compressão e expansão dos
tecidos, cujos resultados vão depender da matriz alimentar. Este trabalho
teve como objetivo avaliar o efeito do US na qualidade de mangas
‘Tommy Atkins’ MP, analisando o sistema de defesa antioxidante,
componentes do metabolismo oxidativo e a atividade de enzimas
hidrolíticas da parede celular. Para tanto, as amostras foram expostas à
sonicação na frequência de 25 kHz por 30 minutos em banho de US.
Observou–se que o tratamento causou uma redução na acidez titulável
(AT) e nos sólidos solúveis (SS), porém após sete dias de
armazenamento a 4 oC, manteve elevada a relação SS/AT (46,54). Os
teores de açúcares também foram reduzidos (15%), bem como água foi
incorporada (4,6%), o que mostra uma modificação na estrutura celular,
que pode ser comprovada pelo decréscimo na firmeza após sete dias (de
241,73 para 139,38 N) e aumento na atividade da pectinametilesterase. A
cor foi degradada após sete dias (∆L = 3,24 e ∆C = 4,42), resultando em
escurecimento, contudo as amostras controle também escureceram. Em
relação ao sistema antioxidante, não houve grandes modificações, tendo
em vista ser um fator benéfico se comparado a outros métodos de
conservação, com destaque apenas para a perda de vitamina C (de
328,10 para 190,18 mg ácido ascórbico/kg matéria fresca (MF)). Houve
viii
ainda redução na peroxidação de lipídios de membrana com o tratamento
(de 23,58 para 18 ηmol MDA/g MF). Conclui–se com base neste estudo,
que a aplicação de US em mangas ‘Tommy Atkins’ MP tem seus pontos
negativos na firmeza e na cor, contudo, não afetou drasticamente os
sistemas antioxidante enzimático e não enzimático, além de levar a uma
redução no teor de açúcar. Todavia, fica claro a necessidade de explorar
esta tecnologia na fisiologia pós–colheita de frutos, assim como, otimizar
e combinar a técnica com outros processos que diminuam seus efeitos
negativos e favoreçam os positivos.
Palavras–chave: Bioativos; enzimas; processamento; sonicação.
ix
ABSTRACT
Currently is growing to search for healthier eating with that comes the
possibility for inclusion of fruits and vegetables in the diet. Mango fruit is
widely consumed and produced in Brazil and fresh–cut (FC) represents
convenience because them are products that comes ready for
consumption without loss of time with operations peeling, cutting, etc., and
these steps there is a stress tissue leading to generation of free radicals
that can lead to a degradation fruit, so it is necessary a type of processing
that minimize the loss of quality and yet ensures the safety of the final
product. In this context arises the ultrasound (US) that is an emerging
technology that has potential for exploitation and utilization. The ultrasonic
waves cause primarily tissue compression and expansion, whose the
results will depend on the food matrix. This study aimed to evaluate the
effect of US in quality of FC 'Tommy Atkins' mangoes, analyzing the
antioxidant defense system, metabolism oxidative compounds and the
activity of cell wall hydrolytic enzymes. The samples were exposed to 25
kHz frequency sonication for 30 minutes in US bath. It was observed that
the treatment caused a reduction in titratable acidity (TA) and soluble
solids (SS), but after seven days of storage at 4 oC, maintaining the high
SS/TA ratio (46.54). The sugars was also reduced (15%) and water
incorporated (4.6%), which indicates a change in cell structure, that can be
evidenced by decreased in firmness after seven days (from 241.73 to
139.38 N) and increased activity of pectinmethylesterase. The color was
degraded after seven days (ΔL = 3.24 and ΔC = 4.42), resulting in
darkening, but the control samples also darkened. In relation to the
antioxidant system, there were no significant changes in order to be a
beneficial factor compared to other preservation methods, particularly only
to the loss of vitamin C (328.10 to 190.18 mg ascorbic acid/kg weight fresh
(WF), still there was a reduction in lipid peroxidation of membrane (from
23.58 to 18 ηmol MDA/g WF). It concluded to base on this study, FC
'Tommy Atkins' mango has its drawbacks on firmness and color, however,
did not affect severely the enzymatic and non–enzymatic antioxidant
x
systems, and lead to a reduction in sugar content. However, it is clear the
necessitate to explore the application of this technology in post harvest
fruits physiology as well as to optimize and to combine the technique with
other processes that reduce their negative effects and promote the
positives.
Keywords: Bioactive; enzymes; processing; sonication.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Manga ‘Tommy Atkins’ .......................................................... 4
Figura 2 – Aparelho de ultrassom de banho ......................................... 8
Figura 3 – Vias de formação das espécies reativas de oxigênio
(EROs) em células vegetais .................................................................. 12
Figura 4 – Etapas da oxidação de ácidos graxos .............................. 13
Figura 5 – Estrutura de um grupo fenol ............................................... 14
Figura 6 – Estrutura de um flavonoide ................................................. 15
Figura 7 – Estrutura de um carotenoide (β–caroteno) ........................ 16
Figura 8 – Estrutura do ácido ascórbico ............................................. 17
Figura 9 – Reação catalisada pela enzima G–POD na qual a mesma
converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol........
................................................................................................................. 19
Figura 10 – Manga ‘Tommy Atkins’ MP ................................................ 24
Figura 11 – Fluxograma de processamento mínimo e tratamento com
US de manga ‘Tommy Atkins’ ............................................................... 25
Figura 12 – Conteúdo de açúcares totais (A) e de açúcares redutores
(B) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e
armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 42
Figura 13 – Firmeza em mangas minimamente processadas, tratadas
com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ...................................... 45
Figura 14 – Peroxidação lipídica (A) e conteúdo de peróxido de
hidrogênio (B) em mangas minimamente processadas, tratadas com
US e armazenadas por sete dias a 4 oC ............................................... 48
Figura 15 – Conteúdo de antocianinas (A), de flavonoides amarelos
(B) e de polifenóis extraíveis totais (C) em mangas minimamente
processadas, tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC.....
................................................................................................................. 50
xii
Figura 16 – Conteúdo de carotenoides (A), de vitamina C (B) e
atividade antioxidante total (C) em mangas minimamente
processadas, tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC.....
................................................................................................................. 53
Figura 17 – Atividade das enzimas antioxidantes APX (A), CAT (B) e
SOD (C) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e
armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 56
Figura 18 – Atividade das enzimas responsáveis pelo escurecimento
G–POD (A) e PPO (B) em mangas minimamente processadas,
tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ........................ 59
Figura 19 – Atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) em
mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas
por sete dias a 4 oC ................................................................................ 61
Figura 20 – Atividade das enzimas PME (A) e PG (B) em mangas
minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por sete
dias a 4 oC ............................................................................................... 62
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Efeito do ultrassom em alimentos sonicados ................... 10
Tabela 2 – Atividade antioxidante de alguns flavonoides .................. 15
Tabela 3 – pH, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS) e razão
SS/AT em mangas minimamente processadas, tratadas com US e
armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 40
Tabela 4 – Parâmetros de cor em mangas minimamente processadas,
tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ........................ 43
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 3
2.1 Mangueira (Mangifera indica L.) ....................................................... 3
2.2 Minimamente Processados ............................................................... 5
2.3 O tratamento com ultrassom ........................................................... 7
2.4 Estresse oxidativo e sistema de defesa ........................................ 11
2.5 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal ............................ 21
3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 24
3.1 Material ............................................................................................. 24
3.2 Métodos ............................................................................................ 24
3.2.1 Processamento mínimo e tratamento com ultrassom ............... 24
3.2.2 Avaliações físicas e físico–químicas .......................................... 26
3.2.2.1 Potencial hidrogeniônico .......................................................... 26
3.2.2.2 Acidez titulável ........................................................................... 26
3.2.2.3 Sólidos solúveis ...................................................................... ...27
3.2.2.4 Conteúdo de açúcares totais e redutores ................................ 27
3.2.2.5 Cor ............................................................................................... 28
3.2.2.6 Firmeza ....................................................................................... 28
3.2.2.7 Umidade em base seca .............................................................. 28
3.2.2.8 Perda de água e de sólidos ....................................................... 29
3.2.2.9 Conteúdo de proteína solúvel total .......................................... 29
3.2.3 Sinalizadores de estresse oxidativo ........................................... 29
3.2.3.1 Atividade da fenil alanina amônia liase .................................... 29
3.2.3.2 Grau de peroxidação lipídica .................................................... 30
3.2.3.3 Conteúdo de peróxido de hidrogênio ...................................... 30
3.2.4 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total..
xv
................................................................................................................. 31
3.2.4.1 Antocianinas totais e flavonoides amarelos ........................... 31
3.2.4.2 Polifenóis extraíveis totais ........................................................ 31
3.2.4.3 Carotenoides .............................................................................. 32
3.2.4.4 Vitamina C .................................................................................. 32
3.2.4.5 Capacidade antioxidante total .................................................. 33
3.2.5 Enzimas antioxidantes ................................................................. 34
3.2.5.1 Atividade da ascorbato peroxidase .......................................... 34
3.2.5.2 Atividade da catalase................................................................. 35
3.2.5.3 Atividade da superóxido dismutase ......................................... 35
3.2.6 Enzimas responsáveis pelo escurecimento ............................... 36
3.2.6.1 Atividade da polifenoloxidase .................................................. 36
3.2.6.2 Atividade da guaiacol peroxidase ............................................ 36
3.2.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular ....................................... 37
3.2.7.1 Atividade da pectinametilesterase ........................................... 37
3.2.7.2 Atividade da poligalacturonase ................................................ 38
3.3 Delineamento experimental e análise estatística .......................... 39
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 40
4.1 Qualidade da manga minimamente processada e tratada com
ultrassom ................................................................................................ 40
4.2 Avaliação de componentes do metabolismo oxidativo ............... 48
4.3 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total.....
................................................................................................................ 50
4.4 Enzimas antioxidantes .................................................................... 56
4.5 Enzimas responsáveis pelo escurecimento .................................. 59
4.6 Enzima marcadora de estresse ...................................................... 61
4.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal ............................. 62
xvi
5 CONCLUSÃO ...................................................................................... 65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 66
1
1 INTRODUÇÃO
A manga é um fruto tropical de importância comercial para o país e
sua utilização como produto minimamente processado (MP) gera renda,
minimiza desperdícios e agrega valor.
Os alimentos MP atendem às tendências de mercado
representando economia de tempo, fácil preparo e redução de lixo gerado
pelo consumidor, porém, quando cortados, os vegetais apresentam
alterações fisiológicas provocadas por danos mecânicos, que aumentam
sua perecibilidade, reduzindo, consequentemente, sua vida útil (BASTOS,
2006a).
Assim, modificações na coloração original como escurecimento e o
amaciamento dos tecidos constituem fatores limitantes na
comercialização desses produtos. Frutos e hortaliças MP se deterioram
mais rapidamente do que o produto intacto (MORETTI, 2007). Além disso,
a instalação do processo de estresse oxidativo em decorrência de fatores
adversos como o processamento resulta em um desequilíbrio entre
compostos oxidantes e antioxidantes, culminando em perda de qualidade.
De modo geral, o prolongamento da vida pós–corte tem sido
determinado por meio da refrigeração e da modificação atmosférica nas
embalagens. No entanto, novas tecnologias complementares a estes
tratamentos e passíveis de serem utilizadas estão sendo largamente
desenvolvidas e estudadas (JACOMINO; SILVA; PINTO, 2009).
A utilização do ultrassom (US) na preservação de alimentos está
relacionada aos seus benefícios quando aplicados em alimentos (CRUZ;
VIEIRA; SILVA, 2007; TIWARI et al., 2009; CAO et al., 2010). Ao
empregar o US espera–se manter a qualidade das mangas MP e
prolongar a vida útil das mesmas, em detrimento a outros métodos de
preservação que trazem perdas aos produtos.
Nesse contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do
tratamento ultrassônico sobre a qualidade de mangas ‘Tommy Atkins’
minimamente processadas através de análises do sistema de defesa
2
antioxidante (enzimático e não enzimático), de componentes do
metabolismo oxidativo e da atividade de enzimas hidrolíticas da parede
celular.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A mangueira (Mangifera indica L.)
A mangueira, pertencente à família Anacardiaceae, é nativa do sul
e sudeste da Ásia, de onde se disseminou para diversas partes do
mundo, sendo atualmente produzida nas regiões tropicais e subtropicais
(CUNHA et al., 1994; ALVES et al., 2006; JAMES; NGARMSAK, 2010).
Apesar de sua origem indiana, a Mangifera indica L. foi introduzida no
Brasil pelos portugueses, no século XVI, e adaptou–se muito bem em
várias regiões, sendo algumas vezes confundida como fruteira nativa
(CEAGESP, 2004).
A manga é reconhecida por seu excelente sabor, aroma e
coloração característicos (BRUNINI; DURIGAN; OLIVEIRA, 2002), sendo
a sexta cultura em área colhida, com 75,2 mil hectares, no Brasil (MAPA,
2011).
Em 2011, a receita obtida com as exportações brasileiras de
manga totalizou US$ 140,9 milhões, valor 17,5% acima do registrado no
ano anterior. De janeiro a novembro do mesmo ano, o total exportado
pelo Brasil foi de 114.000,000 kg, de acordo com a Secretaria de
Comércio Exterior – Secex. Esse montante garantiu à manga o primeiro
lugar na pauta de exportações da fruticultura brasileira (SOARES, 2012).
De acordo com o USDA Foreign Agricultural Service (2012), o
Brasil apareceu como o quarto país exportador de manga para os
Estados Unidos, durante o triênio 2009/2011 e tomando como base o
Mango Crop Report (2012), as previsões eram de que a ‘Tommy Atkins’
seria a principal variedade de manga exportada pelo Brasil no ano de
2012, representando um total de 95%, seguida pelas variedades ‘Ataulfo’
(5%) e ‘Palmer’ (1%).
