Biotechnologia w analizie,
ochronie środowiska,
medycynie i przemyśle
Biotechnologia w analizie,
ochronie środowiska,
medycynie i przemyśle
Redakcja:
Kinga Kropiwiec
Mirosław Szala
Lublin 2015
Recenzenci:
prof. dr hab. Stanisław Chibowski
dr hab. Małgorzata Cytryńska
prof. dr hab. n. med. Janusz Kocki
prof. dr hab. Jacek Goworek
dr hab. Krzysztof Grzywnowicz, prof. UMCS
dr hab. Waldemar Gustaw
dr hab. Jarosław Handzlik
dr Magdalena Jaszek
dr Anna Matuszewska
dr hab. Andrzej Mazur
dr hab. med. Radosław Rola
dr hab. Robert Stawarz, prof. UP
prof. dr hab. Ewa Solarska
prof. dr hab. Joachim Szulc
prof. dr hab. Krzysztof Winkler
Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.
Skład i łamanie: Ilona Żuchowska
Projekt okładki: Agnieszka Ciurysek
© Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL
ISBN 978-83-65272-06-5
Wydawca:
Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL
ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin
www.fundacja-tygiel.pl
Spis treści
Karolina Waleczek Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej części syneklizy
perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych ..................... 7
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi w syntezę EPS
R. leguminosarum bv. trifolii..................................................................... 19
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik,
Łukasz Sęczyk
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie ..................................... 30
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji ....................... 41
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji ......................... 53
Joanna Lach
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń
pierwszych zasad ....................................................................................... 67
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata
Sęczkowska
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III) w
obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia
bakteryjnego .............................................................................................. 78
Mateusz Niścior
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych ....................................................... 89
Mateusz Niścior
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie ....................................... 110
Magdalena Bartosiak, Agnieszka Dobrzańska
Biosensory w służbie zdrowiu ................................................................. 127
Adrian Odrzywolski
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne ........................................ 138
Jan Sobstyl, Paulina Sobstyl, Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna
Schab, Magdalena Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka,
Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał
monoklonalnych ...................................................................................... 149
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych
dziedzinach życia .................................................................................... 158
Marta Głogowska
Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku ........................ 171
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz-Wilkołazka
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii ......................... 178
Ewelina Zielińska, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów wybranych gatunków
pestkowców tropikalnych ........................................................................ 196
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle
spożywczym ............................................................................................ 209
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu ..................... 221
Ewelina Zielińska, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania ................. 231
Indeks autorów: ....................................................................................... 243
7
Karolina Waleczek1
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku
w polskiej części syneklizy perybałtyckiej
na podstawie danych z otworów wiertniczych
1. Wstęp
Przedstawione wyniki badań dotyczą osadów dolnego paleozoiku
należących do obszaru polskiej części platformy prekambryjskiej. Celem
analizy było zdefiniowanie typów litofacji budujących profil dolnego
paleozoiku obniżenia perybałtyckiego. Ustalono również ich sukcesję
czasową oraz skonstruowano typowe profile dla poszczególnych okresów.
Został stworzony schemat litostratygrafii dolnego paleozoiku dla badanego
terenu. Na końcu przedstawiono zbiorczy przekrój geologiczny prezentujący
zgeneralizowany rozkład litofacji dolnego paleozoiku.
Do wyżej zarysowanych celów badawczych wyznaczono linię przekroju,
wzdłuż której wybrano 18 najbardziej reprezentatywnych otworów wiertniczych
dochodzących głębokością do podłoża krystalicznego lub do kambru dolnego
i środkowego. Dane o otworach pochodzą z Centralnej Bazy Danych
Geologicznych Państwowego Instytutu Geologicznego [1].
2. Położenie obszaru badań
Badany obszar obejmuje rejon Polski północno-wschodniej rozciągający
się, w ujęciu geograficznym, od Pojezierza Wschodniopomorskiego na
zachodzie po Pojezierze Litewskie na wschodzie. Geologicznie teren ten
należy do jednostki tektonicznej platformy wschodnioeuropejskiej, która
jest, obok platformy zachodnioeuropejskiej i orogenu karpackiego, jedną
z trzech megajednostek tektonicznych Polski [2].
2.1. Synekliza perybałtycka – uwarunkowania geologiczne
Regionalnie badany teren należy do rozległego obniżenia południowej
części platformy określanego jako synekliza perybałtycka. Jej obszar
rozciąga się na północ i północny-wschód, poza teren Polski, aż po tarczę
bałtycką półwyspu skandynawskiego [3]. W pracy uwzględniona jest jedynie
[email protected], Uniwersytet Jagielloński, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Instytut
Nauk Geologicznych, http://www.ing.uj.edu.pl/
Karolina Korzeniowska
8
część należąca do Polski. Cechą charakterystyczną osadów wypełniających
obniżenie jest monoklinalne zaleganie z tendencją do pogłębiania się spągu
w kierunku południowo-zachodnim, do granicy ze strefą Teisseyre’a-
Tornquista [4]. Zasięg syneklizy na terenie Polski przedstawia Rys.1.
Rysunek 1 Położenie syneklizy perybałtyckiej na tle jednostek geologicznych Polski [2]
W okresie wczesnego paleozoiku platforma prekambryjska stanowiła
część mikrokontynentu Baltica. Teren syneklizy przez cały ten okres
znajdował się w obrębie płytkiego morza epikontynentalnego [5]. Stąd też
osady wypełniające obniżenie składają się głównie ze skał klastycznych oraz
z interkalacjami facji węglanowych.
2.2. Teren badań
Na obszarze syneklizy wyznaczono linię przekroju, wzdłuż której
dobrano otwory wiertnicze, których profile litologiczne posłużyły jako dane
wyjściowe do dalszych interpretacji. Pozycję linii na mapie wraz
z orientacyjnie zaznaczonymi otworami przedstawia Rys. 2.
Rysunek 2 Linia przekroju wraz z zaznaczonymi lokacjami otworów wiertniczych
wykorzystanych w badaniu [opracowanie własne]
Otworami wiertniczymi, których dane zostały wykorzystane na potrzeby
badania są odpowiednio (od zachodu): Niestopowo 1, Gdańsk IG-1,
Młynary-3, Żelazna Góra 5, Dębowiec Warmiński-2, Dębowiec Warmiński
3, Glądy 4, Gałajny 1, Piasek 1, Bąsze 1, Liski 1, Sępopol 2, Barciany 3,
Barciany-4, Lesieniec-1, Gołdap IG-1, Łopuchowi IG-1 oraz Zaboryszki. Ich
odwierty zostały sporządzone głównie w latach 70. i 80. ubiegłego wieku
jako wiercenia badawcze lub surowcowe (poszukiwawcze). Wszystkie
wybrane otwory głębokością dosięgają do spągu kambru dolnego,
,
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej
części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
9
środkowego lub kambru górnego. Dane dotyczące otworów pobrane
z Centralnej Bazy Danych Geologicznych niezależnie od daty sporządzenia
opatrzone są w większości weryfikacją z 2008 roku. Dobadań wykorzystano
profile litologiczne oraz w pewnym stopniu dane litostratygraficzne
i chronostratygraficzne.
3. Wyniki badań
Interpretację profili uzupełniono danymi literaturowymi, z uwzględnieniem
dotychczasowych badań innych autorów, którzy prowadzili prace na danym
terenie.
3.1. Litologie dolnego paleozoiku
Poniższe podrozdziały zawierają szczegółowy opis wspomnianych
osadów dolnopaleozoicznych wypełniających obniżenie perybałtyckie.
3.1.1. Osady kambru
Sukcesja litologiczna kambru zdominowana jest klastycznymi utworami;
naprzemianległymi warstwami piaskowców, mułowców i iłowców.
Piaskowce są osadem wysokoenergetycznego środowiska pływowego
– pozostałe facje (bardziej drobnoziarniste – np. mułowce bitumiczne
formowały się w warunkach płytkiego morza epikontynentalnego [6].
Analizując profile litologiczne zauważa się, że przeważają ilościowo
piaskowce kwarcytowe, które często są przewarstwiane ciemnoszarymi
iłowcami. Zdarzają się w piaskowcach nagromadzenia glaukonitu, nawet
w większych ilościach. Rzadkie są warstwy wapieni gruzłowych lub wapieni
marglistych oraz zlepieńce i bituminy – te ostatnie są bardzo charakterystyczne
dla wczesnego kambru.
Na podstawie osiemnastu profili pobranych z bazy stworzono zbiorczy
profil, będący „typowym” profilem kambru.
Badania wykazały, że najczęściej kambr rozpoczyna się osadami
drobnoziarnistymi, będącymi piaskowcami lub piaskowcami mułowcowymi
o niewielkiej miąższości. Po nich następują osady mieszane, najczęściej
przewarstwienia piaskowców oraz iłowców, rzadziej mułowców. Powyżej
zalegają dużej miąższości piaskowce kwarcytowe, często z przewarstwieniami
iłowców lub mułowców. Można je podzielić na pakiety, które są
porozdzielane wkładkami naprzemianległych warstw jasnych piaskowców
i ciemnych iłowców. Zarówno w tych piaskowcach, jak i w piaskowcach
kwarcytowych znajdują się często nagromadzenia glaukonitu. Istnieje
zależność pomiędzy osadami mieszanymi a piaskowcami kwarcytowymi,
która polega na kompensowaniu miąższości – jeżeli piaskowce są dużej
miąższości, to osady mieszane małej i na odwrót. Profil najczęściej kończy się
Karolina Korzeniowska
10
piaskowcami kwarcytowymi lub przewarstwieniami iłowców i mułowców.
Zdarzają się także w stropie facje wapienne, kontynuujące się w późniejszej
sukcesji ordowickiej. Profil stanowi pewne uogólnienie, założyć trzeba więc, że
analizując dowolne pojedyncze profile, miąższości poszczególnych litologii
mogą być zmienne, niektóre osady mogą w ogóle nie występować,
a niektóre mogą mieć dodatkowe przewarstwienia.
Sporządzony ogólny profil przedstawia Rys. 3. Miąższości odzwierciedlają
częstość występowania poszczególnych litologii w profilu.
Rysunek 3 Zbiorczy profil osadów kambru [opracowanie własne]
3.1.2. Osady ordowiku
Utwory ordowiku reprezentują facje węglanowo-terygeniczne
deponowane w warunkach płytkiego morza szelfowego. Jako osady
o proweniencji terygenicznej wyróżnia się iłowce mułowcowe oraz cienkie
warstewki piaskowców. Fację węglanową, morską tworzą wapienie, margle
i iłowce margliste [7].
Wykazano, że najczęstszymi litologiami ordowiku są wapienie oraz
margle, znacząco przeważające nad resztą osadów. Występują one jako
wapienie organodetrytyczne, pelityczne, gruzłowe, dolomityczne, wapienie
zailone oraz jako forma pośrednia – wapienie margliste. Margle najczęściej
występują obocznie z wapieniami lub z marglami dolomitycznymi. Skały
silikoklastyczne reprezentowane są przez iłowce, w większości wapniste
,
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej
części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
11
i margliste oraz przez pojedyncze warstwy zlepieńców, mułowców
i piaskowców.
Profil zbiorczy dla ordowiku rozpoczynają osady terygeniczne głównie w
postaci wapnistych ciemnych iłowców lub miejscami wapieni. Powyżej
iłowce przechodzą już bezpośrednio w wapienie różnego rodzaju. Nad nimi
zalegają margle przeławicane wapieniami lub wapienie margliste. Ta seria
skalna jest dominująca w profilu. Powyżej często znajduje się niewielkiej
miąższości warstwa wapienia. Profil kończą przeważnie osady terygeniczne
w postaci iłowców, często łupkowatych, przewarstwianych wapieniami.
Całość zgeneralizowanego profilu ordowiku przedstawia Rys. 4.
Rysunek 4 Zbiorczy profil osadów ordowiku [opracowanie własne]
3.1.3. Osady syluru
Osady sylurskie przyjęto uważać jako przede wszystkim osady ilaste [8].
Później zaczęto wyróżniać w ich obrębie takie litologie, jak łupki ilaste, łupki
margliste i mułowce[3]. Pojawiające się w landowerze wapienie gruzłowe
interpretowane są, jako osady bardziej płytkomorskie w stosunku do reszty
sukcesji syluru – interpretowanej jako osady szelfu zewnętrznego [9].
Analizowane profile wiertnicze tylko częściowo zgadzają się z danym
z literatury. Osadami najczęściej występującymi są iłowce. Są to głównie
iłowce ciemnoszare, często o charakterze łupkowatym, wapniste, z dużą
ilością fauny graptolitowej. Pojawiają się także warstwy szarych
i szarozielonych iłowców pstrych, nie burzących z kwasem, bez fauny lub jej
Karolina Korzeniowska
12
bardzo małą ilością. Występują również iłowce szare, czekoladowe i czarne,
iłowce mułowcowe, iłowce łupkowate i inne, rzadsze. Poza dominującymi
iłowcami, w profilu występują niewielkie, acz wyraźne wkładki wapieni
i margli, najczęściej przeławicanych ze sobą. Wapienie występują też jako
pojedyncze warstwy wapieni gruzłowych, bulastych lub wapieni
marglistych. Inne osady klastyczne poza iłowcami są rzadkie i są to
najczęściej zlepieńce, piaskowce lub mułowce. Charakterystyczną litologią
syluru są diabazy i związane z nimi tufity i bentonity, będące zapisem
aktywności wulkanicznej pod koniec tego okresu.
Analiza ilości i prawidłowości w występowaniu poszczególnych
rodzajów litolofacji pozwoliła sporządzić zbiorczy profil dla syluru.
Sedymentację sylurską rozpoczyna cienka warstwa osadów płytkiego morza,
na którą składają się margle przeławicane wapieniami lub niewielkie ilości
szaro-zielonych iłowców. Powyżej, dominują osady iłowcowe, będące
zapisem transgresji morskiej. W ich obrębie, mniej więcej w ¾ profilu
znajdywane są w osadach pojedyncze warstewki bentonitu. Sedymentacja
iłowców najczęściej kończy się pojedynczymi warstwami grubszych osadów
klastycznych, - piaskowców i zlepieńców lub warstwą wapieni, zwykle
bulastych. Wymienione wcześniej diabazy pojawiają się pod koniec syluru,
w obrębie iłowców i piaskowców. Ogólny, zbiorczy profil przedstawia Rys. 5.
,
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej
części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
13
Rysunek 5 Zbiorczy profil osadów syluru [opracowanie własne]
3.2. Litostratygrafia
Obszar wzdłuż wyznaczonej linii przekroju, oprócz analizy litologicznej
został poddany badaniom litostratygraficznym. Posłużyły do tego profile
litostratygraficzne, pobrane z bazy CBDG, oraz dane z literatury.
Zestawienie pełnej litostratygrafii wzdłuż wyznaczonej linii profilu
badanego terenu przedstawia Rys.6.
Kambr syneklizy perybałtyckiej posiada 12 formalnych jednostek
litostratygraficznych wydzielonych przez Bednarczyk i Turnau-Morawską
w 1975 roku [10]. Wydzielenia te dotyczą całości terenu syneklizy,
uwzględniając wszystkie poznane wówczas osady.
Na obszarze badań zaobserwowano jedno z dwunastu wydzieleń:
formację smołdzińską, którą tworzą piaskowce i zlepieńce górnego wendu
i dolnego kambru. Brak innych wydzieleń formalnych kambru.
Osady ordowiku nie posiadają formalnych wydzieleń litostraty-
graficznych, jednakże próby formalizacji poskutkowały stworzeniem pełnej
serii wydzieleń nieformalnych. Najbardziej powszechny jest podział
ordowiku, który zaproponowali w 1997 roku Modliński i Szymański [11].
Wydzielili oni 14 jednostek litostratygraficznych, w tym 9 o randze formacji
Karolina Korzeniowska
14
i 5 o randze ogniwa. W swoich badaniach uwzględnili zmienność litologii ze
wschodu na wschód, ograniczając tym samym lateralnie zasięg poszcze-
gólnych formacji.
Na badanym obszarze rozpoznano 9 z 14 nieformalnych wydzieleń.
Sedymentację ordowicką rozpoczynają osady formacji zlepieńców
i piaskowców z Sępopola tremadoku, należącą do wschodniej części
syneklizy. Powyżej kolejnym wydzieleniem jest formacja czerwonych
wapieni z Pieszkowa, również w części wschodniej, natomiast na zachodzie
pojawia się formacja iłowców i glaukonitów ze Słuchowa. Obie należą do
arenigu. Lanwirn reprezentowany jest przez formację pstrych wapieni
z Kielna na wschodzie oraz częściowo przez formację wapieni z Kopalina na
zachodzie. Osady wapienne z Kielna kontynuują się wyżej w profilu, aż do
połowy karadoku, zazębiając się obocznie z formacją iłowców z Sasina,
która na zachodzie zaczyna się już w lanwirnie. Landeil jest całkowicie
wyerodowany na całej długości badanego obszaru. Formacja z Sasina
przechodzi w stropie w formację margli i iłowców z Prabut na zachodzie
i formację czerwonych margli i wapieni z Morąga na wschodzie. Bezpośred-
nio na formacji z Morąga zalegają osady formacji szarozielonych margli
z Ornety, która kończy sedymentację utworów aszgilu na wschodzie. Na niej
i na formacji z Prabut na zachodzie kończy się okres sedymentacji w ordowiku.
Nieformalnego podziału syluru dokonali Szymański i Modliński wraz
z Tellerem w 2006 roku [12], wydzielając 7 jednostek litostratygraficznych.
Dwie z siedmiu rozpoznano w obrębie badanych osadów, obie należące
wiekowo do landoweru: formacja iłowców z Pasłęka oraz, zazębiająca się
z nią na wschodzie formacja wapieni gruzłowych z Barcian. Znajdują się
one bezpośrednio nad osadami z aszgilu i zamykają serię wydzielonych
jednostek litostratygraficznych badanego terenu.
,
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej
części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
15
Rysunek 6 Zestawienie jednostek litostratygraficznych wzdłuż wyznaczonej linii przekroju
z zachodu na wschód [opracowanie własne]
Karolina Korzeniowska
16
4. Podsumowanie
Klastyczne osady kambryjskie charakteryzują się częstym występo-
waniem piaskowców kwarcytowych oraz sporą ilością przeławiceń
mułowców i iłowców. Osady ordowickie są wyraźnie wapienne, dominują
pakiety wapieni i margli, z niewielkimi ilościami osadów klastycznych na
początku okresu i na jego końcu. Sylur jest zdominowany przez różnego
rodzaju iłowce, które miejscami zastępowane są przez osady wapienne lub
grubsze osady klastyczne. W ujęciu litostratygraficznym badany obszar
odpowiada schematom poczynionym przez innych badaczy, z wyjątkiem
braku części jednostek, których nie zaobserwowano.
W celu podsumowania został sporządzony przekrój geologiczny przez
badany teren, przedstawiający litologię dolnego paleozoiku. Ma on charakter
ogólny – litologie podzielono na bardziej ogólne kategorie. Poza litologiami
głównymi, tzn. piaskowcami, mułowcami, itd. stworzono kategorie
mieszane, oznaczające przeławicenia poszczególnych osadów (np. mułow-
ców z iłowcami). Przekrój ten przedstawia Rys. 7.
Rysunek 7 Przekrój geologiczny wzdłuż sporządzonej linii przekroju z Rys. 2,
przedstawiający układ litofacji dolnego paleozoiku [opracowanie własne]
,
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej
części syneklizy perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
17
Literatura
1. Państwowy Instytut Geologiczny, Centralna Baza Danych Geologicznych –
Otwory wiertnicze, [dostęp 30 stycznia 2014] :
http://otworywiertnicze.pgi.gov.pl/
2. Żelaźniewicz A., Aleksandrowski P., Buła Z., et al., Regionalizacja tektoniczna
Polski, Wrocław, Komitet Nauk Geologicznych PAN, 2011
3. Stupnicka E., Geologia regionalna Polski, Warszawa, Wydawnictwa
Uniwersytetu Warszawskiego, 1997
4. Areń B, Wyniesienie Łeby i obniżenie perybałtyckiej, w: Skały platformy
prekambryjskiej w Polsce, część 2: Pokrywa osadowa, pod red. Łaszkiewicza
W., Warszawa, Wydawnictwa Geologiczne, 1974
5. Stanley S., Historia Ziemi, Warszawa, Wydawnictwa Naukowe PWN, 2002
6. Sikorska M., Pacześna J., Quartz cementation In Cambrian sandstones on the
background of their burial history (Polish part of East European Craton),
Geological Quarterly, 41 (3):265-272, 1997
7. Modliński Z., Nolvak J., Szymański B., Stratygrafia osadów pogranicza ordowiku i
syluru północno-wschodniej Polski i ich korelacja ze stratotypowymi profilami
Estonii, Biuletyn Państwowego Instytutu Geologicznego, 427:61-78, 2007
8. Tupolos T., Charakterystyka utworów sylurskich syneklizy perybałtyckiej na
podstawie badań geofizyki wiertniczej, Geological Quarterly, 21 (3):437-450, 1997
9. Podhalańska T., Późnoordowickie zlodowacenie Gondwany – zapis zmian
środowiskowych w sukcesji osadowej obniżenia bałtyckiego, Prace
Państwowego Instytutu Geologicznego, 193:1-132, 2009
10. Marcinowski R., Piotrowski J., Słownik jednostek litostratygraficznych Polki –
wersja podstawowa, Państwowy Instytut Geologiczny (online), 2004-2011:
http://slp.pgi.gov.pl/
11. Modliński Z., Szymański B., The ordovician lithostratigraphy of the Peribaltic
Depression (NE Poland), Geological Quarterly, 41 (3):273-288, 1997
12. Szymański B., Modliński Z., Teller L., Litostratygrafia syluru polskiej części
obniżenia perybałtyckiego – część lądowa i morska(N Polska), Przegląd
Geologiczny, 54 (9):787-796, 2006
Karolina Korzeniowska
18
Analiza sukcesji osadów dolnego paleozoiku w polskiej części syneklizy
perybałtyckiej na podstawie danych z otworów wiertniczych
Streszczenie
Artykuł dotyczy dolnego paleozoiku syneklizy perybałtyckiej – osadów płytkiego morza epikontynentalnego kambru, ordowiku oraz syluru. Analizowano sukcesję litologiczną
osadów poszczególnych okresów oraz występujące na obszarze jednostki litostratygraficzne.
Do badań posłużyły dane pozyskane z Centralnej Bazy Danych Geologicznych PIG.
Sporządzono zbiorcze profile litologiczne badanych okresów, przekrój jednostek litostratygraficznych oraz ogólny przekrój litologiczny syneklizy, które pozwoliły na opis
specyfiki litologicznej obszaru. Pozwoliło to na porównanie wyników badań z danymi
dostępnymi w literaturze oraz potwierdzenie i uszczegółowienie trendów litologicznych
badanego terenu. Uzyskany zbiorczy profil kambru charakteryzuje się największym udziałem skał klastycznych, w tym typowych dla kambru piaskowców kwarcowych. Ordowik jest
głównie wapienno-marglisty, z pojedynczymi pakietami skał klastycznych na początku
okresu i na jego końcu. Sylur zaś zdominowany jest prawie całkowicie przez iłowce, które
jedynie w podstawie profilu rozpoczynają się warstwami grubiej ziarnistych klastyków i nimi się kończą. Uzyskane zbiorcze profile litologiczne mogą posłużyć analizom dynamiki
rozwoju basenu sedymentacyjnego i ustalaniu zmian poziomu morza.
Słowa kluczowe: synekliza perybałtycka, dolny paleozoik, sukcesja osadów, analiza litologiczna, profile litologiczne, Litostratygrafia
Analysis of sedimentary succession of lower Paleozoic in the Polish part
of the peribaltic syneclise basing on boreholes data
Abstract The article considers lithological studies on lower Paleozoic of the peribaltic syneclise
– Cambrian, Ordovician and Silurian sediments of shallow, epicontinental sea. In the research
the sediments succession of each period in the studied area and lithostratigraphic units were
analyzed. Data from The Central Geological Database was used while conducting the research. A summary lithological profiles of studied periods, the cross-section
of lithostratigraphy and the geological cross-section of lithology in general were prepared.
It was the base of lithological specificity of investigated area description. As an effect the
research results were compared to literature data. Lithological trends of analyzed region were confirmed and particularized. The collective profile of Cambrian period is characterized by
greatest amount of clastic rocks, including quartz sandstones typical for Cambrian sediments.
Ordovician profile contain mainly limestones and marls, with singular layers of clastic rocks
at the beginning of the profile and at its end. Silurian profile is dominated almost entirely by claystones. Coarse-grained clastic layers can be found only at the beginning and at the end of
the profile. The obtained collective and generalized lithological profiles can be used to
conduct sedimentation basin evolution analysis and to determine sea-level changes.
