i
BIOTEKNOLOGI
BERBASIS PROYEK Produksi Purifikasi Enzim Selulase dari Kapang
Trichoderma viride dan Potensinya dalam Bioscouring
Pujiati
Muh. Waskito Ardhi
Endry Nugroho Prasetyo
CV. AE MEDIA GRAFIKA
ii
BIOTEKNOLOGI BERBASIS PROYEK
Pujiati Muh. Waskito Ardhi Endry Nugroho Prasetyo Penerbit
CV. AE MEDIA GRAFIKA Jl. Raya Solo Maospati, Magetan, Jawa Timur 63392 Telp. 082336759777 email: [email protected] website: www.aemediagrafika.co.id Hak cipta @ 2018 pada penulis Hak penerbitan pada CV. AE MEDIA GRAFIKA
Dilarang memperbanyak karya tulis ini dalam bentuk dan dengan cara apapun tanpa ijin tertulis dari penerbit,
kecuali dalam hal pengutipan untuk penulisan artikel atau karangan ilmiah
Produksi Purifikasi Enzim Selulase dari Kapang Trichoderma viride dan Potensinya dalam Bioscouring
ISBN: 978-602-6637-33-8 Cetakan ke-1, Desember 2018 Penulis
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT
atas nikmat dan rahmat-Nya, sehingga buku
dengan judul Bioteknologi Berbasis Proyek dapat
terselesaikan dengan baik dan lancar. Adapun
tujuan dari disusunnya buku ini adalah supaya
mahasiswa dapat mengetahui bagaimana
pemanfaatan enzim. Secara umum buku ini
disusun atas hasil penelitian kerjasama antara
Dosen Pendidikan Biologi FKIP UNIPMA dengan
Dosen Biologi Departemen Biologi ITS yang telah
dilakukan dan berdasarkan rujukan, baik jurnal
maupun buku-buku pedoman sebagaimana yang
ada di daftar pustaka. Ada banyak pihak yang
mendukung terselesaikannya buku ini, oleh karena
itu penulis ingin mengucapkan terima kasih
kepada:
1. Rektor Universitas PGRI Madiun
2. Kepala LPPM Institut Teknologi Sepuluh
November
3. Kepala LPPM Universitas PGRI Madiun
4. Kepala Laboratorium Biologi ITS
5. Kepala Laboratorium FKIP UNIPMA
iv
Penulisan Buku Bioteknologi Berbasis Proyek
masih banyak kekurangan, sehingga segala saran
dan kritik yang bersifat membangun sangat
dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.
Harapan selanjutnya semoga Buku Bioteknologi
Berbasis Proyek dapat bermanfaat bagi dosen dan
mahasiswa yang memerlukan.
Madiun, Agustus 2018
Penulis
v
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ........................................... i
KATA PENGANTAR .......................................... ii
DAFTAR ISI ...................................................... iii
DAFTAR GAMBAR ........................................... iv
PENDAHULUAN .............................................. 1
A. Deskripsi ................................................... 1
B. Petunjuk Penggunaan Buku ....................... 2
PETA KONSEP 1 .............................................. 3
PETA KONSEP 2 .............................................. 5
PETA KONSEP 3 .............................................. 6
BAB I ENZIM ................................................... 7
A. Pengertian Enzim ...................................... 7
B. Enzim Selulase .......................................... 8
C. Aktivitas Enzim .......................................... 10
Tes Formatif 1 ........................................... 12
BAB II PRODUKSI ENZIM ................................. 13
A. Sumber Enzim ........................................... 13
B. Kapang Selulolitik ..................................... 17
Tes Formatif 2 ........................................... 27
C. Substrat Produksi Selulase ......................... 28
Kegiatan Proyek Mahasiswa ...................... 34
vi
D. Reagen DNS dan Bradford ........................ 35
E. Gula Reduksi dan Kadar Protein ................ 40
Tes Formatif 3 ........................................... 47
F. Aktivitas Enzim .......................................... 48
Tes Formatif 4 ...........................................
52
Kegiatan Proyek Mahasiswa ...................... 62
Kegiatan Proyek Mahasiswa ...................... 63
BAB III PURIFIKASI ENZIM SELULASE ................ 66
A. Pengertian Purifikasi .................................. 66
TugasMandiri ............................................ 76
B. Uji Aktivitas Enzim Selulase ........................ 77
C. Reagen Dinitrosalisilat (DNS) dan Bradford 81
Lembar Proyek Mahasiswa ........................ 86
D. Kurva Standar Glukosa ............................. 87
Tugas Mandiri ........................................... 89
E. Menentukan Kadar Gula Reduksi ............... 89
Lembar Proyek Mahasiswa ........................ 94
BAB IV APLIKASI ENZIM SELULASE .................. 96
A. Penggunaan Enzim Selulase ...................... 96
B. Bioscouring Kain ....................................... 97
C. Proses Bioscouring .................................... 99
D. Profil Permukaan Serat Kain ...................... 103
E. Data Hasil Penelitian untuk Perbandingan
Proyek Mahasiswa ..................................... 104
F. Data Hasil Penelitian ................................. 105
GLOSARIUM ................................................... 110
DAFTAR PUSTAKA ........................................... 113
52
G. Produksi Enzim Selulase ............................
vii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Trichodermaviride ..................... 15
Gambar 2.2 Ampas tebu halus ..................... 16
Gambar 2.3 Kurva pertumbuhan fungi ......... 23
Gambar 2.4 Trichoderma viride media PDA .. 24
Gambar 2.5 Trichoderma viride media PDB ... 25
Gambar 2.6 Karakter Trichodermaviride ........ 27
Gambar 2.7 Pemutusan ikatan antara lignin dan selulosa ............................. 30
Gambar 2.8 Skema pemecahan lignoselulosa 31
Gambar 2.9 Kurva standart glukosa ............. 44
Gambar 2.10 Kurva standart BSA ................... 47
Gambar 2.11 Media Mendels ......................... 54
Gambar 3.1 Penambahan ammonium sulfat . 75
Gambar 3.2 Sentrifugasi............................... 75
Gambar 3.3 Natan dan supernatan .............. 82
Gambar 3.4 Larutan DNS danNaOH ............ 83
Gambar 3.5 Larutan Na-K tartart .................. 83
Gambar 3.6 Larutan campuran Adan B ....... 83
viii
Gambar 3.7 Penambahan aquades ............. 83
Gambar 3.8 Comasie Brilliant Blue (CBB) ..... 84
Gambar 3.9 Penambahan etanol ................. 84
Gambar 3.10 Penambahan asamfosfat .......... 85
Gambar 3.11 Penambahan aquades ............. 85
Gambar 3.12 Larutan Standar Glukosa ......... 88
Gambar 3.13 Larutan Standar BSA ................ 88
Gambar 3.14 Memipet enzim ........................ 90
Gambar 3.15 Memipet CMC 1%.................... 90
Gambar 3.16 Inkubasi suhu 500C ................ 90
Gambar 3.17 Penambahan regen DNS ......... 91
Gambar 3.18 Pemanasan suhu 1000C .......... 91
Gambar 3.19 Pengukuran absorbansi............ 91
Gambar 3.20 Memipet enzim ........................ 92
Gambar 3.21 Larutan campuran enzim dan regen Bradford ........................ 93
Gambar 3.22 Pengukuran absorbansi............ 93
Gambar 4.1 Skema lapisan serat kapas ....... 98
Gambar 4.2 Tes pewarnaan pada serat kain 99
Gambar 4.3 Skema bioscouring kain ........... 101
Gambar 4.4 Tes daya serap kain terhadap zat warna ................................ 103
Gambar 4.5 SEM serat kain kontrol negatif (1.500X) .................................. 103
Gambar 4.6 SEM serat kains couring alkalin (1.500X) .................................. 103
ix
Gambar 4.7 SEM permukaan kain kontrol negatif (40X) ............................. 104
Gambar 4.8 SEM permukaan kain scouring alkalin (43X) ............................. 104
Gambar 4.9 SEM permukaan kain kontrol negatif (5.000X) ........................ 104
Gambar 4.10 SEM permukaan kain kontrol positif (5.000X) ......................... 104
Gambar 4.11 SEM permukaan kain bioscouring selulase (5.000X) ...................... 104
Gambar 4.12 SEM permukaan kain kontrol negatif (500X) ........................... 104
Gambar 4.13 SEM permukaan kain kontrol positif (500X) ............................ 105
Gambar 4.14 SEM permukaan kain bioscouring selulase (500X) ......................... 105
Pendahuluan 1
PENDAHULUAN
A. DESKRIPSI
Bioteknologi dikembangkan untuk
meningkatkan nilai bahan mentah dengan
memanfaatkan kemampuan mikroorganisme
atau bagian bagiannya, misalnya bakteri dan
kapang yang digunakan untuk menghasilkan
enzim yang digunakan berbagai proses
industri. Penggunaan mikroorganisme tersebut
secara terarah dan terkontrol, yang
merupakan aplikasi terpadu antara biokimia,
mikrobiologi, bioteknologi, dan teknologi
kimia. Manfaat yang dirasakan manusia dari
kegiatan tersebut antara lain dalam bidang
industri, kesehatan, pertanian, dan
peternakan. Khususnya penggunaan biokimia,
mikrobiologi, dan rekayasa kimia secara
terpadu mempunyai tujuan untuk mencapai
penerapan teknologi dari kemampuan
mikroba.
Buku ini disusun dengan tujuan agar
dapat membantu mahasiswandalam proses
pembelajaran mahasiswa terutama dalam
2 Pendahuluan
meningkatkan pengetahuan mengenai
Bioteknologi dan penerapannya. Buku ini
memiliki peranan untuk membiasakan
mahasiswa untuk berfikir kreatif, berpikir kritis,
melatih keterampilan proses sains, dan
memiliki kemampuan untuk melakukan
pembelajaran berbasis project (Project Based
Learning) berdasarkan hasil penemuan yang
dilakukan sendiri sehingga mampu
merencanakan, melaksanakan, mengevaluasi.
Buku ini berisi merujuk hasil penelitian yang
berupa produksi dan uji aktivitas enzim
selulase dari kapang Trichoderma Viride
dengan menggunakan substrat limbah
pertanian, melakukan Purifikasi dan
Karakterisasi Enzim Selulase serta Aplikasinya.
Melalui buku ini mahasiswa diharap
kan mampu belajar secara mandiri dengan
atau tanpa kehadiran dosen serta mampu
memperdalam ilmu bioteknologi dan
aplikasinya dalam kehidupan sehari-hari.
B. PETUNJUK PENGGUNAAN BUKU
1. Pahami setiap materi teori dasar yang akan
menunjang dalam penguasaan suatu
pekerjaan dengan membaca secara teliti.
2. Berikan pendapat anda terhadap buku ini
untuk ditanyakan kepada dosen pengampu/
pembimbing pada saat kegiatan tatap muka.
Bacalah referensi lainnya yang berhubungan
dengan materi pada buku ini agar anda
mendapatkan tambahan pengetahuan.
Peta Konsep 3
PETA KONSEP 1
Mengukur aktivitas enzim dilakukan
Mengukur produktivitas enzim dilakukan
Dinokulasikan dalam proses
Siap digunakan dalam
Dari
mikroorganisme
Dengan substrat
LIMBAH PERTANIAN
PRODUKSI ENZIM SELULASE
KAPANG SELULOLITIK
PRETREATMENT
FISIK
PRETREATMENT
KIMIA
UJI AKTIVITAS
ENZIM
UJI KADAR
GULA REDUKSI
UJI KADAR
PROTEIN
PRODUKSI ENZIM
4
5
2
6
3
Bab I Enzim 7
BAB I
ENZIM
A. Pengertian Enzim
Enzim adalah biomolekul organik yang
kompleks yang tersusun atas polipeptida
(protein globuler). Enzim merupakan bagian
dari protein yang mengkatalis reaksi-reaksi
kimia, enzim juga dapat diartikan sebagai
protein katalisator yang memiliki spesifisitas
terhadap reaksi yang dikatalisis dan molekul
yang menjadi substratnya.
Enzim memiliki bentuk (konformasi)
tertentu yang spesifik terutama pada sisi
berikatan dengan substrat, enzim hanya
berikatan dengan substrat yang spesifik atau
terbatas. Enzim memiliki sifat spesifik sebab
merniliki tempat aktif yang mengakomodasi
substratnya. Enzim berperan sebagai
biokatalisator pada perubahan substansi kimia.
Enzim juga sebagai biokatalisator berperan
mempercepat terjadinya suatu reaksi tetapi
tidak ikut bereaksi. Zat yang digunakan oleh
8 Bab I Enzim
enzim disebut substrat, sedangkan hasilnya
disebut produk. Dapat dicontohkan dalam
metabolisme glukosa, perubahan glukosa
menjadi alkohol atau asam laktat melibatkan
berbagai jenis enzim yang terdapat dalam
mikroba fermenter. Selain itu, produk reaksi
awal digunakan sebagai substrat reaksi enzim
berikutnya dan seterusnya sampai dihasilkan
produk akhir. Enzim yang berperan sebagai
katalisator dalam proses degradasi selulosa
yaitu enzim selulase.
B. Enzim Selulase
Enzim selulase merupakan salah satu
enzim komersial yang memiliki nilai jual sangat
tinggi. Rahmadani dan Susanti (2013)
mengatakan dalam katalog Merck (2011),
harga selulase (cellulose Onozuka R-10 dari
Tricoderma viride) kemasan 5 g sekitar $3.000,
dan kemasan 25 g selulase sekitar $12.000,
sungguh mahal bukan? Penjualan selulase
terus mengalami pertumbuhan hingga 4% per
tahun. Dalam dunia industri aplikasi enzim
selulase sangat luas sebagai contoh yaitu di
bidang pangan, detergen, tekstil, bahan bakar
kimia, dan pengolahan limbah. Aplikasi
selulase saat ini juga mulai dikembangkan
dalam pengembangan protoplast, antibakteri
chitooligosakarida, immunomodulator dan
agen antitumor (Begum et al, 2012)
Bab I Enzim 9
Enzim selulase sendiri sesungguhnya
adalah sekelompok enzim yang memecah
selulosa menjadi monomer glukosa. Kelompok
enzim tersebut yaitu endoglukanase,
eksoglukanase dan β-glukosidase. Enzim
selulase mampu menghidrolisis selulosa
menjadi glukosa dengan cara memutuskan
ikatan glikosidik β-1,4 dalam selulosa,
selodekstrin, selobiosa, dan turunan selulosa
lainnya.
Enzim selulase merupakan enzim
ekstraseluler yang diproduksi di dalam sel dan
dikeluarkan dari sel untuk mencerna selulosa.
Oleh karena itu, produksi selulase secara
komersial biasanya menggunakan kapang
atau bakteri. Namun, Usaha pengembangan
teknologi enzim selulase terhambat karena
tingginya biaya produksi, sehingga nilai
ekonomi enzim yang dihasilkanpun tinggi.
Salah satu usaha yang dapat dilakukan untuk
menekan biaya produksi adalah dengan
memanfaatkan limbah pertanian yang
mengandung selulosa sebagai media
pertumbuhan mikroorganisme serta sebagai
pengganti substrat selulosa murni. Indonesia
sebagai negara yang banyak menghasilkan
bahan berselulosa (jerami padi, bagase, dan
sebagainya) sangat berpotensi untuk
mengembangkan industri penghasil enzim
selulase.
10 Bab I Enzim
C. Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh
beberapa faktor lingkungannya seperti
temperatur, keasaman (pH), konsentrasi
substrat, konsentrasi enzim dan aktivator.
Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim menurut sebagai berikut:
1. Suhu, setiap kenaikan 100C kecepatan
reaksinya menjadi dua kali lipat dalam
rentang suhu yang tidak beda jauh, hal ini
berlaku juga bagi reaksi katalisis enzim.
Ada enzim yang dapat bekerja optimal
pada pH tinggi dan ada pula yang bekerja
optimal pada pH yang rendah. Jika pH
terlalu tinggi atau terlalu rendah enzim akan
terdenaturasi dan ini akan mengakibatkan
menurunnya aktivitas enzim.
2. Keasaman, aktivitas enzim paling efektif
berkisaran pada pH optimum. Apabila
dinaikkan atau diturunkan akan maka
aktivitas enzim akan turun dengan cepat.