A cultivar Tommy Atkins (Figura 1) é originária da Flórida (EUA) e é
caracterizada por frutos grandes com médias de 12 cm de comprimento,
10 cm de largura, 9 cm de espessura e 500 g de peso. A forma é oval de
ápice arredondado com inserção peduncular moderadamente saliente,
4
casca grossa, bastante cerosa, resistente ao transporte e ao
armazenamento. Quando na maturidade fisiológica, o fruto apresenta
coloração arroxeado–púrpura e quando maduro, vermelho–amarelo–
brilhante (TODA FRUTA, 2003).
Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos
Figura 1 – Manga ‘Tommy Atkins’
De acordo com Chitarra e Chitarra (2005), o amadurecimento é
considerado um conjunto de processos que ocorrem desde os últimos
estádios de desenvolvimento até as etapas iniciais de senescência. Nele,
há um aprimoramento das características sensoriais (sabor, odor, cor e
textura). O fruto torna–se mais macio e colorido devido à degradação da
clorofila e desenvolvimento de pigmentos carotenoides e flavonoides
(CHITARRA; CHITARRA, 2005). Tais mudanças conduzem o fruto a um
estado comestível e, com isso, apropriado para o consumo e
industrialização (BASTOS, 2006b).
A qualidade e composição química das mangas íntegras
dependem da cultivar, das condições climáticas, de práticas culturais,
maturidade e método de colheita (CARDELLO; CARDELLO, 1998;
KADER, 2008). Em estudos anteriores foi relatado que no estádio
maduro, a manga ‘Tommy Atkins’ possui aproximadamente 14 °Brix, 100
mg de vitamina C total/kg massa fresca (MF), 25000 µg carotenoides/kg
MF, 480 mg fenólicos totais/kg MF (RIBEIRO et al.,2007), pH 4,06, acidez
titulável de 3,13 g ácido cítrico/100mL (CRUZ et al., 2010).
5
2.2 Minimamente processados (MP)
De acordo com Moretti (2007) frutos e hortaliças MP são, em
essência, vegetais que passaram por alterações físicas, isto é, foram
descascados, picados, torneados e ralados, dentre outros processos, mas
mantidos no estado fresco e metabolicamente ativos.
O setor de alimentos MP tem como objetivos reduzir perdas, gerar
renda e empregos, proporcionar novos canais de comercialização e
escoamento da produção, através dos quais se espera alcançar um
importante impacto econômico e social (SILVA et al., 2011).
O processamento mínimo no Brasil teve início com a chegada das
redes de refeições rápidas ou fast foods, no final da década de 70 e
condizem perfeitamente com as características da sociedade moderna:
envelhecimento da população, urbanização, aumento da participação
feminina no mercado de trabalho, etc. (SILVA et al., 2011).
A nutrição tem um papel fundamental na melhoria e manutenção
de indicadores de saúde. Uma dieta equilibrada, com alto valor
nutricional, é necessária para assegurar o crescimento e o
desenvolvimento do organismo, para promover uma elevada capacidade
de trabalho e de bem–estar (FAO, 2012). Segundo a Food and Agriculture
Organization (FAO, 2012), é recomendada uma ingestão diária de pelo
menos 400 g de vegetais, então, o seu consumo deve ser estimulado. E
os frutos tropicais MP são particularmente atraentes por sua
conveniência, frescor, nutrição, segurança e pela experiência de comê–
los (JAMES; NGARMSAK, 2010).
O produto MP, geralmente, apresenta maior perecibilidade em
comparação ao produto intacto (MORETTI, 2007) e o prolongamento da
sua vida útil tem sido determinado pelo uso de baixas temperaturas e
embalagens com atmosferas modificadas. Técnicas complementares,
como o uso de inibidores de escurecimento e do etileno, aplicação de
cálcio, revestimentos comestíveis e irradiação, estão sendo desenvolvidas
e estudadas (JACOMINO; SILVA; PINTO, 2009). Nesse contexto, é
importante que novas tecnologias com potencial de aplicação no
6
seguimento, sejam avaliadas, porém, seu emprego efetivo depende do
conhecimento das respostas dos tecidos ao tratamento.
O processamento mínimo aumenta a taxa de respiração dos frutos,
consequentemente, diminui os níveis de açúcares, ácidos orgânicos e
vitaminas, com um impacto negativo no sabor. A perda de água é também
reforçada pela degradação da parede celular e resulta em perda de
turgescência (JAMES, NGARMSAK, 2010).
Os conceitos de qualidade e de segurança alimentar são
inseparáveis do conceito de produtos MP e devem figurar entre seus
principais apelos, independente da grande força motivacional dos
aspectos práticos e convenientes desses produtos.
A qualidade é uma combinação de atributos que compreende as
propriedades sensoriais (aparência, textura, sabor e aroma), o valor
nutricional decorrente dos compostos químicos e das características
funcionais, as propriedades mecânicas e os defeitos do produto
(CHITARRA; CHITARRA, 2005; BASTOS, 2006a). Além disso, o
processamento mínimo, pela sua proposta conceitual, deve garantir as
propriedades nutritivas e organolépticas originais dos produtos in natura
(SEBRAE, 2008).
Os cuidados relacionados aos MP devem continuar durante o
armazenamento, transporte e distribuição, para garantir a qualidade e
segurança. A vida útil dos MP é bastante variada e depende do produto
(taxa de respiração e produção de etileno), dos cuidados no controle
higiênico–sanitário, empregado durante todas as etapas, e de fatores
ambientais, como temperatura, umidade relativa, dentre outros. Em geral,
varia de 3 a 10 dias o tempo estimado por vários pesquisadores,
dependendo dos fatores mencionados (ROBS, 2011).
A medição dos sólidos solúveis (SS) proporciona um indicador
razoável dos níveis de açúcares (JAMES; NGARMSAK, 2010), que são
responsáveis pelo flavor, através da relação com os ácidos (CHITARRA;
CHITARRA, 2005). A sacarose é o açúcar que a manga ‘Tommy Atkins’
tem em maior quantidade (BERNARDES–SILVA; LAJOLO;
CORDENUNSI, 2003).
7
A cor é um dos atributos mais importantes, pois os consumidores
julgam os produtos com base em sua aparência. A vida útil pós–colheita
de MP é limitada devido às lesões fisiológicas resultantes de operações
essenciais de processamento, incluindo descasque, retirada da semente
e corte. Estes processos podem causar escurecimento na superfície, o
que limita a comercialização (FERNANDES; RODRIGUES, 2012), e pode
ser resultado da ação de enzimas como polifenoloxidase, peroxidases,
fenil amônia liase, lipoxigenase, e também de degradações não
enzimáticas dos compostos bioativos, antioxidantes, responsáveis pela
cor e sabor como carotenoides, fenólicos, vitamina C, etc.
A firmeza é um atributo de qualidade crítico para a aceitabilidade
do consumidor. Sua conservação está geralmente relacionada à
manutenção da estrutura do tecido, cujas alterações têm um impacto no
produto final. Alterações que levam ao amaciamento são acompanhadas
por vazamento de eletrólitos, solubilização e despolimerização dos
polissacarídeos da parede celular e rearranjos das suas associações
como resultado da ação combinada de várias enzimas modificadoras de
parede que atuam nas frações pécticas e hemicelulósicas (JAMES;
NGARMSAK, 2010).
2.3 O tratamento com ultrassom (US)
Os ultrassons são ondas acústicas inaudíveis, que cobrem uma
ampla faixa de frequência, associadas a comprimentos de onda
comparáveis às distâncias intermoleculares, que oferece uma grande
variedade de aplicações cuja exploração constitui a base do
desenvolvimento das aplicações de US (NOGUEIRA, 2010).
A utilização de US de alta intensidade (que produz efeitos
permanentes no meio) representa uma nova forma de exploração de
‘energia limpa’ que pode ser utilizada nas indústrias de diferentes
segmentos, dentre eles o alimentício (NOGUEIRA, 2010). Essa tecnologia
é eficaz em temperatura ambiente e minimiza os efeitos térmicos
8
negativos sobre os parâmetros de qualidade e auxilia na conservação dos
alimentos.
Durante a sonicação, quando as ondas ultrassônicas se chocam
contra a superfície de um material, elas geram uma força. Se a força é
perpendicular à superfície, ela resulta na compressão do alimento, ao
passo que, se a força é paralela à superfície, ela produz cisalhamento.
(FELLOWS, 2006).
Os efeitos principais do US são atribuídos aos fenômenos de
cavitação, emitidos a partir dos processos físicos que criam, aumentam e
implodem microbolhas de gases dissolvidos no líquido pela compressão e
descompressão de moléculas que constituem o meio, “efeito esponja”. Os
resultados disto são criação de canais microscópicos no tecido de frutos
(TARLETON, 1992; MCCLEMENTS, 1995; TARLETON; WAKEMAN,
1998, FUENTE–BLANCO et al., 2006).
Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos
Figura 2 – Aparelho de ultrassom de banho
O colapso da bolha de cavitação cria um ponto de transição ativo
com temperatura elevada e pressão localizada, que foram estimadas ser
de até 5000 K e 5000 atm, respectivamente, o que pode acelerar
dramaticamente a reatividade química no meio (SUSLICK et al., 2011). A
baixas frequências, as bolhas de cavitação transiente são relativamente
menos numerosas, embora com dimensões elevadas, que privilegia os
efeitos físicos ao invés dos químicos (ESCLAPEZ, 2011).
A utilização de US na indústria de alimentos (Tabela 1) tem
crescido e, nos últimos anos, muitas aplicações da energia ultrassônica
9
têm sido investigadas quanto ao uso do mesmo afetando diretamente um
processo ou produto (FERNANDES; RODRIGUES, 2012). O tratamento
tem emergido como uma alternativa promissora que faz uso de
fenômenos físicos e químicos fundamentalmente diferentes em
comparação com as técnicas convencionais utilizadas atualmente no
processamento e preservação dos alimentos (YANG et al., 2012).
Este processo proporciona melhorias que vão desde a limpeza de
superfícies, secagem, emulsificação, preservação, homogeneização,
filtração, inativação de microrganismos e enzimas, extração de alguns
compostos, ruptura de células, desgaseificação de alimentos líquidos até
a aceleração da transferência de calor (CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011;
YANG et al., 2012). Seu uso oferece ainda, vantagens em termos de
segurança, rendimento, produtividade e seletividade, tempo de
tratamento, qualidade, riscos físicos e uso de compostos químicos
reduzidos, além de ser ambientalmente amigável (FERNANDES;
RODRIGUES, 2009a; CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011).
O valor nutricional do alimento que é submetido a sonicação pode
sofrer alterações. No entanto, o nível de degradação de compostos
bioativos como os antioxidantes devido à aplicação de US é relativamente
baixo e esta tecnologia pode ser considerada como uma boa alternativa
quando a retenção da qualidade nutricional é uma prioridade
(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).
O US sozinho ou em combinação com o calor e/ou pressão é
eficaz contra várias enzimas pertinentes para a indústria de sucos, tais
como lipoxigenases, peroxidase e polifenoloxidase, bem como as
resistentes ao calor, lipase e protease. A eficácia do US no controle da
atividade enzimática é fortemente influenciada por fatores intrínsecos e
extrínsecos tais como a concentração da enzima, temperatura, pH, e
composição do meio, funcionando melhor quando combinado
(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).
10
Tabela 1 – Efeito do ultrassom em alimentos sonicados (adaptada de
PINGRET; FABIANO–TIXIER; CHEMAT, 2012)
Alimento Analito Observações Referência
Suco de
tomate
Cor e ácido
ascórbico
Modificação da cor e
degradação do ácido
ascórbico
Adekunte et al.
(2010)
Tomate Licopeno Isomerização do
licopeno, com aumento
de 14% nos isômeros
cis e decréscimo de
76% nos trans
Eh; Teoh
(2012)
Sucos de
abacaxi, uva
e cranberry
pH e cor Mudanças em ambos Bermudez–
Aguirre;
Barbosa–
Cánovas
(2012)
Suco de
morango
Antocianinas e
ácido
ascórbico
Redução em ambos Tiwari et al.
(2008)
Suco de
laranja
Ácido
ascórbico e β–
caroteno
Redução em ambos
Vercet; Burgos;
López–Buesa
(2002)
Suco de
melancia
Compostos
minoritários
Degradação de ácido
ascórbico, licopeno e
fenólicos
Rawson et al.
(2011)
Agrião Cor Aumento da cor verde Cruz; Vieira;
Silva (2007)
A cisão das ligações H–O nas moléculas de água e produção de
peróxido de hidrogênio (H2O2) acontecem em meio sonicado, portanto são
importantes, visto que implicam na transformação de espécies químicas.
A este fenômeno de cisão homolítica, deu–se o nome de sonólise da
11
água, o qual leva à produção direta dos radicais livres H● e HO● no meio.
A elevada reatividade dos radicais livres (RL) favorece as interações
destas espécies com íons, moléculas, ou ainda, a associação destes,
gerando novas espécies moleculares, ou ainda, novos RL (KORN;
ANDRADE; BORGES, 2003).
Os RL formados podem atacar as enzimas e destruir pontes de
hidrogênio e interações hidrofóbicas entre as subunidades enzimáticas,
iniciando a sua dissociação e conduzindo à perda da atividade catalítica
(TARUN et al., 2006).
Em frutos, a quantidade de SS também é afetada pelo US se o
mesmo é imerso em água destilada ou numa solução hipotônica
(OLIVEIRA et al., 2010; RODRIGUES et al., 2009; FERNANDES;
RODRIGUES, 2007). Em geral, a perda de SS aumenta com a diminuição
da frequência. A perda total de SS pode ser tão elevada quanto 50%, se o
produto estiver imerso em água destilada por mais de 30 minutos
(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).
Mais estudos são necessários para explorar e avaliar os benefícios
e restrições da aplicação de US no processamento mínimo
(FERNANDES; RODRIGUES et al., 2009b).