Keywords peribaltic syneclise, lower Paleozoic, sediments succession, lithological analysis,
lithological profiles, lithostratigraphy
19
Paulina Matysiak1, Małgorzata Marczak
2, Anna Skorupska
3
Badanie oddziaływań między białkami
zaangażowanymi w syntezę EPS
R. leguminosarum bv. trifolii
1. Wprowadzenie
Symbioza pomiędzy roślinami z rodziny bobowatych a bakteriami
z rodzaju Rhizobium umożliwia rozwój rośliny i wytworzenie obfitej w białko
biomasy, niezależnie od dostępności związków azotu w glebie. Z tego powodu
rośliny te pełnią istotną rolę w rolnictwie, ale ważne są również ze względu na
korzyści dla środowiska – wzbogacają glebę w azot bez potrzeby chemicznego
nawożenia [1]. Nawiązanie efektywnej symbiozy pomiędzy gospodarzem
roślinnym a bakterią jest procesem wysoce złożonym i uczestniczy w nim
wymiana odpowiednich cząsteczek sygnalnych pomiędzy partnerami
symbiotycznymi, czego wynikiem jest wzajemna koordynacja ekspresji ich
genów [2]. Jedną z takich cząsteczek jest wydzielany przez bakterie
egzopolisacharyd (EPS). EPS jest szczepowo specyficznym polisacharydem,
który gromadzony jest na powierzchni komórki lub wydzielany do podłoża [3].
Rys. 1. Schemat struktur powierzchniowych bakterii Gram-ujemnych
(IM – błona wewnętrzna) [4, z własnymi modyfikacjami].
1 [email protected], Uniwersytet Medyczny w Lublinie, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym,
Zakład i Katedra Medycyny Sądowej, http://www.umlub.pl/uczelnia/struktura-
organizacyjna/szczegoly,108.html 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii 3 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
20
Egzopolisacharydy Rhizobium leguminosarum posiadają w większości
identyczną strukturę monomerów. Na monomer składa się pięć cząsteczek
glukozy, dwie cząsteczki kwasu glukuronowego i jedna galaktozy,
połączonych wiązaniami β-(1,4)-glikozydowymi. Monomery są mody-
fikowane podstawnikami takimi jak: grupy acetylowe, pirogronianowe
i hydroksybutanylowe. Poszczególne szczepy mogą różnić się wzorem
podstawników w monomerze. Zaburzenia w produkcji EPS skutkują
nieprawidłowościami w procesie symbiozy i wytwarzaniu prawidłowych
brodawek [5], dlatego istotnym jest poznanie wszystkich elementów
biorących udział w biosyntezie i transporcie na zewnątrz komórki tego
polisacharydu powierzchniowego. Celem niniejszej pracy było rozszerzenie
wiedzy o syntezie EPS w Rhizobium leguminosarum bv. trifolli poprzez próbę
zmapowania interakcji pomiędzy niektórymi białkami uczestniczącymi
w szlaku biosyntezy tego związku.
2. Biosynteza egzopolisacharydów i niektórych polisacharydów
kapsularnych
Białka uczestniczące w biosyntezie i transporcie EPS Rhizobium
leguminosarum bv. trifolli w większości wykazują homologię do systemu
biosyntezy i transportu polisacharydów kapsularnych, takich jak kwas
kolaninowy Escherichia coli. Jest to tak zwany system Wzx/Wzy-zależny.
Składa się on z białek zlokalizowanych zarówno w wewnętrznej,
jak i zewnętrznej błonie komórkowej, których zadaniem jest synteza,
polimeryzacja i transport polisacharydu na powierzchnię komórki [6].
Szlak biosyntezy rozpoczyna się, gdy pierwszy prekursor cukrowy jest
przenoszony w połączeniu z cząsteczką UDP na undekaprenylodifosforan
(und-PP), przy udziale transferazy WbaP. Do niego dołączane są kolejne
cząsteczki cukrów przy pomocy specyficznych glikozylotransferaz, które
mogą być modyfikowane poprzez enzymy przyłączające grupy
niekarboksylowe do łańcucha cukrowego. Und-PP jest zakotwiczony
w błonie wewnętrznej po jej cytoplazmatycznej stronie. Gotowy monomer
zostaje przerzucony przez wewnętrzną membranę, dzięki aktywności
flipazowej białka Wzx. Następnie polimeraza Wzy łączy monomery ze
sobą, a długość powstającego polimeru jest kontrolowana przez
kopolimerazę należącą do rodziny białek PCP (ang. polysaccharide
copolymerase). Lipoproteina Wza tworzy kanał w błonie zewnętrznej
i uczestniczy w wyprowadzaniu gotowego polimeru na powierzchnię
komórki [7].
,
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi
w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii
21
Rys. 2. Schemat przedstawiający polimeryzację i transport polisacharydu
z udziałem systemu Wzx/Wzy-zależnego [8].
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
22
2.1. Biosynteza EPS u R. leguminosarum bv. trifolii
Chrosomosom Rhizobium leguminosarum bv. trifolii ma wielkość około
5 Mpz. Oprócz chromosomu, materiał genetyczny tego szczepu
zlokalizowany jest w czterech megaplazmidach: pRtTA1a, pRtTA1b,
pRtTA1c i pRtTA1d.
Geny odpowiedzialne za syntezę polisacharydów zlokalizowano
dotychczas w pięciu regionach (Pss-I – Pss-V) w obrębie chromosomu oraz
na niesymbiotycznym plazmidzie pRtTA1b [9].
Geny kodujące glikozylotransferazy odpowiedzialne za biosyntezę
podjednostki egzopolisacharydu Rhizobium leguminosarum bv. trifolli
zlokalizowane są w regionie Pss-I razem z genami, których produkty biorą
udział w polimeryzacji i transporcie EPS. Region Pss-I ma wielkość 33,7
kpz, jest zlokalizowany na chromosomie i grupuje on geny, które noszą
wspólną nazwę pss, pochodzącą od ich funkcji, to jest syntezy
polisacharydu (ang. polysaccharide synthesis) [5].
Pierwszym krokiem w biosyntezie egzopolisacharydu R. leguminosarum
bv. trifolii jest przyłączenie glukozy do lipidowego nośnika, przy udziale
glukozylo-IP-transferazy PssA [10, 11]. Do glukozy dołączane są dwie
cząsteczki kwasu glukuronowego przy udziale glukuronozylo-β(1,4)-
glikozylotransferaz kodowanych przez pssC, pssE i pssD [12,13].
Białka uczestniczące w dalszym wydłużaniu powstającego oktameru nie
są znane. Najprawdopodobniej biorą w nim udział produkty genów pssF,
pssG, pssH, pssI, pssJ i pssS, które mogą być glikozylotransferazami. Geny
pssR i pssM przypuszczalnie kodują enzymy modyfikujące łańcuch
cukrowy poprzez przyłączanie grup acetylowych i pirogronianowych [5].
Kolejnymi genami zaangażowanymi w syntezę egzopolisacharydu są
pssP, pssO, pssN, pssT [14] oraz umieszczony dalej w genomie pssL [15].
Produkty tych genów są odpowiedzialne za polimeryzację i wyprowadzenie
z komórki polisacharydu [14].
Rys. 3. Schemat systemu polimeryzacji i transportu egzopolisacharydu
u Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
,
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi
w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii
23
Badania prowadzone nad białkami zaangażowanymi w biosyntezę
polisacharydów wskazują na tworzenie złożonych kompleksów, w których
poszczególne białka mogą tworzyć homooligomery, a także oddziaływać
z innymi białkami kompleksu [16].
W niniejszej pracy analizom oddziaływań poddano te spośród
glikozylotransferaz, które zostały już scharakteryzowane funkcjonalnie,
tj. PssA i PssC oraz białka będące składnikami kompleksu polimeryzacji
i transportu EPS. Celem było zbadanie, czy glikozylotransferazy oddziałują
ze sobą oraz innymi białkami zaangażowanymi w biosyntezę EPS.
3. Materiały i metody
3.1. Bakteryjny System Dwuhybrydowy
Oddziaływania pomiędzy wybranymi białkami badane były przy użyciu bakteryjnego systemu dwuhybrydowego (BTH). System ten wykorzystuje szczep E. coli DHM1 z defektem genu cyklazy adenylowej (cya). Białko to można podzielić na dwa komplementarne polipeptydy, nazwane T18 i T25. Enzym jest aktywny tylko wtedy, gdy obie domeny są fizyczne połączone. Badanie oddziaływań między białkami polega na tworzeniu białek fuzyjnych, w skład których wchodzą komplementarne fragmenty katalitycznej domeny cyklazy adenylowej pochodzącej z Bordetella pertussis oraz badane białka. Interakcje pomiędzy nimi skutkują funkcjonalną komplementacją pomiędzy dwoma fragmentami cyklazy adenylowej, co prowadzi do syntezy cAMP, ten zaś łączy się z aktywatorem katabolicznym – CAP (ang. Catabolite Activator Protein). Kompleks cAMP-CAP ma plejotropowy wpływ na ekspresję genów, w tym indukuje operony kataboliczne, takie jak laktozowy czy maltozowy. Aktywowana przez kompleks ekspresja genu kodującego enzym β-galaktozydazę umożliwia bakterii rozkład cukrów takich jak maltoza, a tym samym wzrost na podłożu minimalnym z maltozą, jako jedynym źródłem węgla. Alternatywne dodanie do podłoża X-gal, który jest analogiem laktozy, umożliwia kolorymetryczną ocenę oddziaływań dzięki temu, że produkt jego rozkładu jest niebieski [17].
Wektory systemu BTH to plazmidy pochodne pUC19 i pSU40. Do pierwszego z nich, niosącego gen oporności na ampicylinę, sklonowano domenę T18 cyklazy adenylowej w pozycji 3’ (pUT18) lub 5’ (pUT18C) polinkera. Zatem kodowane w wektorze pUT18 białko fuzyjne zawiera domenę T18 na swoim końcu karboksylowym, a w pUT18C na końcu aminowym. pSU40 z kasetą oporności na kanamycynę został zmody-fikowany poprzez sklonowanie domeny T25, również w dwóch pozycjach w obrębie polilinkera. Powstały w ten sposób wektor pKT25 kodować będzie białko fuzyjne zawierające domenę cyklazy adenylowej na C-końcu, a pKTN25 na N-końcu badanego białka.
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
24
Rys. 4. Schemat obrazujący zasadę działania Bakteryjnego Systemu Dwuhybrydowego. A.
Aktywna cyklaza adenylowa produkowana przez szczep dziki, B. Fizycznie rozdzielone
podjednostki cyklazy adenylowej, które są nieaktywne, C. Interakcje pomiędzy białkami
fuzyjnymi zawierającymi fragmenty cyklazy adenylowej umożliwiają wytworzenie aktywnego białka, a tym samym syntezę cAMP, D. Tworzenie kompleksu cAMP-CAP i aktywacja genów
reporterowych [17, z własnymi modyfikacjami].
3.2. Konstruowanie wektorów kodujących badane białka fuzyjne
Geny kodujące glikozylotransferazy pssA i pssC które wybrano
do niniejszych badań amplifikowano w PCR z wykorzystaniem par
starterów zaprojektowanych w sposób umożliwiający klonowanie genu
w zgodnej ramce odczytu względem fragmentów kodujących domeny
cyklazy adenylowej. Do amplifikacji wykorzystano polimerazę o wysokiej
wierności (Pfu). Amplikony poddano trawieniu enzymami XbaI i BamHI
(dla pssC), BamHI i SalI (pssA do wektorów pUT18/pUT18C) oraz XbaI
i BamHI (pssA do wektorów pKT25/pKTN25). Po trawieniu DNA
oczyszczono i poddawano ligacji z właściwymi wektorami systemu BTH
(pUT18/pUT18C, pKT25/pKTN25). Wektory przed ligacją trawiono
odpowiednimi restryktazami, a następnie defosforylowano, aby zwiększyć
wydajność efektywnej ligacji wektora ze wstawką. Szczep E. coli DH5α
transformowano mieszaninami ligacyjnymi, a klony komórek, które
pobrały plazmidy selekcjonowano na podłożu LB zawierającym ampicylinę
lub kanamycynę. Wyszukiwanie klonów niosących plazmidy zrekombi-
nowane prowadzono metodą PCR z kolonii.
Wyizolowane DNA klonów, które dały pozytywny wynik w PCR
z kolonii poddano analizie restrykcyjnej i sekwencjonowaniu.
,
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi
w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii
25
W kolejnych doświadczeniach wykorzystano plazmidy skonstruowane
w tej pracy, jak również plazmidy skonstruowane wcześniej, w których
sklonowano wybrane geny polimeryzacji i transportu EPS [16].
3.3. Analiza oddziaływań między białkami fuzyjnymi
w szczepie DHM1
Przygotowanymi konstruktami kodującymi białka fuzyjne
transformowano E. coli DHM1 (szczep reporterowy cya) i wysiewano
na selekcyjne podłoże LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. Wszystkie kolonie
były koloru białego, co świadczy o tym, że obecność jednego plazmidu
BTH nie przyczynia się do komplementacji i przywrócenia aktywności
cyklazy adenylowej. Dla wybranych klonów oznaczono aktywność
β-galaktozydazy – w każdym przypadku oscylowała ona wokół wartości
300 U/mg (suchej masy bakteryjnej) zgodnie z charakterystyką zawartą
w opisie systemu BTH.
Do komórek zawierających pierwszy konstrukt wprowadzano w drodze
transformacji drugi plazmid, tj. pochodną wektora pKT25/pKTN25
kodującą białka fuzyjne. Mieszaniny po transformacji wysiewano na
podłoże selekcyjne LB z kanamycyną, ampicyliną, X-gal i IPTG.
Równocześnie wykonano kontrolę pozytywną z plazmidami kodującymi
fragmenty cyklazy adenylowej T25 i T18 połączonych z zamkiem
leucynowym z białka GCN4. Zamkiem leucynowym (ang. leucine zipper)
nazywany jest dimer złożony z dwóch α-helis bogatych w leucynę, dzięki
którym białko dimeryzuje.
Kolonie, które obserwowano na podłożach selekcyjnych po
wprowadzeniu drugiego konstruktu wykazywały różną barwę: białą lub
niebieską o różnej intensywności. Białe kolonie świadczą o braku
oddziaływań, a niebieskie o ich występowaniu.
Siłę interakcji mierzono aktywnością enzymu β-galaktozydazy, którego
gen jest pod kontrolą promotora regulowanego pozytywnie przez kompleks
cAMP-CAP. Wynik przynajmniej 4-5-krotnie wyższy od aktywności
uzyskanej dla komórek przed wprowadzeniem drugiego wektora uważany
jest za występowanie interakcji [18].
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
26
4. Wyniki i wnioski
Siłę oddziaływania pomiędzy danymi białkami w określonej orientacji
wobec fragmentu cyklazy adenylowej zobrazowano w postaci średniej
aktywności z niezależnych oznaczeń trzech wybranych klonów (rys. 5 i 6).
Rys.5. Zestawienie siły oddziaływań białka PssA z pozostałymi badanymi białkami Pss
mierzone aktywnością β-galaktozydazy w szczepie DHM1 niosącym dwa zgodne plazmidy
kodujące białka fuzyjne
Rys. 6. Zestawienie siły oddziaływań białka PssC z pozostałymi badanymi białkami Pss
mierzone aktywnością β-galaktozydazy w szczepie DHM1 niosącym dwa zgodne plazmidy
kodujące białka fuzyjne
,
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi
w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii
27
Uzyskane wyniki świadczą o występowaniu złożonych zależności
między badanymi białkami. PssA i PssC w większości kombinacji
(zarówno orientacji wstawki wobec domeny cyklazy oraz kolejności
wprowadzania wektorów do szczepu reporterowego) wykazują bardzo dużą
aktywność (wielokrotnie przewyższając aktywność dla kontroli
negatywnej). Jedynie w przypadku pary plazmidów pUT18-A i pKT25-C
aktywność β-galaktozydazy jest równa kontroli negatywnej. Porównując
wyniki otrzymane dla par plazmidów niosących te same geny, czyli
zawierające dwa geny pssA lub pssC, również zauważyć można, że
większość z tych kombinacji wykazuje wysoką aktywność. Świadczyć to
może o zdolności do homodimeryzacji białek PssA i PssC.
W następujących parach plazmidów: pUT18-A i pKT25-T, pUT18C-A
i pKT25-L, pUT18-C i pKT25-T, pUT18C-C i pKT25-T, pUT18C-T
i pKT25-C, pUT18C-T i pKTN25-C, pUT18-C i pKT25-L, pUT18C-C
i pKT25-L notuje się wysoką aktywność β-galaktozydazy. Oznaczać to
może interakcje pomiędzy glikozylotransferazami PssA i PssC a białkami
systemu transportu PssT i PssL.
Uważa się, że regulacja procesu polimeryzacji EPS może odbywać się
na poziomie regulacji przepływu prekursorów cukrowych w wyniku
oddziaływania ko-polimerazy z inicjującą glikozylotransferazą.
Glikozylotransferazy PssA i PssC nie wykazały w systemie BTH interakcji
z białkiem PssP, które jest homologiczne do białek z rodziny kopolimeraz
PCP2a. Wynik taki oznacza prawdopodobny brak interakcji między
białkami, nie wyklucza natomiast ich roli w procesie regulacji stopnia
polimeryzacji i współdziałania na poziomie innym niż potranslacyjny.
Literatura
1. Kozłowski S., Swędrzyński A., Zielewicz W., 2011, Rośliny motylkowe
w środowisku przyrodniczym, Woda-Środowisko-Obszary Wiejskie 2011: T.
11 Z. 4 (36) Water-Environment-Rural Areas s. 161-181
2. Kopcewicz J., Lewak S., 2007, Fizjologia roślin, Wydawnictwo Naukowe
PWN, 246-258
3. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V., 2003, Surface polysaccharide involvement
in establishing the rhizobium-legume symbiosis, Eur J Biochem. 270, 1365-
1380
4. Lepek V. C., D´Antuono A. I., 2005, Bacterial surface polysaccharides and
their role in the rhizobia-legume association, Lotus Newsletter 35, 1, 93-105
5. Skorupska A., Janczarek M., Marczak M., Mazur A., Król J., 2006, Rhizobial
exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions, Microbial Cell
Factories, 5:7
6. Marczak M., Mazur A., Gruszecki W.I., Skorupska A., 2008, PssO, a unique
extracellular protein important for exopolysaccharide synthesis in Rhizobium
leguminosarum bv. trifolii, Biochimie 90, 1781-1790
Paulina Matysiak, Małgorzata Marczak, Anna Skorupska
28
7. Islam S. T., Lam J. S., 2013, Wzx flippase-mediated membrane translocation
of sugar polymer precursors in bacteria, Environmental Microbiology 15, 4,
1001-1015
8. http://www.uoguelph.ca/~cwhitfie/bacterial_capsules.htmlł
9. Skorupska A., Król J., Mazur A., Marczak M., 2008, Genomika Rhizobium
leguminosarum – badanie genów syntezy polisacharydów powierzchniowych,
Biotechnologia, 27, 27-40
10. Janczarek M., Mazur A., Wielbo J., Król J., Skorupska A., 1999,
Egzopolisacharydy rizobiowe: struktura, biosynteza i funkcja w symbiozie, Post.
Mikrobiol., 38, 3, 217-244
11. van Workum W.A.T., Canter Cremers H.C.J., Wijfies A.H.M., van der Kolk
C., Wijffelman C.A., Kijne J.W., 1997, Cloning and characterization of four
genes of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii involved in exopolysaccharide
production and nodulation, Mol Plant Microbe Interact. 10, 290-301
12. Mazur A., Król J. E., Wielbo J., Urbanik-Sypniewska T., Skorupska A., 2002,
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii PssP Protein Is Required
for Exopolysaccharide Biosynthesis and Polymerization, MPMI 15, 4, 388-397
13. Król J.E., Wielbo J., Mazur A., Kopcinska J., Łotocka B., Golinowski W.,
Skorupska A., 1998, Molecular characterization of pssCDE genes of
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain TA1: pssD mutant is affected
in exopolysaccharide synthesis and endocytosis of bacteria, Mol Plant-
Microbe Interact. 11, 1142-1148
14. Wielbo J., Mazur A., Król J.E., Marczak M., Skorupska A., 2004,
Environmental modulation of the pssTNOP gene expression in Rhizobium
leguminosarum bv. trifolii, Can J Microbiol. 50, 201-211
15. Mazur A., Król J.E., Marczak M., Skorupska A., 2003, Membrane topology
of PssT, the transmembrane protein component of the type I exopolysaccharide
transport system in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain TA1; J Bacteriol.
185, 2503-2511
16. Marczak M., Dźwierzyńska M., Skorupska A., 2013, Homo – and heterotypic
interactions between Pss proteins involved in the exopolysaccharide transport
system in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Biol. Chem. 394: 541-559
17. Karimova G., Pidoux J., Ullmann A., Ladant D., 1998, A bacterial two-hybrid
system based on reconstituted signal transduction pathway, Microbiology, 95,
5752-5756
18. Karimova G., Dautin N., Ladant D., 2005, Interaction network among
Escherichia coli membrane protein involved in cell division as revealed
by Bacterial Two-Hybrid analisis, Journal Od Bacteriology, 187, 2233-2243
,
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi
w syntezę EPS R. leguminosarum bv. trifolii
29
Badanie oddziaływań między białkami zaangażowanymi w syntezę
EPS R. leguminosarum bv. trifolii
Streszczenie
Do wytworzenia efektywnej symbiozy pomiędzy bakterią wiążącą azot a jej roślinnym gospodarzem potrzebne jest nawiązanie swoistego dialogu pomiędzy partnerami
symbiotycznymi. Jest to proces złożony a czynnikami w nim uczestniczącymi są zarówno
sygnały roślinne (flawonoidy) jak i bakteryjne (białko NodD, czynniki Nod
i zewnątrzkomórkowe polisacharydy). W Rhizobium leguminosarum bv. trifolli ważnym czynnikiem umożliwiającym zakażenie jest egzopolisacharyd, będący cząsteczką szczepowo
specyficzną. Jest on wydzielany na powierzchnię komórki bakteryjnej a szlak jego syntezy
wykazuje homologię do tak zwanego systemu Wzx/Wzy-zależnego odpowiedzialnego za
produkcję polisacharydów kapsularnych E. coli. Geny odpowiedzialne za jego wytwarzanie oraz potencjalne interakcje pomiędzy poszczególnymi białkami biosyntezy EPS nie zostały dogłębnie
zbadane. W tej pracy analizie wzajemnych oddziaływań poddano glikozylotransferazy PssA
i PssC oraz składniki kompleksu polimeryzacji i transportu EPS, czyli PssP, PssT i PssL. Białka
te wybrano do badań, ponieważ ich geny zostały scharakteryzowane funkcjonalnie. Wykazano, że powyższe glikozylotranserazy homodimeryzują oraz mają zdolność do oddziaływania
z białkami PssT i PssL.
Słowa kluczowe: bakteryjny system dwuhybrydowy, egzopolisacharydy, rizobia, symbioza
The study of interactions between proteins involved in the synthesis
of EPS in R. leguminosarum bv. trifolii
Abstract
To produce an effective symbiotic interaction between rhizobia and the host plant, it is necessary to establish a specific dialogue between symbiotic partners. This complex
process involves signals of both leguminous plant (flavonoids) and bacteria (NodD protein,
Nod factors and extracellular polysaccharides). In Rhizobium leguminosarum bv. trifolli an
important enabling infection factor is exopolysaccharide, which is a strain-specific molecule. It is assembled in a Wzx/Wzy-dependent manner occurs in capsular
polysaccharide biosynthesis in E.coli and excreting to the bacterial cell surface. Genes
responsible for the production of EPS and the potential interactions between the proteins
of EPS’s biosynthesis pathway has not been fully explored. In this work were analyzed interactions between glycosyltransferases PssA and PssC and with the components of the
complex of polymerization and transport of EPS: PssP, PssL and PssT. These proteins were
chosen, because their genes were functionaly analyzed. It has been demonstrated that the
above glycosyltransferases interact with each other and in addition, both have a ability to interact with PssL and PssT proteins.
Keywords: bacterial two-hybrid system, exopolysaccharides, Rhizobia, symbiosis
30
Izabela Podgórska1, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik,
Łukasz Sęczyk
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
1. Wstęp
Produkcja enzymów jest procesem wchodzącym w zakres zastosowań
białej biotechnologii, zajmującej się wykorzystaniem systemów biolo-
gicznych w przemyśle i ochronie środowiska [1]. Enzymy nie zużywają się,
dlatego w sprzyjających warunkach, przy braku czynników destrukcyjnych,
mogą działać nieskończenie długo. Zachowują aktywność poza komórką,
dlatego też poszczególne rodzaje enzymów mogą być z powodzeniem
izolowane, a po odpowiednim utrwaleniu, stanowią preparat charakter-
ryzujący się zdolnością do katalizowania określonego typu reakcji. W skali
przemysłowej enzymy otrzymuje się wykorzystując do tego celu mikro-
organizmy. Obecnie dzięki inżynierii genetycznej możemy otrzymać
preparaty o wybranej i ściśle określonej specyficzności, a dzięki temu
o nowych właściwościach i zastosowaniach w przemyśle. Organizmy
genetycznie zmodyfikowane charakteryzuje jednak duża zmienność i niska
stabilność w procesach technologicznych. W związku z tym doświadczenia
prowadzone są bardzo często na szczepach pochodzących ze środowiska
naturalnego [2].