3. Konsentrasi Enzim, dan Kofaktor, jika pH,
suhu dan konsentrasi enzim suatu sistem
reaksi dala keadaan konstan, maka reaksi
awal sampai batas tertentu sebanding
dengan jumlah subtract yang ada. Jika
sistem enzim memerlukan suatu koenzim
atau ion aktivator maka konsentrasi subtrat
dalam keadaan tertentu dapat menentukan
laju keseluruhan sistem enzim itu.
Bab I Enzim 11
4. Inhibitor Enzim, enzim dapat dihambat oleh
zat kimia baik sementara maupun secara
tetap. Enzim dapat menjadi racun jika
terdapat di tempat yang salah.
5. Substrat, enzim mempunyai spesifitas yang
tinggi. Apabila substrat cocok dengan enzim
maka kinerja enzim juga akan optimal.
Substrat yang digunakan dalam proses
fermentasi berpengaruh terhadap aktivitas
dan produktivitas enzim. Adanya substat
tertentu di dalam medium produksi dapat
memacu mikroorganisme untuk mensekresi
metabolit selnya.
6. Waktu, waktu inkubasi optimum dalam
produksi enzim pada setiap mikroorganisme
berbeda-beda. Pada umumnya produksi
enzimtertinggidihasilkan pada fase
logaritmik/eksponensial pada kurva
pertumbuhan mikroba. Pertumbuhan
mikroorganisme sangat berpengaruh
terhadap produksi enzim. Pertumbuhan
mikroorganisme yang semakin cepat
menyebabkanpeningkatan produksi enzim.
Sedangkan penurunan produksi enzim
disebabkanoleh karena pertumbuhan sel
yang mengalami penurunan setelah
melewati fasestasioner. Selain itu sel
mikroba yang mati akan mengalami lisis
dan akan melepaskan protease endogenous
yang akan menghidrolisis enzim.
12 Bab I Enzim
1. Apa yang kamu ketahui tentang enzim
selulase?
2. Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis enzim
selulase!
3. Bagaimana mekanisme terbentuknya enzim
selulase?
7. Pengaruh ion, stabilitas enzim termasuk
selulase dapat dipertahankan dengan teknik
modifikasi kimia dengan penambahan
bahan tambahan atau aditif yang telah
diketahui dapat mempertahankan stabilitas
enzim.
TES FORMATIF 1
Bab II Produksi Enzim 13
Enzim selulase yang dihasilkan mikroorganisme mempunyai Karakteristik yang berbeda-beda, hal ini dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu, pH lingkungan tempat enzim bekerja, konsentrasi substrat tertentu dan waktu inkubasi. Semua enzim bekerja dalam rentang suhu tertentu pada tiap jenis mikroorganisme.
BAB II
PRODUKSI ENZIM
A. Sumber Enzim
Enzim selulase
merupakan enzim ekstra
seluler yang diproduksi di
dalam sel dan
dikeluarkan dari sel untuk
mencerna selulosa. Oleh
karena itu, produksi
selulase secara komersial
biasanya menggunakan
kapang atau bakteri.
Namun, Usaha
pengembangan teknologi enzim selulase
terhambat karena tingginya biaya produksi,
sehingga nilai ekonomi enzim yang
dihasilkanpun tinggi. Salah satu usaha yang
dapat dilakukan untuk menekan biaya produksi
adalah dengan memanfaatkan limbah
pertanian yang mengandung selulosa sebagai
media pertumbuhan mikroorganisme serta
BIO
INFO
14 Bab II Produksi Enzim
sebagai pengganti substrat selulosa murni.
Indonesia sebagai negara yang banyak
menghasilkan bahan berselulosa (jerami padi,
bagase, dan sebagainya) sangat berpotensi
untuk mengembangkan industri penghasil
enzim selulase.
Enzim selulase yang diproduksi ini
dihasilkan oleh kapang selulotik salah satunya
yaitu Trichoderma viride. Kapang selulolitik
adalah kapang yang memiliki kemampuan
menyerang atau mendegradasi selulosa
terutama pada kondisi aerob. Pemilihan
produksi enzim dalam hal kultivasi yang
digunakan untuk menentukan galur yang
spesifik akan menghasilkan kualitas enzim
yang baik. Berikut ini adalah sumber enzim
selulase yang bersal dari kapang selulolitik
dapat dilihat pada tabel 2.1.
Tabel 2.1 Sumber enzim selulase dan pektinase
(Li dan Hardin, 1997)
No Enzim Sumber Penandaa pH Suhu
1 Multifect selulase
Trichoderma longibrachiatum (terkenal T. reesi)
C1 4 50
2 Selulase Cl 184
Aspergillus niger C2 5 50
3 Selulase c8546
Trichoderma reesi
C3 4 50
* C1 dan P1 dari Genencor Intemational; yang lain dan Sigma Chemical Co.
Bab II Produksi Enzim 15
Trichoderma viride mengekskresikan
enzim ekstraseluler ke lingkungan untuk
mengurai substrat yang kompleks agar
memperoleh nuutrien-nutrien yang diperlukan.
Transportasi nurien ke dalam sel kapang
Trichoderma viride dapat berlangsung melalui
transportasi aktif. Untuk menghasilkan enzim
selulase kapang Trichoderma viride harus di
tempatkan pada media pertumbuhan yang
sesuai yaitu pada media yang banyak
mengandung selulosa, sehingga kapang
kapang akan menghasilkan enzim selulase
saja.
Gambar 2.1 a) Trichoderma Viride dalam media PDA umur 4 hari. b) Trichoderma Viride dalam media PDA umur 6 hari (Pratondo, 2018).
Adanya pertumbuhan oleh kapang
Trichoderma viride pada suatu substrat dapat
diketahui juga karena selain ada penambahan
masa sel, proses metabolisme menyebabkan
perubahan pada substrat, antar lain substrat
menjadi lunak, basah-basah, timbul bau yang
semula tidak tercium, timbulnya perubahan
warna, atau kekeruhan pada suatu substrat
b a
16 Bab II Produksi Enzim
cair. Pertumbuhan kapang Trichoderma viride
pada substrat sebenarnya adalah suatu proses
fermentasi, yaitu kapang Trichoderma viride
mengurai komponen kompleks yang ada
dalam substrat menjadi komponen sederhana
yang bisa diserap sel dan digunakan untuk
sintesis yang menghasilkan energi kegiatan.
Substrat yang digunakan pada produksi
enzim selulase ini adalah Ampas tebu
(baggase).Ampas tebu (baggase) mengandung
selulosa, hemiselulosa, dan lignin dengan
prosentase 50% selulosa, 25% hemiselulosa
dan 25% lignin.
Gambar 2.2 Ampas tebu halus (Pratondo, 2018).
Prosentase selulosa yang tinggi
memungkinkan Trichoderma viride memperoleh
nutrien yang diperlukan dengan
mengekskresikan enzim ekstraseluler ke
Bab II Produksi Enzim 17
lingkungan dan mengurai substrat ampas tebu
(baggase). Perolehan glukosa dengan
penggunaan substrat ampas tebu (baggase)
sebesar 47,213 % dan mampu mempercepat
proses hidrolisis. Penelitian lain juga
menyebutkan enzim selulase yang diperoleh
dari ampas tebu (baggase) sebesar 360 mg/L.
B. Kapang Selulolitik
Kapang atau moulds merupakan fungi
multiseluler berbentuk koloni dari suatu filamen
atau benang. Koloni tersebut dibangun oleh
suatu struktur dasar berupa tubulus berbentuk
silinder yang bercabang-cabang dengan
diameter bervariasi anatar 2 sampai 10 µm
dan disebut hifa. Lebar hifa dari suatu species
biasanya relatif konstan selama
pertumbuhannya. Koloni dari hifa-hifa ini
biasanyakan tumbuh bersamasama diatas
permukaan suatu media dan membentuk suatu
lempengan yang secara kolektif disebut
miselium, yang dapat dilihat secara mudah
tanpa mikroskop. Perkembangan miselium
terjadi karena pertumbuhan dari masing-
masing hifa dengan cara perpanjangan ujung-
ujung hifa dan percabangan dari hifa tersebut.
Hifa merupakan suatu tubulus yang
mengandung nucleus (inti) dengan jumlah lebih
dari satu (bahkan dapat berjumlah ratusan),
yang dilingkupi sitoplasma. Biasanya
sitoplasma dalam suatu hifa dapat saling
18 Bab II Produksi Enzim
bertukar. Beberapa hifa dapat terbagi menjadi
beberapa sel oleh adanya septa atau dinding
pemisah pada tempat-tempat tertentu
sepanjang hifa. Dalam tiap-tiap sel yang
dibatasi septa tersebut dapat terkandung satu
nukleus (hifa uninukleat), juga ada yang
mengandung lebih dari satu nukleus yang
disebut hifa multinukleat. Beberapa species
fungi lain, hifanya tidak mengandung septa
sehingga hifa tersebut tidak terbagi menjadi
beberapa sel. Hifa semacam ini disebut hifa
nonseptat atau hifa aseptat. Septa yang
membatasi tiap-tiap sel tidak sepenuhnya
membatasi sitoplasma sel yang berdekatan
melainkan masih ada pori yang
memungkinkan terjadinya perpindahan
sitoplasma dan nukleus antara sel-sel tersebut
sebagaimana terjadi pada hifa non septat. Ada
tidaknya septa ini sering digunakan sebagai
salah satu cirri dalam identifikasi.
Kapang atau moulds cenderung tumbuh
dengan baik pada permukaan substrat alami
maupun substrat buatan di laboratorium.
Dalam keadaan ini hifa yang menembus
medium dan menyerap nutrisi dari medium
disebut hifa vegetatif atau hifa substrat. Hifa ini
juga berfungsi menjaga menjaga agar kapang
tersebut dapat melekat atau menempelkan
dirinya pada substrat yang tersedia. Selain hifa
vegetatif dalam suatu kapang ada hifa yang
berfungsi lain yang biasanya tumbuh di
Bab II Produksi Enzim 19
permukaan medium (ke arah udara). Hifa yang
membentuk miselium di permukaan medium
berfungsi menghasilkan alat reproduksi berupa
spora bagi kapang tersebut. Hifa semacam ini
disebut hifa reproduktif. Adanya spora yang
dihasilkan hifa reproduktif pada permukaan
kapang menyebabkan warna permukaan
kapang tersebut dapat berbeda-beda
bergantung dari warna spora yang sedang
dihasilkannya. Misalnya talus kapang dapat
berwarna putih, kuning, hijau, biru kehijauan,
merah, coklat atau hitam. Dengan
dihasilkannya spora dalam jumlah yang sangat
banyak pada permukaan kapang,
menyebabkan spora dengan mudah dapat
disebarkan oleh angin ke segala arah dan bila
ditemukan tempat yang cocok akan
membentuk individu baru. Hal ini
menyebabkan kapang merupakan salah satu
kontaminan yang umum ditemukan di
laboratorium. Disamping itu spora kapang juga
sering bertindak sebagai agen terjadinya alergi
atau bahan yang bersifat alergen.
Kapang dapat ditemukan secaraluas di
berbagai habitat di alam dan juga dapat
ditemukan pada roti atau nasi basi, keju atau
buah-buahan. Bila miselium-miselium dari
kapang membentuk suatu struktur yang lebih
padat, lebih terorganisasi dan biasanya cukup
besar yang disebut tubuh buah atau fruiting
bodies, maka kapang ini dapat membentuk
20 Bab II Produksi Enzim
apa yang disebut jamur atau cendawan atau
mushroom. Cendawan umumnya dapat kita
lihat tanpa mikroskop dan dapat ditemukan
pada berbagai tempat seperti di tanah, kayu
lapuk, di permukaan akar tumbuhan konifer
atau di tempat-tempat lain yang lembab.
Kapang pada umumnya dapat diidentifikasi
dari morfologinya. Uji makroskopik dapat
didasarkan atas karakteristik-karakteristik
tertentu seperti kecepatan tumbuh, topografi,
tekstur permukaan (misalnya seperti kapas,
seperti beludru atau seperti tepung) dan
pigmentasi.
Kapang memiliki ciri-ciri tertentu. Berikut
ini adalah ciri-ciri dari kapang:
1. Kapang bersifat heterotrof, hal itu
disebabkan karena kapang tidak memiliki
klorofil untuk menghasilkan makanan
sendiri, jadi biasanya kapang hidup
bersimbiosis, dan ada juga sebagai parasit
dan saprofit.
2. Materi inti kapang di bungkus oleh
membran inti, oleh karena itu kapang
bersifat eukarion yaitu mempunyai inti
sejati.
3. Ukuran kapang bervariasi, hal ini
disebabkan karana kapang ada yang bersel
tunggal, dan ada juga yang bersel banyak
yang berbentuk filament. Oleh sebab itu
kita dapat menemukan kapang yang
berukuran sangat kecil (mikroskopis) dan
Bab II Produksi Enzim 21
ada juga yang ukurannya cukup besar
(makroskopis).
4. Perkembang biakannya secara generatif dan
ada juga yang vegetatif.
5. Habitat hidup di tempat yang lembab yang
mengandung zat organik yang
lingkungannya bersifat agak asam dan
kurang cahaya.
Berdasarkan struktur hifa, kapang
dibedakan menjadi dua kelompok yaitu hifa
tidak bersekat atau nonseptat dan hifa bersekat
atau septet. Kapang yang tidak bersepta yaitu
kelas Phycomycetes (Zygomycetes dan
Oomycetes) sedangkan kapang yang bersepta
meliputi kelas Ascomycetes, Basidiomycetes, dan
Deuteromycetes. Kapang berkembang biak baik
secara seksual ataupun aseksual. Secara seksual
dengan peleburan nukleus dari ke dua induknya,
sedangkan pada aseksual dengan pembelahan,
penguncupan, atau pembentukan spora.
Kapang dapat ditemui di berbagai
tempat, bahkan pada keadaan yang tidak
menguntungkan. Tentunya terdapat beberapa
faktor yang mempengaruhi pertumbuhan
kapang seperti suplai nutrisi, suhu, pH,
ketersediaan oksigen, dan komponen
penghambat.
Kapang selulolitik adalah kapang yang
memiliki kemampuan menyerang atau
mendegradasi selulosa terutama pada kondisi
aerob. Mikroorganisme tanah yang ada
22 Bab II Produksi Enzim
ternyata kapang merupakan spesies yang
paling tinggi kemampuan hidupnya dan juga
daya bersaing tinggi dibandingkan lainnya. Hal
ini disebabkan oleh laju pertumbuhan dan
germinasi yang tinggi, efisiensi tingkat
metabolik yang tinggi dalam menghasilkan
enzim serta mempunyai kemampuan
memproduksi senyawa tertentu seperti
antibiotik yang bersifat toksik bagi
mikroorganisme lainnya.
Kapang yang mampu menghasilkan
komponen selulase diantaranya Penicillium sp,
Aspergillus sp, Fusarium sp, Rhizopus sp,
Trichoderma viride,Mucor. Walaupun enzim
selulase dapat diproduksi oleh berbagai
macam mikroorganisme, enzim selulase dari T.
reesei atau T viride telah banyak dipelajari dan
mempunyai karakteristik yang paling baik.
Kapang dapat tumbuh pada kultur
goyang, pengaduk dan aerator maupun kultur
diam. Media kultur untuk pertumbuhan kapang
dapat menggunakan bahan alami maupun
sintetik. Kultur yang menggunakan bahan
alami dapat berasal dari ekstrak maltose
maupun ekstrak kentang. Sedangkan kultur
yang menggunakan bahan sintetik terdiri dari
karbon, gula, nitrogen, fosfat, magnesium,
kalium dan dilengkapi dengan bahan-bahan
pendukung lainnya. pertumbuhan kapang juga
dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu
substrat, kelembapan, suhu, derajat keasaman
dan bahan kimia.
Bab II Produksi Enzim 23
Setiap mikroorganisme mempunyai kurva
pertumbuhan, begitu pula dengan kapang.