2.4 Estresse oxidativo e sistema de defesa
A instalação do estresse oxidativo decorre da existência de um
desequilíbrio entre compostos ou reações oxidantes e antioxidantes, em
favor da geração excessiva de RL ou em detrimento da velocidade de
remoção destes. Tal processo conduz à oxidação de biomoléculas com
consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio
homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial contra
células e tecidos (BARBOSA et al., 2010).
Durante a respiração normal, algumas espécies reativas de
oxigênio (EROs) são produzidas na cadeia de transporte de elétrons, e
através de outras rotas metabólicas em locais distintos, dentro da célula
(Figura 3).
12
Fonte: Bhattacharjee (2005)
Figura 3 – Vias de formação das espécies reativas de oxigênio (EROs)
em células vegetais
Quando os tecidos estão sob condição de estresse, a taxa
respiratória é acelerada e mais EROs são produzidas (CHITARRA;
CHITARRA, 2005). As EROs podem ser divididas em radicais como ânion
superóxido (O2●−), radical hidroxila (HO●), alcooxil (RO●) e peroxil
(ROO●) e em não radicais como oxigênio, peróxido de hidrogênio (H2O2),
ozônio, ácido hipocloroso, etc. (ARORA et al., 2002).
O sistema de defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou
reduzir os danos causados pela ação deletéria dos RL ou das espécies
reativas não radicais. Este tem o objetivo de limitar as espécies reativas
intracelulares e de controlar os danos (BARBOSA et al., 2010). A
peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO, Figura 4) é um dos
principais indicadores dos danos oxidativos e pode ser definida como
resultante da ação dos RL sobre os lipídeos insaturados das membranas
celulares levando à destruição da sua estrutura e até morte das células
(BENZIE, 1996).
13
Fonte: Damodaran, Parkin e Fennema (2010)
Figura 4 – Etapas da oxidação de ácidos graxos (adaptada)
A via de oxidação de ácidos graxos pode ser descrita por três
etapas gerais: iniciação, onde há a abstração de um hidrogênio de um
ácido graxo para formar um radical alquil; propagação, na qual ocorre a
adição de oxigênio ao radical alquil formando o radical peroxil e ainda a
adição de outro hidrogênio (oriundo de outro ácido graxo) a este último
com a formação do hidroperóxido de ácido graxo e também de novos
radicais alquil, estendendo a reação; e, a terminação, onde vai haver a
combinação de dois radicais para a formação de espécies não radicais
(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
Os sistemas antioxidantes são formados por componentes
enzimáticos e não enzimáticos, como as enzimas superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX) e, compostos
fenólicos, carotenoides e ácido ascórbico, respectivamente (BARBOSA et
al., 2010).
14
Os fenólicos são caracterizados por conterem um grupo fenol, ou
seja, uma hidroxila funcional ligada à um anel aromático (Figura 5)
(CHITARRA; CHITARRA, 2005) e englobam desde moléculas simples até
outras com alto grau de polimerização (BRAVO, 1998), estando presentes
nos vegetais na forma livre ou ligados a açúcares e proteínas (CROFT,
1998). Entre os polifenóis, os flavonoides, os ácidos fenólicos, os taninos
e os tocoferóis, destacam–se como os mais comuns encontrados em
frutos e hortaliças (KING; YOUNG, 1999).
Fonte: Taiz e Zeiger (2009)
Figura 5 – Estrutura de um grupo fenol (adaptada)
A atividade antioxidante apresentada por vários produtos vegetais
está correlacionada ao seu conteúdo de compostos fenólicos (VELIOGLU
et al., 1998; KÄHKÖNEN et al., 1999). E esse potencial dos fenólicos
deve–se a sua ação como sequestradores de radicais e algumas vezes
como quelantes de metais (SHAHIDI et al., 1992), eliminando o oxigênio
singlete e triplete e decompondo hidroperóxidos (WANG; BALLINGTON,
2007).
Os flavonoides (Figura 6 e Tabela 2) são fenólicos que englobam
classes de pigmentos naturais cujo esqueleto básico contém 15 carbonos
organizados em dois anéis aromáticos, conectados por uma ponte de três
carbonos (TAIZ; ZEIGER, 2009). As antocianinas e os flavonóis são
compostos que pertencem ao grupo dos flavonoides e são responsáveis
pela coloração que varia de vermelho vivo à violeta e de branco ao
amarelo–claro, respectivamente (BOBBIO; BOBBIO, 1995). Além de
atuarem como pigmentos atrativos, eles participam também no
desenvolvimento e defesa dos vegetais contra o ataque de patógenos
(DIXON; HARRISON, 1990).
OH
15
Os compostos fenólicos em suco de amora não foram degradados
por US segundo estudo feito por Wong, Vaillant e Perez (2010), bem
como, antocianinas de suco de morango que também não foram
degradadas após sonicação (TIWARI et al., 2009).
Fonte: Taiz e Zeiger (2009)
Figura 6 – Estrutura de um flavonoide (adaptada)
Tabela 2 – Atividade antioxidante de alguns flavonoides (adaptada de
GONZALO; ALONSO, 2002)
Flavonoide Capacidade antioxidante total em
equivalentes de trolox*
Quercetina 4,7
Epigalocatequina 3,8
Catequina 2,4
Luteolina 2,1
Kaempferol 1,3
* concentração mM trolox que tem capacidade antioxidante igual a 1 mM da substância
em estudo.
A quercetina, o kaempferol, e a miricetina, de acordo com Gonzalo
e Alonso (2002), são os flavonoides mais conhecidos em frutos. Todavia,
Azevedo (2006) constatou a epicatequina como o majoritário em mangas
‘Tommy Atkins’.
Os carotenoides (Figura 6) são pigmentos tetraterpenóides, de 40
carbonos unidos por unidades opostas no centro da molécula,
responsáveis pelas cores do amarelo ao vermelho e que desempenham
um papel fundamental na saúde humana como precursores da vitamina A
(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
16
Fonte: Rodrigues–Amaya (2001)
Figura 7 – Estrutura de um carotenoide/β–caroteno (adaptada)
Os carotenoides acumulam–se em cloroplastos como uma mistura
de α e β–carotenos, β–criptoxantina, luteína, zeaxantina, violaxantina e
neoxantina, estando complexados não covalentemente com proteínas
(UENOJO; MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007) e desempenhando
importantes funções na fotossíntese e na fotoproteção (DAMODARAN;
PARKIN; FENNEMA, 2010), susceptíveis a isomerização e oxidação. Em
mangas cv. Tommy Atkins, a violaxantina aparece como carotenoide
majoritário (RODRIGUES–AMAYA; KIMURA; AMAYA–FARFAN, 2008).
Quando os frutos são processados, há a liberação de ácidos
orgânicos que pode provocar a isomerização dos carotenoides, pois estes
são altamente insaturados, causando alterações na cor (MATTIETTO;
LOPES; MENEZES, 2010).
A vitamina C é uma das vitaminas mais importantes para a nutrição
humana e tem o ácido L–ascórbico como sua principal forma
biologicamente ativa (HERNÁNDEZ; LOBO; GONZÁLEZ, 2006), cuja
fórmula química é C6H8O6 (Figura 8), atua como um antioxidante e, por
conseguinte, oferece alguma proteção contra o estresse oxidativo e
doenças relacionadas (DIPLOCK et al., 1998).
A manga pode ser considerada uma fonte de vitamina C
(JERONIMO et al., 2007). Porém, o processamento mínimo favorece a
degradação desta vitamina porque, além do corte aumentar a respiração
dos frutos, fazendo com que os ácidos orgânicos sejam utilizados no seu
metabolismo, há também a oxidação da mesma pelo aumento da
superfície de exposição e o contato com enzimas que podem degradá–la.
Como o US provoca a formação de RL (KORN, ANDRADE,
BORGES, 2003), o ácido ascórbico oriundo do fruto, pode reagir com os
mesmos resultando em sua degradação. Cao et al. (2012), porém, não
17
observaram modificações no conteúdo de vitamina C no dia da aplicação
do US em morangos, assim como Cheng et al. (2007) ao estudar suco de
goiaba sonicado.
Fonte: Fiorucci (2003)
Figura 8 – Estrutura do ácido ascórbico
O nível de degradação de antioxidantes devido à aplicação de US
é relativamente baixo e a tecnologia de processamento com US pode ser
considerada uma técnica alternativa potencial quando a retenção da
qualidade nutricional é uma prioridade (FERNANDES; RODRIGUES,
2012).
As enzimas antioxidantes são responsáveis, em conjunto com os
antioxidantes não enzimáticos, pela conservação pós–colheita dos frutos
combatendo as EROs que causam a deterioração e senescência dos
tecidos. Todavia, a ação das mesmas pode resultar em reações que
levam ao escurecimento e ocasionam a perda da qualidade visual e
nutricional. Essas enzimas estão relacionadas à comercialização e vida
útil dos frutos, pois suas atividades vão refletir diretamente na qualidade
dos mesmos, principalmente nos MP, cuja superfície de exposição e
descompartimentalização foram aumentadas, favorecendo as reações
degradativas.
A catalase (CAT, EC 1.11.1.6) é uma enzima envolvida na
detoxificação e na proteção contra o estresse oxidativo (FARR; KOGOMA,
1991) participando da remoção de peróxidos, mais especificamente,
convertendo o H2O2 em água e oxigênio molecular:
H2O2 H2O + O2
18
Podem ser divididas em três classes: I – removem o H2O2
produzido durante a fotorrespiração em tecidos fotossintéticos; II –
produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma função de
lignificação, mas sua exata função biológica permanece desconhecida; e
III – presentes abundantemente em sementes e plantas jovens, cuja
atividade está relacionada à remoção do H2O2 produzido durante a
degradação dos ácidos graxos nos glioxissomo (BREUSEGEM et al.,
2001).
A dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1) é uma
metaloenzima com três classes dependendo do cofator metálico (Mn, Fe,
ou CuZn) que desempenha um papel essencial na proteção contra o
estresse oxidativo (SANTOS et al., 2000; MORAN et al., 2003), pois
catalisa a dismutação do radical superóxido (O2● −) a H2O2:
O2● − + O2
●− + 2H H2O2 + O2
As plantas, normalmente, têm Cu/Zn–SOD no citosol, Cu/Zn e/ou
Fe−–SOD no cloroplasto e Mn–SOD na mitocôndria (BAKER; ORLANDI,
1995).
As Peroxidases (G–POD, EC 1.11.1.7 e APX, EC 1.11.1.1) de
plantas são heme proteínas que podem estar ligadas covalentemente à
membrana (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Essas enzimas
catalisam reações redox usando o H2O2 como aceptores de hidrogênio
retirado de diferentes substratos como ácido ascórbico (APX), aminas
aromáticas e fenólicos como o guaiacol (G–POD). A remoção do H2O2
evita a formação do oxigênio singlete pela reação com o O2. A APX em
suco de melão foi inativada após tratamento com US (FONTELES et al.,
2012).
Especificamente para a G–POD, sua ação antioxidante se
confunde com a produção de substâncias que resultam no escurecimento
dos tecidos.
19
A reação geral de peroxidação, que resulta em escurecimento é a
que segue:
2 AH (doador de elétron) + H2O2 2H2O + 2A●
No caso de AH ser o guaiacol, haverá adição de radicais livres em
2A● (polimerização), resultando em tetrâmeros, marrons (Figura 8).
Fonte: Fatibello–Filho e Vieira (2002)
Figura 9 – Reação catalisada pela enzima G–POD na qual a mesma
converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol
Outra enzima envolvida com o escurecimento oxidativo é a
polifenoloxidase (PPO, EC 1.14.18.1) que atua sobre os compostos
fenólicos, causando a sua oxidação a quinonas na presença de O2
(CHITARRA, CHITARRA, 2005). Essas enzimas pertencem ao grupo das
óxido–redutases e contém cobre como grupo prostético sendo
classificadas de acordo com o substrato utilizado: fenolase, catecolase,
tirosinase, cresolase ou difenolase (CHITARRA, CHITARRA, 2005) e
assim, mediar as reações a seguir (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA,
2010):
monofenol + O2 + 2H+ o–difenol + H2O
o–difenol + ½ O2 o–quinona + H2O
A ação da enzima não forma pigmentos marrons diretamente. As
quinonas resultantes (que já são compostos escuros) podem ainda
20
sofrem reações de condensação química (envolvendo aminas e
proteínas) gerando macromoléculas escuras chamadas de “melaninas”
(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Assim, o escurecimento
enzimático dos tecidos vegetais depende do tipo de substrato,
concentração e localização e também do tipo de polímero formado a partir
da quinona (CHITARRA; CHITARA, 2005).
Acredita–se que o papel das PPOs em plantas seja de defesa
contra pestes e patógenos (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
Em tecidos vivos, a enzima e o seu substrato fenólico estão separados
dentro das células. Quando há um dano na célula, os mesmos entram em
contato, ocorrendo então a reação, o que acarreta também, além do
escurecimento, a diminuição do valor nutritivo do produto (ESCRIBANO et
al., 1997).
Ndiaye et al. (2009) ao estudarem mangas minimamente
processadas branqueadas com vapor, demonstraram a inativação
completa da POD e PPO seguidos, porém, de um alto índice de
escurecimento
Fonteles et al. (2012) avaliaram o efeito da sonicação nas enzimas
POD e PPO em suco de melão. De acordo com os autores, houve um
aumento na atividade da POD em baixos tempos de processamento, por
outro lado a PPO diminuiu. Ao contrário, Cheng et al. (2007) verificaram
um aumento na atividade da PPO em suco de goiaba tratado com US.
Jang e Moon (2011) demonstraram que o US não inibiu a atividade
monofenolásica e estimulou a difenolásica da PPO em maçãs MP.