W obecnych czasach globalnym trendem wydaje się być przesunięcie
w kierunku ograniczenia zużycia środków chemicznych, a tym samym
dostrzega się silne i narastające pragnienie poszukiwania bezpieczniejszych
i ekologicznych alternatyw walki z chorobami roślin. Produkcja enzymów
litycznych przez mikroorganizmy jest skutecznym czynnikiem
w biokontroli grzybów fitopatogennych. Właściwość tą dobrze poznano
przede wszystkim u grzybów strzępkowych, ale odkryto ją również
u drożdży. Enzymy lityczne (chitinazy, proteazy i glukanazy) wykazują
uzdolnienia do lizy ściany komórkowej grzybów patogennych [3]. Poza
bezpośrednim udziałem w antagonistycznych interakcjach pomiędzy
różnym organizmami, pełnią one także rolę w procesie żywienia, rozwoju,
różnicowania oraz autolizie [4]. Enzymy lityczne mają także szerokie
zastosowanie w innych dziedzinach np. w farmaceutyce, medycynie,
przemyśle spożywczym i chemicznym.
1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii,
Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności
,
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
31
2. Poszukiwanie mikroorganizmów produkujących enzymy
Zróżnicowanie drobnoustrojów w naturze jest ogromne, lecz nie wszystkie
z nich stanowią źródło enzymów przydatnych przemysłowo. Istotnym
zagadnieniem decydującym o powodzeniu produkcji enzymów przez
mikroorganizmy jest wyselekcjonowanie spośród wielu z nich odpowiednio
aktywnego szczepu, który odpowiada stawianym wymaganiom
technologicznym [1].
Najstarszą metodą pozyskiwania szczepów produkcyjnych jest ich
izolacja ze środowisk naturalnych, np. z gleby czy powierzchni roślin [5].
Innym źródłem szczepów przydatnych biotechnologicznie są kolekcje
placówek naukowych i wybranych zakładów przemysłowych lub duże
kolekcje centralne, w których zdeponowane są tysiące szczepów
muzealnych. Jednak przechowywana jest w nich tylko znikoma część
gatunków, szczepów i odmian występujących w przyrodzie, dlatego też nie
konkurują one skutecznie z naturalnym środowiskiem bytowania
drobnoustrojów, a dodatkowo długotrwałe utrzymywanie drobnoustrojów
w warunkach laboratoryjnych może prowadzić do utraty wielu pierwotnych
ich cech [6].
Poszukiwanie mikroorganizmów o oczekiwanych cechach, bytujących
w środowisku naturalnym, obejmuje następujące etapy:
wybór miejsca oraz pobranie próbek;
wstępną obróbkę próbek;
namnażanie drobnoustrojów i selekcje czystych kultur wyprowa-
dzonych z pojedynczych komórek;
testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania
danych produktów [5].
Nowoczesne podejście w poszukiwaniu wydajnych enzymów wymaga
przetestowania około tysiąca mikroorganizmów z wykorzystaniem
szybkich, prostych oraz dobrze poznanych metod detekcji, w celu
eliminacji mało przydatnych wariantów. Następnie liczba wybranych
potencjalnych producentów zostaje zawężona w następstwie większego
zróżnicowania warunków hodowli i wykonania zaadaptowanej do tego celu
charakterystyki biochemicznej. Z wybranych szczepów izolowane są
enzymy, oczyszczane i testowane w specjalnie skonstruowanych na skalę
laboratoryjną układach modelowych, odzwierciedlających optymalne
warunki procesu.
Wydajne zastosowanie nowo poznanych enzymów w procesach
biotechnologicznych wymaga uzyskania dużej ilości białka o stosunkowo
wysokiej czystości. Z reguły naturalni producenci tych enzymów
wytwarzają je z niewielką wydajnością, tak więc wykorzystanie tych
szczepów w przemyśle jest ekonomicznie nieopłacalne. Z tej przyczyny
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk
32
istnieje ogromne zapotrzebowanie na ulepszone szczepy drobnoustrojów,
charakteryzujące się wysoką aktywnością metaboliczną i potrafiące
wytwarzać pożądane enzymy z nawet tysiąc krotnie większą wydajnością
niż ich pierwotni producenci. Metody ulepszania drobnoustrojów oparte są
w dużej mierze na technologii rekombinacji DNA. Obecnie m. in. dzięki tej
metodzie szeroko wykorzystuje się w biotechnologii rekombinowane
szczepy drożdży, grzybów strzępkowych czy bakterii. Szczepy przemysłowe
udoskonalane są także na drodze mutacji indukowanych i selekcji [1].
Istotnym zagadnieniem decydującym o powodzeniu mikrobiologicznej
produkcji określonych substancji, w tym enzymów, jest wyselekcjonowanie
odpowiednio aktywnego szczepu, który powinien odpowiadać następującym
kryteriom:
musi być niepatogenny;
nie może wytwarzać szkodliwych i toksycznych produktów;
musi wykazywać stabilność biologiczną [5].
3. Charakterystyka enzymów litycznych
Ważną rolę w zwalczaniu fitopatogenów pełnią enzymy lityczne,
tj. chitynazy, β-1,3-glukanazy i proteazy oddziałujące na ściany komórkowe
grzybów patogennych. Ich obecność w filtratach pohodowlanych może
wpływać niekorzystnie na wzrost oraz zdolności produkcyjne komórek [7].
Chitynazy (EC 3.2.1.14) należą do grupy enzymów zdolnych do
degradacji chityny bezpośrednio do niskocząsteczkowych produktów.
Degradacja enzymatyczna chityny następuje w dwóch etapach, mianowicie
endochitynazy rozkładają polimer do oligomerów, które następnie są
degradowane przez egzochitynazy do monomerów [8]. Chitynazy są
wytwarzane przez szeroką gamę mikroorganizmów, mianowicie bakterie,
grzyby, owady, rośliny wyższe oraz zwierzęta.
Na podstawie podobieństwa sekwencji aminokwasów, chitynazy zostały
zaliczone do 18, 19 i 20 rodziny hydrolaz glikozydowych. Rodzina 18 jest
zróżnicowana ewolucyjnie i zawiera chitynazy bakteryjne, grzybowe,
wirusowe, zwierzęce, a także kilka roślinnych. Rodzina 19 złożona jest
z chitynaz roślinnych (klasa I, II i III) oraz kilku chitynaz pochodzących ze
Streptomyces. Te dwie rodziny nie wykazują podobieństwa w sekwencji
aminokwasowej. Posiadają one zupełnie inną trójwymiarową strukturę
i mechanizmy molekularne, więc prawdopodobnie pochodzą od ewolucyjnie
różnych przodków. Rodzina 20 obejmuje β-N-acetyloheksoaminidazy
pochodzące z bakterii, Streptomyces oraz ludzi. Bakteryjne chitynazy są
wyraźnie podzielone na trzy główne podrodziny - A, B i C, ze względu na
sekwencję aminokwasową w indywidualnej domenie katalitycznej [9].
,
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
33
Analiza chitynaz z bakterii, grzybów i roślin pozwoliła zidentyfikować
w nich odrębne domeny. Badania wykazały, że chitynazy z roślin takich jak
tytoń, fasola, burak cukrowy, itp. zawierają tylko jedną domenę katalityczną.
Natomiast zewnątrzkomórkowe chitynazy drożdżowe posiadają cztery
domeny, mianowicie sekwencję sygnałową, domenę katalityczną, region
bogaty w serynę/treoninę (akceptorowa strona dla O-glikozylacji) oraz C-
końcową domeną wiążącą chitynę. Chitynazy grzybów Rhizopus
oligosporus, R. niveus oraz pasożyta Brugia malayi także wykazały obecność
regionów bogatych w ser/thr. Opisano sześć różnych chitynaz (A1, A2, B1,
B2, C, i D), które były wydzielone do podłoża przez Bacillus circulans.
Wśród nich chitynaza A1 jest najobficiej produkowana i wykazuje silne
powinowactwo do nierozpuszczalnej chityny [10].
W hodowlach laboratoryjnych Trichoderma mających na celu ocenę
uzdolnień enzymatycznych wykazano, że najlepszymi warunkami indukcji
zewnątrzkomórkowych chitynaz jest wzrost w podłożu zawierającym
oczyszczoną chitynę, grzybnię lub ścianę komórkową jako jedyne źródło
węgla. Zauważono także, że glukoza, sacharoza albo produkty degradacji
chityny mogą powodować inhibicję chitynaz, co może sygnalizować
o regulacji ich biosyntezy na poziomie represji katabolicznej. Chitynazy
pochodzące z różnych źródeł wykazują inne mechanizmy indukcji,
tzn. podczas zjawiska mykoparazytyzmu (rozkładanie ściany komórkowej
innych grzybów) rodzaj wydzielanego enzymu związany jest z grzybem
– gospodarzem. Kolejne badania chitynaz wskazały, że niektóre z nich
(jednakże w niewielkich ilościach) są produkowane konstytucyjnie,
np. CHIT 42, CHIT 33 czy N-acetylo-β-D-glukozoaminidaza (102 kDa).
Chitynazy mogą być także syntetyzowane w warunkach stresowych lub
głodowych, obniżając sztywność ściany komórkowej.
Obok chitynaz znaczący udział w degradacji biopolimerów ścian
komórkowych grzybów patogennych mają również β-1,3-glukanazy (EC
3.2.1.39) [4]. Szereg endo- i egzo- β-1,3- glukanaz zawierają drożdże
Saccharomyces cerevisiae. Przypuszcza się, że około 15 genów tych
drożdży koduje glukanazy oraz enzymy o pokrewnych aktywnościach.
Niektóre z tych glukanaz odgrywają rolę podczas separacji komórek, inne zaś
wykazują aktywność transglikozylazy i mogą być związane z rozbudową
i przekształcaniem łańcuchów β-1,3-glukanu oraz sieciowaniem tego
polimeru do innych komponentów ściany komórkowej. Dowiedziono, iż
usunięcie genu ENG1, kodującego u S. cerevisiae endo-β-1,3-glukanazę,
doprowadziło do zbrylania komórek. Pojedyncze usuwanie genów SCW3,
SCW4 i SCW10, które mogą kodować rozpuszczalne glukanazy ściany
komórkowej, nie miało istotnego wpływu na fenotyp, ale zakłócenie
pokrewnego genu SCW11 powoduje wyraźne hamowanie separacji
komórek po podziale. Dowiedziono również, że usunięcie genu GAS1
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk
34
u S. cerevisiae doprowadziło do kilku wad morfogenetycznych oraz do
wyraźnego spadku w stopniu usieciowania β-1,3-glukanu do innych
polimerów ściany.
Aktywność glukanolityczna została także wykryta w ścianie
komórkowej patogenów układu oddechowego Aspergillus fumigatus,
Coccidioides posadasii i Coccidioides immitis. Niektóre ze znalezionych
enzymów wykazują zarówno aktywność glukanazy i transglikozydazy,
podobnie jak w przypadku glukanaz drożdżowych, co może odgrywać rolę
w przebudowie ściany komórkowej podczas morfogenezy. U A. fumigatus
wykryto monomeryczne i dimeryczne egzo-β-1,3-glukanazy o masie
cząsteczkowej odpowiednio 82 kDa i 230 kDa oraz endo-β-1,3-glukanazy
o masie 74 kDa [11].
Proteazy są enzymami proteolitycznymi mającymi zdolność hydrolizy
wiązania peptydowego. Termin „proteazy” można używać zamiennie
z określeniem „peptydazy”- obydwa jako ogólne określenie dla egzo-
i endopeptydaz. Podział podklasy peptydaz jest kłopotliwy przez wzgląd na
to, iż specyficzność tych enzymów jest na ogół trudna do zdefiniowania
i zależy od budowy kilku aminokwasów znajdujących się w sąsiedztwie
hydrolizowanego wiązania oraz od konformacji całego łańcucha
polipeptydowego substratu. Z tej przyczyny dodatkowym kryterium
klasyfikacji tej podklasy jest mechanizm katalizy enzymatycznej
aminopeptydazy [12].
Enzymy te można podzielić na endo- i egzopeptydazy. Endopeptydazy
(EC 3.4.21-24 i EC 3.4.99) hydrolizują wiązania peptydowe wewnątrz
łańcucha polipeptydowego białek na fragmenty peptydowe różnej długości,
natomiast egzopeptydazy (EC 3.4.11-19) rozkładają wiązania peptydowe
na końcach łańcucha peptydowego. Egzoproteazy odszczepiające skrajne
C- oraz N- końcowe reszty aminokwasowe klasyfikuje się jako
karboksypeptydazy oraz aminopeptydazy [12, 13].
4. Enzymy lityczne- zastosowanie
Produkcja enzymów hydrolitycznych jest skutecznym czynnikiem
biokontroli grzybów fitopatogennych. Właściwość tą dobrze poznano
i opisano przede wszystkim u grzybów strzępkowych. Grzyby z rodzaju
Trichoderma przy udziale kompleksu enzymów litycznych, określanych
skrótem CWDEs (Cell Wall Degrading Enzymes), skutecznie degradują
ścianę komórkową fitopatogenów. Wśród tych enzymów kluczową rolę
w kontroli biologicznej odgrywają enzymy chitynolityczne, β-1,3-glukanazy
i proteinazy [14]. Zdolność produkcji enzymów litycznych została także
poznana u niektórych drożdży. Badania wykazały, że β-1,3-glukanazy
wytwarzane są przez drożdże C. laurentii, R. glutinis, P. membranifaciens,
,
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
35
Pichia anomala, A. pullulans, Tilletiopsis albescens, T. pallescens.
Produkcję chitynaz natomiast stwierdzono u drożdży Candida saitoana,
A. pullulans, T. albescens i T. pallescens. Enzymy te hamowały wzrost
licznych patogenów grzybowych, co przedstawia tabela nr 1 [15].
Tab. 1. Enzymy lityczne wybranych antagonistycznych drożdży [15]
Produkowany
enzym
Antagonistyczny producent Wrażliwy fitopatogen
chitynaza
Aureobasidium pullulans,
Tilletiopsis albescens,
Tilletiopsis pallescens,
Candida saitoana
Penicillium expansum,
Puccinia xanthii, Botrytis
cinerea
β-1,3-glukanaza
Rhodotorula glutinis,
Pichia anomala,
Pichia membranifaciens,
Cryptococcus laurentii,
Aureobasidium pullulans,
Tilletiopsis albescens,
Tilletiopsis pallescens
Botrytis cinerea, Penicillium
expansum, Rhizopus
stolonifer, Sphaerotheca
fuliginea, Aspergillus niger,
Puccinia xanthii
Enzymy lityczne mogą być wykorzystywane w bardzo szerokim
zakresie, nie tylko w biologicznej ochronie przeciwko niektórym
fitopatogenom grzybowym, ale też np. przy produkcji protoplastów,
w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i chemicznym.
Grzyby zawierają w swojej ścianie komórkowej chitynę, dlatego
zastosowanie enzymów chitynolitycznych wraz z innymi enzymami
degradującymi ścianę komórkową, pozwala na otrzymanie protoplastów.
Protoplasty grzybów są stosowane jako efektywne narzędzie eksperymentalne
w poznawaniu mechanizmów syntezy ściany komórkowej, czy w nauce
o syntezie i sekrecji enzymów. W przeprowadzonych badaniach potwierdzono
efektywność chitynaz Enterobacter sp. NRG4 w tworzeniu protoplastów
z Trichoderma reesei, Pleurotus florida, Agaricus bisporus i Aspergillus niger.
Wyizolowano również protoplasty z Schizophylum commune używając w tym
celu filtraty B. circulans KA-304. Kompleks enzymów B. circulans WL-12
o wysokiej aktywności chitynolitycznej okazał się skuteczny w wytwarzaniu
protoplastów z drożdży Phaffia rhodozyma.
Tempo narastania deficytu białka na świecie oraz jego skala
spowodowały, że poza tradycyjnymi metodami biosyntezy białka, podjęto
się opracowania niekonwencjonalnych mikrobiologicznych sposobów.
Produkty takie określono skrótowo SCP (single cell protein), czyli białko
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk
36
z pojedynczych komórek. Obejmują one preparaty pochodzenia
grzybowego, bakteryjnego, jak również z glonów. W celu otrzymania SCP
z odpadów zawierających chitynę zastosowanie znalazły chitynazy.
Zazwyczaj do pozyskania SCP stosuje się grzyby oraz drożdże takie jak
Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae
i Myrothecium verrucaria. Kryteriami do oceny produkcji SCP są: wzrost
wydajności, ogólne białko oraz zawartość kwasów nukleinowych.
Zawartość białek w wykorzystywanych mikroorganizmach powinna
mieścić się między 39 a 73%, natomiast kwasy nukleinowe w granicy 1-11%.
Najlepszym mikroorganizmem stosowanym w tym celu jest S. cerevisiae,
ponieważ zawiera >60% białka i 1-3% kwasów nukleinowych.
Istnieje wiele metod oceny ilościowej grzybów znajdujących się w glebie.
Techniki te obejmują bezpośrednią obserwację mikroskopową, a także
ekstrakcję z mikroorganizmu pewnych specyficznych cząsteczek
sygnalizacyjnych. Oceny tej dokonać można też przy pomocy chitynaz.
Istnieje silna korelacja pomiędzy aktywnością chitynaz a populacją grzybów
w glebie, zatem aktywność tych enzymów wydaje się być odpowiednim
wskaźnikiem oceny pojawienia się tych drobnoustrojów. Takie powiązanie
nie jest widoczne w przypadku bakterii czy promieniowców. Podobnie
chitynazy i białka związane z chityną, mogą być użyte w celu detekcji
zakażeń grzybowych u ludzi [9].
Chitynazy odgrywają również ważną rolę w morfogenezie drożdży
i owadów. Wykazano, iż chitynazy mają wpływ na separacje komórek
podczas wzrostu drożdży S. cerevisiae. Ekspresja genu chiA u S. pombe
powodowała opóźnienie wzrostu komórek i ich wydłużanie, natomiast
kiedy ekspresja dotyczyła genu choA nastąpił obrzęk komórek. Ekspresja
obu genów na raz powodowała wydłużenie i pogrubienie komórek [16].
Enzymy lityczne stosowane są także w produkcji chitooligosacharydów,
glukozaminy i GlcNAc. Substancje te mają szerokie zastosowanie
farmaceutyczne. Chitoheksozy i chitoheptozy wykazują działanie przeciw-
nowotworowe. Chitynazy z Vibrio alginolyticus są używane do wydzielenia
chitopentoz i chitotrioz z koloidalnej chityny. Produkcja chitooligo-
sacharydów wymaga wysokiego poziomu endochitynaz i niższego poziomu
N-acetyloglukozaminidazy i egzochitynaz, natomiast w celu wytworzenia
GlcNAc niezbędny jest wysoki poziom egzochitynaz i N-acetyloglukoza-
minidazy. Enzymy chitynolityczne z N. orientalia IFO12806 są stosowane
do wydzielenia GlcNAc z chitooligosacharydów.
Enzymy chitynolityczne mają także zastosowanie medyczne, bowiem
wzmacniają one aktywność leków przeciwgrzybicznych, a także mogą być
dodawane do kremów i balsamów stosowanych na te schorzenia miejscowo [9].
Opisano aktywność chitynaz w surowicy ludzkiej, co sugeruje, iż może
to być mechanizm obronny przeciwko patogenom grzybowym. Enzym
,
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
37
chitotriozydaza służy jako marker w chorobie Gauchera – uwarunkowanej
genetycznie lizosomalnej chorobie spichrzeniowej, która spowodowana jest
odkładaniem glukozyloceramidu w komórkach [10].
β-glukanazy mogą być stosowane jako dodatki do pasz zwierząt
gospodarskich. Dodaje się je głównie do paszy opartej na jęczmieniu, który
jest bogaty w β-glukany. Dodatek enzymu ma na celu przede wszystkim
podniesienie strawności jelitowej białka i β-glukanów u karmionych daną
paszą zwierząt [17].
Innym przemysłowym zastosowaniem β-glukanazy jest degradacja
β-glukanu podczas filtrowania brzeczki lub piwa. β-glukan występujący
w słodzie wpływa niekorzystnie, bowiem generuje powstawanie zmętnień,
osadów lub żelu w gotowym piwie. Powoduje on także wolną separację
brzeczki oraz słabą filtrację piwa, jak też powstawanie osadów w czasie
jego przygotowywania. Kluczową rolę w degradacji β-glukanu w warunkach
przemysłowych z całą pewnością odgrywają endo-β-glukanazy. Zastosowanie
optymalnych warunków zacierania, powodujących zachowanie Endo-
gennych β-glukanaz czy też dodanie ich podczas zacierania lub leżakowania
może obniżyć ilość β-glukanu w piwie poniżej dopuszczalnego poziomu.
Enzymy te mogą zmniejszyć masę cząsteczkową β-glukanów lub też
całkowicie je degradować [18].
Preparaty β-glukanaz są wykorzystywane przy produkcji win,
szczególnie do otrzymywania win wytwarzanych z winorośli
zaatakowanych przez patogen Botrytis cinerea. Enzym ten jest najczęściej
dodawany pod koniec procesu fermentacji alkoholowej lub przed wtórną
fermentacją jabłczanowo- mleczanową. Preparaty enzymatyczne są
stosowane w procesach maceracji, polepszających smak i intensywność
koloru produktu oraz klarowania przyspieszającego sedymentację,
stabilizację, filtrację, a także wzmocnienie potencjału dojrzewania [1].
Enzymy proteolityczne produkowane m.in. przez drożdże:
Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa,
Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon
cutaneum (beigelii) razem z enzymami lipolitycznymi znalazły
zastosowanie w dojrzewaniu serów. Enzymy te umożliwiają bardziej
zaawansowaną i szybszą hydrolizę protein (także niskocząsteczkowych
tzw. gorzkich peptydów) oraz tłuszczu mlecznego, do prekursorów
substancji aromatycznych, takich jak aminokwasy czy kwasy tłuszczowe.
Gatunek drożdży D. hanseni oprócz aktywności proteolitycznej
i lipolitycznej wykazuje zdolności do hamowania m.in. germinacji
przetrwalników Clostridium butyricum oraz wzrostu niektórych gatunków
grzybów pleśniowych i drożdży, głównie za sprawą wydzielanych
do środowiska toksyn killerowych. Antagonistyczne uzdolnienia drożdży
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk
38
D. hansenii w stosunku do innych mikroorganizmów wskazują na
potencjalną możliwość zastosowania tego gatunku jako czynnika
biokontroli mlecznych produktów spożywczych [19].
Enzymy proteolityczne są wykorzystywane także w przemyśle
detergentów. Te biologiczne katalizatory stosowane są jako dodatkowe
komponenty proszków do prania, środków myjących do zmywarek
i detergentów. Korzyści wynikające z zastosowania enzymów w środkach
piorących to przede wszystkim: lepszy efekt doczyszczania, krótszy czas
prania (mniejsze zużycie wody), obniżenie temperatury prania (obniżenie
ilości zużywanej energii), ograniczenie negatywnego wpływu na
środowisko (biodegradowalność enzymów).
Stosowanie enzymów w środkach piorących cieszy się coraz większym
zainteresowaniem, ponieważ w ostatnich latach, szczególnie w Europie,
obserwuje się rosnące zainteresowanie procesami prania prowadzonymi
w niższych temperaturach [1].
5. Podsumowanie
Zróżnicowanie mikroorganizmów w przyrodzie jest ogromne. Każdego
roku odkrywane są nowe szczepy, jednak spośród wielu z nich należy
wyselekcjonować odpowiednio aktywne drobnoustroje, które spełniają
określone wymagania technologiczne. Konieczne są ciągłe badania nad
poznaniem ich szlaków metabolicznych oraz substancji biorących w nich
udział. Enzymy lityczne wytwarzane przez mikroorganizmy znalazły
szerokie zastosowanie, m.in. w biokontroli grzybów fitopatogennych.
Obecnie biologiczne metody walki z chorobami grzybowymi cieszą się
rosnącym zainteresowaniem i stanowią alternatywę dla metod chemicznych.
Enzymy lityczne wykorzystywane są jednak nie tylko w ochronie
biologicznej, ale też w innych gałęziach przemysłu. Z ich praktycznym
zastosowaniem spotykamy się w życiu codziennym, używając detergentów,
środków piorących, sięgając po niektóre leki, czy produkty żywnościowe.
Literatura
1. Ratledge C., Kristiansen B.: Podstawy biotechnologii, PWN, Warszawa 2011
2. Nowak D., Nowak A.: Kinetyka wzrostu biomasy oraz biosyntezy enzymów
amylolitycznych przez drożdże Saccharomycopsis fibuligera podczas hodowli
w bioreaktorze, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 1(62), 28-36, 2009
3. Gohel V., Singh A., Vimal M., Ashwini P., Chatpar H. S.: Bioprospecting and
antifungal potential of chitinolytic microorganisms, African Journal
of Biotechnology Vol. 5 (2), 54-72, 2006
4. Witkowska D., Stolaś J., Kancelista A., Piegza M.: Uzdolnienia lityczne
grzybów z rodzaju Trichoderma w obecności biomasy fito patogenów, Acta
Sci. Pol., Biotechnologia 8(2), 17-25, 2009
,
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
39
5. Bednarski W., Fiedurek J.: Podstawy biotechnologii przemysłowej, Wyd.
Naukowo-Techniczne, Warszawa 2004
6. Chmiel A.: Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN,
Warszawa 1998
7. Janas P., Podgórska E., Mleko S., Pielecki J.: Biosynteza enzymów
proteolitycznych i ich wpływ na aktywność celulaz Trichoderma reesei.