Kurva pertumbuhan diperoleh dari menghitung
massa sel pada kapang atau kekeruhan media
pada khamir dalam waktu tertentu. Setiap
kapang mempunyai kurva pertumbuhan yang
berbeda-beda, kurva pertumbuhan ini
diperoleh dari menghitung jumlah atau bobot
sel kapang. Ada 6 fase pada kurva
pertumbuhan, yaitu: fase lag, fase akselerasi,
fase eksponensial, fase deselerasi, fase
stasioner dan fase kematian dipercepat. Fase
yang menghasilkan komposisi spora kapang
terbesar adalah pada fase eksponensial. Pada
fase ini tingkat kematian kapang sama dengan
tingkat pertumbuhannya, selain itu spora
kapang juga telah dibentuk secara optimal
dikarenakan adanya enzim yang menghambat
pertumbuhan kapang sehingga kapang
membentuk spora untuk dapat bertahan hidup.
Gambar 2.3. Kurva pertumbuhan fungi (1) Fase Lag; (2) Fase Akselerasi; (3) Fase Eksponensial; (4) Fase Deselerasi; (5) Fase Stasioner; (6) Fase Kematian. (Gandjar dan Wellyzar, 2006)
24 Bab II Produksi Enzim
Cara membuat kurva pertumbahan
adalah dengan mengisi 50 mL media substrat
dalam buffer asetat pH 5 dalam erlenmeyer
kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama
20 menit. Pada 12 buah erlenmeyer masing-
masing ditambahkan 1 mL inokulum kapang
(sebagai sampel) secara aseptik dan 12 buah
erlenmeyer yang lain dijadikan sebagai kontrol.
Kemudian ke-24 erlenmeyer tersebut dishaker
pada temperatur ruang, selanjutnya sampel
diambil tiap 24 jam sekali selama kurun waktu
288 jam untuk diukur berat keringnya.
Penentuan pertumbuhan kapang dilakukan
menggunakan metode pengukuran berat
kering. Data yang didapatkan adalah jumlah
berat kering yang diplotkan terhadap waktu
sehingga akan diperoleh grafik jumlah berat
kering vs waktu.
Gambar 2.4 a) Trichoderma Viride dalam media PDA umur 2 hari. b) Trichoderma Viride dalam media PDA umur 4 hari, c) Trichoderma Viride dalam media PDA umur 6 hari. (Sumber: Pratondo, 2018)
b a C
Bab II Produksi Enzim 25
Gambar 2.5 a) Trichoderma Viride dalam media PDB umur 2 hari. b) TrichodermaViridedalam media PDB umur 6 hari (Sumber: Dokumen Pribadi)
Trichoderma Viride mempunyai
karakteristik makroskopis bagian permukaan
akan terlihat putih bersih, dan bermiselium
kusam. Setelah dewasa, miselium akan warna
hijau kekuningan. Trichoderma viride tumbuh
optimal pada suhu 32-35°C serta pH sekitar 4.
Trichoderma viride merupakan jenis kapang
yang mampu menghancurkan selulosa tingkat
tinggi dan memiliki kemampuan mensintesis
beberapa faktor esensial untuk melarutkan
bagian selulosa yang terikat kuat dengan
ikatan hidrogen. Selulosa yang terikat tersebut
diuraikan menjadi glukosa dan gula sederhana
dengan menggunakan enzim selulase yang
dihasilkan oleh kapang tersebut.
Kapang dapat ditemui di berbagai
tempat, bahkan pada keadaan yang tidak
menguntungkan. Tentunya terdapat beberapa
faktor yang mempengaruhi pertumbuhan
kapang seperti suplai nutrisi, suhu, pH,
a b
26 Bab II Produksi Enzim
ketersediaan oksigen, dan komponen
penghambat.
Trichoderma viride merupakan kapang
yang termasuk dalam kelas Deuteromycetes,
mempunyai kemampuan selulolitik dan
termasuk mikroflora arobik misofilik. Kapang
Trichoderma viride bersifat saprofit dan dapat
ditemukan hampir pada semua jenis tanah.
Berikut klasifikasi kapang Trichoderma viride. Kingdom : Fungi
Divisio : Amastigomycota
Subdiviso : Deuteromycotina
Classis : Deuteromycetes
Ordo : Moniliales
Family : Moniliaceae
Genus : Trichoderma
Species :Trichoderma viride
Penentuan jenis kapang Trichoderma viride
dapat diketahui melalui ciri-ciri makroskopis
maupun mikroskopis. Secara makroskopis
pertumbuhan koloni kapang pada usia 1-2 hari
berwarna putih. Selanjutnya koloni akan
membentuk miselium yang tipis kemudian
berubah warna menjadi hijau tua. (Wirawan, A.
dkk, 2014). Warna hijau terbentuk karena
terdapat konidia.
Konidia berbentuk semibulat hingga oval
pendek dan berdinding relative kasar.
Konidofor bercabang menyerupai piramida
(Gandjar, dkk., 1999). Secara mikroskopis
Trichoderma viride memiliki ciri spesifik
miselium berseptat, konidiofora bercabang
Bab II Produksi Enzim 27
1. Sebutkan jenis kapang yang dapat memproduksi enzim selulase!
2. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kapang? Jelaskan!
3. Jelaskan masing-masing fase pada kurva pertumbuhan kapang!
banyak, septat, dan ujung percabangan
merupakan sterigma, memebentuk konidia
bulat atau oval, bewarna hijau terang dan
berbentuk bola-bola berlendir.
Gambar 2.6 a) Karakter makroskopis dan b) mikroskopis Trichoderma viride (Sumber: Volk, 2004)
Trichoderma viride merupakan salah satu
kapang yang dapat memproduksi enzim
selulase lengkap yaitu endoselulase dan
eksoselulase. Kapang ini tumbuh optimal pada
kisaran pH 4, suhu 32-350C. Sedangkan untuk
produksi enzim selulase pada kisaran pH 3-4
dan suhu 25-280C.
TES FORMATIF 2
a b
28 Bab II Produksi Enzim
TAHUKAH KAMU?
Syarat mikroorganisme yang digunakan
untuk produksi enzim secara komersial,
yaitu:
1. Dapat menghasilkan enzim ekstra seluler
2. Cukup stabil dan mempunyai
kemampuan produksi tinggi
3. Dapat tumbuh pada media yang relatif
murah
4. Tidak membentuk produk fermentasi
yang mengganggu pembentukan enzim
5. Pemanenan dan ekstrasi enzim dapat
dilakukan dengan mudah (Boing, 1982)
C. Substrat Produksi Selulase
Enzim selulase merupakan enzim
ekstraseluler, yaitu enzim yang dihasilkan di
dalam sel, tetapi dikeluarkan ke media
pertumbuhan selama fermentasi. Karena itu
untuk mengisolasi kapang yang dapat
menghasilkan enzim tertentu diperlukan
substrat yang mampu menginduksi enzim
tersebut. Substrat adalah reaktan dalam reaksi
yang dikatalisis enzim dan merupakan bahan
yang akan didegradasi oleh mikroba yang
ditambahkan kedalamnya, sehingga mikroba
dapat bertahan hidup dengan substrat tersebut.
Bab II Produksi Enzim 29
Substrat merupakan salah satu faktor yang
mempengaruhi proses fermentasi. Produksi
enzim selulase memerlukan substrat yang
biasanya berasal dari bahan berpati maupun
bahan berselulosa.
Limbah pertanian merupakan salah satu
sumber pencemar lingkungan. Madiun adalah
daerah dengan banyak jenis tanaman yang
menghasilkan banyak limbah, sebut saja
pohon jati, kulit padi, kulit kacang tanah, kulit
durian, dan sebagainya. Limbah-limbah
tersebutmasih diperlakukan sebagai sampah
tak bernilai dan pemanfaatannya masih
terbatas sebagai bahan bakar atau kompos.
Limbah pertanian umumnya merupakan
sumber selulosa yang murah serta penghasil
produk yang bermanfaat dalam proses industri
salah satunya adalah enzim selulase.
Kandungan selulosa dalam limbah pertanian,
membuat bisa dijadikan substrat dalam
produksi selulase melalui fermentasi dengan
bantuan mikroorganisme.
Enzim hanya bekerja pada substrat yang
spesifik untuk membentuk produk yang juga
spesifik. Pada enzim selulase substrat spesifik
tersebut adalah selulosa. Limbah pertanian
biasanya tidak hanya mengandung selulosa
saja, tetapi mengandung lignoselulosa yang
terdiri dari hemiselulosa, selulosa dan lignin.
Selulosa dalam lignoselulosa biasanya terikat
dengan lignin yang menyebabkan hidrolisis
30 Bab II Produksi Enzim
selulosa menjadi glukosa menjadi sulit tanpa
memecah pelindung lignin ini terlebih dahulu.
Oleh karena itu, untuk memproduksi selulase
dari selulosa yang berasal dari limbah
pertanian perlu dilakukan pretreatment
terlebih. Pretreatment yang dapat dilakukan
adalah pretreatment fisik dan pretreatment
kimia. Pretreatment fisik dilakukan dengan
mencacah substrat, sedangkan pretreatment
kimia dapat dilakukan dengan merendam
substrat ke dalam larutan NaOH pretreatment
kimia ini juga disebut dengan delignifikasi.
Ion OH- dari larutan NaOH dapat
menyerang dan merusak struktur lignin pada
bagian kristalin dan amorf serta memisahkan
sebagian hemiselulosa (Gunam dan Antara,
1999). Safaria, dkk (2013) mengatakan Ion
OH- dari NaOH akan memutuskan ikatan-
ikatan dari struktur dasar lignin sedangkan ion
Na+ akan berikatan dengan lignin yang belum
terputus ikatannya membentuk natrium fenolat.
Garam fenolat ini bersifat mudah larut.
Gambar 2.7. Pemutusan ikatan antara lignin dan selulosa oleh NaOH (Fengel dan Wegener, 1995)
Bab II Produksi Enzim 31
Gambar 2.8. Skema pemecahan lignoselulosa menjadi lignin, hemiselulosa dan selulosa (Mosier, dkk., 2005)
1. Langkah-langkah pretreatment substrat:
a. Menghaluskan limbah pertanian hingga
halus menjadi bubuk.
32 Bab II Produksi Enzim
b. Mengayak bubuk substrat hingga 60
mesh.
c. Menimbang bubuk substrat.
d. Merendam bubuk substrat dengan
larutan NaOH dengan perbandingan
1:10 (w/v) selama semalam.
Bab II Produksi Enzim 33
e. Mencuci substrat yang telah di rendam larutan NaoH dengan akuades hingga pH netral. pH netral dinyatakan pH yang sama dengan akuades.
f. Mengeringkan bubuk substrat dengan oven.
g. Substrat siap digunakan.
.
34 Bab II Produksi Enzim
KEGIATAN PROYEK MAHASISWA
“MEMBUAT SUBSTRAT SELULOSA”
A. Tujuan
Mahasiswa dapat mengenal, mendata dan
membuat substrat selulosa dari limbah
pertanian yang ada di lingkungannya.
B. Alat & Bahan
1. Pensil/bolpoint
2. Buku/kertas
3. Blender
4. Timbangan digital
5. Baskom
6. Kain
7. pH meter
8. Oven
9. Kamera
10. NaOH
C. Langkah Kerja
1. Buatlah kelompok yang terdiri dari 2 s/d 3
orang
2. Data dan carilah literatur tentang limbah-
limbah pertanian di daerah kalian yang
berpotensi untuk dijadikan substrat
selulosa.
3. Pilih salah satu limbah (masing-masing
kelompok harus berbeda)
4. Buatlah larutan NaOH konsentrasi 4% 1
M
5. Buatlah substrat selulosa dengan limbah
pertanian yang telah masing-masing
kelompok tentukan.
Bab II Produksi Enzim 35
D. Reagen DNS dan Bradford
Reagen adalah zat atau senyawa kimia
yang ditambahkan dengan tujuan untuk
membawa atau menyelenggarakan terjadinya
reaksi kimia untuk melihat jika reaksi terjadi.
Jenis-jenis reagen sangat bervariasi tergantung
pada kebutuhan yang digunakan. Dalam
modul ini dijelaskan reagen DNS dan reagen
Bradford, dimana reagen DNS adalah reagen
yang digunakan untuk menentukan kadar gula
reduksi dengan metode DNS. Sedangkan
reagen Bradford digunakan untuk menentukan
kadar protein dengan metode Bradford.
Sesungguhnya selain ke dua reagen dan
metode tersebut, masih banyak metode yang
dapat digunakan untuk mengukur gula reduksi,
untuk mengukur kadar gula reduksi contohnya
adalah pereaksi tembaga alkali (Somogyi) dan
pereaksi arsenomolibat (Nelson) dalam metode
Somogyi nelson, pereaksi Luff-Schoorl dalam
metode luff-schoorl, dan asam fenol sulfat.
Sementara untuk kadar protein dapat
menggunakan ninhidrin, biuret, milon dan lain-
lain berikut merupakan pereaksi yang paling
sering digunakan dalam pengujian gula
reduksi dan protein:
1. DNS (Dinitrosalisilic Acid)
Reagen DNS digunakan untuk mengukur
gula pereduksi dengan teknik kolorimetri
pada metode DNS. Teknik ini hanya dapat
mendeteksi satu gula pereduksi saja
36 Bab II Produksi Enzim
misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus
aldehida, sehingga dapat dioksidasi
menjadi gugus karboksil. Gugus aldehida
yang dimiliki oleh glukosa akan dioksidasi
oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus
karboksil dan menghasilkan sama 3-amino-
5-salisilat pada kondisi basa dengan suhu
90-100C. Senyawa ini dapat dideteksi
dengan spektrofotometer panjang
gelombang 540 nm.
Reagen DNS berwarna kuning dan
sangat sensitive pada cahaya. Penyimpanan
DNS harus pada botol gelap dengan suhu
rendah. Cara membuat reagen DNS:
a. Sebanyak 5 g DNS dan 5 gram NaOH 2
N dilarutkan dalam 100 ml akuades
(Larutan A)
b. Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat
dilarutkan dalam 200 ml akuades
(Larutan B)
Larutan A dan Larutan B dicampur, lalu
ditera dalam labu ukur dengan akuades
hingga volume akhirnya menjadi 500 ml,
kemudian diaduk dengan magnetic
stirrer.
Bab II Produksi Enzim 37
Larutan DNS + Larutan Na K Tartat di tera dengan akuades
DNS + NaoH DNS + NaoH dihomogenkan
Na K Tartat + akuades di Homogenkan
Larutan DNS + Larutan Na K Tartat
Homogenkan
3 4
5
1 2
38 Bab II Produksi Enzim
2. Reagen Bradford
Bradford adalah suatu uji untuk
mengukur konsentrasi protein total dengan
secara kolorimetri dalam suatu larutan.
Dalam Uji Bradford melibatkan pewarna
Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang
berikatan dengan protein dalam suatu
larutan yang bersifat asam sehingga
memberikan warna (kebiruan). karena
menghasilkan warna, sehingga secara
kolorimetri dapat diukur absorbansinya
dengan menggunakan spektrofotometer
pada penjang gelombang 595 nm. Reagen
Bradford dibuat dengan:
a. Menimbang 100 mg Commasie Brilliant
Blue G-250 dilarutkan dalam 50 ml
etanol 95%.
b. Kemudian ditambahkan 100 ml 85%
(w/v) asam fosfat.
c. Diencerkan sampai 1 liter sampai warna
melarut semua.
d. Menyaring dengan menggunakan kertas
saring Whatman No.1. reagen Bradford
harus berwarna cokelat muda jernih.
e. Penyaringan mungkin harus diulang
untuk memisahkan komponen pereaksi
yang berwarna biru (Bintang, 2010).
Bab II Produksi Enzim 39
Menimbang CBB G-250 CBB G-250 + Alkohol 95%
CBB G-250 + Alkohol 95% + asam fosfat 85%
Ditera dengan akuades
Menyaring dengan kertas
Whatman No.1 Menyaring ulang hingga
berwarna coklat jernih
1 2
4 3
5 6
40 Bab II Produksi Enzim
E. Gula Reduksi dan Kadar Protein
1. Menentukan kadar gula reduksi enzim
metode DNS menggunakan spektrofoto
meter
DNS digunakan untuk mengukur
gula reduksi yang diproduksi oleh mikroba
yang memiliki tingkat ketelitian tinggi. DNS
merupakan senyawa aromatis yang akan
bereaksi dengan gula reduksi maupun
komponen pereduksi lainnya untuk
membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid,
suatu senyawa yang mampu menyerap
dengan kuat radiasi gelombang
elektromagnetik pada panjang gelombang
540 nm. Semakin banyak komponen
komponenpereduksi yang terdapat dalam
sampel, maka akan semakin banyak pula
molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid
terbentuk dan mengakibatkan serapan
semakin tinggi (Sazciet, et all. 1986).