Outra enzima envolvida com respostas às condições estressantes
é a fenil amônia liase (do inglês PAL, EC 4.3.15), pois é a primeira enzima
da rota de síntese de compostos fenólicos, os quais participam
diretamente dos vários mecanismos de defesa das plantas. Quando um
vegetal é exposto a condições adversas de temperatura, danos
mecânicos conteúdo hídrico, luz e ataque de patógenos, a síntese de
metabólitos secundários de defesa como os fenólicos é ativada
(SREELAKSHMI; SHARMA, 2008).
21
A rota do ácido chiquímico converte os carboidratos derivados da
glicólise e da via das pentoses–fosfato em fenilalanina que é a precursora
dos fenólicos. Assim, a PAL está situada em um ponto de ramificação
entre o metabolismo primário e o secundário (TAIZ; ZEIGER, 2009), pois
catalisa a desaminação da fenilalanina com produção de ácidos trans–
cinâmico, sendo uma etapa reguladora importante na formação de muitos
compostos fenólicos (DIXON; PAIVA, 1995), tais como: ácidos cumárico,
caféico, ferrúlico e clorogênico, antocianinas, etc. (CHITARRA;
CHITARRA, 2005).
A atividade da PAL parece ser extremamente sensível ao estado
fisiológico da planta, (SREELAKSHMI; SHARMA, 2008) o seu aumento
indica condições de estresse dos tecidos, seja pela ação de agentes
bióticos ou não. No processamento mínimo de banana, o corte induziu a
aumentos significativos na atividade da PAL, bem como acúmulo de
compostos fenólicos (CHEN et al., 2009) que contribuem para o
escurecimento dos tecidos (KLAIBER et al., 2005). Assim, na prática, os
tratamentos que interferem com o aumento da atividade PAL ou com a
síntese e acumulação de compostos fenólicos reduzem a descoloração
de produtos MP (PEISER et al., 1998).
Na avaliação da injúria pelo frio em mangas íntegras armazenadas
sob baixas temperaturas, a atividade da PAL foi bem maior na casca que
na polpa dos frutos (CHIDTRAGOOL et al., 2011).
É difícil identificar o mecanismo de inativação enzimática específica
durante a sonicação. Pode ser devido a um singular ou combinação de
vários efeitos químicos e físicos que ocorrem simultaneamente
(O’DONNELL et al., 2010).
2.5 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal
A firmeza dos frutos depende diretamente da integridade da
membrana plasmática e da parede celular, cujas primárias, típicas das
polpas, são formadas por esqueleto de microfibrilas de celulose imerso
em uma matriz de pectina e hemicelulose, glicoproteínas e água (KNEE,
22
2002). As secundárias, mais espessas e resistentes, são depositadas
quando a maior parte do crescimento está concluída, sendo sua
resistência e rigidez associadas à lignina (TAIZ; ZEIGER, 2009).
As pectinas, também presentes na lamela média (KASHYAP et al.,
2001), têm estruturas complexas, mas a maior parte consiste em
homopolímeros de resíduos de ácido D–poligalacturônico unidos por
ligações α (1→4). Alterações na composição péctica podem ocorrer
devido à modificação química desses compostos como a β–eliminação ou
por ação de enzimas hidrolíticas endógenas, as quais degradam pectina,
como a pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG) (VERLENT
et al., 2004).
A PME (EC 3.1.1.11) catalisa a remoção de ésteres metílicos da
pectina (ANTHON, 2002; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010),
resultando na liberação de metanol e aumento do número de grupos
carboxilas (ANTHON, 2002), tornando a molécula parcialmente
desesterificada. Este processo, por si só não tem impacto direto sobre a
viscosidade do meio, no entanto, o grau mais baixo de esterificação da
molécula, torna–a um melhor substrato para a PG (PRESSEY; AVANTS,
1982). Se por um lado, a PME reforça a ação de PG hidrolisando as
ligações glicosídicas α (1→4) das cadeias de ácido poligalactorônico, por
outro lado, sabe–se que a pectina sob a forma desmetilada pode ligar–se
a íons de Ca2+ para formar pectato de cálcio formando redes de gel, como
aumentando a resistência ao ataque da PG e, assim, ajudar a preservar,
e até aumentar a firmeza do produto (PRESSEY; AVANTS, 1982;
PORRETA, 1996).
A PG (EC 1.2.1.15) cliva o ácido poligalacturônico reduzindo o
comprimento médio das cadeias de pectina (ANTHON, 2002; UENOJO;
PASTORE, 2007) causando uma degradação estrutural (KERTESZ,
1951). É a principal enzima com função hidrolítica da parede celular.
Terefe et al. (2009) demonstraram, ao estudar a inativação da PME
de suco de tomate sonicado, que o tratamento combinado de US e calor
melhora a inativação da enzima, sendo mais eficiente que o tratamento
térmico sozinho. Raviyan, Zhang e Feng (2005) também relataram um
23
aumento na taxa de inativação da PME em extrato bruto de tomate sob
termosonicação, em comparação apenas ao tratamento térmico.
Já ao estudar a inativação da PG de suco de tomate, Terefe et al.
(2009) perceberam que as diferentes isoformas são inativadas em taxas
distintas, atribuído a sinergia entre o calor e o US.
A viscosidade muito mais elevada do meio (por ex. suco de tomate)
resulta em menos cavitação e consequentemente, um efeito do US
menos pronunciado sobre a enzima (VERCET et al., 2002). Diferentes
componentes do suco, incluindo pectina, pode também agir como protetor
sobre a enzima (WHITAKER, 1972).
O US de baixa frequência faz com que ocorra a inativação de
enzimas por várias formas: aumento localizado de temperatura e pressão,
que acompanham o colapso das bolhas de cavitação; uma forte força de
cisalhamento e choques criados por bolhas estáveis e geração de radicais
livres, que oxidam resíduos de aminoácidos importantes para a
estabilidade e atividade catalítica (SALA et al., 1995). A sonicação pode,
ainda, causar a degradação de proteínas oligoméricas (TEREFE et al.,
2009).
24
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Foram utilizadas mangas (Mangifera indica L.) da cultivar Tommy
Atkins no estádio maduro, segundo a escala de padronização
estabelecida por GTZ (1992), obtidas no comércio varejista local da
cidade de Fortaleza–CE. Selecionadas ainda quanto à uniformidade de
cor da casca, forma e tamanho.
3.2 Métodos
3.2.1 Processamento mínimo e tratamento com US
Os frutos foram primeiramente lavados com sabão neutro em água
corrente para a retirada de sujidades aderidas à casca e sanitizados em
solução 150 ppm de hipoclorito de sódio. Então, foram mantidos em
geladeira a 10 oC (previamente sanitizada) pelo período de uma noite,
com a finalidade de diminuir as injúrias durante o processamento. Após
descasque, os frutos foram cortados longitudinalmente e em seguida
fatiados, desprezando–se a semente (Figura 10). As fatias foram, então,
imersas em solução sanitizante de hipoclorito de sódio 5 ppm durante 2
minutos (BASTOS, 2006a) e a água drenada. O fluxograma com as
etapas de processamento, adaptado de acordo com Moretti (2007), está
apresentado na Figura 11.
Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos
Figura 10 – Manga cv. Tommy Atkins MP
25
Fonte: Moretti (2007)
Figura 11 – Fluxograma de processamento mínimo e tratamento com US
de manga ‘Tommy Atkins’ (adaptada)
Recepção
Enxágue com água
fria clorada
Processamento
Lavagem com
água e detergente
neutro
Sanitização com
água clorada e
drenagem
Embalagem
Resfriamento
Armazenamento a
4 °C
Tratamento com
US
26
Os frutos controle correspondentes ao tempo zero e não
submetidos ao US foram imediatamente homogeneizados em Ultra
Turrax® (IKA, modelo T25), diluídos em água destilada (1:1) e a polpa
congelada. Já os frutos controle do tempo sete dias foram submetidos às
mesmas condições daqueles tratados, até as análises.
Os demais frutos processados receberam o tratamento, que se deu
pela alocação das fatias de manga, escolhidas aleatoriamente, em um
Becker com água destilada (na proporção de 1:4) e submetidas ao banho
de US (Marconi, modelo USC 1450) na frequência de 25 kHz por 30
minutos. Após o tratamento com US, as fatias foram drenadas e
acondicionadas em bandejas de poliestireno expandido (isopor), cobertos
com filme de policloreto de polivinila (PVC) e armazenados por sete dias
em refrigeração (4 oC), simulando a armazenagem comercial.
Para definir os parâmetros utilizados neste estudo foram realizados
ensaios preliminares com 10, 20 e 30 minutos de exposição ao US (25
kHz). As fatias de manga foram avaliadas no dia de tratamento e após
sete dias de armazenamento refrigerado a 4 oC, quanto a cor, firmeza,
umidade, perda de água e de sólidos solúveis. Os melhores resultados
foram para o tratamento com US por 30 minutos (dados não mostrados).
3.2.2 Avaliações físicas e físico–químicas
3.2.2.1 Potencial hidrogeniônico (pH)
O pH foi medido através de processo eletrométrico, pelo uso de
pHmetro digital (Bel Engineering, modelo W3B) de acordo com AOAC
(1995).
3.2.2.2 Acidez titulável (AT)
A acidez das amostras foi determinada por processo volumétrico,
através de titulação (IAL, 1985). Aproximadamente, 1 g da amostra foi
pesado e diluído em 50 mL de água destilada, sendo então titulado com
27
NaOH 0,1N, utilizando–se fenolftaleína 1% como indicador. A titulação
procedeu até a mudança da cor da solução para levemente róseo. Os
resultados foram calculados de acordo com a equação 1 e expressos em
termos de percentagem de ácido cítrico.
(1) AT = 10 x Fa x Fb x Vb / Pa
Onde, Fa = fator do ácido málico; Fb = fator do NaOH; Vb = volume de
NaOH gasto na titulação; Pa = peso da amostra.
3.2.2.3 Sólidos solúveis (SS)
Os sólidos solúveis foram determinados por medida direta em
refratômetro digital portátil (Quimis, modelo Q7670145).
3.2.2.4 Conteúdo de açúcares totais e redutores
O açúcares totais e redutores foram quantificado pelos métodos da
Antrona (YEMN; WILLIS, 1954) e do Ácido 3,5–Dinitro–Salicílico, DNS
(MILLER, 1959), respectivamente.
Para a análise de açúcares totais, 5 g da polpa foram pesados e
diluídos em 50 mL de álcool etílico 80%. O conteúdo foi homogeneizado,
filtrado e em seguida, uma alíquota de 1 mL foi diluída em 50 mL de água
destilada. Em microtubos, o meio reacional constava de 50 µL da
segunda diluição e 200 µL de água destilada, que permaneceram em
banho de gelo até a adição de 500 µL do reagente de Antrona. Após
agitação, os microtubos foram colocados imediatamente em Banho–Maria
por 8 minutos a 100 oC, seguidos de resfriamento em banho de gelo para
paralisar a reação. Posteriormente, a absorbância foi medida a 620 ηm e
os cálculos se basearam em uma curva padrão de glicose sendo
expressos em g/kg massa fresca (MF).
Para a análise de açúcares redutores, 5 g da polpa foram pesados
e diluídos em 50 mL de água destilada. Após homogeneização e
filtragem, 75 µL da amostra, 75 µL de água destilada e 100 µL de DNS
28
foram adicionados em microtubos e homogeneizados, sendo mantidos em
Banho–Maria por 5 minutos a 100 oC. Decorrido o tempo, o material foi
resfriado em banho de gelo para paralisar a reação. Em seguida, aos
tubos foram adicionados 75 µL de água destilada. Após homogeneização,
a absorbância foi medida a 540 ηm e os cálculos se basearam em uma
curva padrão de glicose sendo expressos em g/kg MF.
3.2.2.5 Cor
As medições de cor foram realizadas com um colorímetro digital
(Konika Minolta, modelo CR–410), utilizando as coordenadas cilíndricas
do sistema e o espaço de cor L, C e ângulo hue.
3.2.2.6 Firmeza
Para medir a firmeza das amostras foi utilizado um texturômetro
automático de bancada (Brookfield, modelo CT3 25K) acoplado a um
computador. A ponteira de prova empregada foi a de 2 mm. Os resultados
foram obtidos em grama–força e convertidos para Newton.
3.2.2.7 Umidade em base seca
A umidade em base seca foi avaliada por secagem das amostras
em estufa a 60 oC por 24 horas, de acordo com o método 934.06 da
Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1990). E calculada de
acordo com as equações 2 e 3, respectivamente:
(2) U = Pi – Pfe (para amostras controle)
(3) U = P US – Pfe (para amostras tratadas)
Onde, Pi = peso inicial da amostra; Pfe = peso final da amostra após a
estufa; P US = peso da amostra após tratamento com US.
29
3.2.2.8 Perda de água e de sólidos
As amostras foram pesadas antes e após o tratamento e a
percentagem de perda de água (PA) e sólidos (PS), foram calculadas
pelas equações 4 e 5, respectivamente:
(4) PA = 100 x (Pi – P US) / Pi
(5) PS = 100 x (X controle – X US) / X controle
Onde, PA = perda de água; Pi = peso inicial da amostra; P US = peso da
amostra após tratamento com US; PS = perda de sólidos; X controle =
sólidos na amostra controle; X US = sólidos na amostra tratada com US.
3.2.2.9 Conteúdo de proteína solúvel total
A quantificação das proteínas solúveis totais foi realizada de
acordo com a metodologia de Bradford (1976), onde 10 µL de extrato
reagiram com 100 µL do reagente de Bradford, com posterior leitura na
absorbância de 595 ηm. A atividade de todas as enzimas se baseou no
conteúdo de proteínas totais de cada extrato.