Annales UMCS, Sec. E, 59 (1), 461-469, 2004
8. Sandhya C., Binod P., Nampoothiri K. M., Szakacs G., Pandey A.: Microbial
synthesis of chitinase in solid cultures and its potential as a biocontrol agent
against phytopathogenic fungus Colletotrichum gloeosporioides, Appl.
Biochem. Biotechnol., 127 (1), 1-15, 2005
9. Dahiya N., Tewari R., Hondal G. S.: Biotechnological aspects of chitinolytic
enzymes: a review, Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 773-782, 2006
10. Patil R. S., Ghormade V., Deshpande M. V.: Chitinolytic enzymes: an
exploration, Enzyme and Microbial Technology 26, 473-483, 2000
11. Adams D. J.: Fungal cell wall chitynases and glucanases, Microbiology, 150,
2029-2035, 2004
12. Baraniak B., Gawlik- Dziki U., Karaś M., Kowalczyk D., Szymanowska U.,
Świeca M., Wójcik W., Złotek U.: Enzymologia w zarysie, Wydawnictwo
CZELEJ, Lublin 2011
13. Włóka E.: Zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne wytwarzane przez grzyby
owadobójcze- rola w procesie infekcji, Postępy Biochemii, 57 (1), 115-121, 2011
14. Wojtkowiak- Gębarowska E.: Mechanizmy zwalczania fitopatogenów glebowych
przez grzyby z rodzaju Trichoderma, Post. Mikrobiol. 45, 261-273, 2006.
15. El-Tarabily K. A., Sivasithamparam K.: Potential of yeasts as biocontrol
agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters,
Mycosci. 47, 25-35, 2006
16. Shimono K., Matsuda H., Kawamukai M.: Functional expresion of chitinase
and chitosanase, and their effects on morphologies in the yeast
Schizosaccharomyces pombe, Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1143-1147, 2002
17. Hanczakowska E., Koczywąs E.: Zastosowanie enzymów rozkładających
polisacharydy nieskrobiowe w żywieniu świń, Wiadomości Zootechniczne,
R. XLVI, 2: 9-16, 2008
18. Czarnecki Z., Czarnecka M., Śpiewak A.: Zmiany wysokocząsteczkowych
β-glukanów i aktywności β-glukanazy w procesie słodowania jęczmienia
browarnego, Acta Sci. Pol., Technologia Alimentaria 3 (2), 137-146, 2004
19. Szczepaniak G., Wojtatowicz M.: Dobór szczepów Yarrowia lipolytica
i Debaryomyces hansenii do szczepionki wspomagającej proces dojrzewania
sera, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (79), 192-203, 2011
Izabela Podgórska, Monika Kordowska-Wiater, Monika Wójcik, Łukasz Sęczyk
40
Enzymy lityczne – ich producenci i zastosowanie
Streszczenie Intensywny rozwój technik współczesnej biotechnologii, wydzielenie indywidualnych
enzymów komórkowych oraz identyfikacja nowych enzymów, o nieznanych dotąd
właściwościach, spowodowały, iż stały się one nowym elementem kształtowania procesów
technologicznych. W komórkach mikroorganizmów znajduje się ogromna różnorodność enzymów, a w zależności od warunków środowiska, uruchamiana jest synteza takiego
enzymu, który w danych warunkach jest komórce niezbędny. Nie wszystkie drobnoustroje
stanowią źródło enzymów przydatnych przemysłowo, dlatego istotnym zagadnieniem jest
wyselekcjonowanie spośród wielu mikroorganizmów odpowiednio aktywnego szczepu, który odpowiada stawianym wymaganiom technologicznym. Produkcja enzymów
hydrolitycznych, w szczególności chitynaz i glukanaz jest cechą powszechną u wielu
efektywnych czynników kontroli biologicznej. Cecha ta została dobrze poznana u grzybów
strzępkowych z rodzaju Trichoderma, ale stwierdzono ją także u niektórych drożdży.
Enzymy lityczne wykazują ogromny potencjał i mogą być wykorzystywane w bardzo
szerokim zakresie, nie tylko w biologicznej ochronie roślin przeciwko niektórym patogenom
grzybowym, ale też między innymi przy produkcji pasz, w farmaceutyce, medycynie,
czy przemyśle detergentów.
Słowa kluczowe: biokontrola, enzymy lityczne, skrining
Lytic enzymes – their producers and application
Abstract
Intensive development of the modern biotechnology techniques, secretion of individual
cellular enzymes and identification of new enzymes with unknown properties, caused that they have become a new element in shaping technological processes. The microbial cells
have a great variety of enzymes. Not all microbes are the source of industrially useful
enzymes, therefore an important issue is to select the most active strain, from a variety
of microorganisms, which corresponds to the particular requirements for technology. The production of hydrolytic enzymes, especially chitinases and glucanases is a common feature
of many effective agents of biological control. This feature is well known in the filamentous
fungi of the genus Trichoderma, but it can also be found in some yeasts. Lytic enzymes have
enormous potential and can be used in a very wide range, not only in biological plant protection against some phytopathogenic fungi, but also in the production of animal feed,
pharmaceutical, medical, and industrial detergents.
Keywords: biocontrol, lytic enzymes, screening
41
Magdalena Bartosiak1, Anna Cieślak
Zastosowanie grzybowej lakazy
w procesie bioremediacji
1. Wstęp
Grzyby to niewątpliwie bogate źródło cząsteczek enzymatycznych,
zdolnych do przyspieszania skomplikowanych reakcji chemicznych. Ze
względu na potencjalne zastosowanie w detoksykacji zanieczyszczeń
i bioremediacji związków fenolowych, w ostatnim czasie wzrosło
zainteresowanie grzybową laktazą [1]. Za pomocą tego enzymu możliwe
jest przekształcenie drewna, tworzyw sztucznych, farb, paliw i wielu
innych materiałów w składniki odżywcze. Obecnie wykorzystuje się je
m.in. w przetwórstwie celulozy. Ponadto, ostatnie badanie sugerują, że
użycie grzybów degradujących ligninę, takich jak Phanerochaete
chrysosporium może w przyszłości zastąpić niektóre chemiczne etapy
produkcji papieru [2]. Stosowanie enzymów do usuwania zanieczyszczeń
przyciąga uwagę naukowców ze względu na dużą skuteczność metody,
wysoką selektywność i bezpieczeństwo dla środowiska. Prowadzone są
także badania nad ulepszeniem produkcji lakazy, a mianowicie testowanie
nowych szczepów, modyfikowanie warunków wzrostu, stosowanie
induktorów czy wykorzystanie nowych podłóż wzrostowych
pozyskiwanych z odpadów spożywczych i rolnych [3].
2. Charakterystyka lakazy
Lakaza to oksydoreduktaza zawierająca w swojej cząsteczce atom
miedzi. Katalizuje reakcje jednoelektronowego utlenienia różnorakich
substratów, np. fenoli bądź aromatycznych lub alifatycznych amin, do
odpowiednich rodników, przy użyciu tlenu cząsteczkowego jako
końcowego akceptora elektronów, tzn. katalizuje redukcję tlenu
cząsteczkowego do wody z pominięciem etapu powstawania nadtlenku
wodoru [3,4]. Lakaza jest jednym nielicznych enzymów, nad którym
nieustannie od XIX wieku, trwają prace mające na celu poznanie ich
innowacyjne właściwości i zastosowanie. Po raz pierwszy opisana została
1 Email: [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
42
w 1883 roku przez Yoshidam. Naukowiec wizował enzym z japońskiego
drzewa Rhus vernicifera [3].
Lakazy to glikoproteiny o masie cząsteczkowej 50-130 kDa. Część
węglowodanowa zawiera głównie mannozę, N-acetyloglukozaminę,
galaktozę i stanowi 45% masy cząsteczkowej enzymu pochodzenia
roślinnego. Grzybiczne lakazy charakteryzują się niższą zawartością
węglowodanów (10-20%), np.: w składzie lakazy pochodzącej z P.eryngii
ilość oligosacharydów waha się od 1 do 7% [8]. Rolą tej części enzymu jest
stabilizacja globularnej struktury białka oraz ochrona przed procesem
proteolizy i inaktywacją cząsteczki przez wolne rodniki [9, 10].
2.1. Źródła lakazy
Enzym lakaza rozpowszechniony jest szczególnie wśród
ligninolitycznych podstawczaków, ale występują również w komórkach
niektórych prokariotów, owadów i roślin. Fakt ten sugeruje, że białko
występuje dość powszechnie w naturze [4].
Poza wyizolowaniem lakazy przez Yoshidam z drzewa, enzym
pochodzenia roślinnego jest rzadkością. Wykrywanie i oczyszczanie
enzymu w roślinach jest często trudne z powodu obecności w surowym
ekstrakcie roślinnym dużej ilości enzymów oksydacyjnych o szerokiej
speficzności substratowej. W literaturze można znaleźć jedynie częściową
charakterystykę lakazy pochodzącej z Rhus succedanea, Acer
pseudoplatanus, Pinus taeda, Populus euramericana, Liriodendron
tulipifera, Nicotiana tobacco, Lolium perenne i Zea mays.
Większość opisywanych lakaz wyizolowane zostały z grzybów
wyższych, głównie grzybów ligninolitycznych, glebowych saprofitów
i fitopatogenów grzybowych oraz jadalnych grzybów kapeluszowych,
np.: pieczarki Agaricus bisporus, boczniaka Pleurotus ostreatus. Po raz
pierwszy dokonali tego Bertrand i Laborde w 1896 roku. Większość
ligninolitycznych gatunków grzybów jest zdolna do konstytutywnego
wytwarzania przynajmniej jednego izoenzymu lakazy. Największa
aktywność enzymu występuje u workowców i podstawczaków. Przykładem
fitopatogenicznych grzybów typu ascomycetes będących źródłem lakazy są
Melanocarpusalbomyces, Cerrena unicolor, Magnaporthe grisea, Trametes
versicolor, Trichoderma reesei oraz Xylaria polymorpha. Producentami
lakazy są również saprofityczna Myceliophthora thermophila i Chaetomium
thermophilum, które biorą udział w procesie humifikacji. Ponadto enzym
i geny go kodujące zidentyfikowano u Botrytis cinerea – patogena moszczu
winogronowego [3].
Wśród drożdży źródło lakazy wykryto dotychczas tylko u ludzkiego
patogena drożdżowego Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans. Ten typ
,
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
43
drożdży zdolny jest do wytwarzania lakazy, ściśle związanej ze ścianą
komórkową, zdolnej do utleniania fenoli i aminofenoli i przyczyniającej się
do oporności na fungicydy [6].
Pierwsza bateryjna laktaza wyizolowana została z wolno żyjących
glebowych bakterii azotowych Azospirillum lipoferum . Bacillus subtilis
zdolny jest do produkcji termostabilnej CotA lakazy, który uczestniczy
w wytwarzaniu pigmentu osłonki endospor. Z kolei endospory Bacillus
licheniformis, po ówczesnej izolacji z gleby, wytwarzają lakazę
zaangażowaną w degradację fenoli. Ponadto, producentem enzymu jest
Streptomyces lavendulae oraz Streptomyces cyaneus [3].
2.2. Lokalizacja lakazy w komórce
Biorąc pod uwagę specyficzność substratową, enzymy biorące udział
w degradacji ligniny są wyłącznie zewnątrzkomórkowe. Fakt ten jest
prawdziwy dla peroksydaz ligninowych i peroksydaz manganowych.
W przypadku lakazy jest inaczej. Prawda jest, że większość poznanych
lakaz pochodzenia grzybowego należy do białek zewnątrzkomórkowych.
Niemniej jednak opisane są także przykłady enzymu występującego
wewnątrzkomórkowo, przede wszystkim u grzybów powodujących biała
zgniliznę drewna [7]. Grzyby te zdolne są do produkcji zarówno
wewnątrzkomórkowej, jak i zewnątrzkomórkowej lakazy. Jednak enzym
w większości (95%) występuje na zewnątrz komórki. Niewielkie ilości
enzymu wewnątrzkomórkowego znaleziono u A.bisporus. W dwojaki
sposób lakazę wydzielają także Phanerochaete chrysosporium i Suillus
granulatu. Wewnatrzkomórkowe lakazy grzybowe mogą być wykorzystane
do transformacji niskocząsteczkowych związków fenolowych
produkowanych w komórce, a zlokalizowane w ścianie komórkowej
i sporach do syntezy melaniny oraz innych substancji chroniących ścianę
komórkową [5].
2.3. Budowa centrum aktywnego lakazy
W centrum aktywnym enzymu znajdują się cztery sąsiadujące ze sobą
atomy miedzi, reprezentujące trzy typy, wyróżnione ze względu na
specyficzne właściwości. Typ I miedzi (miejsce T1) jest miejscem
utleniania substratu oraz nadaje niebieski kolor cząsteczce enzymu, dlatego
lakaza określania jest „niebieska oksydazą”. Utleniona forma tego typu
miedzi wykazuje absorbancję przy długości fali 610nm. Dwa atomy miedzi
typu III (miejsce T3) i jeden atom miedzi typu II (miejsce T2) tworzą
trójpierścieniowy klaster.
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
44
Rys. 1. Trójatomowy zespół, w którym każdy atom miedzi związany jest w grupą
imidazolowi histydyny. Miedź oznaczona została kolorem brązowym, a azot niebieskim
Takie ugrupowanie jest miejscem wiązania i redukcji tlenu
cząsteczkowego do wody. W każdym cyklu katalitycznym redukcji
1 cząsteczki tlenu do 2 cząsteczek wody towarzyszy utlenienie 4 cząsteczek
substratów do 4 rodników substratów. Podczas utleniania substratu
powstają reaktywne rodniki, które z kolei mogą pełnić rolę substratów
w innych nieenzymatycznych reakcjach. Atomy miedzi centrum aktywnego
lakazy, w spektroskopowej analizie elektronowego rezonansu magnetyce-
nego, wykazały charakterystyczne właściwości, tj. aktywność
paramagnetyczną dla miedzi typu I i II oraz, w skutek antyferromagne-
tycznego sprzężenia pary atomów miedzi typu III, brak sygnału dla
trzeciego typu miedzi [11]. Odległość między miejscem T2 i T3 wynosi
4A⁰, natomiast T1 oddalone jest od dwóch pozostałych o 12A⁰. Ligandami
dla T1 są grupy imidazolowi dwóch histydyn oraz grupa tiolowa cysteiny,
które tworzą strukturą trójkątną. Ten jon miedzi może zostać zastąpiony
atomem rtęci lub kobaltu [5]. Miedź w miejscu T2 występuje
w tetragonalnym kompleksie i może zostać selektywnie usunięte z
cząsteczki enzymu, czemu towarzyszy znaczne zmniejszenie aktywności
lakazy [12]. Dwa jonu miedzi ,wchodzące w skład miejsca T3, o cechach
antyferromagnetycznych połączone są ze sobą za pomocą mostka
wodorotlenkowego [5].
,
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
45
Rys. 2. Schemat rozmieszczenia atomów miedzi w miejscach T1, T2 i T3
w cząsteczce lakazy
2.3.1. Mechanizm katalizy enzymatycznej
Mimo ogromnej liczby badan dotyczących niebieskiej oksydazy
zawierającej miedź, brak jest jednego, ogólnego stwierdzenia dotyczącego
drogi transferu elektronu w białku i mechanizmu redukcji tlenu
cząsteczkowego w cząsteczce. Miejsce T1 centrum aktywnego lakazy jest
akceptorem elektronów pochodzących ze zredukowanego substratu, które
następnie transportowane są do klastra T2/T3, gdzie tlen molekularny ulega
aktywacji i redukcji do cząsteczki wody [13].
W wyniku interakcji zredukowanej formy enzymu z tlenem
cząsteczkowym powstają dwa produkty pośrednie: nadtlenkowy oraz
natywny. Natywny produkt pośredni odgrywa ważną rolę w cyklu
katalitycznym enzymu. Podczas reakcji z 17
O2 produkt ten działa jako
rodnik tlenowy, a jego struktura różni się od enzymu w stanie pierwotnym,
brakiem Kołacznie jonów miedzi w miejscu T2 i T3 [5].
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
46
Rys. 2. Cykl katalityczny lakazy pokazujący mechanizm redukcji i utleniania
miejsc zawierających jon miedzi.
Przedstawiony schemat pokazuje czteroelektrodowa redukcję tlenu
atmosferycznego to cząsteczki wody przy użyciu lakazy. W wyniku
całkowitej redukcji klastra T2/T3 cząsteczki białka dochodzi do powstania
nadtlenkowego produktu pośredniego. Wykorzystanie lakazy, która
w miejscu T1, zamiast jonu miedzi, zawiera jon rtęci powoduje
wytworzenie mostka nadtlenowego pomiędzy zredukowanym miejscem
T2, a utlenionym T3. Rozerwanie wiązania nadtlenkowego O-O podczas
przekształcenia w natywny produkt pośredni, nie ma jasno wytłuma-
czonego mechanizmu. Energia aktywacji, potrzebna do zajścia procesu,
wynosi ok.9 kcal/mol. Taki poziom energii odpowiada mechanizmowi
jednoelektronowej redukcji rozkładającej wiązanie nadtlenkowe
,
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
47
w produkcie przejściowym. Następnie natywny produkt pośredni ulega
powolnej transformacji do formy utlenionej, często określanej jako forma
spoczynkowa. Miejsce T1 tej formy enzymu może ulec redukcji w wyniku
oddziaływania z substratem. Tempo transferu elektronów do 3-
miedziowego klastera jest jednak zbyt wolne, by redukcja ta miała
znaczenie dla procesu katalizy [14].
3. Praktyczne zastosowania lakazy
Katalityczne i elektrokatalityczne właściwości lakazy dają duże
możliwości ich zastosowania w przemyśle papierniczym, tekstylnym
i kosmetycznym w celu detoksyfikacji odpadów chemicznych, syntezie
organicznej, degradacji ksenobiotyków i bioremediacji, w celu utworzenia
sterylnych produktów, w produkcji płyt pilśniowych, bloczków drewna
oraz tektury bez użycia toksycznych półśrodków, w produkcji detergentów
oraz w tworzeniu biosensorów i katod dla biopaliw [15, 16].
Zastosowanie lakazy w praktyce jest oparte na dwóch powiązanych ze sobą
środkach: poszukiwaniu enzymów z fizykochemicznymi właściwościami
oraz wydajnych wzmacniaczy i induktorów aktywacyjnych tych enzymów.
Wszystkie cele w zastosowaniu lakazy w biotechnologii oparte są na ich
zdolności do produkcji wolnych rodników podczas oksydacji różnych
substratów. W przemyśle spożywczym lakaza używana jest do stabilizacji
i poprawienia jakości napojów oraz deoksygenacji produktów
zawierających tłuszcze roślinne, które łatwo ulegają zepsuciu [17].
Bezpośredni transfer elektronów z elektrody do cząsteczek lakazy został
wykorzystany w produkcji biopaliw [3]. Lakaza używana jest również do
delignifikacji lignocellulozy oraz modyfikacji lignino-pochodnych
materiałów. Ponadto biosensory amperometryczne oparte na lakazie znajdują
zastosowanie w analizie fenolopochodnych (chlorofenole, katecholaminy,
ligninę, taninę). Lakaza używana jest również jako marker enzymatyczny
w analizie zawartości pestycydów.
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
48
Rys.3 Zastosowanie lakazy w biotechnologii
3.1. Zastosowanie lakazy w bioremediacji
Bioremediacja jest technologią usuwania zanieczyszczeń z gleby i wód
podziemnych z użyciem żywych mikroorganizmów do katalizowania,
destrukcji lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w mniej
szkodliwe pochodne tych związków. Zdolność grzybów do transformacji
szerokiego zakresu niebezpiecznych związków chemicznych wzbudziła
zainteresowanie użyciem ich do bioremediacji [18]. Enzymatyczne
oczyszczanie jest uznawanie za alternatywną metodę usuwania
toksycznych ksenobiotyków ze środowiska.
3.1.1 Degradacja ksenobiotyków
Lakazy charakteryzuje szeroki zakres substratów, dlatego zdolne są do
utleniania większości ksenobiotyków, związków składających się
z chlorofenoli, pestycydów i policyklicznych węglowodorów aromatycz-
nych. Ponadto, policykliczne węglowodory aromatyczne pochodzące
z naturalnych składów ropy oraz utylizacji paliw kopalnych mogą być
degradowane przez lakazy.
Badania laboratoryjne wykazały, że fenole i aminy aromatyczne mogą
być usuwane z wody z zastosowaniem lakazy [5]. Mechanizm oczyszczania
wymaga utleniania enzymatycznego zanieczyszczeń do wolnych rodników
lub chinonów, które przechodzą polimeryzację i częściowe wytrącenie się
w postaci osadu. Ponadto, lakazy mogą również immobilizować zanieczy-
,
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
49
szczenia gleb, poprzez ich przemianę do gleb humusowych – w procesie
analogicznym do procesu syntezy kwasów humusowych w glebach.
Ksenobiotyki, które mogą być zimmobilizowane w ten sposób składają się
z pochodnych fenoli. Immobilizacja obniża biologiczną dostępność
ksenobiotyków i co za tym idzie – ich toksyczność.
Lakaza produkowana przez drożdże została zmodyfikowane tak aby
zwiększyć poziom transferu elektronów pomiędzy zawierającym miedź
miejscem aktywnym lakazy i elektrodą [19]. Genetyczne modyfikacje dają
lakazie możliwość zwiększenia jej wydajności w procesie bioremediacji.
3.1.2 Dekoloryzacja barwników
Chemiczne środki używane w przemyśle tekstylnym są bardzo
zróżnicowane pod względem składu chemicznego. Struktura chemiczna
barwników daje im odporność na blaknięcie pod wpływem światła
słonecznego, wody i innych środków chemicznych co sprawia, że są bardzo
trudne do dekoloryzacji [5]. Część barwników składa się ze znanych
kancerogenów takich jak benzydyna i inne węglowodory aromatyczne.
Najpopularniejsze procesy odbarwiania ścieków z produkcji barwników
są niewydajne i nieopłacalne [3]. Dlatego też, rozwój procesu z użyciem
lakazy jest atrakcyjną alternatywą ze względu na ich zdolność do
degradacji barwników o zróżnicowanej chemicznej strukturze. Kultury
Pycnoporus sanguineus produkują lakazę w postaci fenolooksydazę, która
umożliwia częściową dekoloryzację dwóch barwników azotowych i dwóch
barwników trifenylometanowych. Natomiast lakaza wyizolowana z grzyba
Trametes hirsuta jest w stanie zdegradować barwniki triarylometanowe,
indygoidowe i azotowe powszechnie używane do barwienia tekstyliów oraz
23 inne barwniki przemysłowe.
3.1.3 Oczyszczanie ścieków
Lakazy izolowane z grzybów znajdują swoje biotechnologiczne zasto-
sowanie w oczyszczaniu ścieków przemysłowych. Ze względu na ich szeroki
zakres substratów, używane są do wybielania miazgi drzewnej albo do
detoksyfikacji rolniczych produktów ubocznych takich jak miąższ kawowy lub
ścieki z wytłaczarni oliwy [3]. Lakazy uzyskane z Trametes villosa degraduje
bisfenol A – powodujący zaburzenia endokrynologiczne związek chemiczny.
Nonylofenole są obecnie przedmiotem zainteresowania naukowców ze
względu na ich zdolność do naśladowania działania naturalnych hormonów
u wyższych kręgowców [20]. Nonylofenole powstają podczas niecałkowitej
biodegradacji oksyetylenowanych nonylofenoli (NPEO), które są używane
jako niejonowe surfaktanty w procesach przemysłowych. Zarówno NPEO jaki
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
50
i nonylofenole są odprowadzane do środowiska, głównie poprzez niecałkowite
usunięcie ich ze ścieków wodnych [20].
Nonylofenole są bardziej odporne na biodegradację niż NPEO, dlatego
są obecne w rzekach i roślinach narażonych na działanie ścieków. Lakazy
produkowane przez Clavariopsis aquatica wykazują zdolność do
degradacji nonylofenoli. Dlatego też, trwają badania nad zastosowaniem
lakazy w celu oczyszczania ścieków na szeroką skalę [5].
3.1.4 Bioremediacja miazgi drzewnej w przemyśle papierniczym
Obecnie wybielanie miazgi drzewnej prowadzi się za pomocą środków
chemicznych opartych głównie na chlorze. To prowadzi do utworzenia się
chloropochodnych związków alifatycznych i aromatycznych, które mogą
być ostro trujące, mutageniczne i kancerogenne [21]. W ostatnich latach
prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem nowoczesnej
technologii wybielania za pomocą enzymów. Zastosowanie lakazy na
szerszą w celu „biowybielania” miazgi drzewnej ograniczają jedynie
wysokie koszty otrzymywania, a jej zastosowanie w bioremediacji
w przemyśle drzewnym i papierniczym jest utrudniona przez zasadowy
charakter ścieków. Lakazy izolowane z Coriolopsis gallica są
wykorzystywane do dekoloryzacji zasadowych ścieków przemysłowych,
do ich dechloracji oraz oczyszczenia z chloropochodnych związków takich
jak chloroligniny z wybielonych ścieków [3].