Reaksi dengan DNS yang terjadi
merupakan reaksi redoks pada gugus
aldehid gula dan teroksidasi menjadi gugus
karboksil. Sementara itu DNS sebagai
oksidator akan tereduksi membentuk 3-
amino dan 5-nitrosalicylic acid. Reaksi ini
berjalan dalam suasana basa. Bila terdapat
gula reduksi pada sampel, maka larutan
DNS yang awalnya berwarna kuning akan
bereaksi dengan gula reduksi sehingga
menimbulkan warna jingga kemerahan.
Bab II Produksi Enzim 41
2. Langkah uji gula reduksi metode DNS:
a. Menyiapkan sampel enzim sebanyak 1
ml
b. Menambahkan larutan CMC (Carbon
Metil Celullose) 1 % pada masing-
masing sampel enzim. Pembuatan CMC
1% sebanyak 50 ml adalah 0,05 g
CMC.
c. Menginkubasi sampel pada suhu 500 C
selama 5 s/d 30 menit (optimum 30
menit)
d. Menambahkan reagen DNS sebanyak 1
ml
e. Menginkubasi sampel pada suhu
1000C selama 5-15 menit hingga
berwana merah-coklat.
f. Meletakkan sampel di cuvet dan
dihitung absorbasinya dengan
spektrofotometer panjang gelombang
540 nm.
g. Mencatat nilai absorbansi sampel.
h. Menghitung kadar gula reduksi dengan
memasukkan pada persamaan linier
kurva standar glukosa y=ax+b dimana
y adalah nilai absorbansi sampel dan x
adalah kadar gula reduksi total.
42 Bab II Produksi Enzim
1 ml crude enzim +
CMC 1%
Ditambahkan reagen DNS
Diletakkan pada kuvet Dilihat absorabansinya
Diinkubasi pada suhu
1000C selama 15 menit
1
5 6
2
Diinkubasi pada suhu
500C selama 30 menit
4 3
Bab II Produksi Enzim 43
Kadar gula reduksi ditentukan dengan
membuat kurva standart glukosayang
berfungsi untuk mengetahui konsentrasi
larutan dengan nilai absorbansinya. Larutan
glukosa dipilih karena glukosa termasuk
gula reduksi yang dihasilkan dari hidrolisis
selulosa oleh enzim selulase. kurva standart
dibuat dengan minimal 6 variasi
konsentrasi. Hasil kurva standart memiliki
persamaan y = ax-b dimana x adalah
kadar glukosa dan y merupakan nilai
absorbansi glukosa pada setiap sampel.
Dengan demikian kadar glukosa dapat
diketahui.
3. Membuat kurva standart glukosa:
Membuat larutan stok glukosa standar
2 mg/ml = 2 mg
1 ml =
50 mg
25 ml =
0,05 g
25 ml
Untuk membuat stok larutan standart
glukosa 2 mg/mg dibutuhkan 0,05 g
glukosa, dilarutkan dengan akuades
sebanyak 25 ml. kemudian membuat
larutan glukosa dengan konsentrasi 0.2,
0.4, 0.6, 0.8 25, dst. Sebanyak 5 ml dibuat
sesuai dengan perhitungan menggunakan
rumus pengenceran sebagai berikut:
(1) Konsentrasi 0,2 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 2 mg/ml = 5 x 0,2 mg/ml
V1 = 0,5 ml larutan stok + 4.5
ml akuades
44 Bab II Produksi Enzim
(2) Konsentrasi 0.4 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 2 mg/ml = 5 x 0.4 mg/ml
V1 = 1 ml larutan stok + 4 ml
akuades
(3) Konsentrasi 0,6 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 2 mg/ml = 5 x 0,6 mg/ml
V1 = 1,5 ml larutan stok + 3,5
ml akuades
Dan seterusnya,
a. Membaca nilai absorbansi larutan
glukosa dengan spektofotometer
panjang gelombang 540 nm.
b. Membuat kurva standart glukosa dan
mencari nilai R2 sehingga mendapat
persamaan y= ax+b (Nilai R2 minimal
adalah 0. 97).
Gambar 2.9. Contoh kurva standar glukosa.
Bab II Produksi Enzim 45
4. Menentukan kadar protein dengan metode
Bradford menggunakan spektrofotometer
Kadar protein ditentukan digunakan
untuk mengukur aktivitas spesifik enzim.
Sebanyak 0.05 ml crude enzim
ditambahkan dengan 4 ml reagen Bradford
kemudian diinkubasi selama 5 menit.
Selanjutnya, campuran tersebut diukur
absorbansinya pada panjang gelombang
595 nm. Hasil pembacaan absorbansi
kemudian dikonversikan ke persamaan
linier standart protein. Pembuatan kurva
standart protein secara umum sama
dengan pembuatan kurva standart glukosa,
hanya saja glukosa diganti dengan bovine
serum albumin. Bovine serum albumin
adalah protein, penyimpanan harus di
tempat gelap dengan suhu rendah.
500 µ ml crude enzim
+ 4 ml reagen Bradford
Diinkubasi selama 5
menit di suhu ruang,
kemudaian siap dibaca
absorbansinya
1 2
46 Bab II Produksi Enzim
5. Membuat kurva standart BSA
Membuat larutan stok protein standar
1 mg/ml = 1 mg
1 ml =
10 mg
10 ml =
0,01 g
10 ml
Untuk membuat stok larutan standar BSA 1
mg/mg dibutuhkan 0,01 g BSA, dilarutkan
dengan akuades sebanyak 10 ml.
kemudian membuat larutan glukosa
dengan konsentrasi 0.02, 0.04, 0.06, 0.08,
dst. Sebanyak 3 ml dibuat sesuai dengan
perhitungan menggunakan rumus
pengenceran sebagai berikut:
(1) Konsentrasi 0,02 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 0.1 mg/ml = 3 x 0,02 mg/ml
V1 = 0,6 ml larutan stok +
2.4 ml akuades
(2) Konsentrasi 0.04 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 0.1 mg/ml = 3 x 0.04 mg/ml
V1 = 1,2 ml larutan stok +
1,8 ml akuades
(3) Konsentrasi 0,06 mg/ml
V1 X M1 = V2 X M2
V1 X 0.1 mg/ml = 3 x 0.06mg/ml
V1 = 1,8 ml larutan stok +
1.2 akuades
Dan seterusnya,
c. Membaca nilai absorbansi larutan
glukosa dengan spektofotometer
panjang gelombang 595 nm.
Bab II Produksi Enzim 47
1. Apa fungsi dari penambahan CMC 1%?
2. Mengapa absorbansi gula reduksi pada
metode DNS diukur pada panjang gelombang
540 nm?
3. Mengapa absorbansi protein pada metode
Bradford diukur pada panjang gelombang
595 nm?
4. Mengapa suhu dalam labu leher tiga harus
dipertahankan sekitar 500C?
5. Apa saja yang Anda ketahui mengenai
metode analisa kuantitatif glukosa?
d. Membuat kurva standart glukosa dan
mencari nilai R2 sehingga mendapat
persamaan y= ax+b (Nilai R2 minimal
adalah 0. 97).
Gambar 2.10. Contoh kurva standar BSA
TES FORMATIF 3
48 Bab II Produksi Enzim
F. Aktivitas Enzim
1. Aktivitas enzim selulase
Aktivitasenzim didefinisikan sebagai
kecepatan pengurangan substrat atau
kecepatan pembentukan produk pada
kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim
selulase didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang menghasilkan satu mikromol gula
reduksi (glukosa) setiap menit. (Lehninger,
1993). Penggunaan substrat spesifik dapat
dilakukan untuk menentukan aktivitas
selulase. Aktivitas endroglukanase dapat
dilakukan dengan menguji pada substrat
CMC (Carbonmethyl cellulose).
Penentuan aktivitas selulase akan
sulit apabila filtrat yang aan diukur aktivitas
enzimnya merupakan campuran dari
berbagai macam enzim selulase. Enzim-
enzim ini tidak hanya dapat menghidrolisis
substrat yang sama tetapi juga dapat
bekerja secara sinergis memecah substrat
yang sama, sehingga menyebabkan
aktivitas yang diukur dipengaruhi oleh
proporsi dari masing-masing enzim yang
ada.
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim selulase
a. Substrat
Enzim mempunyai spesifitas yang
tinggi. Apabila substrat cocok dengan enzim
maka kinerja enzim juga akan optimal.
Bab II Produksi Enzim 49
Substrat yang digunakan dalam proses
fermentasi berpengaruh terhadap aktivitas
dan produktivitas enzim. Adanya substat
tertentu di dalam medium produksi dapat
memacu mikroorganisme untuk mensekresi
metabolit selnya.
b. Waktu
Waktu inkubasi optimum dalam
produksi enzim pada setiap mikroorganisme
berbeda-beda. Pada umumnya produksi
enzim tertinggi dihasilkan pada fase
logaritmik/ eksponensial pada kurva
pertumbuhan mikroba.Pertumbuhan
mikroorganisme sangat berpengaruh
terhadap produksi enzim. Pertumbuhan
mikroorganisme yang semakin cepat
menyebabkan peningkatan produksi enzim.
Sedangkan penurunan produksi enzim
disebabkan oleh karena pertumbuhan sel
yang mengalami penurunan setelah
melewati fase stasioner. Selain itu sel
mikroba yang mati akan mengalami lisis
dan akan melepaskan protease endogenous
yang akan menghidrolisis enzim.
c. Suhu
Suhu sangat berpengaruh dalam reaksi
kimia. Jika suhu rendah reaksi kimia
berlangsung lambat, sedangkan pada suhu
yang lebih tingg ireaksi berlangsung lebih
cepat. Namun, kenaikan suhu dapat
menyebabkan terjadinya proses denaturasi,
50 Bab II Produksi Enzim
maka bagian aktif enzim akan terganggu
dan kecepatan reaksinya pun akan
menurun.
d. pH
Enzim selulase pada umumnya stabil
pada kisaran pH 5,0-8,0. Perunahan pH
lingkungan sangat berpengaruh terhadap
efektivitas bagian aktif enzim dalam
membentuk kompleks substrat. Jika kondisi
pH rendah atau pH tinggi dapat
menyebabkan terjadinya proses denaturasi
dan akan mengakibatkan aktivitas enzim
menjadi turun.
e. Pengaruh ion
Stabilitas enzim termasuk selulase
dapat dipertahankan dengan teknik
modifikasi kimia dengan penambahan
bahan tambahan atau aditif yang telah
diketahui dapat mempertahankan stabilitas
enzim. Aditif digolongkan menjadi
beberapa kelompok, yaitu substrata tau
koenzim, ion logam, garam, anion dan
kation, gula, dan glikol serta aditif lainnya.
f. Konsentrasi inokulum
Enzim selulase diperlukan jumlah
inokulum dan waktu inkubasi (fermentasi)
dalam jumlah yang sesuai agar
mendapatkan enzim selulase yang optimal,
sehingga aktivitas enzim selulase maksimal.
Konsentrasi inokulum adalah jumlah
mikroorganisme yang ditambahkan dalam
Bab II Produksi Enzim 51
substrat dan nutrisi untuk proses pembuatan
enzim selulase. Jumlah mikroorganisme
sangat berpengaruh dalam proses
fermentasi. Proses fermentasi dapat optimal
dengan menambahkan jumlah inokulum
dengan konsentrasi yang tepat, sehingga
didapatkan enzim selulase dengan aktivitas
enzim yang maksimal.
3. Pengukuran aktivitas enzim selulase
Pengukuran aktivitas enzim selulase
dapat dilakukan dengan metode DNS
berdasarkan jumlah kadar gula reduksi
hasil hidrolisis selulosa. Kadar gula reduksi
tersebut ditentukan dengan membuat kurva
standar glukosa yang telah dipelajari pada
bab menentukan kadar gula reduksi dan
protein halaman 24. Untuk melihat
besarnya satu unit aktivitas enzim tersebut
digunakan rumus (Amelia, 2012)
Aktivitas (U/ml)=mg glukosa x 1000
Mr glukosa x t x V
Keterangan:
Mr Glukosa = Berat Molekul Glukosa (180g/
mol)
t = Waktu inkubasi (menit)
V = Volume Enzim (mL)
52 Bab II Produksi Enzim
1. Apa yang kamu ketahui tentang aktivitas
enzim?
2. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi
aktivias enzim? Jelaskan!
3. Bagaimana cara mengukur aktivitas enzim
selulase? jelaskan!
Sedangkan untuk menentukan aktivitas
spesifik enzim selulase dihitung berdasarkan
(Nency, 2012) dengan rumus berikut:
Aktivitas spesifik=aktivitas enzim
konsentrasi protein
TES FORMATIF 4
G. Produksi Enzim Selulase
Tahap produksi enzim merupakan tahap
dimana enzim selulase dihasilkan melalui
proses fermentasi limbah pertanian sebagai
akibat dari metabolisme kapang. Menurut
Gandjar (2006) pada proses fermentasi
dilakukan pemberian larutan nutrisi untuk
melengkapi nutrisi yang dapat merangsang
pertumbuhan jamur. Nutrisi ini berupa karbon,
nitrogen, hidrogen dan mineral seperti fosfor,
sulfur, kalsium, kalium dan magnesium.
Sumber karbon yang digunakan berupa
selulosa yang berasal dari ampas sagu. Karbon
berfungsi sebagai unsur utama dalam
Bab II Produksi Enzim 53
pembentukan sel. Nitrogen berfungsi dalam
pembentukan asam amino, DNA, RNA dan
ATP. Hidrogen dan oksigen berfungsi dalam
proses pembentukan sel. Fosfor berfungsi
sebagai kofaktor enzim dan pembentukan
asam nukleat. Sulfur, kalium, dan kalsium
berfungsi sebagai kofaktor enzim. Magnesium
berfungsi untuk menjaga kestabilan ribosom,
membran sel dan asam nukleat, sebagai
kofaktor enzim, dan sebagai komponen dari
klorofil.
1. Media produksi enzim selulase
Media produksi enzim selulase sangat
beragam, pada umumnya media produksi
enzim selulase terdiri dari larutan yang
mengandung nutrisi yang sesuai untuk
pertumbuhan kapang. Media nutrisi untuk
meningkatkan produksi selulase dapat
menggunakan media mendels.
Komponen Komposisi
Urea 0.3 g/L
(NH4)2 SO4 1.4 g/L
KH2PO4 2.0 g/L
CaCl2.2H2O 0.4 g/L
MgSO4.7H2O 0.3 g/L
Peptone 0.75 g/L
Yeast extract 0.25 g/L
Bubuk substrat 10 g/L
Tween 80 0.2 mg/ml
MnSO4.7H2O 1.6 mg/ml
FeSO4.2H2O 5 mg/ml
ZaSO4.7H2O 1.4 mg/ml
CoCl2.6H2O 2 mg/ml
Sumber: Chand, dkk. 2004
54 Bab II Produksi Enzim
Gambar 2.11. Media Nutrisi Mendels
2. Produksi crude enzim selulase
Komponen utama dalam
memproduksi enzim adalah mikro
organisme selulolitik dan substrat selulosa.
Namun, untuk meningkatkan produktivitas
enzim selulase perlu menggunakan larutan
nutrisi yang berfungsi untuk memenuhi
kebutuhan unsure yang dibutuhkan kapang
untuk tetap hidup. Agar kapang terbiasa
dan dapat bertahan hidup pada larutan
nutrisi, maka proses aklimatisasi perlu
dilakukan. Aklimatisasi adalah suatu upaya
penyesuaian fisiologis atau adaptasi suatu
organisme terhadap lingkungan baru yang
akan kapang nantinya mampu
menyesuaikan diri dan bertahan hidup
pada lingkungan dengan medium nutrisi
pada proses produksi enzim.