3.2.3 Sinalizadores de estresse oxidativo
3.2.3.1 Atividade da enzima fenil alanina amônia–liase (PAL)
Tanto a obtenção dos extratos quanto a determinação da atividade
da PAL foram baseadas em modificações dos métodos originalmente
descritos por Mori, Sakurai e Sakuta (2001) e El–Shora (2002),
respectivamente. Para o extrato, 3 g de polpa foram homogeneizados em
3 mL de tampão Tris–HCl 100 mM (pH 8,4) e em seguida, centrifugados a
10.192 g por 10 minutos a 4 oC, sendo o sobrenadante utilizado como
extrato. Todos os passos subsequentes foram realizados a 4 oC.
Esta enzima atua catalisando a desaminação não oxidativa da
fenilalanina tendo como produto ácido trans–cinâmico e amônia, sendo
30
uma enzima–chave entre o metabolismo primário e o secundário. Para a
determinação da atividade enzimática o meio de reação foi composto por
3,5 µL de β–mercaptoetanol, 16,5 µL do extrato, 96,5 μL do tampão Tris–
HCl 100 mM (pH 8,4) e 33,5 µL de L–fenilalanina 40mM. A amostra foi
incubada por 1 hora na temperatura de 30 oC e em seguida, a
absorbância lida a 290 ηm. Para os cálculos, foi utilizado o fator de 0,94 e
os resultados dados em ηmol de ácido trans–cinâmico/h/mg P.
3.2.3.2 Grau de peroxidação lipídica
A determinação da peroxidação dos lipídios de membranas
biológicas foi feita conforme método descrito por Zhu et al. (2008), com
base na formação do malondialdeído (MDA), produto secundário da
oxidação de ácidos graxos polinsaturados, que ao reagir com o ácido
tiobarbitúrico (do inglês, TBA) pode ser lido por espectrofotometria.
Para a análise, 2 g de polpa foram centrifugados com 10 mL de
ácido tricloroacético 0,1% (do inglês, TCA), na rotação de 3.248 g por 20
minutos a 4 oC. Foram adicionados, 75 µL do sobrenadante e 300 µL de
uma solução com TCA 20% e TBA 0,5% seguido de agitação e
aquecimento por 30 minutos a 95 oC. Decorrido o tempo da reação, a
mesma foi paralisada quando os tubos foram transferidos para banho de
gelo. Uma nova centrifugação, então, foi realizada a 3.000 g por 10
minutos. A absorbância do sobrenadante foi lida em 532 e 600 ηm
gerando absorbâncias específica e não específica, respectivamente. Os
cálculos foram obtidos utilizando o coeficiente de extinção molar do MDA
de 155 mM/cm e expressos em ηmol MDA/g MF.
3.2.3.3 Conteúdo peróxido de hidrogênio (H2O2)
A quantificação do H2O2 foi feita conforme descrito por Sergiev,
Alexieva e Karanova (1997). Onde, 0,5 g da polpa foram macerados com
TCA 5% por 5 minutos, em banho de gelo. Em seguida o material foi
centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4 oC. No escuro, uma alíquota
31
de 20 µL do sobrenadante foi então adicionada a 20 µL de tampão fosfato
de potássio 10 mM, pH 7, e a 40 µL de iodeto de potássio 1M. A mistura
foi deixada, ainda em ambiente sem luz, reagindo durante uma hora.
Passado o tempo, a leitura foi feita a 390 ηm e os cálculos, baseados em
uma curva padrão de H2O2, foram expressos em µmol H2O2/g MF.
3.2.4 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total
3.2.4.1 Antocianinas totais e flavonoides amarelos
A avaliação se baseou na metodologia de Francis (1982). Em um
graal, 1 g de polpa e 5 mL de solução etanol–HCl (1,5 M) foram
homogeneizados durante 5 minutos. Em seguida, o conteúdo foi
transferido para um balão de 10 mL e o volume aferido com a mesma
solução. Em frasco escuro, o conteúdo do balão ficou em repouso por
uma noite, sendo em seguida filtrado e a absorbância medida a 535 ηm
para antocianinas e 374 ηm para flavonoides amarelos. Para os cálculos,
foram utilizados os coeficientes de extinção molar de 76,6 e 98,2 M/cm,
para flavonoides amarelos e antocianinas totais, respectivamente. Os
resultados foram expressos em mg/kg MF.
3.2.4.2 Polifenóis extraíveis totais (PET)
A quantificação dos PET se deu através do método de Folin–
Ciocalteu descrito por Obanda e Owuor (1997) e modificado por Rufino et
al. (2006). Para a obtenção do extrato (LARRAURI et al., 1997), 5 g de
polpa foram pesados e receberam 4 mL de metanol 50%. Após
homogeneização, os tubos permaneceram em repouso na ausência de
luz e em temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, foram
centrifugados a 4.677 g por 30 minutos a 4 oC, sendo o sobrenadante
filtrado e recolhido para um balão volumétrico de 10 mL. Ao resíduo da
centrifugação foi adicionado mais 4 mL de acetona 70% que foi
homogeneizado e deixado em repouso, centrifugado e recolhido nas
32
mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, o balão
volumétrico foi completado com água destilada constituindo o extrato de
análise.
Em microtubos mantidos no escuro, foram adicionados nesta
ordem: 100 µL do extrato, 650 µL de água destilada, 250 µL do reativo de
Folin–Ciocalteau e 500 µL de carbonato de sódio anidro 20%. Após
homogeneização, os tubos ficaram descansando por 30 minutos
protegidos da luz e na temperatura ambiente. A leitura aconteceu em
leitor de microplacas na absorbância de 700 ηm. Os resultados,
calculados com base em uma curva padrão de ácido gálico, foram
expressos em mg de equivalente à ácido gálico (EAG)/kg MF.
3.2.4.3 Carotenoides
O método descrito por Lichtenthaler e Wellburn (1983) foi utilizado
para esta análise. No escuro, 2 g da polpa foram macerados em banho de
gelo por 5 minutos, com 0,2 g de carbonato de cálcio e 7 mL de acetona
80%. O extrato foi filtrado diretamente num balão volumétrico âmbar de
25 mL. Uma alíquota foi retirada e lida nas absorbâncias de 470, 646 e
663 ηm. Para os cálculos foram utilizadas as seguintes equações:
(6) Clorofila a (µg/mL) = 12,21 x (A663) – 2,81 x (A646)
(7) Clorofila b (µg/mL) = 20,13 x (A646) – 5,03 x (A663)
(8) Carotenoides (µg/mL) = (1000 x (A470) – 3,27 x [clorofila a] – (104 x
[clorofila b]) / 227
Onde, A663, A646 e A470 = absorbâncias a 663, 646 e 470 ηm,
respectivamente.
Os resultados foram expressos em mg/kg MF.
3.2.4.4 Vitamina C total
A análise do conteúdo total de vitamina C foi feita de acordo com
Strohecker e Henning (1967). Na ausência de luz, 1 g de polpa foi
33
adicionado a 50 mL de ácido oxálico 0,5% (refrigerado) e uma alíquota de
5 mL foi colocada em um erlenmeyer completando–se o volume com
água destilada até 50 mL. Procedeu–se, então, a titulação com a solução
de Tillman refrigerada, até ponto de viragem, representado pela cor róseo
clara, persistente por 15 segundos, quando o reagente é reduzido de azul
a incolor tornando–se róseo em meio ácido. Os resultados foram
expressos em mg ácido ascórbico/kg MF.
3.2.4.5 Capacidade antioxidante total
Para a determinação da capacidade antioxidante total (do inglês,
TEAC – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) foi seguido o método da
captura do radical ABTS•+ descrito originalmente por Re et al. (1999) e
modificado por Rufino et al. (2006). A análise baseou–se na captura do
radical 2,2’–azinobis (3–etilbenzotiazolina–6–ácido sulfônico) (ABTS●+),
formado da reação entre uma solução ABTS 7 mM com uma solução de
persulfato de potássio 140 mM, mistura a qual foi mantida no escuro e em
temperatura ambiente por 16 horas antes do seu uso. A solução de
ABTS●+ resultante foi diluída em álcool etílico P.A. para a absorbância de
0,700 ± 0,020 em 734 ηm. O radical foi utilizado nesta faixa de
absorbância.
O extrato analisado foi obtido da mesma forma que o utilizado na
análise de PET, contudo, partindo de 25 g de polpa para um balão de 25
mL, em três diferentes concentrações. Em ambiente escuro, foi
adicionado em microplaca, uma alíquota de 3 μL do extrato e 300 µL da
solução ABTS●+. Após 6 minutos de descanso a absorbância foi lida na
absorbância de 734 ηm.
Uma curva padrão construída a partir do composto de referência 6–
hidroxi–2,5,7,8–tetrametilchroman–2–ácido carboxílico (trolox) foi utilizada
para avaliar a TEAC. Partindo desta curva, foi obtida uma equação, a
partir da qual se calculou a absorbância referente a 1000 µM de trolox.
Os resultados foram apresentados em capacidade antioxidante
equivalente ao trolox correspondente a µM de trolox/g MF.
34
3.2.5 Enzimas antioxidantes
Os extratos enzimáticos foram preparados a partir de uma
modificação no protocolo descrito por Yang, Zheng e Cao (2009). A
amostra (1 g) foi adicionada a 5 mL de tampão gelado Tris–HCl 0,05M,
pH 8 contendo EDTA 0,1mM e macerada durante 5 minutos, seguido de
filtração em tecido de náilon de malha fina. O filtrado foi mantido em
repouso por uma hora a 4 oC, período no qual foram realizadas agitações
ocasionais. Decorrido o tempo, o homogeneizado foi transferido para
microtubos e centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4 oC. O
sobrenadante constituiu o extrato enzimático para a determinação da
atividade das enzimas antioxidantes e da peroxidase do guaiacol (G–
POD). Todos as etapas a seguir foram realizadas a 4 oC.
3.2.5.1 Atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A análise da APX tem como base a reação que ela catalisa, onde
H2O2 e ascorbato são convertidos em água e monodeidroascorbato. Foi
realizada utilizando o princípio proposto por Nakano e Asada (1981), onde
o ácido ascórbico é oxidado durante a degradação de H2O2. A reação
constituiu–se de 100 µL de tampão fosfato de potássio 0,05 M com EDTA
0,05 mM (pH 6,0), 30 µL de extrato, 10 µL de H2O2 0,03M e 10 µL de
ascorbato 0,015M. As leituras foram realizadas a cada minuto durante 20
minutos, na absorbância de 290 ηm. Para os cálculos, tomou–se por base
o coeficiente de extinção molar do ascorbato (2,8 mM/cm) e a atividade foi
expressa como μmol H2O2/min/mg proteína (P), considerando que são
necessários 2 mols de ácido ascórbico para reduzir 1 mol de H2O2
(AMANKO; CHEN; ASADA, 1994).
35
3.2.5.2 Atividade da catalase (CAT)
A atividade da CAT está relacionada à degradação de H2O2. Para
medir a atividade desta enzima foi utilizado o método de Beers e Sizer
(1952). O meio reacional foi composto de 120 µL de tampão fosfato de
potássio 0,1 M com EDTA 0,1 mM (pH 7), 10 µL de H2O2 0,5M e 20 µL de
extrato. A leitura foi feita a cada minuto, a 240 ηm, num intervalo de 20
minutos. Para os cálculos foi utilizado o coeficiente de extinção molar do
H2O2 (36 M/cm) e os mesmos foram expressos em µmol H2O2/min/mg P.
3.2.5.3 Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A determinação da atividade da SOD (GIANNOPOLITIS; RIES,
1977), baseia–se na reação da riboflavina com o oxigênio molecular (O2)
que na presença da luz reage com o nitro azul de tetrazólio (NBT),
resultando na formação de formanzana, um produto colorido que pode ser
monitorado espectrofotometricamente. Para a marcha analítica, em
microplaca e no escuro, foram adicionados 100 µL de tampão fosfato de
potássio 0,05 M com EDTA 0,1 mM e metionina 19,5 mM (pH 7,8), 5 µL
de extrato, 15 µL de NBT 750 µM e 30 µL de riboflavina 10 µM,
obedecendo esta ordem. A mistura reacional foi transferida para uma
câmara com luz fluorescente de 20 W, onde permaneceu por 15 minutos.
Foram utilizados dois tipos de branco, o “claro” que consistia de
todos os reagentes com substituição do extrato por água destilada, que foi
incubado nas mesmas condições da amostra e o “escuro”, o qual foi
preparado igual ao branco “claro”, porém, não foi submetido à presença
da luz. Após o período de reação na presença da luz, procedeu–se com
as leituras de absorbância a 560 ηm. O branco “escuro” foi utilizado para
zerar o equipamento. De acordo com Beauchamp e Fridovich (1971) uma
unidade de atividade (UA) foi definida como a quantidade de enzima
necessária para inibir em 50% a fotorredução do NBT. A atividade
específica foi expressa como UAE/mg P.
36
3.2.6 Enzimas responsáveis pelo escurecimento
O extrato enzimático para a determinação da PPO foi preparado
segundo método (modificado) descrito em 1998, por Sojo, Nuñez–
Delicado e García–Carmona. Em graal imerso em gelo, foram adicionados
10 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M contendo 4% de Triton X–110
(pH 6,1), 1 g de polpa e 0,02 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP). A
solução foi macerada por 5 minutos até apresentar–se homogênea e
então, centrifugada a 4.993 g por 40 minutos a 4 oC. O precipitado foi
descartado e o sobrenadante foi transferido para Banho–Maria a 37 oC
por 10 minutos seguidos de centrifugação a 1.630 g por 20 minutos a 4 oC. Todos os passos a seguir foram realizados a 4 oC. O extrato para a a
análise da G–POD foi o mesmo utilizado para as enzimas antioxidantes.
3.2.6.1 Atividade da polifenoloxidase (PPO)
A determinação da atividade desta enzima (Robinson, 1987) se
deu com 80 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6), 100 µL de
extrato e 5 µL do substrato pirocatecol 0,1 M. A amostra foi incubada por
30 minutos a 30 oC. A absorbância foi medida a 395 ηm, uma unidade de
atividade enzimática (UAE) foi definida como a variação de 0,001 na
absorbância e os resultados expressos como UAE/min/mg P.