Inne zastosowania lakazy w przemyśle papierniczym to ulepszanie
właściwości miazgi drzewnej. Lakazy wyizolowane z grzybów są
wykorzystywane do oczyszczania ścieków z przetwórni drewna lub innych
zawierających chloroligniny lub związki fenolowe. Lakazy neutralizują
związki fenolowe przez ich degradację lub polimeryzację lub krzyżowe
łączenie zanieczyszczonych fenoli z tymi które naturalnie występują
w środowisku.
4. Podsumowanie
Lakazy to enzymy należące do oksydaz, które katalizują
jednoelektronowe utlenianie szerokiego spektrum substancji takich jak
orto- i para-difenoli, aminofenoli, związków aromatycznych i amin.
Dlatego też lakazy posiadają zdolność do degradacji ligniny i są obecne
u wielu grzybów. Lakazy są używane do dekoloryzacji i detoksyfikacji
ścieków przemysłowych oraz oczyszczaniu wód. Działają zarówno na
niefenolowe związki ligniny jak i na zanieczyszczenia środowiskowe.
Mogą być efektywnie wykorzystywane w przemyśle papierniczym,
tekstylnym i drzewnym do degradacji ksenobiotyków i bioremediacji.
,
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
51
Ze względu na ich specyficzną naturę, lakazy obecnie są w centrum
zainteresowania naukowców.
Od czasu odkrycia lakaz u grzybów trwają badania nad ich
biotechnologicznym zastosowaniem. Nowe technologie związane
z częściową delignifikacją w produkcji celulozy, przekształceniem
ligninocelulozy w biopaliwo oraz oczyszczanie ścieków przemysłowych są
niedoskonałe, dlatego poszukuje się nowych lepszych rozwiązań,
bezpiecznych dla środowiska. Idealnym rozwiązaniem wydają się być
właśnie lakazy, które posiadają zdolność do degradacji i modyfikacji
różnych związków chemicznych oraz remediacji gleb i ścieków. Ten
artykuł ukazuje potencjalne zastosowania lakaz izolowanych z grzybów
w celu ochrony środowiska, ich budowę, źródła oraz mechanizm działania.
Literatura
1. Shekher R i in., Laccase: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications, Enzyme research, 2011
2. Singh G i in., Laccase from prokaryotes: a new source for an old enzyme, Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 2011, s.309-326
3. Viswanath B i in., Fungal laccases and their applications in bioremediation, Enzyme Research, 2014
4. Jong-Rok J i in., Laccase-catalysed oxidations of naturalny occurring phenols: from in vivo biosynthetic pathways to green synthetic applications, Microbial biotechnology, 2012, s.318-332
5. Morozova OV i in., „Blue” laccases, Biochemistry, 2007, s.1396-1412 6. De Jesus M i in., Capsular localization of the Cryptococcus neoformans
polysaccharide component galactoxylomannan, Eukaryotic Cell, 2009, s.96-103 7. Blaich R, Esser K, Function of enzymes in Wood destroying fungi. II. Multiple
forms of laccase in white rot fungi, Arch. Microbiol., 1975, s. 271-277 8. Munoz C i in., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii: characterization,
catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn
2+ oxidation, Appl. Environ. Microbiol., 1997, s. 2166-2174
9. Ko E.-M. i in., Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum, Appl.Microbiol. Biotechnol., 2001, s.98-102
10. Yoshitake A i in., N-linked carbohydrate chains protect laccase-III proteolysis in Coriolus versicolor, J. Gen. Microbiol., 1992, s.179-185
11. Polak J, Jarosz-Wilkołazka A, Reakcje katalizowane przez lakazę – mechanizm i zastosowanie w biotechnologii, Biotechnologia, 2007, s.82-94
12. Malkin R i in., The reversible removal of one specific cooperII from fungal laccase, Eur. J. Biochem., 1969, s.253-259
13. Bento I i in., Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; structural perspective, Dalton Trans., 2005, s.3507-3513
14. Lee SK i in., Nature of the intermediate formed in the reduction O(2) to H(2)O at the trinuclear copper cluster active site in native laccase, J. Am. Chem.Soc., 2002, s.6180-6193
15. Yaropolov, A. I. i in., Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, 257-280
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
52
16. Bolobova, A, V. i in., Theoretical Principles ofTechnology of Wood Composites. Book II, 2002
17. Mayer, A. M., i in., 2002, Phytochemistry, 60, 551-565 18. Bollag J.M i in., 2003 Enzymatic oxidative transformation of chlorophenolmixtures,
Journal of Environmental Quality, vol. 32, no. 1, pp. 63-69 19. Riu J. i in., Determination of sulfonated azo dyes in groundwater and
industrial effluents by automated solid-phase extraction followed by capillary electrophoresis mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry, 1998, s. 653-663
20. Lyons J. I. i in., Diversity of ascomycete laccase gene sequences in a southeastern US salt marsh, Microbial Ecology, 2003, s. 270-281, 2003
21. Taspinar A., Kolankaya N. Optimization of enzymatic chlorine removal from Kraft pulp, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1998, s. 15-21, 1998
Zastosowanie grzybowej lakazy w procesie bioremediacji
Streszczenie
Grzyby stanowią bogate źródło różnych cząsteczek enzymatycznych, przyspieszających skomplikowane reakcje enzymatyczne. Jednym z enzymów produkowanych przez
te organizmy jest lakaza, czyli oksydoreduktaza zawierająca w swojej cząsteczce atom
miedzi. Lakaza katalizuje jednoelektronowe utlenianie różnych substratów, np. fenoli bądź
aromatycznych lub alifatycznych amin, do odpowiednich rodników, przy użyciu tlenu
cząsteczkowego. Enzym charakteryzuje się szerokim zakresem substratów, dlatego zdolne
są do utleniania większości ksenobiotyków, związków składających się z chloro fenoli,
pestycydów i policyklicznych węglowodorów aromatycznych. Ponadto, degradowane mogą być policykliczne węglowodory aromatyczne pochodzące z naturalnych składów ropy oraz
utylizacji paliw kopalnych. Dzięki temu enzym znalazła zastosowanie w procesie
bioremediacji – usuwania zanieczyszczeń z gleby i wód.
Słowa kluczowe: lakaza, bioremediacja
Fungal laccase and its application in bioremediation
Summary
Fungi are a rich source of different enzyme molecules, which accelerate complex enzymatic
reactions. One of the enzymes produced by these organisms is laccase – oxidoreductase
which contains a copper atome in its structure. Laccase catalyzes one-electron oxidation of various substrates like phenols or aromatic and aliphatic amines to the radicals, using
molecular oxygen. This enzyme has a wide range of substrates, therefore it’s able to oxidize
most of the xenobiotic compounds like chlorophenols, pesticides and polycyclic aromatic
hydrocarbons. In addition, aromatic hydrocarbons derived from natural oil deposits can be degraded by laccase as well as fossil fuels. Hence, laccase can be used in the
bioremediation process which is removing contaminants from soil and groundwater.
Key words: laccase, bioremediation
53
Magdalena Czemierska1, Aleksandra Szcześ
2, Anna Jarosz-Wilkołazka
1
Oczyszczanie roztworów wodnych
w procesie flokulacji
1. Wprowadzenie
Woda, pomimo prostej budowy chemicznej, stanowi podstawę życia
na Ziemi. Ze względu na swoje właściwości jest najcenniejszym surowcem
dostępnym człowiekowi, dlatego też jej zanieczyszczenie może okazać się
zgubne dla ludzkości. Problem czystości wody nadającej się do spożycia od
wielu lat znajduje się w grupie tematów analizowanych w środowisku
naukowym. Wszelkie badania prowadzone w tym kierunku mają na celu
uzyskanie najbardziej wydajnej metody oczyszczania, pozwalającej na
usunięcie szkodliwych produktów powstających w procesach
technologicznych. Istotny aspekt tych rozważań stanowi flokulacja,
uznawana za dynamiczny i wyjątkowo wydajny proces usuwający
zawieszone cząstki stałe, koloidy czy też szczątki komórek organizmów.
Substancje przeprowadzające proces flokulacji nazywane są flokulantami
i ze względu na źródło pochodzenia dzielimy je na trzy grupy: flokulanty
nieorganiczne (siarczan glinu, chlorek żelaza), syntetyczne flokulanty
organiczne (pochodne poliakrylamidu) i flokulanty naturalne (bioflokulanty).
Wiele flokulantów znajduje zastosowanie w oczyszczaniu ścieków,
usuwaniu zanieczyszczeń z przemysłu paliwowego, spożywczego oraz
metalurgicznego [1].
Bioflokulanty otrzymywane są jako naturalne produkty przemian,
zachodzących w czasie wzrostu mikroorganizmów. Podstawowymi
składnikami tych agregatów są glikoproteiny, polisacharydy, białka, kwasy
nukleinowe. Obecnie to właśnie bioflokulanty znalazły się w obszarze
zainteresowań badaczy opracowujących metody wydajnego oczyszczania
wody. Głównym powodem jest bezpieczeństwo tych polimerów dla
zdrowia człowieka, ich biodegradowalność oraz brak ryzyka wtórnego
zanieczyszczenia środowiska [2].
1 [email protected] Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie,
Wydział Biologii i Biotechnologii, Zakład Biochemii, (http://www.fungi.umcs.lublin.pl); 2 Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Chemii, Zakład Zjawisk Międzyfazowych;
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
54
2. Mechanizm flokulacji
Flokulacja jest procesem, podczas którego bardzo rozdrobnione
i rozproszone cząstki są zbierane razem tak aby mogły utworzyć większe
zgrupowania o masie pozwalającej na ich osiadanie, oczyszczając w ten
sposób środowisko, w którym zachodzi reakcja [3]. Przeprowadzone
badania pozwoliły na szczegółowe poznanie sił działających w trakcie tego
zjawiska i opracowanie modeli przedstawiających oddziaływania cząsteczek
w roztworach wodnych.
Obecnie znane są dwa podstawowe mechanizmy wyjaśniające przebieg
procesu flokulacji: mostkowanie i łatkowanie [4]. Wiele opracowań
naukowych wyróżnia dodatkowe etapy występujące na granicy faz ciecz-
ciało stałe, które są określane jako sprzężenie zwrotne i flokulacja
wymiatająca.
2.1. Mostkowanie
Mostkowanie (ang. bridging) - zachodzi, gdy segmenty łańcucha
polimeru adsorbują się na więcej niż jednej cząstce, łącząc je razem.
Kontakt z koloidami powoduje, że grupy reaktywne związku
wielkocząsteczkowego nie tylko osiadają na powierzchni cząstki, ale
również rozprzestrzeniają go w środowisku reakcji. Polimer adsorbuje się
na koloidzie w formie pętli (części rozpościerające się w roztworze)
i w formie łańcuchów (segmentów przyłączonych tylko do powierzchni).
Jeżeli druga cząstka, posiadająca wolne miejsce adsorpcyjne, wejdzie
w kontakt z pętlami i łańcuchami, wówczas następuje jej przymocowanie do
takiej struktury [3]. Ten agregat sprawia, że związek wielkocząsteczkowy
staje się swoistym mostem łączącym poszczególne koloidy (cząsteczka-
polimer-cząsteczka). Przebieg tego mechanizmu pozwala stwierdzić, że
długość polimeru jest najistotniejszym czynnikiem wpływającym na
efektywne mostkowanie. Można również założyć, że liniowy polimer (bez
łańcuchów bocznych), byłby najlepszy do zastosowania. Dłuższe łańcuchy
zwiększałyby szansę interakcji takiego związku z więcej niż jedną
cząsteczką jednocześnie, co zaburzyłoby cały proces [4].
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
55
Rys. 1. Mechanizm mostkowania: a) adsorpcja polimeru i formowanie pętli zdolnych do
tworzenia wiązań b) wytworzenie mostka pomiędzy polimerem a cząsteczkami (agregacja) c)
restabilizacja cząsteczek koloidów (rozpad flokuł) [3]
2.2. Łatkowanie
Łatkowanie (ang. patching) - mechanizm ten często określany jest jako
elektrostatyczny, gdyż obejmuje nierównomierną dystrybucję ładunków,
wynikającą z adsorpcji niewielkich łatek polimeru na powierzchni cząstek.
Związek wielkocząsteczkowy o ładunku silnie dodatnim jest przyłączany
do negatywnie naładowanych koloidów w postaci płaskich konformacji.
Większość naładowanych grup znajduje się blisko powierzchni cząstki, co
inicjuje flokulację, poprzez uprzednią redukcję całkowitego ujemnego
ładunku. W ten sposób obniżana jest awersja cząsteczek względem
polimeru i zjawisko to określane jest jako neutralizacja ładunków [3].
Dodatkowo obszary adsorpcji polimeru mogą posiadać ładunek dodatni ze
względu na wysoką gęstość ładunku związku wielkocząsteczkowego.
Dodatnie energetycznie regiony są również przyciągane do negatywnych
regionów innych cząsteczek, co określane jest terminem heterokoagulacji.
W wyniku tego zjawiska powstają spoiste flokuły, bardzo odporne na siły
redyspersji. Należy podkreślić, że mechanizm łatkowania zachodzi
w przypadku zastosowania polimerów o niskiej masie cząsteczkowej
z wysoką gęstością ładunku. Tak, więc jeżeli polimer jest za krótki by
wiązać wiele komórek jednocześnie, wówczas adsorbuje się na
powierzchni koloidu w formie łatki, tworząc lokalnie dodatni ładunek [4].
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
56
Rys. 2. Mechanizm łatkowania: a) ujemnie naładowane cząsteczki b) flokulant o ładunku
dodatnim c) neutralizacja ładunków łączących się cząsteczek i łatkowanie, strzałki pokazują
przyciąganie przeciwnych jonów [3]
2.3. Dwuwarstwowe sprzężenie/ flokulacja wymiatająca
Oprócz mostkowania i łatkowania, znane są jeszcze dwa mechanizmy
opisujące powstawanie flokuł a mianowicie dwuwarstwowa kompresja
(znana również jako sprzężenie) oraz tzw. flokulacja wymiatająca [5].
Flokulacja wymiatająca jest połączeniem destabilizacji oraz transportu
i znajduje zastosowanie w oczyszczaniu zmętnienia wody, w rozpuszczaniu
organicznego węgla w połączeniu z szybkim mieszaniem oraz w procesie
ulepszania filtracji. Mechanizm ten stosowany jest w przypadku cząstek,
które nie mają zdolności bezpośredniego łączenia się z polimerem.
Ostrożne dodanie materiału stałego (np. glina, nieorganiczne sole) do
koloidu, powoduje jego większe powinowactwo do polimeru a pierwotne
cząstki zawieszone w roztworze zostają uwięzione pomiędzy materiałem
stałym tworzącym flokuły przez zwykły mechanizm mostkowania.
Flokulacja wymiatająca jest więc modyfikacją podstawowego procesu
mostkowania, w którym stosuje się dodatkowe ,,aktywatory’’ flokulacji [3].
Dwuwarstwowe sprzężenie (tzw. teoria DLVO, skrót pochodzi od
nazwisk jej twórców: Derjaguin, Landau, Verwey i Overbeek) jest zwykle
związane z akumulacją flokulantów nieorganicznych takich jak sole żelaza
i ałunu. Proces ten występuje np. w przypadku cząstek o niskiej sile
jonowej, zawieszonych w wodach słodkich, które mieszają się
z wysokozjonizowanymi cząsteczkami wody morskiej [3]. Powierzchnia
bakteryjnych komórek otoczonych polimerem zewnątrzkomórkowym jest
naładowana ujemnie, co pozwala wyznaczyć potencjał elektrokinetyczny
dzeta (δ), który jest napięciem elektrycznym wywołanym przez akumulację
jonów na powierzchni bakterii [6]. Warstwa jonów o przeciwstawnych
ładunkach, dość mocno przylegająca do powierzchni, nazywana jest
powłoką surową (Rys. 3). Na zewnątrz tej warstwy leży kolejna warstwa
(powłoka rozproszona), na którą składają się jony tworzące
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
57
chmuropodobną strukturę o ładunku neutralnym [7]. Począwszy od
warstwy surowej aż do dyfuzyjnej, potencjał dzeta stopniowo spada, aż
osiągnie wartość otoczenia zbliżoną do zera. Gdy taka cząsteczka
flokulantu porusza się, wówczas niektóre ładunki powłoki dyfuzyjnej są
gubione, powodując powstanie nowej warstwy o mniejszej liczbie
ładunków, determinującej potencjał dzeta. Dzięki równomiernemu
rozłożeniu ładunków, cząsteczki są utrzymywane w rozproszeniu,
kontrolowanym przez siły van der Waalsa. Wiązania te wywołane
polaryzacją cząsteczek w dipole i pobudzające siły przyciągania, powodują
agregację flokuł. Tak więc trwałość powstałych komponentów zależy
przede wszystkim od potencjału dzeta i sił van der Waalsa [6]. Jeżeli
potencjał dzeta jest wysoki a siły odpychające cząsteczki są mocniejsze niż
siły van der Waalsa, wówczas cząstki nie będą tworzyły agregatów,
pozostając w dyspersji. W sytuacji odwrotnej, przy niskim potencjale dzeta
i słabych oddziaływaniach ładunku cząsteczek, agregaty są otrzymywane [7].
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
58
Rys. 3. Schematyczny obraz naładowanych cząsteczek w dwuwarstwowym sprzężeniu,
zaznaczono ładunek i potencjał dzeta w poszczególnych [8]
3. Flokulacja a koagulacja
Omawiając mechanizmy tworzenia agregatów przez bakterie, nie
sposób pominąć zjawiska koagulacji – procesu bardzo zbliżonego do
flokulacji. Koagulacja jest procesem, w którym cząsteczki koloidalne oraz
ciała stałe zawieszone w roztworze, są destabilizowane, co sprzyja ich
aglomeracji. Koloidy obecne w ściekach cechują się dużą stabilnością
z powodu ładunku elektrycznego, który posiadają. Ładunek ten może być
dodatni lub ujemny, jednakże cząstki występujące powszechnie
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
59
w roztworach mają ujemny ładunek [9]. Dodatkowo koagulacja może
powodować usunięcie cząsteczek większych niż koloidy poprzez
uwięzienie takich cząstek we flokułach tworzonych podczas procesu [10].
Tak więc koagulacja polega na łączeniu nierozpuszczalnej materii
organicznej, zawieszonej w roztworze, w większe agregaty, co skutkuje
późniejszą ich sedymentacją, flotacją i w konsekwencji filtracją. Proces ten
angażuje zwykle rozproszenie kilku chemicznych reagentów
(koagulantów), które destabilizują cząstki koloidalne, prowadząc do
utworzenia mikroflokuł. Takimi koagulantami są nieorganiczne sole metali
np. siarczany oraz chlorki żelaza i glinu. Dodanie tych kationów
zapoczątkowuje neutralizację negatywnego ładunku koloidów [11].
Rys. 4. Schematyczne porównanie procesów koagulacji i flokulacji u bakterii [12]
Przykładowo wprowadzenie jonów Fe3+ do środowiska reakcji
spowoduje ich gwałtowną hydrolizę, a powstałe w ten sposób hydrolizaty
pełnią podstawową rolę w destabilizacji cząstek koloidalnych. Obecnie
stosowane koagulanty (pre-hydrolizowane formy glinu i żelaza jak
np. siarczan poli-żelaza) są wydajniejsze ze względu na to, że ich hydroliza
przebiega w ściśle określonych warunkach przed dodaniem do środowiska
reakcji. Umożliwia to lepszą kontrolę nad całą procedurą [11]. Koagulacja
znalazła zastosowanie w oczyszczaniu ścieków, przede wszystkim
z barwników przemysłowych, a wybór odpowiedniego koagulantu
i zmniejszenie kosztów są obecnie głównymi parametrami analizowanymi
w badaniach nad czystością wody. Analizowane są możliwości połączenia
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
60
działania większej liczby koagulantów, tak aby zwiększyć wydajność
procesu koagulacji.
Warto podkreślić, że koagulacja stanowi zwykle pierwszy etap
przemian, po którym zachodzą procesy związane z flokulacją. Powstałe
podczas koagulacji mikroflokuły, dzięki polimerom zewnątrzkomórkowym
adsorbowanym na powierzchni bakterii, mogą łączyć się w większe
aglomeracje, tworząc makroflokuły.
Rys. 5. Model flokulacji dla biologicznie modyfikowanego kwarcu obrazujący
oddziaływania pomiędzy cząsteczkami; IEP – punkt izoelektryczny [13]
Hirajima i wsp. [13] przeprowadzili badania nad wpływem wartości pH
na flokulację, stosując jako podłoże modyfikowany biologicznie kwarc
(Rys. 5). Okazało się, że jeżeli wartość pH reakcji jest zbliżona do wartości
punktu izoelektrycznego bakterii, wówczas elektrostatyczne odpychanie
zanika, siły van der Waalsa przeważają i flokulacja jest możliwa.
W przypadku gdy wartości pH są dalekie od punktu izoelektrycznego
bakterii to oddziaływania van der Waalsa są zbyt niskie i preferowanym
procesem jest dyspersja. Wynika z tego, że aby proces flokulacji zachodził
we właściwy sposób, należy zwrócić uwagę na wiele czynników
oddziaływujących na przebieg tego mechanizmu.
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
61
4. Czynniki wpływające na aktywność flokulacyjną hodowli
mikroorganizmów
Flokulacja, jak każdy proces biochemiczny, przebiega w określonych
warunkach i nawet niewielka anomalia powoduje mniejszą jej wydajność.
Ponadto wykorzystanie tego mechanizmu w nowoczesnych technologiach
wymaga zwrócenia uwagi na aspekty środowiskowe, fizjologiczne
i genetyczne [5]. Dlatego też wyodrębniono główne czynniki mające znaczący
wpływ na regulację wzrostu i aktywności hodowli, a tym samym na proces
bioflokulacji.
4.1. Rodzaj mikroorganizmu i faza wzrostu
Flokulacja jest procesem wymagającym nakładu energii, dlatego też nie
wszystkie mikroorganizmy są zdolne do jej inicjowania. Obecnie znanych jest
wiele gatunków wytwarzających flokuły i na podstawie badań tych
mikroorganizmów można stwierdzić, że intensywność flokulacji jest różna
w zależności od rodzaju organizmu. Dzieje się tak, ponieważ występują
różnice w składach chemicznych poszczególnych związków wielko-
cząsteczkowych, a nawet niewielka zmiana proporcji poszczególnych
składników może wpływać na otrzymanie wysokoaktywnego polimeru.
Badania przeprowadzone na bioflokulantach różnych organizmów
wykazały ponadto zależność aktywności procesu flokulacji od fazy wzrostu
danej hodowli. Jia i wsp. badali działanie czasu hodowli na wytwarzanie
egzopolisacharydów w osadzie czynnym i stwierdzili, że podczas
wykładniczej fazy wzrostu, zawartość polisacharydów zewnątrz-
komórkowych zwiększała się w miarę upływu czasu, natomiast w fazie
stacjonarnej ilość wytwarzanego polimeru malała [14]. Z kolei
w przypadku bakterii fotosyntetycznych sytuacja przedstawiała się skrajnie
odwrotnie. Podczas fazy wykładniczej zawartość egzopolisacharydów
spadała w czasie, a w fazie stacjonarnej ich ilość pozostała prawie
niezmieniona [15]. Obecnie przyjmuje się, że najwyższa aktywność
flokulacyjna występuje w fazie stacjonarnej, ale u wielu organizmów
pojawia się już pod koniec fazy wykładniczej i trwa aż do stacjonarnej.
4.2. Źródło węgla i azotu
Substancje odżywcze użyte jako substrat w metabolizmie komórkowym
mają ogromny wpływ na funkcjonowanie organizmu. Szczególnie ważne
jest zastosowane źródło węgla i azotu, gdyż to te składniki odpowiadają za
cykl komórkowy. Stwierdzono, że zawartość źródeł azotu i węgla
w znaczący sposób wpływa na wytwarzanie i aktywność bioflokulantów
[16]. Przykładowo wytwarzaniu polimerów zewnątrzkomórkowych przez
Rhodococcus erythropolis sprzyjał dodatek sorbitolu, mannitolu i etanolu,
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
62
natomiast w przypadku Alcaligenes cupidus był to dodatek glukozy,
galaktozy i fruktozy [17]. Organicznym źródłem azotu najlepiej
oddziałującym na otrzymywanie flokulantów okazały się ekstrakt
drożdżowy i kazeina, z kolei najbardziej wydajnymi nieorganicznymi
formami azotu był siarczan amonowy i mocznik [18]. Użycie chlorku
amonu i azotanu amonu obniża aktywność flokulacji o 30-40%,
w porównaniu z zastosowaniem ekstraktu drożdżowego. Oprócz rodzaju
źródła azotu i węgla, istotny jest także stosunek węgla do azotu (C/N),
gdyż bezpośrednio wpływa na wytwarzanie egzopolisacharydów.