Langkah-langkah produksi selulase:
Bab II Produksi Enzim 55
a. Membuat larutan nutrisi (sesuai kebutuhan)
Keterangan:
Setelah larutan dihomogenkan, larutan
perlu di atur pH nya. Pengaturan pH
sangatlah penting untuk dilakukan karena
kapang dapat tumbuh hanya pada pH
tertentu. pH larutan mendels optimum
adalah 5 s/d 5,5. Pengaturan pH dilakukan
dengan menambahkan NaOH apabila
larutan terlalu asam, ataupun dengan HCL
apabila larutan terlalu basa.
Mengatur pH
larutan nutrisi
Autoklaf pada suhu
1510C selama 15
menit
Menimbang semua bahan untuk larutan nutrisi
Menghomogenkan dengan akuades
1 2
3 4
56 Bab II Produksi Enzim
b. Persiapan inokulum kapang
Produksi enzim dengan fermentasi
cair dapat menggunakan kapang yang
ditumbuhkan pada medium cair.
Medium cair ini adalah PDB (Potato
Dextrose Broth). Kapang ditumbuhkan
pada medium PDB denganrotary shaker.
Cara memindahkan kapang yang
berada pada cawan petri medium PDA
adalah mengambil 2-3 ose kedalam
akuades steril, kemudian divorteks
hingga spora keluar dan air akuades
menjadi keruh, kemudian disuspensikan
kedalam media PDB. Kapang yang
disuspensikan ke medium PDB sebanyak
10%. Bentuk kapang yang ditumbuhkan
pada media PDB berbentuk granul
(bulat-lonjong).
Bab II Produksi Enzim 57
c. Aklimatisasi
Aklimatisasi dilalui agar kapang
dapat beradaptasi pada lingkungan
baru. Lingkungan baru disini adalah
larutan nurtrisi dengan substrat selulosa
dari limbah pertanian. Semakin banyak
tahap aklimatisasi dilakukan, daya
tahan kapang terhadap larutan nutrisi
semakin tinggi.
Tahap aklimatisasi 1
1) Mengambil kapang yang telah berusia
6 hari (kapang yang telah berada
pada fase lag) dari media PDB.
Kapang pada media PDA Disuspensikan pada
media PDB
Kapang umur 2 hari Ditumbuhkan dengan
rotary shaker
1 2
3 4
58 Bab II Produksi Enzim
2) Menyiapkan larutan nutrisi yang
telah di sterilisasi dan yang telah
disesuaikan pada pH 5.
3) Menimbang substrat limbah pertanian
sebanyak 1% (menyesuaikan
penelitian) ke dalam botol
4) Menambahkan kapang sebanyak
10% dan larutan nutrisi kedalam
botol yang telah terisi substrat limbah
pertanian.
5) Meletakkan botol kedalam rotary
shaker pada kecepatan 125 rpm
selama 6 hari.
Media nutrisi Media nutrisi + 1 % substrat +
10% kapang dari PDB yang
berisi kapang
Di inkubasi pada rotary shaker
selama 6 hari
2
3
1
Bab II Produksi Enzim 59
Tahap aklimatisasi 2: 1) Mengambil kapang yang telah
berusia 6 hari dari media
aklimatisasi 1 sebanyak 10%
2) Menyiapkan larutan nutrisi yang
telah di sterilisasi dan yang telah
disesuaikan pada pH 5.
3) Menimbang substrat limbah pertanian
sebanyak 1% (menyesuaikan
penelitian) ke dalam botol
4) Meletakkan botol kedalam rotary
shaker pada kecepatan 125 rpm
selama 6 hari.
Media Aklimatisasi 1
Media Nutrisi aklimatisasi
2 + 1% substrat + 10%
Media Aklimatisasi 1
Diinkubasi pada rotary
shaker selama 6 hari
1
2
3
60 Bab II Produksi Enzim
d. Produksi
Tahap produksi:
1) Mengambil kapang yang telah
berusia 6 hari dari media
aklimatisasi 2 sebanyak 10%.
2) Menyiapkan larutan nutrisi yang
telah di sterilisasi dan yang telah
disesuaikan pada pH 5.
3) Menimbang substrat limbah
pertanian sebanyak 1%
(menyesuaikan penelitian) ke dalam
botol.
4) Meletakkan botol kedalam rotary
shaker pada kecepatan 125 rpm
selama waktu yang diinginkan.
Media Nutrisi Produksi +
1% substrat + 10%
Media Aklimatisasi 2
Diinkubasi pada rotary
shaker selama waktu
panen yang diinginkan
2
1
Bab II Produksi Enzim 61
e. Pemanenan crude enzim selulase
Tahap pemanenan crude enzim:
1) Menyiapkan kertas Whatman No.1.
2) Menyaring larutan kedalam kertas
Whatman No.1.
3) Mensentrifugasi larutan dengan
kecepatan 3000 rpm selama 20
menit.
Menyaring larutan produksi dengan Whatman No.1 (Dokumen Pribadi)
Disaring hingga berwarna jernih (Dokumen Pribadi)
Dimasukan ke dalam cuvet (Dokumen Pribadi)
Disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 3000 rpm. (Dokumen Pribadi)
2
3 4
1
Crude enzim selulase (Dokumen Pribadi)
5
62 Bab II Produksi Enzim
KEGIATAN PROJECT MAHASISWA “MEMPRODUKSI ENZIM SELULASE”
A. Tujuan Mahasiswa mampu memproduksi enzim
selulase dengan substrat limbah pertanian lokal.
B. Alat & Bahan 1. Alat
Tabung reaksi, rak tabung reaksi, timbangan digital, hot plate, gelas ukur, beaker glass, erlenmeyer, cawan petri, jarum ose, bunsen, kulkas, incubator, autoclave, pH meter, magnetic stirrer, rotator orbital, sentrifuge, sentrifuge tube, pipet volume, micropipet dan tip, spatula, mikroskop cahaya, waterbath, spektofotometer, kertas saring Whatman No.1, alcohol 70%, alumunium foil, wrapping plastic, botol sprei, korek api.
2. Bahan Limbah pertanian, kapang selulolitik, Potato Dextrose Agar, akuades, NaOH 4%, Urea, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, Peptone, Yeast extract, Tween 80, FeSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2.6H2O
C. Petunjuk: 1. Buatlah kelompok yang terdiri dari 3 orang
mahasiswa. 2. Desainlah penelitian produksi enzim selulase
dengan kapang, substrat dan perlakuan yang berbeda (pH, waktu inkubasi, suhu, konsentrasi substrat) pada masing-masing kelompok
3. Produksilah enzim selulase sesuai dengan desain penelitian anda
Bab II Produksi Enzim 63
KEGIATAN PROJECT MAHASISWA “MENGUKUR GULA REDUKSI, PROTEIN
DAN AKTIVITAS ENZIM SELULASE”
A. Tujuan Mahasiswa mampu mengukur kadar gula
reduksi, kadar protein dan aktivitas enzim
selulase.
B. Alat & Bahan 1. Alat
Tabung reaksi, rak tabung reaksi,
micropipet dan tip, waterbath,
spektofotometer, kuvet.
2. Bahan
Enzim, Glukosa, Bovine Serum Albumin,
Reagen DNS, Reagen Bradford.
TAHUKAH KAMU?
Enzim selulase yang dihasilkan mikro
organisme mempunyai karakteristik
yang berbeda-beda, hal ini dipengaruhi
oleh factor lingkungan seperti suhu,
Ph lingkungan tempat enzim bekerja,
konsentrasi substrat tertentu dan waktu
inkubasi. Semua enzim bekerja dalam
rentang suhu tertentu pada tiap jenis
mikroorganisme. (Saropah dkk. 2012)
64 Bab II Produksi Enzim
C. Langkah
1. Mengukur kadar gula reduksi
a. Siapkan crude enzim selulase, masukkan
sebanyak 1 ml kedalam tabung reaksi
b. Tambahkan CMC 1% pada tabung
reaksi yang telah berisi crude enzim
selulase
c. Lakukan inkubasi pada suhu 500C
Selama 30 menit
d. Tambahkan reagen DNS, Selanjutlah
inkubasi pada suhu 1000C selama 5 s/d
15 menit sampai berwarna merah
e. Setelah dingin, letakkan pada kuvet dan
dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm.
f. Buatlah kurva standart glukosa.
g. Masukkan pada persamaan garis linier
kurva standar glukosa
2. Mengukur kadar protein
a. Siapkan 0.05 ml crude enzim selulase,
masukkan ke dalam tabung reaksi
b. Tambahkan 4 ml reagen Bradford
dan diamkan hingga 5 menit
c. Letakkan larutan pada kuvet dan
hitung absorbansinya pada panjang
gelombang 595 nm.
d. Buatlah kurva standar BSA
e. Masukkan persamaan garis liniernya
3. Mengukur aktivitas enzim selulase
a. Aktivitas enzim selulase
Aktivitas (U/ml)=mg glukosa x 1000
Mr glukosa x t x V
Bab II Produksi Enzim 65
b. Aktivitas spesifik enzim selulase
D. Data Hasil Penelitian
E. Pembahasan
F. Kesimpulan
Aktivitas spesifik=aktivitas enzim
konsentrasi protein
66 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
BAB III
PURIFIKASI ENZIM SELULASE
A. Pengertian Purifikasi
Purifikasi merupakan suatu metode
pemisahan enzim dari molekul-molekul protein
lain sehingga didapatkan enzim murni.
Purifikasi atau pemurnian protein dapat
dilakukan dengan beberapa cara diantaranya:
fraksinasi garam ammonium sulfat, polaritas
(pengendapan dengan etanol atau aseton),
kelarutan relatif protein karena pengaruh pH
(pengendapan isoelektrik). Purifikasi enzim
dengan fraksinasi garam ammonium sulfat
dilakukan secara bertahap dengan tujuan
untuk dapat memperoleh enzim selulase yang
semakin tinggi tingkat kemurniannya, dan
ditandai dengan semakin meningkatnya
aktivitas spesifik enzim tersebut. Purifikasi yang
tidak dilakukan secara bertahap akan
ditemukan protein yang berfungsi sebagai ko-
enzim pada fraksi hasil filtrasi.
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 67
Purifikasi protein menggunakan prinsip
salting out, yaitu pengendapan protein (enzim)
karena garam ammonium sulfat berikatan
dengan air. Molekul protein terdiri dari asam
amino hidrofilik dan asam amino hidrofobik.
Asam amino hidrofilik berinteraksi dengan air
sehingga protein akan larut dalam air
sedangkan bagian asam amino hidrofobik
akan mengendap. Penambahan konsentrasi
ammonium sulfat secara bertahap pada
fraksinasi menyebabkan garam ammonium
sulfat menarik beberapa molekul air yang
tersedia guna berinteraksi dengan asam amino
hidrofilik protein. Pada konsentrasi rendah, ion
akan mencegah bersatunya molekul serta
melindungi molekul protein sehingga protein
melarut, peristiwa ini disebut salting in.
Teknik purifkasi enzim/pemurnian enzim
dapat dilakukan berdasarka sifat-sifat enzim
sebagai protein yang berbeda dalam hal
kelarutan, muatan serta ukuran berat
molekulnya. Metode pemurnian enzim
diantaranya, filtrasi, dan kromatograf.
kromatrogafi adsorbs, kromatrografi afinitas
dan pengendapan.
1. Filtrasi
Filtrasi merupakan pemisahan padatan dari
sejumlah larutan melalui sebuah penyaring
sehingga paertikel padat akan tertahan di
penyaring tadi. Kecepatan aliran cairan
yang melewati penyaring bergantung pada
perbedaan tekanan, hambatan oleh materi,
68 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
kekentalan cairan, dan hambatan oleh
lapisan yang sudah terbentuk.
2. Kromatografi
Kromatografi merupakan cara pemisahan
berdasarkan perbedaan interaksi antara
komponen-komponen yang akan dipisahkan
dengan fasa diam dan fasa gerak.
3. Kromatografi filtrasi gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan
pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan ukurannya. Perlakuan enzim
selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan
ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi
gel menggunakan sephadex G-100.
Sampel diteteskan pada bagian atas kolom
gel sephadex G-100 yang berfungsi
sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat
pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak.
4. Kromatografi Penukar Ion
Terdapat dua fasa dalam kromatografi
kolom penukar ion, yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Dalam proses pertukaran ion,
fasa gerak bertugas mengambil kembali
ion-ion yang terkait pada penukar ion
dengan jalan mengalirkannya melalui
tumpukan penukar ion. Pada umumnya
proses ini berlangsung pada sebuah kolom,
dan fasa gerak ini dialirkan dari atas ke
bawah dengan kecepatan tertentu,sehingga
mampu menyebabkan reaksi pertukaran
ion ketika fasa gerak mengalir
melalui tumpukan resin penukar ion.
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 69
5. Pengendapan
Pengendapan biasa dilakukan dengan
menggunakan ammonium sulfat, pelarut
organic, dan polimer dengan berat molekul
tinggi.
Purifikasi enzim selulase dari kapang
Trichoderma viride ini menggunakan teknik
pengendapan. Purifikasi enzim dengan
fraksinasi garam ammonium sulfat dilakukan
secara bertahap dengan tujuan untuk dapat
memperoleh enzim selulase yang semakin
tinggi tingkat kemurniannya, dan ditandai
dengan semakin meningkatnya aktivitas
spesifik enzim tersebut. Purifikasi yang tidak
dilakukan secara bertahap akan ditemukan
protein yang berfungsi sebagai ko-enzim pada
fraksi hasil filtrasi. Purifikasi protein
menggunakan prinsip salting out, yaitu
pengendapan protein (enzim) karena garam
ammonium sulfat berikatan dengan air.
Molekul protein terdiri dari asam amino
hidrofilik dan asam amino hidrofobik. Asam
amino hidrofilik berinteraksi dengan air
sehingga protein akan larut dalam air
sedangkan bagian asam amino hidrofobik
akan mengendap. Penambahan konsentrasi
ammonium sulfat secara bertahap pada
fraksinasi menyebabkan garam ammonium
sulfat menarik beberapa molekul air yang
tersedia guna berinteraksi dengan asam amino
hidrofilik protein. Pada konsentrasi rendah, ion
70 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
akan melindungi molekul protein dan
mencegah bersatunya molekul sehingga
protein melarut, peristiwa ini disebut salting in.
Teknik pemurnian enzim dapat dilakukan
berdasarkan sifat-sifat enzim sebagai protein
yang berbeda dalam hal kelarutan, muatan
serta ukuran berat molekulnya. Metode
pemurnian enzim diantaranya pengendapan,
filtrasi, dan kromatograf. kromatrogafi adsorbs,
kromatrografi afinitas dan filtrasi.
1. Pengendapan
Pengendapan biasa dilakukan dengan
menggunakan ammonium sulfat, pelarut
organic, dan polimer dengan berat molekul
tinggi.
2. Dialisis
Dialisis adalah suatu teknik pemisahan
dengan cara menggunakan membrane
yang memisahkan dua frasa cairan.
Membran tersebut bersifat semipermebel
terhadap partikel solute. Partikel solute
berpindah melalui membran ke larutan
dengan konsentrasi rendah. Dialisis
digunakan untuk memisahkan garam-
garam dari suspense dalam biokimia
dengan tujuan untuk mencegah koagulasi
atau penggumpalan.
3. Filtrasi
Filtrasi merupakan pemisahan padatan dari
sejumlah larutan melalui sebuah penyaring
sehingga paertikel padat akan tertahan di
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 71
penyaring tadi. Kecepatan aliran cairan
yang melewati penyaring bergatnung pada
perbedaan tekanan, hambatan oleh materi,
kekentalan cairan, dan hambatan oleh
lapisan yang sudah terbentuk.
4. Kromatografi
Kromatografi merupakan cara pemisahan
berdasarkan perbedaan interaksi antara
komponen-komponen yang akan
dipisahkan dengan fasa diam dan fasa
gerak.
5. Kromatografi filtrasi gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan
pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan ukurannya. Perlakuan enzim
selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan
ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi
gel menggunakan sephadex G-100.
Sampel diteteskan pada bagian atas kolom
gel sephadex G-100 yang berfungsi
sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat
pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak.