3.2.6.2 Atividade da peroxidase do guaiacol (G–POD)
A atividade da G–POD, que está relacionada à degradação do
guaiacol na presença de H2O2 formando o tetraguaiacol, foi mensurada
conforme descrito por Amanko, Chen e Asada (1994). Foram adicionados,
em microplaca, 90 µL de tampão fosfato de potássio 0,1 M com EDTA 0,1
mM (pH 7), 50 µL de guaiacol 0,02 M, 50 µL de H2O2 e 10 µL do extrato
sendo incubados a 30 oC e sua absorbância medida em 470 ηm após 1 e
10 minutos. Para os cálculos foi utilizado o coeficiente de extinção molar
37
do tetraguaiacol (26,6 mM/cm) e os resultados foram dados em µmol
H2O2/min/mg P.
3.2.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal
A extração enzimática para a determinação da
pectinametilesterase (PME) foi feita pela homogeneização de 5 g de polpa
em 20 mL de NaCl 0,2 M gelado. A solução resultante foi filtrada em papel
de filtro quantitativo e o filtrado utilizado como extrato enzimático
(KÖRNER; ZIMMERMANN; BERK, 2006).
O extrato para poligalacturonase (PG) foi preparado segundo o
método de Pressey e Avants (1973), no qual 12,5 g de polpa foram
pesados e homogeneizados com 25 mL de água destilada e depois
centrifugados a 3.248 g durante 10 minutos a 4 oC. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 10 mL de água, seguido de
centrifugação nas mesmas condições já descritas. Esse procedimento foi
realizado duas vezes. O último precipitado foi ressuspenso e
homogeneizado por um minuto em 25 mL de NaCl 0,1 M gelado. O pH
desta solução foi ajustado para 6 e a mesma foi incubada a 4 oC por uma
hora. Decorrido o tempo de incubação, a solução foi centrifugada a 3.248
g por 20 minutos a 4 oC. O sobrenadante constituiu o extrato enzimático.
3.2.7.1 Atividade da pectinametilesterase (PME)
A atividade tem por base a quantificação dos grupos carboxílicos
livres formados pela enzima, quando a mesma atua sobre as ligações da
pectina. Sua determinação foi feita através de titulometria seguindo
Kertesz (1955).
Em um Becker, 5 mL do extrato enzimático juntamente com 30 mL
do substrato pectina cítrica 1% em NaCl 0,2 M (pH 7,0), foram titulados
com NaOH 0,01N com auxílio de uma bureta de 10 mL. A titulação cessa
quando o pH 7 (± 0,01) é atingido ficando estável por 10 minutos. O
volume de NaOH gasto é utilizado para calcular a atividade da PME,
38
sendo uma unidade de atividade definida como a quantidade de enzima
capaz de desmetilar a pectina correspondente ao consumo de 1 ηmol
NaOH/min/g MF. Os resultados foram dados em UAE/mg P.
3.2.7.2 Atividade da poligalacturonase (PG)
A análise de atividade da PG (BUESCHER; FURMANSKI, 1978)
tem por base a determinação da quantidade de açúcar redutor (AR)
liberado devido à atividade desta enzima. A determinação ocorreu em
duas etapas. Primeiramente, a tubos de ensaio foram adicionados, 300 µL
de extrato e 300 µL de água destilada. A solução foi agitada e em seguida
uma alíquota de 75 µL foi retirada para análise do conteúdo de AR (1),
conforme método do DNS descrito no item 3.2.2.8.
Na segunda etapa, 300 µL de extrato e 300 µL de ácido
poligalacturônico 0,25% em tampão acetato de sódio 37,5 mM (pH 5)
foram colocados em tubos de ensaio e agitados. A solução foi incubada
durante 3 horas a 30 oC. A reação foi interrompida com banho de água
quente (100 oC) por 5 minutos, seguido de banho de gelo. Da solução
resultante, foi retirada uma alíquota de 75 µL para determinação do
conteúdo de AR (2) de acordo com o método do DNS, exposto no item
3.2.2.8.
A quantidade de açúcares redutores se deu pela subtração dos
valores de AR (1) por AR (2). Como a atividade da enzima é expressa
com base no conteúdo de AR liberados, o AR (1) representa a atividade
da enzima no extrato enzimático e o AR (2) a atividade quando a enzima
é colocada em contato com o seu substrato. Os resultados foram
calculados com base em uma curva padrão de glicose e expressos em
μmol AR/min/mg P.
39
3.3 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado,
com 3 repetições. Todas as análises foram feitas em triplicata. Vale
ressaltar que os resultados foram corrigidos de acordo com o fator de
diluição inicial (1:1). Os dados foram submetidos a analise de variância e
ao teste de Tukey a 5% de significância utilizando o programa SISVAR
(FERREIRA, 2005).
40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Qualidade da manga minimamente processada e tratada com US
Os atributos de qualidade estão descritos na Tabela 3. O
tratamento com US resultou em um aumento significativo no pH de 4,27
para 4,34 no tempo zero, apesar deste não ter sido afetado pelo tempo de
armazenamento. Provavelmente a entrada de água, bem como redução
de alguns compostos após sonicação, pode explicar essa modificação
sofrida pelo pH.
Vilas Boas et al. (2004) encontraram valores de pH (4,54) para
mangas MP, semelhantes aos encontrados neste trabalho. Cruz et al.
(2010) também relataram pHs próximos aos deste estudo para frutos
íntegros armazenados sob condições ambientais. Bhat et al. (2011) não
verificaram alterações no pH de limão dourado após sonicação. Adekunte
et al. (2010) também não observaram modificações em suco de tomate
sonicado.
A acidez titulável (AT) diminuiu após a aplicação do US mostrando
um menor valor após sete dias, 0,22%. Esses resultados estão
condizentes com aqueles obervados para pH, quando o aumento induzido
pelo tratamento com US resultou na queda da acidez, que pode ser ainda
justificada pela grande redução no conteúdo de vitamina C (Figura 16B).
Todavia, morangos submetidos ao tratamento com US nas
mesmas condições utilizadas neste trabalho não apresentaram redução
na AT em relação ao controle (0,78%) (CAO et al., 2010). Bhat et al.
(2011) também não verificaram diferenças estatísticas na AT entre o
controle e as amostras de suco de limão dourado tratadas com 30 e 60
minutos de US. Portanto, a AT sofre influência do tratamento e também
da interação do mesmo com o fruto em questão.
Vilas Boas et al. (2004) encontraram valores semelhantes de AT
(0,23%) quando avaliaram mangas ‘Tommy Atkins’ MP e tratadas com
ácido ascórbico 1%, após seis dias de armazenamento. Já, Jeronimo et
41
al. (2007) relataram AT de 1,16% em mangas ‘Tommy Atkins’ inteiras
armazenadas por oito dias à 13 oC.
Tabela 3 – pH, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS) e razão SS/AT
em mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas
por sete dias a 4 oC
Tratamento Tempo
(dias)
pH AT
(% ác.
cítrico)
SS
(oBrix)
SS/AT
Controle 0 4,27 Aa 0,33 Aa 12,99 Aa 39,36 Aa
US 0 4,34 Ba 0,26 Ba 9,18 Ba 35,30 Ba
Controle 7 4,32 Aa 0,32 Aa 12,71 Aa 39,71 Aa
US 7 4,34 Ba 0,22 Bb 10,24 Bb 46,54 Bb
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível de
5% de significância pelo Teste de Tukey.
De acordo com Chitarra e Chitarra (2005), a acidez em produtos
hortícolas é atribuída principalmente aos ácidos orgânicos dissolvidos nos
vacúolos das células, tanto na forma livre como combinados. O conteúdo
desses ácidos diminui com a maturação, em decorrência do seu uso
como substrato no processo respiratório ou na conversão em açúcares. O
processamento também pode afetar estes valores e isto justificaria ou
influenciaria parte da redução nos valores de AT.
Apesar de valores ligeiramente maiores de pH (Tabela 3), a AT das
amostras sonicadas diminuiu, provavelmente devido a prevalência de
ácidos orgânicos ligados à outras moléculas, o que pode ser sustentado
pela redução no teor de sólidos solúveis (SS) ou então, pela absorção de
água pelos tecidos durante o tratamento com US.
Os valores de SS diminuíram significativamente após o tratamento
com US, contudo, após sete dias de armazenamento, apenas as
amostras sonicadas apresentaram valores maiores (10,24 oBrix) do que
no dia do tratamento (9,18 oBrix).
42
Os resultados aqui mostrados contradizem os encontrados por Cao
et al. (2010) e Adekunte et al. (2010) que não observaram diferença
significativa em morangos e em suco de tomate tratados com US,
respectivamente. Porém, corroboram com os resultados de Oliveira et al.
(2010), que observaram a perda destes sólidos ao avaliarem o US como
pré–tratamento na desidratação de jambo.
Durante o amadurecimento, uma das principais modificações
característica dos frutos é o acúmulo de açúcares com simultânea
redução da acidez, conferindo uma maior qualidade sensorial ao produto
(CHITARRA; CHITARRA, 2005). A relação SS/AT não sofreu variações
significativas nas amostras controle com o armazenamento. Todavia, o
tratamento interferiu nas variáveis que compõem tal relação, acarretando
na diminuição da mesma, contudo, após os 7 dias a 4 oC, o ratio SS/AT
foi superior (Figura 3).
O US reduziu significativamente (aproximadamente 15%) o
conteúdo dos açúcares totais de modo que no dia zero, o controle tinha
215,65 g/kg de açúcar total e após o tratamento, esse valor caiu para
185,37 g/kg (Figura 12A). O principal decréscimo foi observado no final do
armazenamento dos frutos tratados que apresentaram 160,02 g/kg,
contudo, foram mantidas as mesmas diferenças em relação ao tempo
zero, pois a baixa temperatura e a embalagem coberta com PVC
reduziram a perda de água.
Gonzales–Aguilar et al. (2001) encontraram valores superiores de
açúcares para mangas ‘Tommy Atkins’ após tratamento com UV–C por
20 minutos e armazenamento por 14 dias a 5 oC mais sete dias a 20 oC
(de 55,26 para 73,53 mg sacarose/g MF).
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Período de armazenamento (dias)
Controle
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M
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Período de armazenamento (dias)
Controle
US
Aa
Ba Aa
Bb
B
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 12 – Conteúdo de açúcares totais (A) e de açúcares redutores (B)
em mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas
por sete dias a 4 oC
A Figura 12B mostra que grande parte dos açúcares presentes
eram redutores, com o maior valor (203,36 g/kg) encontrado para o
controle no tempo zero. Esses resultados apresentaram o mesmo
comportamento que o observado para os açúcares totais (Figura 12A),
sendo influenciado negativamente pelo US e pelo armazenamento, isto é,
diminuindo com ambos.
44
A perda de açúcares após tratamento com US já foi confirmada por
diversos autores em frutos como banana, melão, jambo e morango
(FERNANDES; RODRIGUES, 2007; FERNANDES; GALLÃO;
RODRIGUES, 2008; OLIVEIRA et al., 2010; GARCIA–NOGUERA et al.,
2010). O US atua sobre os tecidos de forma semelhante a uma esponja,
comprimido–os repetidamente. De acordo com Rodrigues et al. (2009) o
“efeito esponja” (compressão e expansão) pode ser responsável pela
expulsão de pequenas moléculas solúveis, como glicose e frutose
(açúcares redutores) devido ao seus tamanhos e porosidade do fruto.
A cor é uma característica fundamental por ser um fator de
atratividade e exercer influência direta sobre a escolha do consumidor
(Tabela 4). A luminosidade (L) diminuiu com o tempo de armazenamento
de forma significativa, porém, só foi influenciada pelo US após sete dias a
4 oC, atingindo 67,98. O croma (C) apresentou o mesmo comportamento
que a luminosidade, atingindo 66,91. No momento da aplicação do US, a
cor teve um leve aumento como pode ser observado através da variação
do ângulo hue de 82,78 para 83,12 (∆H = –0,34), porém, após os sete
dias, os valores decaíram tanto para o controle como para as amostras
tratadas.
Tabela 4 – Parâmetros de cor em mangas minimamente processadas,
tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC
Tratamento Tempo (dias) L C ohue
Controle 0 75,33 Aa 74,56 Aa 82,78 Aa
US 0 75,25 Aa 74,25 Aa 83,12 Ba
Controle 7 71,22 Ab 71,33 Ab 81,31 Ab
US 7 67,98 Bb 66,91 Ab 80,79 Bb
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível de
5% de significância pelo Teste de Tukey.
Em relação ao armazenamento, houve perda de cor, luminosidade
(∆L = 3,24) e de cromaticidade (∆C = 4,42), indicando um escurecimento
que está provavelmente associado à ruptura de células, introdução de
45
água, perda de açúcares, de vitamina C (Figura 16B) e de pigmentos
responsáveis pela coloração característica da manga.
Donadon et al. (2003) também observaram, em manga ‘Parvin’ MP,
uma evolução gradativa de amarelo escuro para amarelo alaranjado no
decorrer do tempo de armazenamento e redução nos valores de L com o
tempo. E esta redução geralmente acontece, tal como já foi descrito para
mangas MP de diversas cultivares: Tommy Atkins, Ataulfo, Kent e Keitt
(RATTANAPANONE et al., 2001; GONZÁLEZ–AGUILAR et al., 2008;
DJIOUA et al., 2009). Todavia, Tiwari et al. (2008) relataram que o uso do
US afetou muito pouco (pequena redução) a cor e os conteúdos de ácido
ascórbico e antocianinas após o processamento do suco de morango.