Yoshitaka i Aida stwierdzili, że jeżeli proporcja C/N wynosi od 60 do 114,
wówczas aktywność flokulacyjna jest wyższa, wartości poza granicą
powodują gwałtowny jej spadek [19]. Durmaz i Sanin zaobserwowali, że
w przypadku osadu czynnego bogatego w białka i o niższej zawartości
węglowodanów- stosunek C/N wynosił 5 [20]. Jeżeli wartość wzrosła do
40, wtedy ilość białek spadała, podczas gdy ilość węglowodanów rosła.
4.3. Temperatura i wartość pH hodowli
Temperatura to jeden z parametrów regulujących wytwarzanie
flokulantów przez mikroorganizmy. Przyjęto, że optimum temperaturowe
dla hodowli bakterii zawiera się w granicach 25-35°C [8]. Badania
pokazały, iż wyższe wartości (>35°C) mogą obniżać powstawanie
polimerów zewnątrzkomórkowych o 75% w porównaniu z niższymi
temperaturami. Wpływ temperatury na aktywność bioflokulacyjną jest
złożony, gdyż z jednej strony może powodować zmiany w strukturze
substancji wielkocząsteczkowych, prowadzące do degradacji, z drugiej zaś
dodatnio oddziaływać na wytwarzanie flokuł [18]. W 2000 roku
przeprowadzono serię doświadczeń w celu znalezienia związku pomiędzy
temperaturą a wielkością i strukturą morfologiczną cząstek osadu
czynnego. Willen i wsp. stwierdzili, że deflokulacja cząstek zachodzi
znacznie częściej w niższych temperaturach niż wyższych,
prawdopodobnie w wyniku obniżenia aktywności metabolicznej mikro-
organizmów [21]. Z kolei Krishna i Loosdrecht wykazali, że przy
30-35°C następuje zwiększenie masy cząsteczek osadu czynnego
z jednoczesnym nadmiernym wytwarzaniem polimerów zewnątrz-
komórkowych [22]. Tak, więc optymalne temperatury 20-25°C wydają się
najlepszymi wartościami parametru, w celu uzyskania stabilnych flokuł
o średnich objętościach wynoszących około 200 ml [8].
Wykazano, że aktywność flokulacyjna w znacznym stopniu zależy
od wartości pH hodowli, którego wartości są bardzo różnorodne
w zależności od gatunku organizmu wytwarzającego flokuły. Zakres
wartości pH, w którym bakteria jest zdolna do wytwarzania bioflokulantów
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
63
nieznacznie różni się od wartości optymalnej dla wzrostu hodowli. Badania
Endo i wsp. pokazały, że jeżeli wartość pH zostanie utrzymana na
optymalnym poziomie (pH 6,0) - wzrost Aspergillus sojae będzie
intensywny, ale nie zaobserwujemy aktywności bioflokulacyjnej [23].
Dopiero w środowisku neutralnym następuje uruchomienie procesów
powodujących powstawanie makrocząstek. Natomiast Kurane i wsp. [17]
wykazali efektywniejsze wytwarzanie flokuł przez Rhodococcus
erythropolis w środowisku alkalicznym, gdy wartości optymalne pH
wynosiły 8-9,5. Flokulacja Streptomyces griseus zachodzi w środowisku
kwaśnym (pH 2-6), a maksymalna wydajność tego mechanizmu występuje
przy wartości pH 4 [24]. Pomimo tego, że wartość pH nie jest wartością
łatwą do regulowania, jej zmiany są ograniczone przez optymalny zakres,
w jakim organizm może przeżyć, nie narażając się na poważniejsze
uszkodzenia [8].
4.4. Obecność jonów metali
Jony metali jako kofaktory wielu reakcji chemicznych stanowią czynnik
odpowiedzialny za zmiany aktywności cząsteczek flokulujących. Kationy
stymulują flokulację przez neutralizację i stabilizację ujemnych ładunków
grup funkcyjnych oraz formowanie mostków (swoistych połączeń) między
cząsteczkami. Podstawową rolą dwu- i trójwartościowych jonów jest
zwiększenie początkowej adsorpcji polimerów zewnątrzkomórkowych
na zawieszonych cząstkach, poprzez obniżenie negatywnego ładunku
łańcuchów bocznych zarówno biopolimeru jak i substancji z nim
połączonych [25]. Wpływ obecności jonu na proces flokulacji zależy od
stężenia tego jonu. Dlatego też po osiągnięciu pewnej krytycznej wartości,
oddziaływanie danego kationu na polimer jest znikome. Yin i wsp. badając
zależność aktywności flokulantu GS7 od obecności jonów metali, zauważyli,
że pewne stężenia naładowanych dodatnio jonów (Ca2+
, Mg2+
, Fe3+
, A13+
)
pełnią katalityczną rolę w procesie flokulacji i im większa gęstość ładunku
kationu tym proces jest bardziej wydajny [26]. Z kolei badania Kurane i wsp.
[17] wykazały, że wytwarzanie flokulantu przez Rhodococcus erythropolis
i Alcaligenes cupidus jest intensywniejsze w obecności jonów Ca2+
i Al3+
.
W przypadku Nocardia amarae aktywność flokulacji została zwiększona
przez kationy Na+, Ca
2+, Al
3+, Fe
3+, jednakże nadmierne stężenia jonów Fe
3+
powodowały inhibicję tego procesu.
Opisane czynniki w istotny sposób wpływają na aktywność flokulacyjną
i powinny być brane pod uwagę przy zastosowaniu tego procesu
w przemyśle technologicznym. Najbardziej znanym przykładem
wykorzystania flokulacji jest oczyszczanie wody z barwników, metali,
odpadów chemicznych, gdzie wydajność procesu zależy przede wszystkim
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
64
od właściwości biopolimeru takich jak: masa cząsteczkowa, stężenie
i ładunek danego związku [27]. Ponadto niezwykle istotne są fizyczne
parametry procesu (dawkowanie, intensywność mieszania, czas trwania)
i cechy oczyszczanych ścieków (wielkość i stężenie cząsteczek,
temperatura i wartość pH wody zanieczyszczonej). Dlatego też wybór
właściwej metody oczyszczania musi być poparty licznymi testami,
dopasowującymi technikę do konkretnego zanieczyszczenia ścieku.
Wyzwaniem staje się poszukiwanie polimeru spełniającego wymagane
parametry [27].
5. Podsumowanie
Flokulacja stanowi ważny aspekt procesów zachodzących w układach fizyko-chemicznych. Pomimo tego że jest zjawiskiem dosyć dobrze poznanym, nadal cieszy się zainteresowaniem licznej grupy naukowców, poszukujących dalszych jej zastosowań. Obecnie prowadzone badania w tej dziedzinie mają na celu znalezienie nowych organizmów zdolnych do wytwarzania bioflokulantów o wysokiej aktywności flokulacyjnej, a przy tym niskich kosztach ich produkcji. Naukowcy dążą do uzyskania preparatów, których otrzymywanie na szeroką skalę będzie opłacalne. Niezwykle istotne jest to, że pomimo szeregu dostępnych na rynku syntetycznych flokulantów, działania nauki zwróciły się w stronę rozwiązań bardziej przyjaznych dla środowiska naturalnego, mających na celu ochronę otaczającego świata i jednocześnie nas samych.
Podziękowania
Praca współfinansowana ze środków Narodowego Centrum Nauki w ramach grantu badawczego (2012/07/B/ST5/01799).
Literatura
1. Wang S.G., Gong W.X., Liu X.W., Tian L., Yue Q.Y., Gao B.Y. Production of a novel bioflocculant by culture of Klebsiella mobilis using dairy wastewater, Biochemical Engineering Journal, 2007 vol. 36, s. 81-86
2. Yu G.H., He P.J., Shao L.M. Characteristics of extracellular polymeric substances (EPS) fractions from excess sludges and their effects on bioflocculability, Bioresource Technology, 2009 vol. 100, s. 3193-3198
3. Shrama B. R., Dhuldhoya N. C., Merchant U. C. Flocculants—an ecofriendly approach, Journal of Polymers and Environment, 2006 vol. 14, s. 195-202
4. Salim S., Bosma R., Vermuë M. H., Wijffels R. H. Harvesting of microalgae by bio-flocculation, Journal of Applied Phycology, 2011 vol. 23, s. 849-855
5. Salehizadeh H., Shojaosadati S. A. Extracellular biopolymeric flocculants: recent trends and biotechnological importance, Biotechnology advances, 2001 vol. 19, s. 371-385
6. Sobeck D. C., Higgins M. J. Examination of three theories for mechanisms of cation- induced bioflocculation, Water Research 2002 vol. 36, s. 527-538
,
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
65
7. Hermansson M. The DLVO theory in microbial adhesion, Colloids and Surfacies B: Biointerfaces, 1999 vol. 14 (1–4), s. 105-119
8. Schryver P. D., Crab R., Defoirdt T., Boon N., Verstraete W. The basics of bio-flocs technology: The added value for aquaculture, Aquaculture, 2008 vol. 277, s. 125-137
9. Koohestanian A., Hosseini M., Abbasian Z. The separation method for removing of colloidal particles from raw water, American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Sciences, 2008 vol. 4, s. 266-273
10. Farajnezhad H., Gharbani P. Coagulation treatment of wastewater in petroleum industry using polyaluminum chloride and ferric chloride, International Journal of Research and Reviews in Applied Sciences, 2012 vol. 13, s. 306-310
11. Renault F., Sancey B., Badot P. M., Crini G. Chitosan for coagulation/flocculation processes–An eco-friendly approach, European Polymer Journal, 2009 vol. 45, s. 1337-1348
12. http://www.aquasure.fr/spip.php?article74 (11.02.2014 r.) 13. Hirajima T., Aiba Y., Farahat M., Okibe N., Sasaki K., Tsuruta T., Doi K.
Effect of microorganisms on flocculation of quartz, International Journal of Mineral Processing, 2012 vol. 102–103, s. 107-111
14. Jia X. S., Furumai H., Fang H. H. P. Extracellular polymers of hydrogen-utilizing methanogenic and sulfate-reducing sludges, Water Research, 1996 vol. 30, s. 1439-1444
15. Sheng G.-P., Yu H.-Q., Li X.-Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial aggregates in biological wastewater treatment systems: a review, Biotechnology Advances, 2006 vol. 28, s. 882-894
16. Bura R., Cheung M., Liao B., Finlayson J., Lee B. C., Droppo I. G. Composition of extracellular polymeric substances in the activated sludge floc matrix, Water Science and Technology, 1998 vol. 37 (4–5), s. 325-333
17. Kurane R., Hatamochi K., Kakuno T., Kiyohara M., Hirano M., Taniguchi Y. Production of a bioflocculant by Rhodococcus erythropolis S-1 grown on alcohols, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1994 vol. 58, s. 428-429
18. Bao-jun J. I. A., Jiang-mei Y. U. The research status and development trend of microbial flocculant, Physics Procedia, 2012 vol. 24, s. 425-428
19. Yoshitaka T., Aida K. Exocellular mucopolysaccharide closely related to bacterial floc formation, Applied and Environmental Microbiology, 1977 vol. 34 (3), s. 308-314
20. Durmaz B., Sanin F. D. Effect of carbon to nitrogen ratio on the composition of microbial extracellular polymers in activated sludge, Water Science and Technology, 2001 vol. 44 (10), s. 221-229
21. Willen B. M., Keiding K., Nielsen P. H. Anaerobic deflocculation and aerobic reflocculation of activated sludge, Water Research, 2000 vol. 34, s. 3933-3942
22. Krishna C., van Loosdrecht M. C. M. Effect of temperature on storage polymers and settleability of activated sludge, Water Research, 1999 vol. 33, s. 2374-2382
23. Endo T., Nakamura K., Takahashi H. Pronase susceptible floc forming bacteria: relationship between flocculation and calcium ion, Agricultural and Biological Chemistry, 1976 vol. 40, s. 2289-2295
Magdalena Czemierska, Aleksandra Szcześ, Anna Jarosz-Wilkołazka
66
24. Shimofuruya H., Koide A., Shirota K., Tsuji T., Nakamura M., Suzuki J. The production of flocculating substance(s) by Streptomyces griseus, Bioscience, Biotechnology and Biochememistry, 1996 vol. 60, s. 498-500
25. Levy N., Magdasi S., Bar-Or Y. Physico-chemical aspects in flocculation of bentonite suspensions by a cyanobacterial, Water Research, 1992 vol. 26, s. 249-254
26. Jin B., Wilén B. M., Lant P. A comprehensive insight into floc characteristics and their impact on compressibility and settleability of activated sludge, Chemical Engineering Journal, 2003 vol. 95, s. 221-234
27. Ebeling J. M., Rishel K. L., Sibrell P. L. Screening and evaluation of polymers as flocculation aids for the treatment of aquacultural effluents, Aquaculture Engineering, 2005 vol. 33, s. 235-249
Oczyszczanie roztworów wodnych w procesie flokulacji
Streszczenie Flokulacja jest procesem fizyko-chemicznym zachodzącym w roztworach wodnych na granicy fazy stałej i ciekłej. Zjawisko to występuje przy udziale związków zdolnych do agregacji cząstek fazy stałej, w wyniku czego możliwa jest ich sedymentacja, a w konsekwencji usunięcie z roztworu. Substancje przeprowadzające proces flokulacji nazywane są flokulantami i ze względu na źródło pochodzenia dzielimy je na trzy grupy: flokulanty nieorganiczne (siarczan glinu, chlorek żelaza), syntetyczne flokulanty organiczne (pochodne poliakrylamidu) i flokulanty naturalne zwane bioflokulantami. Bioflokulanty powstające jako produkty metabolizmu mikroorganizmów są nietoksyczne i biodegradowalne i mogą być stosowane bez szkody dla środowiska naturalnego. Proces flokulacji może zachodzić według dwóch podstawowych mechanizmów - mostkowania i łatkowania, przy czym znane są jeszcze inne procedury tłumaczące to złożone zjawisko jak dwuwarstwowe sprzężenie i flokulacja wymiatająca. Flokulacja, jako proces przebiegający w środowisku naturalnym, jest zależna od wielu czynników, które w mniejszym lub większym stopniu wpływają na jej wydajność. Umiejętne dostosowanie tych czynników w warunkach laboratoryjnych pozwala na efektywniejszy przebieg flokulacji na skalę przemysłową. Słowa kluczowe: flokulacja, bioflokulanty, oczyszczanie
Wastewater treatment using flocculation process
Abstract Flocculation is a physicochemical process taking place in water solutions on solid and liquid phase border. This phenomenon occurring with the participation of molecules, that are able to aggregate solid particles, which causes sedimentation and in the end - their removal from the solution. Substances carrying out the flocculation process are known as flocculants and can be classified in three groups: inorganic flocculants (polyaluminium sulphate, ferric chloride), synthetic organic flocculants (polyacrylamide derivatives) and natural flocculants called bioflocculants. Bioflocculants synthesized by microbial cultures are non-toxic and biodegradable and can be applied without damage for natural environment. Flocculation can occur according to two basic mechanisms - bridging and patching, beyond we know two more motion which can explain that phenomenon like double layer compression and sweep flocculation. Flocculation as natural running process is dependent on many factors, which can influence on its efficiency in different ways. Appropriate correlation between these factors during laboratory scale results in more effective working on industrial scale. Keywords: flocculation, bioflocculants, wastewater treatment
67
Joanna Lach1
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego
w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
1. Wstęp
To nie przypadek, że coraz więcej osób zaczyna się interesować
problemem zatopionych w Morzu Bałtyckim bojowych środków
chemicznych (BSCh). Według oficjalnych danych w czasie II wojny
światowej oraz tuż po zakończeniu w Bałtyku zostało zatopionych
w przybliżeniu 50 tysięcy ton amunicji zawierającej co najmniej 15 tysięcy
ton bojowych środków trujących [1]. W miarę wzrostu wartości
ekonomicznej Morza Bałtyckiego, problemy związane z tysiącami ton
pocisków oraz bomb zawierających bojowe środki chemiczne (głównie
gazy bojowe) zaczynają nabierać globalnego znaczenia.
To skłania do zastanowienia się, co zrobić, aby zminimalizować
zagrożenie związane z BSCh – lepiej zapobiegać niż leczyć. Do dziś, nie
znaleziono efektywnego sposobu, by zniszczyć lub zneutralizować środki
chemiczne wyprodukowane na potrzebny II wojny światowej, które do dziś
stanowią realne zagrożenie nie tylko dla państw nadbałtyckich, lecz
również tych położonych w bardziej w głąb lądu. Rozwiązanie problemu
neutralizacji gazów bojowych należy rozpocząć od zbadania, w jakich
formach związki te występują w roztworze wodnym, w warunkach
panujących na dnie Morza Bałtyckiego. Dopiero wtedy możemy zacząć
szukać rozwiązania problemu neutralizacji BSCh.
2. Od zatrutych strzał do II wojny światowej
Pierwsze doniesienia dotyczące użycia trucizn – szkodliwych substancji
chemicznych, sięgają epoki kamienia (10000 p.n.e.). Mieszkający w Afryce
łowcy, zwani Sanu, używali strzał namaczanych w jadach węży,
skorupiaków oraz w ekstraktach z trujących roślin. W Indiach, na polu
bitwy, stosowano toksyczne opary już około 2000 roku p.n.e. Znaleziono
setki chińskich receptur produkcji trujących i drażniących dymów
pochodzących z VII wieku p.n.e. Asyryjczycy około roku 600 p.n.e. zatruli
ziarnami sporyszu dopływ wody. W czasie oblężenia Cirrha w roku 590
zostały użyte korzenie ciemiernika, będące silnym środkiem przeczysz-
czającym. Za czasów naszej ery jednym z pierwszych przypadków
stosowania trucizn na polu walki było użycie przez Nerona kwasu
cyjanowodorowego. Lista przykładów stosowania substancji dziś
Joanna Lach
68
nazywanych gazami bojowymi, czy bojowymi środkami trującymi, jest
bardzo długa [2]. Mimo szybkiego rozwoju cywilizacyjnego, ludzie wciąż
używają przeciwko swoim wrogom szkodliwych substancji chemicznych.
Ze względu na wprowadzenie nowoczesnych, jak na tamte czasy, metod
użycia broni chemicznych, I wojna światowa nazwana została „wojną
chemików”. Większość użytych bojowych środków trujących została
odkryta w XVIII i XIX wieku, należą do nich między innymi: chlor,
fosgen, gaz musztardowy oraz chloropikryna [3]. Użycie broni chemicznej
na masową skalę w czasie I wojny światowej spowodowało wprowadzenie
Protokołu Genewskiego (1929). Mimo że produkcja i używanie bojowych
środków chemicznych zostały zabronione, na potrzeby II wojny światowej
zostały wyprodukowano tysiące ton amunicji. Na terenie Niemiec po
wojnie do 1948 roku znaleziono 296 103 ton chemicznej amunicji, głównie
bomby lotnicze i pociski artyleryjskie zawierające BSCh, w tym 40% to
gaz musztardowy [1, 4].
3. Powojenny sposób “neutralizacji”
Przywódcy koalicji antyhitlerowskiej w 1945 roku podpisali
Porozumienie Poczdamskie regulujące zasady neutralizacji bojowych
środków chemicznych pozostałych po II wojnie światowej. Wybrano
metodę zatapiania w morzu lub oceanie amunicji chemicznej, kierując się
niskimi kosztami oraz możliwością szybkiego pozbycia się arsenału broni
chemicznej. Trzecim powodem, o którym już tak głośno się nie wspomina,
był brak pomysłu, jak skutecznie i bezpiecznie zniszczyć tak duże ilości
trujących chemikaliów. Nie jest to zaskakujące, gdyż nawet w obecnych
czasach neutralizacja BSCh jest procesem skomplikowanym oraz bardzo
kosztownym [5, 6].
3.1. Drogi transportu oraz rejony zatapiania BSCh
Zatapianie amunicji polegało na wyrzucaniu za burtę amunicji
w drewnianych kratownicach, które często, przez długi czas unosiły się na
powierzchni wody. Na dnie Morza Bałtyckiego, zostały również znalezione
wraki okrętów z ładunkami BSCh. Systemy nawigacyjne na statkach
transportowych nie były tak dokładne jak dziś (np. GPS), co często
uniemożliwia podanie dokładnej lokalizacji zatopionych pocisków i bomb.
Oficjalne rejony zatapiania BSCh:
wschodnia część Bornholmu;
południowa część Głębi Gotlandzkiej;
cieśnina Mały Bełt;
Skargerrak.
,
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
69
Oprócz rejonów oficjalnych amunicję chemiczną odnaleziono również
w Głębi Gdańskiej oraz bruździe Słupskiej, czyli bardzo bliskopolskiej linii
brzegowej. Często, już nawet w drodze do rejonów zatapiania amunicja
była wyrzucana za burtę [1, 2].
Rys. 1. Rysunek przedstawia oficjalne oraz nieoficjalne rejony zatapiania (zaznaczone na
ciemny niebieski kolor), oficjalne (zaznaczone kropkami) oraz nieoficjalne (linia ciągła)
drogi transportu bojowych środków chemicznych [2].
W zależności od rejonu zatapiania inny jest rodzaj i ilość zatopionej
amunicji. W Basenie Bornholmskim oraz Głębi Gotlandzkiej znaleziono
głównie bomby lotnicze (K.C. 250) zawierające do 100 kg BSCh, głównie
iperytu siarkowego. W cieśninie Mały Bełt zlokalizowano amunicję
zawierającą w większości przypadków środek paralityczno-drgawkowy,
jakim jest tabun.
4. Przykłady chemicznych środków bojowych oraz zasady
pierwszej pomocy
Tabun
Jeden z najbardziej toksycznych bojowych środków trujących, które
zostały zatopione w Morzy Bałtyckim. Przenika do organizmu poprzez
skórę, oczy oraz drogi oddechowe. Mioza – zwężenie źrenicy oka, jest
jednym z pierwszych objawów działania tabunu. Ogólnie tabun powoduje
osłabienie widzenia, zmianę ostrości widzenia, zmniejszenie zdolności do
akomodacji oczu oraz ból gałek ocznych. Objawy te po kilku dniach
ustępują i nie pozostawiają żadnych trwałych skutków. Dawka śmiertelna
przy działaniu przez skórę wynosi 1 gram na człowieka, podczas działania
na drogi oddechowe z kolei wynosi 400 mg*min*m3 (śmierć następuje po
około 20 minutach). Ochrona przed działaniem tabunu polega na nałożeniu
pogumowanej odzieży ochronnej oraz maski przeciwgazowej.
Joanna Lach
70
W środowisku wodnym łatwo ulega degradacji, rozkładając się do
nietoksycznych związków. Jednym z produktów rozkładu jest kwas
cyjanowodorowy, który również ulega degradacji w tych warunkach.
W wypadku skażenia tabunem należy przemyć oczy dwu procentowym
roztworem kwaśnego węglanu sodu. Skażoną skórę przemyć bieżącą wodą
z mydłem. W razie skażenia wewnętrznego podać do wypicia zawiesinę
węgla aktywnego i wywołać wymioty.
Luizyt
Luizyt łatwo rozpoznać po charakterystycznym zapachu pelargonii.
Przenika do organizmu przez skórę i działa na układ oddechowy
wywołując ogólne zatrucie i nekrozę (martwicę). Podczas kontaktu ze
skórą pojawia się natychmiastowe pieczenie, przy większych dawkach
wiśniowo-czerwone pęcherze, które pękają tworząc trudno gojące się rany.
Porażenie dróg oddechowych wywołuje kaszel, duszności, utratę głosu,
często zapalenie płuc. Ochrona przed działaniem luizytu i pierwsza pomoc
wygląda identycznie jak w przypadku porażenie iperytem siarkowym
(opisane w rozdziale 5).
Chloroacetofenon
Należy do grupy lakrymatorów – łzawiących środków chemicznych.
Działa na błony śluzowe powodując silne łzawienie oczu. Gdy stężenie jest
duże może wywołać podrażnienia skóry twarzy. Objawy ustępują po
opuszczeniu skażonej strefy. Zabezpieczenie przed działaniem
chloroacetofenonu stanowi założenie maski przeciwgazowej. Pierwsza
pomoc polega na przemyciu oczu 2% roztworem kwaśnego węglanu sodu
(soda oczyszczona), przy obfitym łzawieniu z kolei 1% roztworem
Atropiny, przeciwbólowo można zastosować Nowokainę. Skażoną skórę
należy przemyć obficie wodą i acetonem [1,2,4].
Adamsyt
Środek bojowy drażniący błony śluzowe i górne drogi oddechowe.
Wywołuje natychmiastowy silny ślinotok, ból w płucach i trudności
z oddychaniem. Nie wywołuje nieodwracalnych zmian w organizmie – po
opuszczeniu skażonego terenu objawy znikają bez trwałych następstw.
W wypadku skażenia należy przemyć oczy i jamę ustną 2% roztworem
kwaśnego węglanu sodu. Jeśli jest to konieczne należy podać
poszkodowanemu środki przeciwbólowe, uspokajające i hamujące kaszel [2].
Iperyty azotowe
Wykazują właściwości oraz objawy porażenia podobne do iperytu
siarkowego (podane w rozdziale 5). Różnicą między iperytami azotowymi
,
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
71
a iperytem siarkowym jest to, iż okres utajonego działania iperytów
azotowych jest znacznie krótszy i może wynosić nawet kilka minut.
Charakteryzują się kwiatowym zapachem, co ułatwia ich rozpoznanie.
Zachowanie iperytów azotowych w środowisku wodnym do dziś nie jest
dokładnie poznane.