6. Kromatografi Penukar Ion
Terdapat dua fasa dalam kromatografi
kolom penukar ion, yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Dalam proses pertukaran ion,
fasa gerak bertugas mengambil kembali
ion-ion yang terkait pada penukar ion
dengan jalan mengalirkannya melalui
tumpukan penukar ion. Pada umumnya
proses ini berlangsung pada sebuah kolom,
72 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
dan fasa gerak ini dialirkan dari atas ke
bawah dengan kecepatan tertentu,sehingga
mampu menyebabkan reaksi pertukaran
ion ketika fasa gerak mengalir
melalui tumpukan resin penukar ion.
Pemurnian dengan amonium sulfat,
purifikasi atau pemurnian merupakan suatu
metode pemisahan enzim dari molekul-molekul
protein lain sehingga didapatkan enzim murni.
Purifikasi atau pemurnian protein dapat
dilakukan dengan beberapa cara diantaranya:
fraksinasi garam ammonium sulfat, polaritas
(pengendapan dengan etanol atau aseton),
kelarutan relatif protein karena pengaruh pH
(pengendapan isoelektrik). Purifikasi enzim
dengan fraksinasi garam ammonium sulfat
dilakukan secara bertahap dengan tujuan
untuk dapat memperoleh enzim selulase yang
semakin tinggi tingkat kemurniannya, dan
ditandai dengan semakin meningkatnya
aktivitas spesifik enzim tersebut. Purifikasi yang
tidak dilakukan secara bertahap akan
ditemukan protein yang berfungsi sebagai ko-
enzim pada fraksi hasil filtrasi.
Purifikasi protein menggunakan prinsip
salting out, yaitu pengendapan protein (enzim)
karena garam ammonium sulfat berikatan
dengan air. Molekul protein terdiri dari asam
amino hidrofilik dan asam amino hidrofobik.
Asam amino hidrofilik berinteraksi dengan air
sehingga protein akan larut dalam air
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 73
sedangkan bagian asam amino hidrofobik
akan mengendap. Penambahan konsentrasi
ammonium sulfat secara bertahap pada
fraksinasi menyebabkan garam ammonium
sulfat menarik beberapa molekul air yang
tersedia guna berinteraksi dengan asam
amino hidrofilik protein. Pada konsentrasi
rendah, ion akan melindungi molekul protein
dan mencegah bersatunya molekul sehingga
protein melarut, peristiwa ini disebut salting in.
Prosedur yang dilakukan dalam purifikasi
dengan ammonium sulfat meliputi:
1. Mempersiapkan alat meliputi tabung reaksi,
erlenmeyer, gelas beker, gelas ukur, pipet
volum, pipet mikro, tips blue, autoclave,
neraca analitik, spatula, centrifuge, waterbath,
microcentrifuge tube, hot plate, cawan petri,
batang pengaduk, dan jarum ose.
2. Mempersiapkan bahan meliputi Potato
Dextrose Agar(PDA), Potato Dextrose
Broth(PDB), urea, 0,14 g (NH4)SO4, KH2PO4,
CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, pepton, yeast
extract, bubuk substrat, tween 80, MnSO4.
7H2O, FeSO4. 7H2O, ZnSO4. 7H2O,
CoCl2.6H2O, ammonium sulfat ((NH4)2SO4),
aquades, Comasie Brilliant Blue (CBB),
etanol (C2H5OH) 95%, asam fosfat (H3PO4)
85 %, 3,5-dinitrosalisilat (DNS), kalium
natrium tartrat (K-Na tartrat), glukosa
(C6H12O6), natrium hidroksida, bufer sitrat,
dan bufer fosfat.
74 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
3. Peremajaan kapang Trichoderma viride
pada media PDA.
4. Inokulasi Trichoderma viride dari medium
PDA ke medium PDB dengan cara
memindahkan 1 tabung inokulum dalam
100mL medium PDB aseptis lalu dikocok di
rotator selama 6X24 jam pada suhu ruang
dengan kecepatan 130 rpm (Azizah, 2017).
5. Produksi enzim selulase dilakukan dengan
menginokulasi secara aseptis 100mL (10%
v/v dari total volume fermentasi) ke dalam
1.000mL medium fermentasi yang terdiri
dari:
Nama bahan Gram/Liter
Urea 0,3 (NH4)SO4 1,4 KH2PO4 2 CaCl2.2H2O 0,4 MgSO4.7H2O 0,3 Pepton 0,75 Yeast extract 0,25 Tween 80 2 ml Bubuk substrat 1 MnSO4. 7H2O 1,6 FeSO4. 7H2O 5 ZnSO4. 7H2O 1,4 CoCl2.6H2O 2
Kemudian disterilkan pada suhu 1210C
selama 15 menit dalam autoklaf.
Selanjutnya media fermentasi yang berisi
10% medium inokulum di kocok dalam
rotator dengan kecepatan 120 rpm selama
6X24 jam.
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 75
6. Pemanenan crude enzymedilakukandengan
mensentrifugasi kultur pada kecepatan
3000 rpm selama 20 menit. Setelah itu
memisahkan cairan enzim (supernatan)
yang dihasilkan dari endapan (residu)
(Wahyuningtyas, dkk., 2013)
7. Mengambil crude enzyme dan menambahkan
amonium sulfat dengan kejenuhan tertentu
secara perlahan-lahan dan diaduk
mengunakan magnetic stirrer pada suhu
40C hingga larut.
Gambar 3.1 Penambahan ammonium sulfat Sumber:Fajarwati, 2018
8. Menyimpan di lemari pendingin selama
semalam.
9. Mesentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm
selama 20 menit.
Gambar 3.2 Sentrifugasi Sumber: Fajarwati, 2018
76 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
10. Memisahkan natan dan supernatan.
Gambar 3.3. Natan dan supernatant Sumber: Fajarwati, 2018
11. Menguji aktivitas enzim hasil purifikasi
pada setiap fraksi.
12. Menambahkan ammonium sulfat pada
supernatan fraksi 1yang diperoleh
berdasarkan tingkat kejenuhan fraksi
selanjutnya.
TUGAS MANDIRI
Kerjakan soal berikut dengan benar dan lengkap!
1. Bagaimana teknik pemurnian dengan metode
kromatografi filtrasi gel?
2. Apa yang terjadi jika urea dan pepton tidak ada
dalam media produksi?
3. Mengapa penambahan ammonium sulfat harus
dilakuakan dengan suhu 40C?
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 77
B. Uji Aktivitas Enzim Selulase
Aktivitas enzim selulase ditentukan berdasarkan
pembentukan produk gula dan konsentrasi
protein. Banyak uji maupun metode yang dapat
digunakan untuk mengetahui kadar glukosa
dan protein. Berikut beberapa metode yang
dapat digunkan untuk mengetahui kadar gula
dan protein, diantaranya:
1. Kadar Gula
a. Metode Folin-Wu
Analisis ini digunakan untuk analisis
kuantitatif glukosa dalam darah.
Glukosa akan dioksidasi oleh tembaga
alkali (mengandung ion kupri)
membentuk kupro, dan mengendap
menjadi kupro dioksida (Cu2O) yang
akan dioksidasi kembali oleh asam
fosmolibdat membentuk warna biru
gelap karena adanya oksida Mo.
Banyaknya Cu2O yang terbentuk
berbanding lurus dengan jumlah
glukosa dalam darah. Bahan yang
dibutuhkan untuk membuat pereaksi
adalah Na2CO3, CuSO4, asam tartrat,
asam molibdat, Na-tungsat, NaOH
10%.
b. Metode Somogyi-Nelson
Metode ini digunakan untuk mengukur
kadar glukosa secara kuantitatif. Protein
diendapkan dengan ZnSO4 dan
Ba(OH)2. Kupri oksida dioksidasi oleh
larutan tembaga alkali dengan
78 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
membentuk kupro oksida ini dioksidasi
kembali dengan asam arsen molibdat
yang akan membentuk warna biru
arsenmolibdat. Bahan yang dibutuhkan
pereaksi ini adalah ZnSO4 5%, Barium
hidroksida (BaOH) 0,3 N, Na2PO4, Na-K
tartrat, NaOH 1 N, ammonium
molibdat, H2SO4, dan asam molibdat.
c. Metode Luff-Schoorl
Metode ini digunakan untuk menentuksn
ksndungan glukosa secara kuantitatif
dalam bahan yang akan diuji, misalnya
pada reaksi titrasi indometri dari
kelebihan Cu. Bahan yang dibutuhkan
adalah asam sitrat, Na2CO3 anhidrat,
CuSO4.5H20, CH3COOH, iodium 0,1 N,
HCl 0,75 N, Na-tiosulfat 0,1 N, dan
larutan pati.
d. Metode Dinitrosalisilat (DNS)
Metode ini digunakan untuk mengukur
gula pereduksi dengan teknik
kolorimetri. Metode ini hanya dapat
mendeteksi satu gula pereduksi,
misalnya glukosa. Glukosa memiliki
gugus aldehida, sehingga dapat
dioksidasi menjadi gugus karboksil.
Gugus aldehida yang dimiliki oleh
glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-
dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil
dan menghasilkan asam 3-amino-
5salisilat pada kondisi basa dengan
suhu 90-1000C. Senyawa ini dapat
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 79
dideteksi dengan spektofotometer pada
panjang gelombang 540 nm. Bahan
yang dibutuhkan untuk membuat
pereaksi ini adalah 3,5-dinitrosalisilat,
NaOH 2 N, dan Natrium kalium tartrat.
e. Metode Asam Fenol Sulfat
Metode ini disebut juga TS (total sugar)
yang digunakan untuk mengukur total
gula. Metode ini dapat mengukur dua
molekul gula pereduksi. Gula sederhana,
oligosakarida, dan turunannya dapat
dideteksi dengan fenol dalam asam
sulfat pekat yang akan mengahsilkan
warna jingga kekuningan stabil. Bahan
yang dibutuhkan untuk membuat
pereaksi adalah fenol 5% dan H2SO4.
Sampel diukur absorbannya dengan
spektofotometer pada panjang
gelombang 490 nm.
2. Kadar Protein
a. Uji Biuret
Uji ini digunakan untuk uji umum
terhadap prtein, karena uji ini dapat
mendeteksi mendeteksi adanya peptide.
Uji biuret didasarkan pada reaksi antara
ion Cu2+ dan ikatan peptide pada
suasana basa. Warna komplek ungu
menunjukkan adanya protein. Intensitas
warna yang dihasilkan merupakan
ukuran jumlah ikatan peptide yang ada
dalam protein. Ion Cu2+ dari peraksi
biuret dalam suasana basa akan
80 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
bereaksi dengan polipeptida atau
ikatan0ikatan peptide yang menyusun
protein, dan membentuk senyawa
kompleks berwarna ungu atau violet.
Protein melarutkan tembaga untuk
membentuk warna. Bahan yang
dibutuhkan adalah Natrium hidroksida
10% dan larutan tembaga sulfat 0,1%.
b. Uji heller
Uji ini dapat digunakan untuk
menentukan adanya protein secara
kualitatif dan cepat. Protein akan
terkoagulasi dengan adanya asam kuat
atau akibat panas. Bahan yang
dibutuhkan adalah asam nitrat.
c. Uji Bradford
Uji Bradford dilakukan berdasarkan
pengamatan absorban maksimum untuk
larutan Coomassie Brillian Blue G-250
yang berkisar dari 465 ke 595 nm,
ketika terjadi pengikatan protein. Kedua
interaksi bersifat hidrofobik dan
menstabilkan ion bentuk anionic
pewarna yang menyebabkan perubhan
warna terlihat. Bahan yang dibutuhkan
untuk membuat reagen adalah
Coomassie Brillian Blue G-250, etanol
95%, dan asam fosfat 85%.
d. Uji Lowry
Uji ini merupakan uji pilihan untuk
menentukan kadar protein dalam suatu
bahan. Protein akan bereaksi dengan
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 81
Folin-Ciocalteau mmbentuk senyawa
kompleks yang berwarna. Pembentukan
warna disebabkan adanya reaksi antara
basa tembaga dengan sampel protein
yang diuji. Intensitas warna yang
terbentuk pada jumlah asam aromatic
yang berada untuk setiap jenis protein.
Bahan yang dibutuhkan unutk pereaksi
adalah Na-karbonat, NaOH, CuSO4.
5H2O, Na-K tartrat, dan pereaksi Folin-
Ciocalteau.
e. Uji Hopkins-Cole
Reaksi ini tergantung adanya triptofan
molrkul protein. Triptofan akan
berkondensasi dengan macam-macam
aldehida dengan adanya asam kuat,
sehingga terbentuk kompleks warna.
Bahan yang dibutuhkan untuk pereaksi
ini adalah bubuk magnesium (Mg) dan
asam oksalat.
C. Reagen Dinitrosalisilat (DNS) dan Bradford
Reagen adalah zat atau senyawa kimia
yang ditambahkan untuk melihat dan
mengetahui jika reaksi terjadi. Reagen DNS
digunakan untuk mengukur kadar gula
pereduksi dengan teknik kolorimetri.
Sedangkan reagen Bradford untuk mengukur
kadar protein dengan melibatkan larutan
Coomassie Brillian Blue G-250.
DNS merupakan senyawa aromatis yang
akan bereaksi dengan gula reduksi membentuk
asam-3-amino-5-dinitrosalisilat yang merupakan
82 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
suatu senyawa yang mampu menyerap dengan
kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada
panjang gelombang 540 nm. Pereaksi DNS
dapat bekerja dengan adanya komponen
pendukung yang membantu kerja DNS yaitu
KNa-Tartarat, fenol, sodium bisulfit (Na2SO3),
dan natrium hidroksida (NaOH).
Prinsip pengujian dengan metode
dinitrosalisilat (DNS) adalah gugus aldehid
pada rantai polisakarida dioksidasi menjadi
gugus karboksil, disaat yang bersamaan,
gugus aldehid gula akan mereduksi asam 3,5-
dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5-
nitrosalisilat. Reaksi tersebut akan berlangsung
terus-menerus selama terdapat gula pereduksi
dalam larutan yang diujikan (Hasanah dan
Iwan, 2015). Adanya gula pereduksi pada
sampel akan bereaksi dengan larutan DNS
yang awalnya berwarna kuning menjadi warna
jingga kemerahan. Prosedur pembuatan
reagen DNS sebagai berikut:
1. Menimbang 1 g DNS (3,5-dinitrosalisilic
acid) dan 1 g NaOH.
2. Melarutkan ke dalam 20 mL aquades
(Larutan A).
Gambar 3.4 Larutan DNS dan NaOH Sumber: Fajarwati, 2018
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 83
3. Menimbang 30 g Na-K tartrat.
4. Melarutkan ke dalam 40 mL aquades
(Larutan B).
Gambar 3.5 Larutan Na-K tartrat
Sumber: Fajarwati, 2018
5. Mencampur larutan A dan B kemudian
mengaduk dengan magnetik stirrer.
Gambar 3.6 Larutan campuran A dan B Sumber: Fajarwati, 2018
6. Menambahkan aquades hingga volume
akhir 100mL
Gambar 3.7 Penambahan aquades Sumber: Fajarwati, 2018
84 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
Reagen Coomassie Brilliant Blue (CBB)
akan bebas berwarna merah kecoklatan jika
berada pada suasana basa. Hal ini dikarenakan
Coomassie Brilliant Blue (CBB) mengandung
residu asam amino dengan rantai samping
aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan
Phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine,
Histidine dan Leucine) sehingga absorbansi
diukur pada panjang gelombang 465 nm.
Namun, reagen CBB akan berwarna biru jika
berada pada suasana asam. Selanjutnya
langkah-langkah pembuatan reagen Bradford
sebagai berikut:
1. Menimbang 10 mg Comasie Brilliant Blue
(CBB) G-250.
Gambar 3.8 Comasie Brilliant Blue (CBB) G-250 Sumber: Fajarwati, 2018
2. Melarutkan dalam 5 mL etanol (C2H5OH) 95%.
Gambar 3.9 Penambahan etanol Sumber: Fajarwati, 2018
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 85
3. Menambahkan 10 mL asam fosfat (H3PO4)
85 %.
Gambar 3.10 Penambahan asam fosfat Sumber: Fajarwati, 2018
4. Mengencerkan dengan aquadest hingga
volume 100 mL.
Gambar 3.11 Penambahan aquades Sumber: Fajarwati, 2018
5. Setelah larut sempurna disaring larutan
dengan menggunakan kertas saring
whatman no. 1 sesaat sebelum digunakan.