Segundo Chidtragool et al. (2011) o escurecimento da polpa de
mangas não foi correlacionado com atividade enzimática da principal
enzima da rota dos fenólicos, a PAL. Porém, as enzimas tradicionalmente
responsáveis pelo escurecimento como a G–POD e PPO, podem estar
relacionadas a esse efeito após o armazenamento das amostras. A
degradação da cor após sonicação pode ser atribuída ainda à reações de
oxidação que ocorrem como resultado da interação com os radicais livres
gerados durante o tratamento (MASON, 1991).
A propriedade mecânica mais relevante de frutos que se
correlaciona com US é a firmeza. É uma característica muito importante,
que reflete as alterações no tecido durante a maturação e o
armazenamento. Assim, a firmeza é, geralmente, associada com o
amadurecimento, frescor, retenção de boa qualidade e, portanto, com a
viabilidade comercial (MIZRACH, 2008).
A firmeza dos frutos processados decaiu com o período de
armazenamento, porém, apenas após o armazenamento, é que as
mangas tratadas com US apresentaram diferença significativa na firmeza
em relação ao controle, 139,34 e 359,33 N, respectivamente (Figura 13).
Após a sonicação, as amostras perderam água e sólidos e isso
pode ter contribuído grandemente para a redução destes valores, bem
como afetado a porosidade do fruto (Figura 20A e B). Então, percebe–se
que o tratamento não foi eficiente na manutenção da firmeza das mangas.
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Período de armazenamento (dias)
Controle
US
AaAa
Ab
Bb
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 13 – Firmeza em mangas minimamente processadas, tratadas com
US e armazenadas por sete dias a 4 oC.
Cao et al. (2010) ao contrário dos resultados aqui expressos,
concluíram que a firmeza em morangos sonicados não foi alterada,
todavia, também diminuiu com o armazenamento. Após tratamento
ultrassônico em abacaxi, Fernandes, Gallão e Rodrigues (2009),
observaram que as células tornaram–se mais distorcidas e que canais
microscópicos foram formados por causa da perda de adesão celular que
produziu espaços intercelulares, diferente do que foi observado em
melões pelos mesmos autores (2008), onde os canais microscópicos
foram formados por achatamento e alongamento das células. Portanto, as
mudanças vão depender do tipo de fruto.
A degradação dos tecidos acontece normalmente com o avanço
da maturação e a diminuição na firmeza está diretamente associada a
estes eventos oriundos do metabolismo dos tecidos, incluindo as
modificações nos polissacarídeos da parede celular, bem como a
deterioração enzimática da mesma.
A firmeza também sofre influência do corte ou processamento de
um produto hortícola, pois este causa a descompartimentalização celular,
47
expõe o interior do produto e aumenta a taxa de evaporação da água,
promovendo também o extravazamento do suco celular que se concentra
na superfície. Isso promove a formação de uma solução hipertônica que
favorece a perda de água a partir das células intactas (JACOMINO et
al.,2004).
Os resultados mostraram que após o tratamento com US houve
uma perda de água negativa, significando aumento de água nas amostras
(4,6%) e consequentemente de umidade (de 6,80 para 7,27 em base
seca), porém a perda de sólidos foi de 24,38%. E essa perda está
condizente com os resultados apresentados para conteúdo de SS (Tabela
3), porém, podem ser associados aos encontrados para os açúcares
(Figura 12A e B), bem como para o ganho de água.
Os efeitos mecânicos do ultrassom proporcionam uma maior
penetração do solvente em materiais celulares e melhoram a
transferência de massa (MASON, 1996). Assim, as mudanças podem ser
explicadas pelo efeito de compressão e expansão que o US causa nos
tecidos e pela diferença de concentração entre o fruto e o meio no qual
ele foi imerso (água destilada) resultando na transferência de sólidos da
manga para o meio externo, bem como de absorção de água pelo fruto.
Pois, em um meio líquido, a sonicação provoca a cavitação que consiste
na formação de bolhas que podem entrar em colapso e explodir gerando
uma pressão localizada, além de produzir microjatos na superfície do
alimento que podem introduzir o líquido para o interior do sólido e
aumentar a transferência de massa em ambas as direções (MASON et al.,
2005; SHAMAEI; EMAM–DJOMEH; MOINI, 2011).
Fernandes e Rodrigues (2007) e Azoubel et al. (2010) também
observaram comportamento semelhante em bananas tratadas com US,
que perderam sólidos 21,3% e 2,4%, respectivamente. Já Fernandes,
Gallão e Rodrigues (2009) observaram perda de açúcar (23,2%) e de
água (3,1%) em amostras de abacaxi sonicadas. De um ponto de vista
geral, todos os efeitos produzidos por US podem influenciar fenômenos
de transferência de massa. Nos tratamentos com um sólido imerso em um
fluido, o US pode acelerar o transporte interno fazendo entrar ou sair
48
fluidos na matriz sólida, facilitando também as trocas entre a superfície
sólida e o fluido circundante (CÁRCEL et al., 2012).
4.2 Avaliação de componentes do metabolismo oxidativo
A peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO) pode ser
entendida como um conjunto de eventos bioquímicos que resultam da
ação dos RL ou EROs sobre os lipídios insaturados levando a destruição
das membranas celulares (BENZIE, 2006).
O grau de LPO das mangas processadas foi significativamente
reduzido pelo US, mas não com o armazenamento (Figura 14A). No
tempo zero, os frutos controle apresentaram 23,58 ηmol MDA/g MF,
enquanto os tratados apresentaram 18,00 ηmol MDA/g MF. Esses valores
não podem ser associados com os resultados para firmeza (Figura 13),
pois apesar da redução observada para os frutos tratados com US, estes
não estavam mais firmes que os controles. Esse resultado mostra que
para a manga, outros fatores como a composição da parede celular
contribuem fortemente para a estruturação e firmeza dos tecidos, além da
integridade da membrana plasmática.
Diferentemente, o grau de LPO aumentou (de aproximadamente
34 para 45 ηmol MDA/g MF) imediatamente quando mangas ‘Keitt’ MP
foram tratadas termicamente a 46 oC por 30 minutos (DJIOUA et al.,
2009). Neste caso o tratamento térmico desnatura as proteínas da
membrana, levando ao acréscimo da LPO e apesar de ter um efeito
diferente do US é utilizado comumente para tratar MP.
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Período de armazenamento (dias)
Controle
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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 14 – Peroxidação lipídica (A) e conteúdo de peróxido de hidrogênio
(B) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e
armazenadas por sete dias a 4 oC
Ding et al. (2007) ao avaliarem mangas cv. Zill íntegras tratadas
com ácido oxálico encontraram valores iniciais de 0,0014 µmol MDA/g
MF, e após dez dias de armazenamento a 5 oC, estes valores subiram
para 0,0022 µmol MDA/g MF, mostrando também que o tratamento não
foi satisfatório para redução deste parâmetro. Todavia, Wang et al. (2008)
relataram uma redução (19,6%) na LPO em manga íntegras 'Tainong'
50
tratadas com 2,4–diclorofenoxiacético após sete dias de armazenamento
a 4 oC.
O H2O2 é uma ERO utilizada como sinalizador ou indicador de
estresse oxidativo. Os níveis de H2O2 não foram afetados pelo US, mas
sim pelo armazenamento, de modo que após sete dias, os frutos controle
tinham 0,0318 e os tratados 0,0271 µmol/g MF (Figura 14B). Ding et al.
(2007) avaliando ainda, o conteúdo de H2O2, encontraram valores de 1,5
µmol/g MF em mangas ‘Zill’ sem tratamento armazenadas a 5 oC.
Os resultados aqui demonstrados indicam que a sonicação não
induziu a danos oxidativos causados pelo H2O2 e, além disso, ao se
relacionar esses resultados com os de LPO (Figura 14A) observa–se que
outra ERO, que não o H2O2, pode ser responsável pela maior peroxidação
das mangas não tratadas.
Corroborando com essa ideia, outro estudo mostra que a sonólise
da água (cisão das ligações H–O) provocada por ondas ultrassônicas
implica na produção direta de outros radicais que não o H2O2, como H● e
HO● (KORN; ANDRADE; BORGES, 2003).
4.3 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total
Apesar da manga ter um baixo conteúdo de antocianinas, o
objetivo foi observar o efeito do tratamento sobre esse composto (Figura
15A). O tratamento com US reduziu o conteúdo de antocianinas apenas
no tempo zero (4,15 mg/kg MF), o qual se manteve constante com o
armazenamento. Porém, os frutos controle apresentaram um decréscimo
após os sete dias a 4 oC (de 6,20 para 5,30 mg/kg MF).
Tiwari et al. (2009) verificaram que antocianinas de suco de
morango não foram degradadas após sonicação, no entanto, Tiwari et al.
(2010) verificaram alta retenção de antocianinas em suco de uva sonicado
quando comparado ao de morango (TIWARI et al., 2008) e ao de amora
(TIWARI; O’DONNELL; CULLEN, 2009).
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Período de armazenamento (dias)
Controle
US
Ab
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C
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 15 – Conteúdo de antocianinas (A), de flavonoides amarelos (B) e
de polifenóis extraíveis totais (C) em mangas minimamente processadas,
tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC
52
Os flavonoides amarelos, juntamente com os carotenoides
contribuem grandemente para a coloração amarela das mangas.
O conteúdo de flavonoides amarelos (14,44 mg/kg MF) diminuiu
significativamente após o tratamento com US para 11,58 mg/kg MF, mas
apresentou um aumento durante o armazenamento para 13,23 mg/kg MF,
apesar de não diferir do controle (13,53 mg/kg MF) (Figura 15B). Esse
aumento pode estar ligado à atividade da PAL (Figura 19) que atua no
metabolismo secundário tendo os compostos fenólicos como seu produto
final.
Ashokkumar et al. (2008) relataram que a atividade antioxidante
dos componentes, tais como os flavonoides, pode aumentar por causa do
incremento no grau de hidroxilação das moléculas, devido aos radicais
HO● formados no processo de sonicação. Bhat et al. (2011) verificaram
um aumento nos flavonoides totais em suco de limão dourado após
tratamento com US por 30 e 60 minutos.
Os valores de polifenóis totais não diferiram com o tratamento,
porém, com o tempo, aumentando de 260,15 para 304,71 mg EAG/kg MF
no caso do controle e de 250,93 para 299,81 mg EAG/kg MF no US
(Figura 15C). Esse aumento, assim como o de flavonoides pode ter
relação com a PAL (Figura 19). Também há o fato de haver a
descompartimentalização celular com o corte, que coloca em contato a
enzima com seus substratos que estavam espacialmente separados,
favorecendo sua atividade. E pode justificar ainda, o escurecimento
avaliado na Tabela 1, onde os valores de L e C diminuíram com o
armazenamento, uma vez que esses compostos são substratos para as
enzimas responsáveis por deteriorações na cor. De acordo com estudo
realizado por Azevedo (2006) o fenólico mais abundante na manga foi a
epicatequina (27,26 mg/g MF).
Já, Bhat et al. (2011) observaram diferenças significativas entre as
amostras tratadas com US (272 mg EAG/g MF) e o controle (263,08 mg
EAG/g MF) no suco de limão dourado, assim como, Sales e Ressurrecion
(2010) que noticiaram um aumento nos fenólicos após tratamento de
53
amendoim com US. Pois, segundo Ashokkumar et al. (2008), a adição de
grupos HO● gerados sonoquimicamente ao anel aromático destes
compostos gera um aumento nas formas extraíveis, além da ruptura das
células que também poderia provocar a liberação dos mesmos. Porém,
Fonteles et al. (2012) verificaram uma redução nos fenólicos do suco de
melão após a aplicação de US e concluíram que o efeito do US depende
das condições de processamento da matriz alimentar.
A violaxantina é o carotenoide mais encontrado na manga ‘Tommy
Atkins’ (RODRIGUES–AMAYA; KIMURA; AMAYA–FARFAN, 2008).
Ocorre um decréscimo do teor de carotenoides com o amadurecimento
(MEDINA et al. 1981), porém, os mesmos não foram afetados pelo US e
nem pelo armazenamento com valor médio de 11,06 mg/kg MF (Figura
16A). A manutenção dos carotenoides pode ser explicada pelo fato de
serem lipofílicos e, portanto, não serem eliminados por lixiviação com o
tratamento.
Os resultados observados para flavonoides e carotenoides não
podem ser individualmente relacionados aos de luminosidade e
cromaticidade (L, C, Tabela 4) que mostram uma queda significativa no
brilho, bem como um aumento no desgaste da cor amarela, após o
armazenamento, gerando um escurecimento nos frutos tratados.
Neste trabalho, houve diferença significativa entre os frutos
controle e os tratados em relação ao conteúdo de vitamina C (Figura
14B). O US promoveu um decréscimo para 190,18 mg/kg MF que se
manteve durante o armazenamento. Segundo Chitarra (1998), o ácido
ascórbico pode ser oxidado por uma série de mecanismos bioquímicos
que são responsáveis pela perda de sua atividade vitamínica e também
pela formação de pigmentos escuros, além de diminuir com o
amadurecimento (MEDINA et al., 1981). Diferentes enzimas podem
catalisar a sua degradação direta ou indiretamente, como o aumento na
atividade da APX (Figura 17A).
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Período de armazenamento (dias)
Controle
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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 16 – Conteúdo de carotenoides (A), de vitamina C (B) e atividade
antioxidante total (C) em mangas minimamente processadas, tratadas
com US e armazenadas por sete dias a 4 oC
55
O decréscimo ocasionado pelo US pode ser explicado pelo fato do
tratamento degradar diretamente a estrutura da vitamina, ou liberá–la por
lixiviação junto aos sólidos perdidos, assim como ocasionar um aumento
na produção de EROs que seriam neutralizados por essa vitamina,
levando a uma redução em seu conteúdo. Então, os radicais HO●
produzidos pela cavitação podem degradar o ácido ascórbico ou ainda
isso pode resultar de termólise ou combustão associada à bolha de
cavitação (FERNANDES; RODRIGUES, 2012).