5. Iperyt siarkowy – główny cel badań
Pierwsze użycie iperytu siarkowego odnotowano w 1917 roku w Belgii,
nieopodal miejscowości Ypres we Flandrii. Alianci byli wtedy ostrzeliwani
pociskami artyleryjskimi zawierającymi gaz musztardowy. Początkowo nie
były odczuwalne żadne skutki niepożądanego działania, dopiero po
2 godzinach, gdy stężenie par znacznie wzrosło, zaczęły pojawiać się
charakterystyczne objawy. Gaz musztardowy wykazuje toksyczność
w postaci par, cieczy i roztworów. W czasie I Wojny Światowej, wojskowe
laboratoria starały się prześcignąć w produkcji coraz nowszych gazów
bojowych oraz środków ochrony osobistej. Gaz musztardowy był jednym
z pierwszych bojowych środków chemicznych, który wnikał do organizmu
całą powierzchnią ciała i przez drogi pokarmowe, a nie tylko przez drogi
oddechowe.
Po okresie utajonego działania można zaobserwować następujące
skutki:
pojawienie się pęcherzyków na skórze łączących się później
w duże pęcherze, które po kilku dniach pękają (gojenie się ran trwa
nawet do kilku miesięcy pozostawiając po sobie blizny i brązowe
plamy);
bolesny, suchy kaszel, zanik głosu, zapalenie płuc;
uszkodzenie spojówek i rogówki oczu, trwałe uszkodzenia w zarodku;
trwałe osłabienie (cherlactwo poiperytowe);
działanie teratogenne;
działanie kancerogenne [1, 2].
Zabezpieczenie przed działaniem iperytu siarkowego jest dość trudne,
gdyż należy osłonić całą powierzchnię ciała poprzez nałożenie
pogumowanej odzieży ochronnej oraz maski.
Leczenie w każdym wypadku wymaga opieki medycznej. W wypadku
skażenie powierzchni ciała należy usunąć pozostałości iperytu
z powierzchni skóry przy pomocy gazy (tamponu) oraz 5-10% roztworu
węglanu sodu, wody amoniakalnej czy 1-2% roztworu nadmanganianu
potasu. Usunięcie iperytu siarkowego z układu pokarmowego polega na
wywołaniu wymiotów lub zastosowaniu płukania żołądka. Powierzchnię
śluzówek i ran należy przemyć 5% roztworem węglanu sodu, oczy
0,2% roztworem węglanu sodu.
Joanna Lach
72
5.1. Budowa i właściwości
Rys. 2. Struktura iperytu siarkowego w fazie gazowej. Oznaczenie atomów: węgiel – kolor
niebieski, wodór – kolor biały, siarka – kolor żółty, chlor – kolor zielony
[Opracowanie własne]
Iperyt siarkowy należy do tioeterów (sulfidów) organicznych związków
chemicznych. Zbudowany jest z siarki będącej centralnym heteroatomem
z przyłączonymi do niego dwoma grupami 2-chloroetylowymi.
Jest oleistą cieczą, jego temperatura topnienia wynosi 13-14°C,
temperatura wrzenia zaś 215-217°C. Masa cząsteczkowa gazu musztar-
dowego wynosi 159,08 u. Produkt techniczny ma barwę żółtobrunatną
i charakterystyczny zapach czosnku, po oczyszczeniu jest bezbarwny oraz
bezwonny [3, 4].
Niektóre źródła podają, że iperyt siarkowy w środowisku wodnym ulega
hydrolizie, w wyniku której powstają nieszkodliwe produkty [6].
Zakładając samoistną hydrolizę iperytu w wodzie należałoby uznać, że
problem zatopionych BSCh zostanie sam rozwiązany. Zawarte w beczkach
BSCh ulegną degradacji i zagrożenie zniknie po kilku latach. Okazuje się,
że tak nie jest. Badania podwodne nie wskazują na ubytek masy BSCh na
dnie Bałtyku.
Wyrzucane na brzeg morza grudy iperytu pokazują, że może on
przetrwać w formie niezhydrolizowanej przez wiele lat. W wodzie morskiej
iperyt siarkowy, być może ze względu na stosowane w amunicji
wypełniacze, nie hydrolizuje (lub dzieje się to bardzo wolno). Przyjmuje on
stabilną formę o konsystencji gliny, którą trudno rozdrobnić [2, 7].
6. Metoda badawcza
W celu zbadania rzeczywistego zachowania się iperytu siarkowego
w wodzie morskiej należy zachować wszystkie warunki środowiska,
w jakim się on znajduje. Wyciągnięcie próbek iperytu na powierzchnię
i kontakt z powietrzem powodują zachodzenie reakcji uniemożliwiających
,
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
73
analizę procesów chemicznych w głębi morza. Zebranie próbek, które
znajdowały się na powierzchni w stanie takim, jak na dnie morza jest
bardzo trudne, a czasami wręcz niemożliwe do zrealizowania. Podwodne
laboratoria, no cóż, nie istnieją.
Teoretyczne modelowanie molekularne oparte na metodach chemii
kwantowej otwiera wiele możliwości. Jest to metoda znacznie
bezpieczniejsza, bo nieinwazyjna oraz pozwala na dokładne określenie
przebiegu procesu chemicznego. Modelowanie molekularne pozwala na
opis reakcji solwatacji iperytu siarkowego na poziomie molekularnym.
Obliczenia kwantowo-mechaniczne dla cząsteczki iperytu siarkowego
oraz cząsteczki wody zostały przeprowadzone przy pomocy pakietu
GAUSSIAN. Wykorzystana została teoria funkcjonałów gęstości DFT
(ang. Density Functional Theory), przy użyciu funkcjonału PBE oraz bazy
funkcyjnej cc-pVDZ. Obliczenie energii izolowanych cząsteczek iperytu
siarkowego, wody oraz układów złożonych z obu cząsteczek pozwoliło na
wyznaczenie energii odziaływań międzycząsteczkowych. Jako struktury
początkowe dla kompleksów iperyt siarkowy – woda wzięto różne
konfiguracje różniące się rodzajem oraz ilością wiązań wodorowych.
Wykonano optymalizację geometrii dla struktur początkowych. Wybrano
najbardziej stabilne minima lokalne, dla których przeprowadzono później
dokładną analizę parametrów strukturalnych.
Joanna Lach
74
7. Wyniki
A B
C
D
Rys. 3. Zoptymalizowane struktury kompleksu iperyt siarkowy – woda (A, B, C) oraz
struktury izolowanej cząsteczki w fazie gazowej (D). Na rysunkach zaznaczone zostały wiązania wodorowe powstające między cząsteczkami oraz ich długość [Å]
[opracowanie własne]
A B C Ebezwzg [kJ/mol] -49,75 -36,15 -28,73
Ewzgl [kJ/mol] 0 13,60 21,02
Tabela 1.Energia bezwzględna oraz energia względna odziaływań cząsteczek iperytu
siarkowego z wodą wyrażone w kJ/mol. Struktura A jest najbardziej stabilna i stanowi
minimum globalne [opracowanie własne]
Obliczono energię układów iperyt siarkowy-woda oraz energię
izolowanych cząsteczek. Różnica pomiędzy kompleksem iperyt siarkowy-
,
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
75
woda a monomerami wody oraz iperytu siarkowego wyraża energię
odziaływań międzycząsteczkowych. Oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami
wody i gazu musztardowego wyrażane jest głównie, jako odziaływanie
elektrostatyczne wskutek powstającego wiązania wodorowego.
Najbardziej stabilną strukturą (o najniższej energii) jest struktura A, zwana
minimum globalnym. Optymalizacja geometrii spowodowała wygięcie się
cząsteczki iperytu siarkowego w stosunku do izolowanej struktury
monomeru w fazie gazowej. W minimum globalnym występują dwa
wiązania wodorowe typu C-H …
O oraz jedno typu O-H …
Cl. Obliczona
energia wiązania jest wartością szacunkową i może się nieznacznie zmienić
w zależności od metody obliczeniowej. Nie zmienia to jednak faktu, że
wartość 30 kJ/mol wskazuje na silne łączenie się iperytu siarkowego
z wodą i tworzenie trwałego kompleksu.
Wartość energii wiązania dla struktury B wynosi -36,15 kJ/mol, energia
względna wynosi 13,60 kJ/mol. Między cząsteczkami powstaje jedno
wiązanie C-H …
O oraz jedno O-H …
S.
Najmniej stabilną strukturą jest struktura B, w której obserwujemy
oddziaływania C-H …
O oraz O-H …
Cl. Obliczona energia osiąga
najwyższą wartość -28,73 kJ/mol. Różnica energii względem struktury
najbardziej stabilnej wynosi 21,02 kJ/mol.
8. Wnioski
Na podstawie otrzymanych wyników widzimy, że obecność większej
ilości wiązań C-H …
O powoduje stabilizację struktury (A), obecność trzech
wiązań wodorowych sprawia, że energia osiąga najniższe wartości. Mimo
że w układach B i C występuje taka sama liczbą wiązań, ich oddziaływania
mają różną siłę. Na podstawie wartości energii możemy wnioskować, że
wiązanie O-H …
S jest silniejsze od wiązania wodorowego O-H …
Cl.
Energia wiązania C-H …
O ma podobną wartość we wszystkich układach,
co sugeruje, że układ B jest stabilniejszy ze względu na większą moc
wiązania O-H …
S.
Cząsteczka iperytu siarkowego dąży do maksymalizacji energii
oddziaływania z wodą. Struktura A znacznie odbiega od struktury gazu
musztardowego w środowisku gazowym (D).
Podziękowania
Serdecznie dziękuję kmdr. por. dr. inż. Jackowi Fabisiakowi oraz
dr. Jackowi Bełdowskiemu za umożliwienie wykorzystania materiałów
opracowanych w projekcie CHEMSEA (www.chemsea.eu).
Joanna Lach
76
Literatura
1. CHEMSEA FINDINGS Results from the CHEMSEA Project – Chemical
muniions search and assessment
2. Zatopiona amunicja chemiczna – poradnik dla załóg kutrów rybackich
3. Chemical Warfare Agents, J. A. Romano, B. J. Lukey, H. Salem, 2008 Taylor
& Framcis Group, LLC
4. The war gases, M. Sartori, 1939, New York, D. VAN NOSTRAND CO., INC.
5. www.chemsea.eu
6. Parameters for Evaluation of the Fate, Transport, and Environmental Impacts
of Chemical Agents in Marine Environments. George O. Bizzigotti, Harry
Castelly, Ahmed M. Hafez, Wade H. B. Smith, and Mark T. Whitmire. Chem.
Rev. 2009, 109, 236-256
7. Polska dla Bałtyku, Główny Inspektorat Ochrony Środowiska, Warszawa
2012
Mikrosolwatacja częsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń
pierwszych zasad
Wartość ekonomiczna Morza Bałtyckiego w ciągu ostatnich lat zaczęła wzrastać, głównie
jest to spowodowane transportem dóbr i nośników energii. Czynnikiem ograniczającym dalszy rozwój jest obecność na dnie morza chemicznych środków bojowych (BSCh)
zatopionych po drugiej wojnie światowej (ich ilość szacuje się na 50 tysięcy ton). Koszt ich
wydobycia i neutralizacji jest bardzo wysoki, co zmusza nas do odnalezienia sposobu na
oszacowanie potencjalnego zagrożenia i zrozumienia procesu degradacji BSCh w środowisku wodnym.
Spośród wszystkich BSCh zrzuconych do Morza Bałtyckiego, największy odsetek stanowi
gaz musztardowy (znany także jako iperyt siarkowy, H czy HD). Cząsteczka iperytu
siarkowego jest idealnym modelem do badania procesu solwatacji BSCh w wodzie przy
pomocy technik modelowania molekularnego. Przewidywanie natury oddziaływań
rozpuszczalnika z cząsteczkami substancji rozpuszczonej przy pomocy obliczeniowych
metod kwantowo-chemicznych są bezpieczne oraz mniej kosztowne w porównaniu do
analizy laboratoryjnej. Głównym celem naszej pracy było teoretyczne opisanie procesu mikrosolwatacji gazu
musztardowego w wodzie. W celu znalezienia struktur lokalnych minimów gazu
musztardowego wykorzystaliśmy teorię funkcjonałów gęstości (DFT – density functional
theory). W celu przewidzenia stabilności badanych systemów obliczono energię wiązań.
Słowa kluczowe: mikrosolwatacja, iperyt siarkowy, gazy bojowe, DFT, Morze Bałtyckie
,
Mikrosolwatacja cząsteczek iperytu siarkowego w ujęciu obliczeń pierwszych zasad
77
Microsolvation of sulphur yperite from first principles calculation
Economical value of Baltic Sea is increasing due to new investments, mainly to the transfer
of goods and energy carriers. The limiting step in further development is the presence of dumped chemical warfare agents (CWA's) from the Second World War. The costs of taking
out and neutralization of CWA's are very high so we have to find way to estimate the
potential danger and understand the process of CWA degradation in the water solution.
Among the CWA dumped in Baltic Sea, the amount of sulfur mustard (also known as mustard gas, sulfur yperite, H or HD) is estimated as the highest. The molecule of sulfur
mustard is an ideal model to study the solvation process of CWA's in water using molecular
modeling techniques. The laboratory analysis of CWA are of the high risk, therefore the
theoretical approaches based on quantum chemical seems to be safe and low cost method to investigate the nature of solute-solvent interactions.
The main aim of this work is the theoretical description of the process of sulphur mustard
solvation in water. We used the density functional theory (DFT) to obtain local minima
structures of sulphur mustard – water complexes with different stechiometry. We calculated binding energies to estimate the relative stability of the system
Keywords: microsolvation, sulphur mustard, CWA, DFT, Baltic Sea
78
Katarzyna Szewczuk-Karpisz1, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata
Sęczkowska
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji
tlenku chromu(III) w obecności
poli(kwasu akrylowego)
oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
1. Wstęp
Skład fizyczno-chemiczny wód powierzchniowych jest w wysokim
stopniu uzależniony od działalności gospodarczej człowieka.
Zanieczyszczenia antropogeniczne, stanowiące często poważny problem
wielu ekosystemów, przyczyniają się do różnorodności oraz zmienności
udziału procentowego poszczególnych związków chemicznych w wodach
powierzchniowych [1]. W ostatnich latach stale rośnie zainteresowanie
mikrozanieczyszczeniami wód. Objawia się to coraz większą liczbą
normowanych wskaźników jakości wody przeznaczonej do spożycia
i celów gospodarczych oraz tendencją do ciągłego obniżania
dopuszczalnych stężeń mikrozanieczyszczeń do takich, przy których nie
wywołują one patologicznych zmian u konsumentów [2].
Flokulacja to proces powstawania agregatów cząstek, tzw. „kłaczków”
lub inaczej „flokuł”, w wyniku łączenia zdestabilizowanych cząstek
koloidalnych za pośrednictwem makrocząsteczek wprowadzonego do
układu polimeru. Łańcuchy polimerowe adsorbują się na powierzchni
cząstek koloidalnych tworząc „mostki” pomiędzy nimi, co prowadzi do
destabilizacji układu. Powstałe skupiska cząstek, które dzięki wysoce
rozwiniętej powierzchni właściwej mogą dodatkowo adsorbować
mikrozanieczyszczenia wody występujące w postaci rozpuszczonej lub
zawiesin, usuwane są na drodze sedymentacji i/lub filtracji [3, 4]. A zatem,
zjawisko destabilizacji suspensji jest wysoce pożądane w procesie
oczyszczania wód i ścieków. W układzie zdestabilizowanym powstają
agregaty o znacznie większych rozmiarach w porównaniu do tych,
powstających w układzie o wysokiej stabilności. Dzięki swojej masie
1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Chemii,
Zakład Radiochemii i Chemii Koloidów, www.radiochemistry.umcs.lublin.pl
,
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
79
skupiska te znacznie szybciej opadają na dno osadników, przez co ich
usunięcie z roztworu jest łatwiejsze.
Jako flokulanty określa się rozpuszczalne w wodzie, naturalne lub
syntetyczne polimery, które znacząco podnoszą efektywność procesu
destabilizacji. Związki uczestniczą w tworzeniu trójwymiarowych struktur
ze znajdującymi się w wodzie cząstkami koloidalnymi. Zastosowanie
odpowiednich substancji polimerowych ułatwia opadanie osadu oraz
umożliwia przebieg procesu w niskich temperaturach [5, 6].
Głównym celem przeprowadzonych prac doświadczalnych było
zbadanie zdolności flokulacyjnych polimeru syntetycznego – poli(kwasu
akrylowego), oraz polimeru naturalnego – egzopolisacharydu bakterii
Sinorhizobium meliloti, w odniesieniu do koloidalnego tlenku chromu(III).
To intensywnie zielone ciało stałe ze względu na szerokie wykorzystanie
w wielu gałęziach przemysłu w charakterze barwnika może stanowić
wysoce niepożądany składnik ścieków przemysłowych [7].
2. Materiały
W przeprowadzonych pracach doświadczalnych jako adsorbent
wykorzystano tlenek chromu(III) – Cr2O3. Jego powierzchnia właściwa
określona metodą BET wynosiła 7,12 m2/g. Przed rozpoczęciem badań
adsorbent odmyto wodą redestylowaną do przewodności poniżej 3 µS/cm
w celu usunięcia zanieczyszczeń nieorganicznych.
Z kolei, jako adsorbaty wykorzystano dwa rodzaje polimerów o różnym
pochodzeniu. Pierwszym z nich był anionowy poli(kwas akrylowy) – PAA,
o średniej wagowo masie cząsteczkowej równej 240 000 (Aldrich). Zawiera
on w swojej makrocząsteczce jeden rodzaj grup funkcyjnych – grupy
karboksylowe (rys. 1), które ulegają dysocjacji wraz ze wzrostem pH
roztworu.
Rys. 1. Wzór strukturalny poli(kwasu akrylowego) [8]
Wartość pKa, tj. pH roztworu, przy którym połowa grup
karboksylowych w makrocząsteczkach PAA występuje w formie
zdysocjowanej, jest równa 4,5 [9]. Korzystając z poniższego wzoru:
1logapKpH (1)
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska
80
obliczono stopnie dysocjacji (α) PAA w roztworach o różnym pH (w pH
3 α = 0,03, w pH 4,5 α = 0,5, natomiast w pH 9 α = 0,99).
Drugim wykorzystanym adsorbatem był egzopolisacharyd (EPS)
syntetyzowany przez bakterie Sinorhizobium meliloti podczas ich wzrostu.
Wyizolowany EPS to głównie sukcynyloglikan złożony z oktasacharydowych
podjednostek zawierających siedem cząsteczek glukozy oraz jedną
cząsteczkę galaktozy połączonych wiązaniami β-1,3, β-1,4 oraz
β-1,6 glikozydowymi [10]. Sukcynyloglikan ma szkielet cukrowy
modyfikowany podstawnikami bursztynylowymi, pirogronylowymi
i acetylowymi [11] (rys. 2).
Rys. 2. Struktura sukcynyloglikanu [12]
Masa frakcji wysokocząsteczkowej (HMW) wyizolowanego EPS
wynosi od 1 000 000 do 10 000 000 [13]. Makrocząsteczki EPS zawierają
głównie grupy karboksylowe oraz hydroksylowe, z których tylko te
pierwsze ulegają dysocjacji i są źródłem ujemnego ładunku biopolimeru.
Na podstawie wyników przeprowadzonego miareczkowania potencjo-
metrycznego wyznaczono wartość pKa dla EPS, która wynosi ok. 3,8.
Ponadto, korzystając ze wzoru (1) obliczono, że stopień dysocjacji
egzopolisacharydu w pH 3 wynosi 0,14, w pH = 3,8 α = 0,5, natomiast
w pH 9 α = 0,99.
3. Metody
Miareczkowanie potencjometryczne rozpoczynano od przygotowania
50 cm3 roztworu zawierającego 0,01 M NaCl (elektrolit podstawowy).
Następnie dodawano 0,2 cm3 0,1 M roztworu HCl, otrzymując w ten
sposób roztwór o pH wyjściowym ok. 3,5, Po wprowadzeniu 1,5 g tlenku
chromu(III) suspensję miareczkowano 0,1 M NaOH. W identyczny sposób
przeprowadzono miareczkowanie suspensji zawierającej odpowiedni
polimer (0,1 ppm). Gęstość ładunku powierzchniowego adsorbentu przy
braku i w obecności PAA lub EPS wyliczono przy wykorzystaniu
programu ‘titr_v3’ opracowanego przez W. Janusza.
,
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
81
Wielkość adsorpcji wybranego związku wielkocząsteczkowego na
powierzchni ciała stałego mierzono spektrofotometrycznie na podstawie
różnicy w jego stężeniu w roztworze przed i po procesie adsorpcji. Do
oznaczenia ilościowego poli(kwasu akrylowego) wykorzystano metodę
Crummeta i Hummela [14], natomiast do oznaczenia stężenia
egzopolisacharydu – metodę Dubois i współpr. [15]. Pomiar wielkości
adsorpcji rozpoczynano od przygotowania szeregu roztworów polimeru
(10 cm3) o stężeniach: 10, 30, 50, 70, 100, 150 i 200 ppm, które
równocześnie zawierały 0,01 M NaCl. Następnie dodawano odpowiednią
naważkę tlenku chromu(III) oraz ustalano pH roztworów (3 lub 9 ± 0,05).
Proces adsorpcji prowadzono przez 24 godziny, po czym suspensje dwukrotnie
odwirowano i mierzono stężenie związku wielkocząsteczkowego
w supernatancie.
Pomiary stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy braku
i w obecności polimeru wykonano przy wykorzystaniu turbidymetru.
Podczas pomiaru przez badaną próbkę przechodziła wiązka światła
z zakresu podczerwieni ( = 880 nm). Wyniki pomiarów rejestrowano
w postaci krzywych transmisji i rozproszenia wstecznego światła
przechodzącego przez suspensję. Uzyskane dane umożliwiły wyznaczenie
współczynników stabilności TSI (ang. Turbiscan Stability Index), których
wartości zostały obliczone przez specjalistyczne oprogramowanie
komputerowe współpracujące z turbidymetrem na podstawie wzoru:
1
)(1
2
n
xx
TSI
n
i
BSi
(2)
gdzie: xi – średnie rozproszenie wsteczne dla każdej minuty pomiaru,
xBS – średnie xi, n – ilość skanów.
Ponadto, powyższe oprogramowanie pozwoliło na uzyskanie średniego
rozmiaru agregatów tlenku chromu(III) oraz jego flokuł utworzonych
w obecności PAA lub EPS w badanych próbkach. Suspensje nie
zawierające polimeru przygotowywano poprzez dodanie 0,02 g tlenku
chromu(III) do 20 cm3 roztworu 0,01 M NaCl. Z kolei, próbki ze
związkiem wielkocząsteczkowym sporządzano poprzez wprowadzenie
identycznej naważki do 20 cm3 roztworu zawierającego polimer oraz
0,01 M NaCl. Po 3-minutowej sonifikacji oraz ustaleniu określonego pH
roztworu (3 lub 9 ± 0,05) rozpoczynano pomiar stabilności. Pojedynczy
pomiar trwał 15 godzin, w ciągu których co 15 minut rejestrowano
odpowiednie dane.
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska
82
4. Wyniki pomiarów oraz ich interpretacja
4.1. Gęstość ładunku powierzchniowego tlenku chromu(III) przy
braku i w obecności PAA oraz EPS
Na podstawie wyników przeprowadzonego miareczkowania
potencjometrycznego stwierdzono, że wartość pHpzc (punkt zerowego ładunku)
tlenku chromu(III) wynosi ok. 7,6. Oznacza to, że w roztworze o pH równym
7,6 wypadkowy ładunek powierzchniowy adsorbentu jest równy 0.
W roztworach o pH powyżej tej wartości powierzchnia tlenku chromu(III) jest
naładowana ujemnie, natomiast w pH poniżej tej wartości – dodatnio. Dodatek
zarówno poli(kwasu akrylowego), jak i egzopolisacharydu powoduje
przesunięcie pHpzc układu w kierunku kwaśnych wartości pH. W obecności
PAA wartość ta wynosi ok. 3,8, natomiast w obecności0 EPS – 6,7. Dane te
zestawiono w poniższej tabeli.
Tab. 1. Wartości pHpzc tlenku chromu(III) w roztworze elektrolitu
podstawowego oraz w roztworach zawierających PAA lub EPS
0,01 M NaCl 0,1 ppm PAA 0,1 ppm EPS
pHpzc 7,6 3,8 6,7
Warto również zauważyć, że adsorpcja PAA lub EPS na powierzchni
tlenku chromu(III) powoduje obniżenie ładunku powierzchniowego ciała
stałego w całym badanym zakresie pH w stosunku do układu pod ich
nieobecność. Co więcej, obniżenie to jest tym większe, im wyższe jest pH
roztworu. Wzrost pH skutkuje zwiększeniem ilości zdysocjowanych grup
karboksylowych w makrocząsteczkach zastosowanych polimerów. Grupy
COO- występujące w segmentach polimerowych niezwiązanych
bezpośrednio z adsorbentem (tworzących struktury typu pętli i ogonów
zaadsorbowanych łańcuchów) odpowiadają za obniżenie ładunku
powierzchniowego tlenku metalu.