Spektrofotometer ultra-violet dan sinar
tampak dalam analisis kimia adalah untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Metode
spektrofotometri ultra-violet dan sinar
tampak berdasarkan pada hukum Lambert-
Beer. Hukum tersebut menyatakan bahwa
jumlah radiasi cahaya tampak, ultra-violet
dan cahaya-cahaya lain yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan
86 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
LEMBAR KEGIATAN PROYEK MAHASISWA
A. Indikator : Membuat reagen DNS dan Bradford
B. Tujuan : Mahasiswa mampu membuat reagen DNS dan Bradford melalui praktikum
C. Alat dan Bahan: 1. Magnetic
stirrer 8. Dinitrosalisilat (DNS)
2. Erlenmeyer 9. Na-K tartrat 3. Neraca analitik 10. NaOH 4. Gelas ukur 11. Aquades 5. Spatula 12. Etanol 95% 6. Corong kaca 13. Asam fosfat 85% 7. Kertas saring
whatman no.1 14. Comassie Brillian
Blue (CBB)
D. Cara Kerja
1. Reagen DNS a. b. c.
2. Reagen Bradford a. b. c.
merupakan suatu fungsi eksponen dari
konsentrasi zat dan tebal larutan (Triyati,
1985). Metode ini memerlukan suatu proses
pengompleksan sehingga dapat
membentuk warna yang spesifik pada
larutan agar terukur dalam
spektrofotometer UV-Vis.
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 87
D. Kurva Standar Glukosa dan Bouvine Serum
Albumin (BSA)
Kurva standar merupakan standar dari
sampel yang dapat digunakan sebagai acuan
untuk sampel tersebut pada percobaan.
Pembuatan kurva standar bertujuan mengetahui
hubungan antara konsentrasi larutan dengan
nilai absorbansinya sehingga konsentrasi
sampel dapat diketahui. Kurva standar
dibutuhkan untuk menentukan kadar gula
reduksi dan kadar protein. Pada penentuan
kadar gula reduksi dibutuhkan kurva standar
glukosa, sedangkan pada penentuan kadar
protein dibutuhkan kurva standar BSA.
Prosedur pembuatan kurva standar glukosa
dengan konsentrasi 2 mg/mL sebagai berikut:
1. Menimbang 0,05 mg glukosa.
2. Melarutkan dalam 25 mL aquades, larutan
ini sebagai larutanstok glukosa.
3. Mengencerkan larutan glukosa dengan
konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 mg/mL.
4. Mengambil 1 ml larutan standar glukosa
0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 mg/mL dan
memasukkan ke dalam tabung reaksi.
5. Memasukkan 1 mL reagen DNS dan
menghomogenkan.
6. Memanaskan selama 10 menit dan
didinginkan.
7. Setelah dingin mengukur serapannya
menggunakan spektofotometer pada
panjang gelombang (λ) 540 nm.
88 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
Gambar 3.12 Larutan Standar Glukosa Sumber: Fajarwati, 2018
Prosedur pembuatan kurva standar BSA
dengan konsentrasi 1 mg/mL sebagai berikut:
1. Menimbang 0,01 g BSA.
2. Melarutkan dalam 10 mL aquades, larutan
ini sebagai larutan stok BSA.
3. Mengencerkan larutan glukosa dengan
konsentrasi 0,02; 00,4; 0,06; 0,08; 1
mg/mL.
4. Mengambil 1 ml larutan standar BSA 0,02;
00,4; 0,06; 0,08; 1 mg/mL dan
memasukkan ke dalam tabung reaksi.
5. Memasukkan 4 mL reagen Bradford dan
menghomogenkan.
6. Menginkubasi selama 5 menit.
7. Setelah dingin mengukur serapannya
menggunakan spektofotometer pada
panjang gelombang (λ) 595 nm.
Gambar 3.13 Larutan Standar BSA Sumber: Fajarwati, 2018
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 89
TUGAS MANDIRI
E. Menentukan Kadar Gula Reduksi dan Kadar
Protein
Aktivitas enzim selulase dapat diketahui
berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk
dan kadar proteinnya. Salah satu mengukur
kadar gula pereduksi dengan metode 3,5-
dinitrosalisilat (DNS) dan metode Bradford
untuk mengeetahui kadar protein total.
Langkah-langkah yang dilakukan untuk uji
DNS sebagai berikut:
Kerjakan soal berikut dengan benar dan lengkap!
1. Diketahui absorbansi larutan glukosa sebagai
berikut:
Konsentrasi Absorbansi
0 0
0.2 0.474
0.4 0.843
0.6 1.296
0.8 1.833
1 2.267
1.2 2.644
Hitunglah persamaan garis linear dan
regresinya!
2. Pada pembuatan reagen BSA terdapat
penambahan etanol dan asam fosfat. Apa fungsi
etanol dan asam fosfat?
90 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
1. Memipet enzim sebanyak 0,2 mL.
Gambar 3.14 Memipet enzim Sumber: Fajarwati, 2018
2. Menambahkan 0,8 mL CMC 1% yang
dilarutkan dalam buffer sitrat.
Gambar 3.15 Memipet CMC 1% Sumber: Fajarwati, 2018
3. Menambahkan 1 mL buffer sitrat kemudian
menghomogenkan.
4. Menginkubasi di waterbath selama 10
menit pada suhu 500C.
Gambar 3.16 Inkubasi suhu 500C Sumber: Fajarwati, 2018
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 91
5. Menambahkan 1 mL reagen DNS 1%.
Gambar 3.17 Penambahan reagen DNS Sumber: Fajarwati, 2018
6. Memanaskan di air suhu 1000C selama 10 menit
Gambar 3.18 Pemanasan suhu 1000C Sumber: Fajarwati, 2018
7. Mendinginkan dan mengukur serapannya menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang (λ) 540 nm.
Gambar 3.19 Pengukuran absorbansi Sumber: Fajarwati, 2018
8. Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada
persamaan regresi linier kurva standart
glukosa
92 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan
dengan menggunakan kurva standar glukosa.
Aktivitas enzim selulase dinyatakan dalam
satuan internasional yaitu U/mL. Aktivitas enzim
selulase ditentukan dengan mengkonversi nilai
absorbansi yang diperoleh dari konsentrasi
glukosa standar, kemudian dihitung dengan
menggunakan rumus berikut:
AE = C
BM Produk x t x
H
E
Keterangan:
AE = Aktivitas enzim (Unit/mL)
C = Konsentrasi glukosa
BM = Berat molekul glukosa (180 g/mol)
T = Waktu inkuabasi (menit)
H = Volume total enzim-substrat (mL)
E = Volume enzim
Setelah diketahui aktivitas enzim
selanjutnya menentukan kadar total protein
dengan metode Bradford. Langkah-langkah
uji kadar protein sebagai berikut:
1. Mengambil cairan enzim selulase
(supernatan) sebanyak 0,2 mL.
Gambar 3.20 Memipet enzim Sumber: Fajarwati, 2018
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 93
2. Menambahkan 4 mL pereaksi Bradford.
Gambar 3.21 Larutan campuran enzim dan reagen Bradford Sumber: Fajarwati, 2018
3. Menginkubasi selama 5 menit.
4. Mengukur serapan larutan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang (λ) 595 nm.
Gambar 3.22 Mengukur absorbansi Sumber: Fajarwati, 2018
5. Absorbansi yag diperoleh diplotkan pada
persamaan regresi linier kurva standart
protein.
94 Bab III Purifikasi Enzim Selulase
LEMBAR PROYEK MAHASISWA
A. Indikator
Menghitung aktivitas enzim dan kadar protein.
B. Tujuan
Mahasiswa mampu menghitung aktivitas enzim
dan kadar protein melalui praktikum.
C. Alat dan Bahan
1. Spektofotometer 8. Tabung reaksi
2. Kuvet 9. Mikro pipet
3. Pipet volum 10. Enzim
4. Gelas beker 11. Reagen DNS
5. Kompor listrik 12. Reagen Bradford
6. Waterbath 13. Aquades
7. Rak tabung reaksi 14. Bufer sitrat
D. Cara Kerja
1. Uji Gula Reduksi
a.
b.
2. Uji Kadar Protein
a.
b.
E. Hasil
1. Kadar Gula Reduksi
No Sampel Absorbansi Kadar
Glukosa (mg/mL)
Aktivitas Enzim (U/mL)
1
2
3
Bab III Purifikasi Enzim Selulase 95
2. Kadar Protein
No Sampel Absorbansi Kadar Protein
(mg/mL)
1
2
3
F. Pembahasan
G. Kesimpulan
96 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
BAB IV
APLIKASI ENZIM SELULASE
A. Penggunaan Enzim selulase
Pengunaan enzim dalam bidang industri
sangatlah menjanjikan karena afek yang
ditimbulkan dalam hasil akhir dalam limbah
dapat diminimalkan karena enzim bersifat
biodegredebel mudah diurai. Pabrik yang
menggunakan teknologi enzim cenderung
memiliki modal lebih rendah dan biaya energi
lebih sedikit. Penggunaan enzim dalam industri
khususnya pada industri tekstil adalah relatif
baru. Enzim saat ini telah digunakan dalam
berbagai aplikasi untuk meningkatkan metode
produksi dan finishing kain pada dalam industri
tekstil. Proses enzimatis banyak dilakukan
karena dapat mengurangi penggunaan air dan
energi. Prosentase enzim yang digunakan untuk
industri tekstil sekitar 11%.
Salah satu aplikasi enzim tertua di
industri tekstil adalah penggunaan amilase
untuk menghilangkan pati yang digunakan
saat proses “sezing”. Benang warp (benang
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 97
posisi vertikal/ memanjang) sering dilapisi
dengan pati untuk memperkuat dan mencegah
agar tidak terkoyak selama ditenun. Selulase
telah menjadi alat dalam proses finishing dan
bioblasting kain. Keberhasilan penggunaan
enzim selulase dimulai pada proses finishing
danim dimana perlakuan dengan selulase
mampu menghasilkan kain denim mirip
dengan yang diproses menggunakan batu
apung abrasif. Proses bioblasting adalah
tahapan finishing kain untuk memodifikasi
permukaan kain katun dengan mengunkan
enzim selulase. Bioblasting dapat secara
permanen mencegah piling dan menjaga
kehalusan dan kelembutan kain dari waktu
kewaktu. Enzim selulase juga digunakan pada
proses scouring kain.
B. Bioscouring Kain
Serat mentah, benang atau kain
memiliki berbagai jenis bahan pengotor seperti
motes, fragmen kulit dari biji, pestisida,
kotoran, residu kimia, berbagai jenis garam
logam, dan belum menghasilkan serat yang
matang. Bahan pengotor bawaan dibuang di
ruang pengolahan sementara kotoran internal
dari serat kapas dilepas dengan proses
penggosokan/scouring process.
98 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
Gambar 4.1. Skema lapisan serat kapas (Rocky, 2012)
Komposisi dari serat kapas meliputi
selulosa (90% -94%), wax (0,6%1,3%), pectic
substance (0,9% -1,2%), protein (0,6% -1,3%),
abu (±1,2%), asam organik (± 0,8%) dan
bahan lain (± 1,2%). Tujuan utama dari
penggosokan/ scouring adalah untuk
menghilangkan wax, pectins, hemi-selulosa
dan mineral-mineral bawaan dari serat kapas
mentah. Proses tersebut dilakukan pada tahap
awal pengolahan tekstil dengan tujuan untuk
meningkatkan daya serap kapas sehingga
akan mengoptimalkan proses selanjutnya
seperti mercerizing, bleaching, dyeing, printing
dan finishing.
Scouring merupakan proses
penggosokan kain/kapas pada industri textile
dengan menggunakan bahan alam seperti
enzim (selulase, pectinase).
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 99
Gambar 4.2 Gambar tes pewarnaan pada serat kain
tanpa perlakuan enzim selulase (a) dan dengan
perlakuan enzim selulase (b) (tektiltoday, 2010)
C. Proses Bioscouring
Bioscouring pada kain bertujuan untuk
menghilangkan bagian dari komponen
penyusun serat berupa minyak, lilin, kotoran
yang tidak larut dan kotoran yang mnempel
pada permukaan serat dapat dihilangkan,
sehingga proses selanjutnya seperti
pengelantangan, pencelupan, pencapan dapat
berhasil dengan baik. Pada dasarnya proses
pemasakan atau scouring dilakukan dengan
alkali seperti NaOH (Natrium Hidroksida),
Na2CO3 (Natrium Karbonat), dan air kapur.
Sedangkan proses Bioscouring yaitu mengganti
alkali seperti NaOH (Natrium Hidroksida),
Na2CO3 (Natrium Karbonat), dan air kapur
dengan bahan yang tidak mencemari
lingkungan dan bersifat biodegredebel seperti
enzim selulase.
100 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
Penelitian yang telah dilakukan untuk
mengetahui potensi enzim selulase yang
berasal dari kapang Trichoderma viride,
penggunaan enzim sebanyak 1%, 2%, 3%, 4%,
dan 5%. Kontrol menggunakan NaOH sebagai
kontrol positif dan aquades sebagai kontrol
negatif. Berikut langkah-langkah dalam proses
bioscouring:
Mempersiapkan kain blacu atau kain
yang belum di scouring dan menimbangnya
pada timbangan digital seberat 4 gr sebagai
berat awal pada masing-masing kain balcu
sebelum diberi perlakuan. Proses pemasakan
atau bioscouring kain menggunakan resep
dengan vlot 1:40, dan kontrol positif NaOH
sebanyak 7 gr dalam 1 liter aquades.
1. Pemasakan kain dengan enzim 1%, 2%,
3%, 4%, dan 5%.
Kain yang digunakan di timbang
dengan berat 4 gr sebagai berat awal
sebelum di beri perlakuan pada setiap
masing masing kain, kemudian
menghitung jumlah larutan (aquades) yang
akan digunakan dengan vlot 1:40.
Kebutuhan aquadesnya sebanyak 160 ml,
aquades diukur dengan gelas ukur dan di
tuangkan pada gelas beker. Menghitung
kebutuhan enzim 1% dalam 160 ml larutan
dengan kebutuhan sebanyak 1,6 ml,
kebutuhan enzim 2% sebanyak 3,2 ml,
kebutuhan enzim 3% sebanyak 4,8 ml,
kebutuhan enzim 4% sebanyak 6,4 ml,
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 101
kebutuhan enzim 5% sebanyak 8 ml.
Masing masing Enzim tersebut di masukkan
dalam gelas beker yang telah berisi
aquades selanjutnya kain dimasukkan dan
di panaskan pada hot plate dengan suhu
40-50oC selama 1 jam. Larutan yang
digunakan untuk pemasakan kain tersebut
kemudian di ganti dengan aquades baru
selanjutnya dipanaskan lagi dengan suhu
75-90oC selama 15 menit. Kain diambil
dan dibilas sampai bersih menggunakan
air dingin, kemudian dikeringkan dengan
suhu 65oC selama 1 hari.
Kain ditimbang 4 gr Aquades160 ml
Pemasakan kain Penambahan enzim
Gambar 4.3 Skema Bioscouring kain
(Pratondo, 2018)
102 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
2. Pemasakan kain dengan NaOH
Kain yang digunakan di timbang
dengan berat 4 gr sebagai berat awal
sebelum di beri perlakuan pada setiap
masing masing kain, kemudian menghitung
jumlah larutan (aquades) yang akan
digunakan dengan vlot 1:40. Kebutuhan
aquadesnya sebanyak 160 ml, aquades
diukur dengan gelas ukur dan di tuangkan
pada gelas beker. Menghitung kebutuhan
NaOH dalam 160 ml larutan. NaOH yang
dibutuhkan yaitu sebanyak 1,12 g. NaOH
tersebut di masukkan dalam gelas beker
yang telah berisi aquades selanjutnya kain
dimasukkan dan di panaskan pada hot
plate dengan suhu 40-50oC selama 1 jam.
Larutan yang digunakan untuk pemasakan
kain tersebut kemudian di ganti dengan
aquades baru selanjutnya dipanaskan lagi
dengan suhu 75-90oC selama 15 menit.
Kain diambil dan dibilas sampai bersih
menggunakan air dingin, kemudian
dikeringkan dengan suhu 65oC selama 1
hari.