Quando se comparou o conteúdo de vitamina C em tomate tratado
termicamente e ultrassonicamente, concluiu–se que com o US houve um
maior nível retido do que com o calor (ERCAN; SOYSAL, 2011). Um
trabalho mostrou que os níveis de ácido ascórbico aumentaram após
tratamento de suco de goiaba com US de 110 para 119 mg/100mL
(CHENG et al., 2007). Já, Cao et al. (2010) não observaram diferenças
significativas no conteúdo desta vitamina em morangos tratados e não
tratados com US (média de 83,26 mg/100 g).
A capacidade ou atividade antioxidante total (AAT) das mangas
processadas não sofreu influência do tratamento com US ou do
armazenamento com 0,64 trolox/kg para os frutos controle, no tempo zero
(Figura 16C).
Ao contrário do que foi encontrado aqui, um aumento na AAT (de
577,2 para 665,9 mg equivalente de ácido ascórbico/g MF) de suco de
limão foi observado após sonicação (Bhat et al., 2011). Sogi et al. (2012)
também noticiaram um aumento na AAT (de 261,5 μM trolox/100g MF,
para 338.0 to 416,4 μM trolox/100g MF) após tratamento de mangas
‘Tommy Atkins’ MP com infravermelho.
56
4.4 Enzimas antioxidantes
O tratamento com US influenciou significativamente a atividade da
peroxidase do ascorbato (APX, Figura 17A) apenas no tempo zero
aumentando para 0,029 µmol H2O2/min/mg P, em relação ao controle.
Após o período de armazenamento, houve uma redução significativa,
porém, sem diferença entre os tratamentos (controle, 0,027 µmol
H2O2/min/mg P).
O incremento na atividade da APX (Figura 17A) no início do
experimento pode ser associado à queda nos níveis de vitamina C total
(Figura 16B), pois implica no maior gasto dessa vitamina como doadora
de elétrons na reação catalisada pela enzima, todavia, essa relação não
se mantém após o armazenamento.
O aumento observado logo após a sonicação pode ser explicado
pela formação das bolhas de cavitação, que de acordo com Mason
(1998), resultam em uma força de cisalhamento que pode alterar a
conformação das proteínas. Já ao ser relacionado com o conteúdo de
H2O2 (Figura 14B), a maior atividade da APX após o armazenamento
pode explicar a redução nessa ERO, então.
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Período de armazenamento (dias)
Controle
US
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P)
Período de armazenamento (dias)
Controle
US
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Aa
Aa
C
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível
de 5% de significância pelo Teste de Tukey.
Figura 17 – Atividade das enzimas antioxidantes APX (A), CAT (B) e SOD
(C) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e
armazenadas por sete dias a 4 oC
58
Fonteles et al. (2012) obtiveram resultados de completa inativação
e de atividade residual inferior a 52% da APX em suco de melão tratado
com US a 19 kHz. Quando peras foram sonicadas a 40 kHz a atividade da
APX foi de 11,79 contra 10,36 UAE/mg P para o controle (Yang et al.,
2012).
Quanto à catalase (CAT, Figura 17B) nas mangas processadas, o
tratamento com US não induziu nenhuma mudança significativa, diferente
do período de armazenamento que aumentou a atividade do controle para
377 µmol H2O2/min/mg P. A CAT aparentemente foi a mais importante na
remoção de H2O2 em mangas, pois sua ação foi maior do que a da APX
(Figura 17A) e ainda, parece estar mais claramente associada ao
conteúdo de H2O2 (Figura 14B), sendo influenciado pelo armazenamento,
mas sem diferença entre os tratamentos.
A atividade da SOD não sofreu modificações significativas com o
tratamento nem com o tempo (Figura 17C) apresentando um valor médio
de 17,93 UAE/mg P. Esse resultado denota uma estabilidade da enzima e
denota a sua importância para o metabolismo antioxidante desse fruto.
A atividade da CAT e da SOD, quando avaliadas por Yang et al.
(2012) em peras, demonstraram um comportamento de decréscimo após
sonicaçao: 32,94 para 31,03 UAE/mg P e 84,52 para 74,34 UAE/mg P,
respectivamente. Ding et al. (2007) observaram que a atividade da APX,
CAT e SOD em mangas íntegras cv. Zill aumentou após armazenamento
a 5 oC.
Em relação ao metabolismo antioxidante das mangas processadas,
o US exerceu um efeito inicial que foi revertido com o tempo de
armazenamento nas variáveis conteúdo de antocianinas e flavonoides e
na atividade da APX. Já, quanto a LPO e o conteúdo de vitamina C, o
efeito de redução perdurou durante o armazenamento, enquanto as
atividades das enzimas SOD e CAT não foram sequer influenciadas por
esse tratamento.
O principal efeito observado, de redução na LPO e no conteúdo de
vitamina C pode ser interpretado diferentemente, pois a menor
59
peroxidação poderia ter induzido a maior integridade dos tecidos, porém,
isso não foi observado na avaliação da firmeza, enquanto que a redução
do conteúdo de vitamina C diminui a qualidade desse produto, apesar da
manga não ser um fruto caracteristicamente rico nessa vitamina.
4.5 Enzimas responsáveis pelo escurecimento
A sonicação diminuiu estatisticamente a atividade da G–POD
apenas no tempo zero para 0,0046 μmol H2O2/min/mg P, porém, esse
efeito foi perdido com o armazenamento, de modo que após os sete dias,
ambos os tratamentos diferiram estatisticamente do tempo zero, atingindo
0,0057 μmol H2O2/min/mg P (Figura 18A). Esses resultados estão em
concordância com os dados apresentados para L e C (Tabela 4)
indicando que a atividade da POD induziu o escurecimento dos frutos
após armazenamento.
O processamento ou corte, por si só, permite que enzimas
envolvidas nas reações de escurecimento, como PODs e a PPO, sejam
unidas com seus substratos, os quais muitas vezes estão em
compartimentos celulares distintos (JACOMINO et al., 2004). Além da cor,
pois oxida o guaiacol para reduzir o H2O2 transformando o primeiro em um
produto colorido, a atividade da G–POD contribui para alterações
deteriorantes no aroma, sabor, textura e valor nutricional de alimentos
frescos ou armazenados (ARAÚJO, 2004).
Fonteles et al. (2012) observaram que a atividade da G–POD
dependia do tempo de processamento com US devido ao rompimento
celular da polpa do fruto, sendo a enzima intracelular liberada no meio,
ocasionando o aumento da sua atividade. Ou seja, para tempos de
exposição baixos, a taxa de liberação da enzima é mais elevada do que
sua taxa de desnaturação, sendo o contrário verdadeiro. Ndiaye, Xu e
Wang (2009) demonstraram inativação completa da G–POD em fatias de
manga quando o branqueamento a vapor foi aplicado por 5 minutos,
porém, também observaram um alto índice de escurecimento.
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P)
Período de armazenamento (dias)
Controle
US
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B
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 18 – Atividade das enzimas responsáveis pelo escurecimento G–
POD (A) e PPO (B) em mangas minimamente processadas, tratadas com
US e armazenadas por sete dias a 4 oC
As PPOs são enzimas intracelulares (GOMES et al., 2001) que
atuam sobre compostos fenólicos causando, na presença de O2, a
oxidação dos mesmos resultando em quinonas (CHITARRA, CHITARRA,
2005).
Não foram observadas diferenças significativas na atividade da
polifenol oxidase (PPO, Figura 18B) entre os tratamentos e nem durante o
61
tempo de armazenamento, com valores médios de 0,13 UAE/min/mg P.
Esse resultado demonstra que a sonicação não foi capaz de inativar em
qualquer nível essa enzima, todavia, a sua atividade também não pôde
ser relacionada com os parâmetros de cor (Tabela 4), o que indica que a
G–POD (Figura 18A) é então, a principal enzima envolvida com
escurecimento na manga.
A não eficácia do US aqui observada na inativação desta enzima
na manga pode estar relacionada a potência utilizada que foi de 150
W/cm2. Quando a atividade de PPO em suco de melão sonicado foi
analisada sob diferentes intensidades de tratamento, observou–se que a
melhor condição para redução da mesma foi a de 10 minutos de
tratamento a 376 W/cm2 (FONTELES et al., 2012). Um experimento com
maçãs MP tratadas com US mostrou que a atividade monofenolásica da
PPO foi inibida enquanto a difenolásica foi estimulada (JANG; MOON,
2011). Contudo, a atividade desta enzima aumentou em sucos de goiaba
sonicados (CHENG et al., 2007).
4.6 Enzima marcadora de estresse
A atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) aumentou
significativamente com a sonicação para 19,52 µmol ác. trans–
cinâmico/h/mg P (Figura 19). Com o armazenamento, a atividade
continuou aumentando sem diferença entre os tratamentos, com valores
de 24,06 µmol ác. trans–cinâmico/h/mg P para o controle.
A PAL catalisa a desaminação da fenilalanina com produção de
ácido trans–cinâmico, sendo essa reação importante na formação dos
compostos fenólicos e sua atividade foi relacionada a condições adversas
(SREELAKSHMI; SHARMA, 2008). Portanto, o acréscimo inicial
observado para a atividade da PAL denota uma situação de estresse
induzido pelo tratamento com US, todavia, não refletiu em aumento nas
antocianinas ou flavonoides (Figura 15A e B), porém, pode estar ligado ao
maior conteúdo de fenólicos com o tempo.
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Controle
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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 19 – Atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) em
mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por
sete dias a 4 oC
Segundo Chidtragool et al. (2011) a atividade da PAL na casca de
manga foi muito mais elevada que na polpa e isso se correlacionou com o
nível mais alto de compostos fenólicos na casca.
4.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal
A atividade da enzima PME (Figura 20A) sofreu influência do
tempo de armazenamento e do US apenas após os sete dias a 4 oC
atingindo 185.597,27 UAE/min/mg P, sendo mais que o dobro da
atividade do controle no mesmo tempo, 75.708,98 UAE/min/mg P. Esses
resultados podem ser associados aos apresentados para a firmeza
(Figura 13), os quais decaíram fortemente após o armazenamento dos
frutos tratados, de 241,73 para 139,38 N, sugerindo que o amaciamento
da polpa da manga está mais relacionado com a degradação da parede
63
celular do que da membrana plasmática, segundo o grau de peroxidação
lipídica (Figura 14A).
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AR
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Período de armazenamento (dias)
Controle
US
Aa
Ba
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Ba
B
* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,
respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de
significância pelo Teste de Tukey.
Figura 20 – Atividade das enzimas PME (A) e PG (B) em mangas
minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por sete
dias a 4 oC
As substâncias pécticas constituem o grupo de polissacarídeos da
parede celular vegetal mais modificado durante o amadurecimento de
alguns frutos, com o aumento da sua solubilização e despolimerização
64
associados ao amaciamento (OLIVEIRA et al., 2006). Todavia, segundo
Tucker (1993), é improvável que uma única enzima seja responsável por
mudanças na firmeza, pois o processo deve envolver uma interação
complexa de enzimas amilásicas, pécticas e galactosidásicas.
Quando Terefe et al. (2009) avaliaram o efeito da temperatura e da
sonicação na inativação da PME em suco de tomate, observaram que o
aquecimento do suco a 50 oC não foi efetivo, porém, quando aplicado em
combinação com o US causou uma redução significativa na atividade
enzimática. Raviyan, Zhang e Feng (2005) também observaram efeito
sinergístico entre altas temperaturas e US na inativação de PME de
tomate.
Ao catalisar a desmetilação da cadeia de pectina, a PME permite
que a PG possa hidrolisar as ligações glicosídicas liberando os resíduos
de ácido galacturônico. Diferente da PME (Figura 20A), a atividade da PG
(Figura 20B) foi estimulada pelo tratamento com US no tempo zero para
59.708,09 nmol AR/min/mg e se manteve após o armazenamento, no
entanto, não sofreu modificação com o tempo e isso pode ter relação com
a atmosfera modificada criada pela embalagem.
Esse resultado corrobora com aqueles apresentados para PME e
firmeza (Figura 13) indicando que o tratamento com US não foi
interessante do ponto de vista da manutenção da firmeza das mangas
minimamente processadas. Terefe et al. (2009) também avaliaram a
inativação da PG e seus resultados mostraram que o aquecimento do
suco de tomate entre 50 e 75 oC seguido de sonicação ocasionou a
inativação da PG.
65
5 CONCLUSÃO
Através deste estudo, foi verificado que o tratamento com US em
mangas ‘Tommy Atkins’ MP afetou negativamente parâmetros de
qualidade importantes como a firmeza e a cor, justificados principalmente
pelo aumento na atividade da PME e degradação de vitamina C.
Como os frutos MP são produtos que serão armazenados deve–se,
fazer uma avaliação levando em maior consideração o tempo de
armazenamento. E, em detrimento a outros métodos de conservação, a
sonicação não provocou a formação de H2O2, bem como não afetou
drasticamente os sistemas antioxidante enzimático e não enzimático.
Concluiu–se ainda, que a manga MP também responde ao
tratamento perdendo açúcar, o que tem duas vertentes de análise
distintas: perda de sabor ou abrangência de público mais específico para
este tipo de produto.
Nessas condições, a sonicação, sozinha, não seria interessante
para a manutenção da qualidade das mangas MP. Porém, modificações
nas condições apresentadas, tais como combinação com calor, agentes
anti escurecimento, uso de atmosfera modificada, dentre outros, poderiam
minimizar os efeitos negativos e destacar os benefícios ocasionados pelo
US.
Não obstante, vê–se claramente a necessidade de maiores
estudos no setor da pós–colheita, em especial com frutos MP, tendo em
vista suprir a demanda por produtos de maior qualidade, considerando
ainda, que o US tem grande potencial de utilização neste sentido.
66
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