3. Uji prosentase penurunan berat kain
Perhitungan prosentase pengurangan
berat kain dengan menggunakan formula,
% penurunan berat kain=x -y
y×100, dimana 𝑥
adalah berat kain sebelum perlukuan, dan
𝑦 adalah berat kain sesudah perlakuan.
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 103
4. Uji daya serap kain terhadap zat warna
Kain direntangkan di atas gelas beker
menggunkan karet, setelah itu dilakukan tes
kecepatan daya serap kain pada zat warna
yaitu sudan III, congo red, dan naftol,
dengan cara meneteskan zat warna di atas
permukaan kain dan dihitung kecepatan
daya serapnya menggunakan metode
AATCC Test 79-2000.
Gambar 4.4 Tes daya serap kain terhadap zat warna (Pratondo, 2018)
D. Profil Permukaan Serat Kain
Gambar 4.5 SEM gambar Gambar 4.6 SEM gambar serat kain Kontrol negative serat kain scouring alkalin (1.500 X) (Adivarekar, 2013) (1.500 X) (Adivarekar, 2013)
104 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
Gambar 4.7 SEM gambar Gambar 4.8 SEM gambar permukaan kain permukaan kain Kontrol negatif (40 X) scouring alkalin (43 X) (Adivarekar, 2013) (Adivarekar, 2013)
E. Data Hasil Penelitian untuk Perbandingan
Proyek Mahasiswa
Gambar 4.9 SEM gambar Gambar 4.10 SEM gambar permukaan kain permukaan kain Kontrol negatif (5000X) Kontrol positif (5000X) (Pratondo, 2018) (Pratondo, 2018)
Gambar 4.11 SEM gambar Gambar 4.12 SEM gambar permukaan kain permukaan kain bioscouring selulase (5000X) Kontrol negatif (500X) (Pratondo, 2018) (Pratondo, 2018)
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 105
Gambar 4.13 SEM gambar Gambar 4.14 SEM gambar permukaan kain permukaan kain Kontrol positif (500 X) bioscouring selulase(500X) (Pratondo, 2018) (Pratondo, 2018)
F. Data Hasil Penelitian
1. Ativitas Enzim Selulase Data pengamatan aktivitas enzim selulase dapat dilihat pada tabel 5.1 berikut ini: Tabel 4.1 Aktivitas Enzim Selulase
Pelakuan
Substrat Bagas Kadar Protein
(mg/mL)
Gula Reduksi
(mm/mL)
Unit Aktivitas (U/mL)
Aktivitas Spesifik (U/mg)
S1 0.700 0.198 17.594 25.126
S2 0.702 0.268 23.853 33.983
S3 0.735 0.287 25.525 34.750
S4 0.755 0.368 32.742 43.366
Keterangan: S1 = Inkubasi 1 hari S2 = Inkubasi 3 hari S3 = Inkubasi 5 hari S4 = Inkubasi 7 hari
2. Kecepatan Daya Serap Kain Terhadap Zat Warna. Data pengamatan kecepatan daya serap kain terhadap zat warna dapat dilihat pada tabel 5.2 berikut ini:
106 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
Tabel 4.2 Kecepatan Daya Serap Kain Terhadap Zat Warna (detik).
Perlakuan
Kain Blacu
Sudan III Naftol (C10H8O)
Congo Red
U1 U2 U1 U2 U1 U2
Kontrol negatif 10 14 885 919 3073 3033 Kontrol positif 3 5 647 697 1869 1901 Enzim 1% 8 9 768 832 2980 2985 Enzim 2% 7 8 733 741 2965 2924 Enzim 3% 4 5 521 524 2914 2899 Enzim 4% 3 3 364 379 2424 2552 Enzim 5% 1 2 348 310 2222 2233
Keterangan: U1 = Ulangan 1 U2 = Ulangan 2
Tabel 4.2 menunjukkan bahwa prosentase enzim yang digunakan akan membuat semakin cepat pula daya serap kain terhadap zat warna hal ini menandakan bawah semakin besar penghilangan lemak, wax, ataupun kotoran yang ada pada kain sehingga daya serapnya semakin cepat.
3. Prosentase Pengurangan Berat Kain Data pengamatan prosentase pengurangan berat kain dapat dilihat pada tabel 4.3 berikut ini: Tabel 4.3 Prosentase Pengurangan Berat Kain (%).
Perlakuan Kain Blacu
U1 U2 U3
Kontrol negatif 0,25 0,5 0,25 Kontrol positif 1,25 1 1 Enzim 1% 0,5 0,5 0,5 Enzim 2% 0,5 0,75 0,75 Enzim 3% 0,75 0,75 0,75 Enzim 4% 0,75 0,75 1 Enzim 5% 1 1,25 1
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 107
Keterangan: U1 = Ulangan 1 U2 = Ulangan 2
Tabel 4.3 menunjukkan bahwa prosentase enzim yang digunakan maka semakin besar prosentase pengurangan berat kain ini menandakan bawah semakin besar penghilangan lemak, wax, ataupun kotoran yang dapa pada kain sehingga kain menjadi berkurang beratnya, walaupun pengurangannya sangat sedikit.
4. Dokumentasi Perlakuan
Perlakuan Keterangan
Kontrol Negatif (Aquades)
Sudan III Congo red Naftol
Kontrol Positif (NaOH)
Sudan III Congo red Naftol
a
b
c
a
b
c
108 Bab IV Aplikasi Enzim Selulase
Perlakuan Keterangan
Enzim 1%
Sudan III Congo red Naftol
Enzim 2%
Sudan III Congo red Naftol
Enzim 3%
Sudan III Congo red Naftol
a
b
c
a b
c
a
b
c
Bab IV Aplikasi Enzim Selulase 109
Perlakuan Keterangan
Enzim 4%
Sudan III Congo red Naftol
Enzim 5%
Sudan III Congo red Naftol
a
b
c
c
b
a
110 Glosarium
GLOSARIUM
Selulase : Nama bagi semua enzim yang memutuskan ikatan glikosidik beta-1,4 di dalam selulosa, sedodekstrin, selobiosa, dan turunan selulosa lainnya.
Selulosa
: Selulosa merupakan senyawa organik dengan rumus (C6H10O5)n, sebuah polisakarida yang terdiri dari rantai linier dari beberapa ratus hingga lebih dari sepuluh ribu ikatan β(1→4) unit D-glukosa. Selulosa merupakan komponen struktural utama dinding sel dari tanaman hijau.
Kapang Selulolitik
Kapang yang memiliki kemampuan menyerang atau mendegradasi selulosa terutama pada kondisi aerob
Substrat
: Reaktan dalam reaksi yang dikatalisis enzim. Substrat merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi proses fermentasi.
Aklimatisasi
: Aklimatisasi merupakan suatu upaya penyesuaian fisiologis suatu organisme terhadap lingkungan baru. Tujuan aklimatisasi adalah agar kapang nantinya mampu menyesuaikan diri dan bertahan hidup pada lingkungan dengan medium nutrisi pada proses produksi enzim.
Waktu Inkubasi
: Masa antara inokulasi sampai pertumbuhan koloni yang karakteristik atau sampai terjadinya gejala penyakit yang khas yang ditimbulkan oleh jasad
Glosarium 111
renik patogen. Inkubasi atau fermentasi adalah proses memanfaatkan kemampuan mikroba untuk mengasilkan metabolit primer dan metabolit sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan.
Crude Enzim
: Enzim kasar atau mentah yang diisolasi dari kecambah, biji-bijian atau tumbuhan
Gula Pereduksi
: Semua gula yang memiliki kemampuan untuk mereduksi dikarenakan adanya gugus aldehid atau keton bebas.
Aktivitas Enzim
: kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum
Aktivitas Spesifik Enzim
: Aktivitas spesifik menggambarkan aktivitas enzim untuk setiap mg enzim
Bioteknologi : Cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa.
Purifikasi enzim
: Merupakan proses pembersihan zat yang tidak diinginkan agar diperoleh enzim murni yang diinginkan.
Kapang : Fungi yang berfilamen dan multinukleat yang memiliki hifa.
Trichoderma viride
: Merupakan kapang yang dapat ditemukan di berbagai tempat dan merupakan salah satu kapang yang dapat memproduksi enzim selulase.
Bioprospecting : Eksplorasi materi biologis untuk genetik bernilai komersila dan sifat biokimia.
Biokatalisator : Senyawa yang mempercepat reaksi metabolisme tanpa mengalami perubahan struktur kimia.
112 Glosarium
Degradasi : Suatu reaksi perubahan kimia atau peruraian suatu senyawa menjadi senyawa lebih sederhana secara bertahap.
Bioscouring : Proses pembersihan bahan pengotor yang ada pada kain seperti motes, fragmen kulit dari biji, pestisida, residu kimia, berbagai jenis gram logam menggunakan agen mikroorganisme.
SEM : (Scanning Electron Microscopy) mikroskop optik metalurgi yang menggunakan prinsip refleksi, berarti bahwa permukaan spesimen memantulkan berkas media.
113 Glosarium
DAFTAR PUSTAKA
Arnata I. W,. 2009. Pengembangan Alternatif Teknologi Bioproses Pembuatan Bioetanol Dari Ubi Kayu Menggunakan Trichoderma viride, Aspergillus niger dan Saccharomyces cerevisiae. Tesis. Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian. Institut Pertanian Bogor
Aryani, S.B, Asmawit, Utomo P.P. 2014. Optimasi inkubasi produksi enzim selulase oleh Aspergilus niger menggunakan fermentasi substrat padat. Jurnal Biopropal Industri Vol. 5 No.2.
Begum S.F., Savitha, C., Jaison, J.P. 2012. Utilization of banana waste for effercyive production of cellulose by rhizopus sp. Research journal of pharmaceutical, Biological and Chemical Science. Volume 3 issue 1.p 674-683
Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. PT. Gelora Aksara Pratama: Jakarta
Boing JTP. 1982. Enzyme production. Di dalam Reed G, editor. Prescott &Dunns Industrial Microbiology 4th Ed.West Port: AVI.
114 Glosarium
Chand. P, A. Aruna, A.M. Maqsood and L.V. Rao. 2004. Novel mutation method for increased cellulase production. Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 318–323.
Enari, T.M. 1983. Microbial Celullose. In: Forgaty, W.M. 1985. Microbial Enzymes and Biotechnology. Appl.Sci.Publ. New York.
Fengel, D dan Wegener, G, 1995. Kayu: Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi. Terjemahan. Gadjah Mada University Press: Yogyakarta.
Gandjar, I. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Yayasan Obor Indonesia. Jakarta.
Gunam, I.B.W., dan Antara, N.S., 1999, Study on Sodium Hydroxide Treatment Of Corn Stalk to Increase Its Cellulose Saccharification Enzymatically by Using Culture Filtrate of Trichoderma reesei. Gitayana, Agric. Technol. J, 5 (1): 34-38
Heru, N. 2011. Diklat Bioteknologi. Universitas Negeri Yogyakarta. Yogyakarta.
Irawati,R. 2016. Karakterisasi pH, suhu dan konsentrasi substrat pada enzim selulase kasar yang diproduksi oleh bacillus circulans. Skripsi. Malang: Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang
Lehninger, A.L. 1993. Dasar-dasar biokimia. Jilid 1, 2, 3. (Alih bahasa oleh; M. Thenawidjaja). Erlangga, Jakarta.
Landecker, E. M. 1972. Fundamental of the Fungi. Prentice Hall Inc. NewYork.
Glosarium 115
Mandels, M. 1982. Cellulases. di dalam D. Pearlman (Ed) Annual reports on Fermentation Process. 5:39-44.
Montesqrit. 2007. Isolasi dan karakterisasi selulase dari trichoderma viride dan rhizopus spp dengan substrat jerami padi. Jurnal peternakan Indonesia, 12 (2):112-123, 2007.
Mosier, N., et al. 2005. Features of Promising Technologies for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass. Bioresource Technology 96(2005): 673-686.
Muchtadi, T.R. dan Sugiyono. 1992. Petunjuk Laboratorium Ilmu Pangan. PAU Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hal:4-20.
Ompusunggu, H.E.S., Juwita, Silaban, R. 2014. Kajian Biomedik Enzim Amilase dan Pemanfaatannya Dalam Indutri. Universitas HKBP Nommensen. Medan.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia press. Jakarta.
Pujiati., Ardhi M.W., Sulistyarsi. A. 2013. Isolation of Cellulolytic Mold from Soil of Teak Forest In Kresek, Madiun. Proceeding international conference. The 4th Green Technology Faculty of Science and Technology Islamic of University State Maulana Malik Ibrahim Malang
116 Glosarium
Pujiati., Kiswardianta, R.B., Solikawati, W. 2014. Pengaruh Konsentrasi dan Lama Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Selulase dari Kapang Aspergillus Niger. Jurnal LPPM Vol. 2 No 1. IKIP PGRI Madiun.
Pujiati., Widiyanto, J. 2017. Kapang Selulolitik. Program Studi Pendidikan Biologi Universitas PGRI Madiun: Madiun.
Roosdiana, A., Mufarrikha, I., dan Prasetyawan, S. 2014. Optimasi Kondisi Produksi Pektin dari Aspergillus niger. Universitas Brawijaya. Malang Saropah, A. Jannah, A., Maunatin, A. 2012. Kinetika reaksi enzimatik enkstrak kasar enzim bakteri selulolitik hasil isolasi dari bekatul. Alchemy. 2 (1): 34-35
Sulistyarsi, A., Pujiati., Ardhi, M.W. 2016. Pengaruh Konsentrasi dan Lama Inkubasi terhadap Kadar Protein Crude Enzim Selulase dari Kapang Aspergillus niger. Proceeding Biology Education Conference. Vol 13(1) 2016: 781-786
Wood, T. M. 1985. Aspects of the Biochemistry of Cellulose Degradation. p. 173-187. Di Dalam J. F.Kennedy, G. O. Phillips, D. J. Wedlock, and P. A. Williams (eds). Celllose and its Derivite; Chemistry, Biochemistry and Applications. Eleis Horwood Limeted, John Wiley and Sons.New York
117 Penulis
PENULIS
Pujiati Lahir di Bendo Kabupaten Magetan, 15 juni 1986. Bekerja sebagai dosen Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas PGRI Madiun sejak 2012. Ia memperoleh gelar Magister Sains dari Universitas Airlangga. Aktif melakukan penelitian bidang
Mikrobiologi terutama produksi dan aplikasi microbial enzym, aktif membuat artikel serta aktif mengikuti seminar nasional maupun international. Mata kuliah yang diampu adalah mikrobiologi dan bioteknologi. Selain aktif melakukan penelitian beliau juga aktif melakukan pengabdian kepada masyarakat. Pernah menjabat sebagai kepala Laboratorium Biologi Prodi Biologi dan sekarang menjabat sebagai Ketua Program Studi Pendidikan Biologi.
Muh. Waskito Ardhi Lahir di Ceper Kabupaten Klaten, 25 Februari 1984. Bekerja sebagai dosen di Prodi Pendidikan Biologi FKIP Uiversitas PGRI Madiun sejak 2011 sampai sekarang. Pernah menjadi dosen di Program Studi pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Surakarta 2006-
2010. Pernah menjabat sebagai sekertaris Prodi Pendidikan Biologi UNIPMA dan sekarang menjabat sebagai Ke.Lab Biologi FKIP UNIPMA.
118 Penulis
Endry Nugroho Prasetyo. , S.Si, MT.Dr. techn.
Bekerja sebagai dosen di Departemen Biologi ITS sejak 2000-sekarang. Beliau menyelesaikan S3 Universitaet Graz (TU Graz) Austria. Bidang pengajaran diantaranya Bakteriologi, Bioremediasi, Teknologi Enzim, Biokimia, Bioteknologi, Bioteknologi Lingkungan. Aktif menulis artikel di jurnal International.
Selain itu aktif pula sebagai konsultan industri baik nasional maupun internasional. Pengalaman Research scientist in European Union Biorenew Project [Sixth Framework Programme (FP6–2004-NMP-NI-4)] located in TU Graz Austria 2007-2010. 7th Frame European Cotton Bleach Project 2010-2011. British American Tobacco and TU Graz project colaboration for enzymatic removing cigarette toxicants 2011-sekarang dan research-research nasional lainnya.
Top Related