,
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
83
4.2. Wielkość adsorpcji PAA oraz EPS na powierzchni tlenku
chromu(III)
Uzyskane wyniki pomiarów adsorpcyjnych przedstawiono na
poniższym rysunku.
Rys. 3. Wielkość adsorpcji PAA oraz EPS na powierzchni tlenku chromu(III) w pH 3 i 9
(stężenie początkowe polimeru wynosiło 150 ppm)
Analiza danych zamieszczonych na rysunku 3 wykazała, że zarówno
w pH 3, jak i pH 9 oba badane związki wielkocząsteczkowe adsorbują się
na powierzchni tlenku metalu. Jednakże, wielkość adsorpcji obu polimerów
jest wyższa w roztworze o pH 3. Ilość zaadsorbowanego polimeru
uzależniona jest przede wszystkim od siły i charakteru oddziaływań
elektrostatycznych adsorbent-adsorbat. Ma to bezpośredni wpływ na
konformację makrocząsteczek polimeru związanych z powierzchnią Cr2O3.
Jak wspomniano w poprzednim rozdziale, w pH 3 powierzchnia tlenku
chromu(III) jest naładowana dodatnio. Z kolei, makrocząsteczki PAA oraz
EPS na skutek dysocjacji małej części ich grup karboksylowych posiadają
niewielki ładunek ujemny. Dzięki temu możliwe jest słabe przyciąganie
elektrostatyczne pomiędzy powierzchnią tlenku metalu i łańcuchami
związku wielkocząsteczkowego. Ponadto, niewielki stopień dysocjacji
badanych polimerów w pH 3 (dla PAA 0,03; dla EPS 0,14) sprawia, że
adsorbujące się łańcuchy polimerowe przyjmują bardziej skłębioną
konformację. Taka struktura makrocząsteczek umożliwia adsorpcję ich
dużej liczby na jednostkowej powierzchni adsorbentu.
W pH 9 zarówno makrocząsteczki polimeru, jak i powierzchnia tlenku
chromu(III) są naładowane ujemnie. Skutkiem tego jest odpychanie
elektrostatycznego pomiędzy powierzchnią cząstek tlenku metalu
0
0,5
1
1,5
2
pH 3 pH 9
wielkość adsorpcji [mg/m2]
PAA
EPS
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska
84
a segmentami polimeru, które utrudnia im wzajemny kontakt. Zjawisko to
powinno wykluczać adsorpcję, jednakże, uzyskane wyniki wykazują, że
pewna ilość polimerów adsorbuje się na powierzchni ciała stałego. Jest to
prawdopodobnie związane z tworzeniem mostków wodorowych pomiędzy
wszystkimi rodzajami grup powierzchniowych tlenku chromu(III)
a grupami karboksylowymi polimeru. Co więcej, w pH 9 stopnie dysocjacji
poli(kwasu akrylowego) oraz egzopolisacharydu są sobie równe i wynoszą
0,99. Oznacza to, że praktycznie wszystkie grupy karboksylowe w ich
łańcuchach są zdysocjowane i na skutek wzajemnego odpychania
pomiędzy segmentami, makrocząsteczki przyjmują silnie rozwiniętą
konformację. Ich adsorpcja powoduje zablokowanie części miejsc
aktywnych na powierzchni ciała stałego, co objawia się niższą wielkości
adsorpcji polimeru w tych warunkach pH.
Większa ilość zaadsorbowanego EPS w porównaniu do PAA przy obu
wartościach pH roztworu jest spowodowana znacznie wyższą masą
cząsteczkową EPS.
4.3. Stabilność suspensji tlenku chromu(III) przy braku
i w obecności PAA oraz EPS
W tabeli 2 zestawiono uzyskane wartości TSI dla badanych układów.
Natomiast w tabeli 3 umieszczono uzyskane rozmiary agregatów tlenku
chromu(III) oraz flokuł powstających w obecności wybranych polimerów.
Tab. 2. Wartości współczynnika stabilności (TSI) dla suspensji tlenku
chromu(III) przy braku i w obecności PAA oraz EPS
Współczynnik stabilności (TSI)
pH 3 pH 9
Tlenek chromu(III) 12,76 29,28
Tlenek chromu(III) + PAA 65,55 10,63
Tlenek chromu(III) + EPS 25,59 61,85
Tab. 3. Średnia wielkość agregatów (flokuł) w suspensji tlenku chromu(III)
przy braku i w obecności PAA oraz EPS
Średni rozmiar agregatów (flokuł) [µm]
pH 3 pH 9
Tlenek chromu(III) 0,077 0,127
Tlenek chromu(III) + PAA 0,156 0,109
Tlenek chromu(III) + EPS 0,085 0,625
,
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
85
Suspensja tlenku chromu(III) jest stosunkowo stabilna zarówno w pH 3
(TSI=12,76). Natomiast w pH 9 układ charakteryzuje się niższą
stabilnością (TSI=29,28). Adsorpcja poli(kwasu akrylowego) i egzopoli-
sacharydu wyraźnie wpływa na stabilność badanych suspensji.
W obecności PAA w pH 3 dochodzi do znacznego obniżenia stabilności
układu (TSI=65,55), z kolei w pH 9 do jej podwyższenia (TSI=10,63).
Natomiast, dodatek EPS zarówno w pH 3, jak i pH 9 powoduje spadek
stabilności układu. Jednakże, spadek ten jest znacznie większy w pH 9
(TSI= 61,85). W próbkach o niższej stabilności powstają większe agregaty
oraz flokuły w porównaniu do próbek bardziej stabilnych. Przykładowo,
w pH 3 w suspensji tlenku chromu(III) zawierającej poli(kwas akrylowy)
charakteryzującej się niską stabilnością tworzą się flokuły o średnicy 0,156
µm. Natomiast w pH 9 w identycznej suspensji, która w tych warunkach
odznacza się stosunkowo wysoką stabilnością, powstają flokuły o średnicy
0,109 µm.
4.4. Mechanizm stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy
braku i w obecności PAA oraz EPS
Analiza otrzymanych wyników pozwoliła na określenie mechanizmu
stabilności suspensji tlenku chromu(III) przy braku i w obecności
syntetycznego oraz naturalnego polimeru w pH 3 oraz 9.
Suspensja tlenku chromu(III) jest stosunkowo stabilna w pH 3. W tych
warunkach w układzie zachodzi stabilizacja elektrostatyczna. W roztworze
o pH 3 cząstki tlenku metalu są naładowane dodatnio i dookoła każdej
z nich zostaje utworzona dyfuzyjna warstwa ładunku ujemnego, czyli
warstwa jonów chlorkowych pochodzących z roztworu elektrolitu
podstawowego. Warstwa tych jonów stanowi barierę, która skutecznie
zapobiega zderzaniu się cząstek, a tym samym znacznie ogranicza
tworzenie się agregatów.
W obecności poli(kwasu akrylowego) w pH 3 dochodzi do wyraźnego
spadku stabilności układu. Jest ona przede wszystkim związana
z neutralizacją dodatniego ładunku cząstek adsorbentu przez
makrocząsteczki polimeru obdarzone niewielkim ładunkiem ujemnym.
W roztworze o pH poniżej wartości pKa w makrocząsteczkach PAA
przeważają niezdysocjowane grupy karboksylowe w stosunku do grup
zdysocjowanych. Jednakże, ich ilość jest wystarczająca do skutecznego
zobojętnienia ładunku cząstek ciała stałego. Ponadto, jak już wcześniej
wspomniano w pH 3 makrocząsteczki PAA przyjmują bardziej skłębioną
konformację na skutek niewielkiej zawartości grup COO-. Prowadzi to do
praktycznie całkowitego pokrycia powierzchni cząstek tlenku chromu(III)
skłębionymi łańcuchami polimerowymi.
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska
86
W pH 9 adsorpcja PAA powoduje wyraźne podwyższenie stabilności
suspensji tlenku chromu(III). W tych warunkach w układzie ma miejsce
stabilizacja elektrosteryczna układu. Wynika ona zarówno z odpychania
elektrostatycznego pochodzącego od ładunków ujemnych zaadsorbowanych
makrocząsteczek, jak i odpychania sterycznego warstewek polimerowych.
W układzie są więc obecne siły odpychania elektrosterycznego, które
przyczyniają się do znacznego wzrostu jego stabilności.
Natomiast w obecności egzopolisacharydu bez względu na pH roztworu
dochodzi do obniżenia stabilności suspensji tlenku chromu(III). W pH 3,
podobnie jak w przypadku PAA, zachodzi destabilizacja układu na skutek
neutralizacji ładunku dodatnich cząstek tlenku metalu przez zaadsorbowane
łańcuchy polimerowe. W tych warunkach makrocząsteczki EPS podobnie
jak makrocząsteczki PAA są skłębione ze względu na niewielką zawartość
zdysocjowanych grup karboksylowych, dzięki czemu możliwe jest
całkowite pokrycie powierzchni adsorbentu polimerem.
W pH 9 suspensja tlenku chromu(III) zawierająca EPS charakteryzuje
się jeszcze niższą stabilnością niż w pH 3. W tym przypadku praktycznie
wszystkie grupy karboksylowe makrocząsteczek polisacharydu są
zdysocjowane. Jednakże, ujemny ładunek powierzchniowy cząstek ciała
stałego sprawia, że destabilizacja układu poprzez neutralizację ładunku
adsorbentu nie jest możliwa. W pH 9 destabilizacja suspensji jest wynikiem
tworzenia mostków polimerowych przez zaadsorbowane makrocząsteczki
egzopolisacharydu. Ze względu na wysoką masę cząsteczkową EPS
łańcuchy polimerowe charakteryzują się wystarczającym rozwinięciem,
aby możliwa była ich jednoczesna adsorpcja na powierzchni co najmniej
dwóch cząstek ciała stałego. Zjawisko to sprzyja tworzeniu flokuł
o znacznych rozmiarach – średnio pięć razy większych niż w pozostałych
układach (tabela 3), które szybko opadają na dno fiolki pomiarowej. Taką
destabilizację na skutek tworzenia mostków polimerowych określa się jako
flokulację mostkową.
5. Wnioski
Analiza rezultatów przeprowadzonych prac doświadczalnych
(tj. miareczkowania potencjometrycznego, pomiarów stabilności układu
oraz wielkości adsorpcji) pozwoliła na określenie mechanizmu stabilności
suspensji tlenku chromu(III) przy braku i w obecności poli(kwasu
akrylowego) oraz egzopolisacharydu syntetyzowanego przez bakterie
Sinorhizobium meliloti w pH 3 i 9. Suspensja tlenku chromu(III) nie
zawierająca polimeru charakteryzuje się stosunkowo wysoką stabilnością
zarówno w pH 3, co jest związane ze stabilizacją elektrostatyczną układu.
Poli(kwas akrylowy) wywołuje destabilizację suspensji w pH 3, co jest
,
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia bakteryjnego
87
podyktowane neutralizacją ładunku powierzchniowego adsorbentu przez
makrocząsteczki polimeru. Natomiast egzopolisacharyd przyczynia się do
najwyższej destabilizacji układu w pH 9, powodując flokulację mostkową.
Reasumując, zarówno poli(kwas akrylowy), jak i polisacharyd bakteryjny
mogą być wykorzystane jako substancje zwiększające efektywność procesu
usuwania tlenku chromu(III) z wody i ścieków. W pewnych warunkach pH
roztworu oba zastosowane związki wielkocząsteczkowe powodują destabi-
lizację suspensji, która jest równoznaczna z powstawaniem flokuł
o znacznych rozmiarach, szybko opadających na dno zbiornika.
Literatura
1. Kowal A. L., Świderska-Bróż M., Oczyszczanie wody. Podstawy teoretyczne i technologiczne, procesy i urządzenia, Warszawa, PWN, 2009
2. Świderska-Bróż M., Mikrozanieczyszczenia wód i możliwości ich usuwania, Ochrona środowiska, 1993 vol. 3, s. 23-28
3. Adamski W., Modelowanie systemów oczyszczania wód, Warszawa, PWN, 2002 4. Beddow V., Coagulation and flocculation in water and wastewater
treatement, http://iwawaterwiki.org/xwiki/bin/view/Articles/CoagulationandFlocculationinWaterandWastewaterTreatment
5. Kaleta J., Puszkarewicz A., Uzdatnianie wody do spożycia przez ludzi, Rzeszów, Oficyna Wydawnicza Politechniki Rzeszowskiej, 2011
6. Magrel L., Uzdatnianie wody i oczyszczanie ścieków, Urządzenia, procesy, metody. Białystok, Wydawnictwo Ekonomia i Środowisko, 2000
7. Gattens R. J., Stout G. L., Painting materials: a short encyclopaedia, New York, Dover Publications, 1966
8. Szewczuk K., Badanie możliwości usuwania tlenku chromu(III) z suspensji wodnej przy użyciu poli(kwasu akrylowego), Praca magisterska,UMCS, Wydział Chemii
9. Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna t.1, Warszawa, PWN, 1965 10. Skorupska A., Janczarek M., Marczak M., Mazur A., Król J., Rhizobial
exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions, Micro. Cell. Factor., 2006 vol. 5, s. 5-17
11. Reinhold B. B., Chan S. Y., Reuber T. L., Marra A., Walker G. C., Reinhold V. N., Detailed structural characterization of succinoglycan, the major exopolysaccharide of Rhizobium meliloti Rm1021, J. Bacteriol., 1994 vol. 176, s. 1997-2002
12. Simsek S., Ojanen-Reuhs T., Stephens S. B., Reuhs B. L., Strain-ecotype specifity in Sinorhizobium meliloti-Medicago truncatula symbiosis is correlated to succinoglycan oligosaccharide structure, J. Bacteriol., 2007 vol. 189, s. 7733-7740
13. Gharzouli R., Cerpene M. A., Couderc F., Benguedouar A., Poinsot V., Relevance of Fucose-Rich Extracellular Polysaccharides Produced by Rhizobium sullae strains nodulating Hedysarum coronarium L. Legumes, Appl. Env. Microbiol., 2013 vol. 79, s. 1764-1776
Katarzyna Szewczuk-Karpisz, Małgorzata Wiśniewska, Małgorzata Sęczkowska
88
14. Crummet W. B., Hummel R. A., The determination of traces of polyacrylamides in water, J. Am. Water works Accos., 1963 vol. 55, s. 209
15. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analytical Chemistry, 1956 vol. 28, s. 350-356
Porównanie mechanizmu stabilności suspensji tlenku chromu(III)
w obecności poli(kwasu akrylowego) oraz polisacharydu pochodzenia
bakteryjnego
Streszczenie Ograniczona dostępność wody pitnej to problem dotyczący wielu regionów świata. W celu jego rozwiązania wielu naukowców poszukuje substancji pozwalających na zwiększenie efektywności oczyszczania wód i ścieków. Ogromną szansą dla poprawy wydajności tego procesu są flokulanty – polimery przyspieszające proces tworzenia agregatów cząstek stałych. W tej pracy zbadano zdolności flokulacyjne polimeru syntetycznego PAA – poli (kwasu akrylowego) oraz polimeru naturalnego EPS – polisacharydu pochodzenia bakteryjnego, względem tlenku chromu(III). Wybór tlenku metalu był podyktowany jego szerokim wykorzystaniem w przemyśle, a tym samym wysokim prawdopodobieństwem jego obecności w ściekach. Prace doświadczalne obejmowały szereg metod badawczych, tj. miareczkowanie potencjometryczne, spektrofotometryczne oznaczenie ilościowe polimeru, turbidymetryczny pomiar stabilności układu. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że w określonych warunkach pH roztworu zarówno PAA, jak i EPS wykazują zdolności flokulacyjne w stosunku do cząstek tlenku chromu(III). Poli(kwas akrylowy) powoduje najsilniejszą destabilizację suspensji w pH 3, natomiast egzopolisacharyd w pH 9. A zatem, powyższe związki wielkocząsteczkowe mogą znaleźć potencjalne wykorzystanie w procedurze usuwania tlenku chromu(III) z wód i ścieków. Słowa kluczowe: poli(kwas akrylowy), polisacharyd bakteryjny, adsorpcja, stabilność, tlenek chromu(III)
The comparison of chromium(III) oxide suspension stability
mechanism in the presence of polyacrylic acid and bacterial
polysaccharide
Abstract The limited availability of drinking water is a problem in many world regions. To partly solve it, many scientists is looking for the substances enhancing the efficiency of water and wastewater treatment. Flocculants, i.e. polymers accelerating the formation of solid particle aggregates, are a great opportunity to improve the efficiency of this process. In this paper the flocculating ability of synthetic polymer PAA - polyacrylic acid, and natural polymer EPS - polysaccharide of bacterial origin, relative to the chromium(III) oxide was determined. The metal oxide choice was dictated by its extensive use in the industry and thus a high probability of its presence in wastewaters. Experiments included many research methods, such as potentiometric titration, spectrophotometric polymer quantification as well as turbidimetric measurement of the system stability. The result analysis showed that under certain pH conditions both PAA and EPS possess the chromium(III) oxide flocculation ability. Polyacrylic acid causes the highest suspension destabilization at pH 3, whereas exopolysaccharide – at pH 9. Thus, these macromolecules can be used in the chromium(III) oxide removal procedure from water and wastewaters. Keywords: polyacrylic acid, bacterial polysaccharide, adsorption, stability, chromium(III) oxide
89
Mateusz Niścior1
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
1. Podstawowe pojęcia i definicje
Adsorpcja to zjawisko występujące na granicy zetknięcia się dwóch
faz, związane z występowaniem pewnego pola niewysyconych sił
międzycząsteczkowych np. sił Van der Waalsa. W rezultacie
oddziaływania tych sił następuje zmiana stężenia określonego składnika
(adsorbatu) w fazie ciekłej lub gazowej oraz jego stężenia na granicy faz.
Materiałem, na powierzchni, którego zachodzi zjawisko adsorpcji
nazywamy adsorbentem. Najczęściej jest to porowate ciało stałe.
Adsorpcja dodatnia ma miejsce wtedy, gdy wzrasta stężenie substancji na
powierzchni adsorbentu, natomiast w odwrotnej sytuacji mówimy
o adsorpcji ujemnej. Adsorpcja to w większości przypadków proces
egzotermiczny. Cząsteczka, która uległa adsorpcji na powierzchni, traci
stopnie swobody, w wyniku, czego zmiana entropii jest ujemna, ΔS<0. Aby
proces był samorzutny zmiana entalpii swobodnej, określona zależnością
ΔG= ΔH - TΔS, musi być mniejsza od zera, ΔG<0, zatem zmiana entalpii
ΔH również musi być ujemna (proces egzotermiczny). W zależności od
rodzaju działających na powierzchni sił rozróżniamy adsorpcję fizyczną
i chemiczną [1].
Adsorpcja fizyczna (fizysorpcja), jest zjawiskiem, w którym cząsteczki
adsorbatu znajdujące się na granicy faz podlegają niezrównoważonym
siłom Van der Waalsa, skierowane prostopadle do powierzchni granicznej.
Fizysorpcja jest procesem egzotermicznym, a w podwyższonej
temperaturze następuje odwrócenie procesu, którego szybkość jest
ograniczona głównie przez szybkość dyfuzji adsorbatu do powierzchni.
W adsorpcji tego rodzaju pojedyncza cząsteczka ma dwa stopnie swobody,
umożliwia jej to przemieszczanie się po powierzchni. Zaadsorbowane
cząsteczki często mogą tworzyć więcej niż jedną warstwę [1, 2].
W przypadku adsorpcji chemicznej (chemisorpcji), cząsteczki
adsorbatu wiążąc się z powierzchnią tworząc pewien rodzaj połączeń
chemicznych – powstaje wówczas wiązanie kowalencyjne bądź
koordynacyjne. W takiej sytuacji możliwa jest tylko adsorpcja w postaci
monowarstwy, przy czym pojedyncza cząsteczka ma zero stopni swobody.
1 [email protected], UMCS, Wydział Biologii I Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii,
http://www.binoz-programy.umcs.lublin.pl
Mateusz Niścior
90
Oczywiście obok sił natury chemicznej równocześnie zawsze występują
siły dyspersji i odpychania, niezależnie od charakteru adsorpcji i granic
fazowych. Chemisorpcja jest procesem często nieodwracalnym. Entalpia
chemisorpcji jest dużo większa niż w przypadku fizysorpcji - wynosi
średnio od 100 do 400 kJ/mol. Oznacza to, że cząsteczki ulegające
adsorpcji chemicznej są silniej związane z powierzchnią adsorbentu
i trudniej ulegają wymianie z innymi cząsteczkami. Na podstawie
porównania efektów energetycznych towarzyszących procesowi adsorpcji
możemy wówczas określić jej charakter – czy jest to adsorpcja fizyczna
bądź chemiczna. Adsorpcja może być monowarstwowa (jedna,
niekoniecznie pełna warstwa adsorbatu na powierzchni adsorbenta) bądź
wielowarstwowa [1].
Adsorpcja na granicy różnych faz
Proces adsorpcji zachodzi na granicy faz. Ze względu na rodzaj granicy
faz, zjawisko adsorpcji można rozpatrywać w następujących układach:
ciało stałe-ciecz;
ciało stałe-gaz;
ciecz-gaz;
ciecz-ciecz [2].
Proces adsorpcji substancji rozpuszczonej na powierzchni swobodnej
roztworu opisujemy najczęściej równaniem Gibbsa. Proces adsorpcji gazu
na powierzchni ciał stałych opisuje teoria adsorpcji jednowarstwowej
Langmuira i teoria adsorpcji wielowarstwowej BET (skrót od nazwisk
autorów). Adsorpcję na granicy ciało stałe roztwór opisywana jest za
pomocą empirycznego równania Freundlicha [2].
Pomiar adsorpcji - desorpcji
Pomiar adsorpcji - desorpcji (proces odwrotny do adsorpcji) ma na celu
określenie, na podstawie analizy zmian stężenia lub ciśnienia w fazie
gazowej lub ciekłej, jaka ilość adsorbatu przemieściła się do lub
z adsorbentu [1].
2. Podstawowa klasyfikacja adsorbentów ze względu na:
2.1. Porowatość:
Adsorbent nieporowate - mają one niewielką powierzchnię właściwą,
rzadko przekraczającą 10 m2/g. Zazwyczaj powierzchnia ta wynosi
od 0,1 do 1 m2/g. Powierzchnię właściwą ciał nieporowatych określa
się ich powierzchnią zewnętrzną, którą można zwiększyć poprzez
rozdrabnianie. Przykładem tego typu adsorbentów są: dymy sadze
(sadza grafitowana), BaSO4, aerożele krzemionkowe [2];
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
91
Adsorbenty porowate - są to ciała stałe o powierzchniach
właściwych od setek do tysiąca m2/g. Adsorbenty takie stosuje się
w postaci ziarnistej (tabletki, granulki, kulki) w celu nadania im
odpowiedniej wytrzymałości i zmniejszenia oporu w stosunku do
strumienia gazu bądź cieczy. Wielkości ziaren wynoszą zwykle od
0,1 do 2 nm. [2].
Rodzaje porowatości:
Porowatość adsorbentów może być różna. Pory mogą różnić się
zarówno rozmiarami jak i kształtem. W wielu przypadkach jednak
najważniejszym rozróżnieniem porowatości adsorbelit6w jest szerokość
por6w. Przyjmując cylindryczny kształt porów mówimy o ich średnicy.
W przypadku szczelinowych porów można mówić o ich szerokości.
Dubinin [3] podał klasyfikację porów według ich promieni:
Mikropory – pory o promieniach mniejszych od 2 nm;
Pory pośrednie (mezopory) – pory o promieniach większych
od 2 nm.a mniejszych od 50nm;
Makropory – pory o promieniach większych od 50 nm.
Klasyfikacja porów według Dubinina została dość powszechnie przyjęta
w literaturze naukowej dotyczącej zagadnienia adsorpcji i adsorbentów.
2.2. Podział adsorbentów ze względu na charakter powierzchni
(uwzględnia rozmieszczenie ładunków elektrycznych na
powierzchni):
Adsorbenty niespecyficzne –charakteryzujące się oddziaływaniami
powszechnymi, które występują miedzy dowolnymi partnerami, są to
przede wszystkim oddziaływania dyspersyjne, związane z uzgodnionym
ruchem elektronów (np. grafitowane sadze, polimery);
Adsorbenty specyficzne – charakteryzujące się oddziaływaniami
spowodowanymi niejednorodną gęstością elektronów zewnętrznych
(peryferyjnych), związane jest to z miejscowym zagęszczeniem
ujemnych lub dodatnich ładunków (np. SiO2 x nH2O, zeolity) [2, 4].
2.3. Klasyfikacja adsorbentów według Kisielewa
Typ I – adsorbenty niespecyficzne – na ich powierzchni nie ma grup
funkcyjnych zdolnych do wymiany jonu. Do tej grupy należą przede
wszystkim grafitowane sadze, a także węglowodory nasycone
i polimery (np. polietylen);
Typ II – adsorbenty specyficzne dodatnie na swojej powierzchni
mają grupy OH o kwasowym charakterze np. zhydroksylowane
Mateusz Niścior
92
powierzchnie tlenków kwasowych, w szczególności SiO2 x nH2O.
Do adsorbentów grupy drugiej zaliczamy zeolity;
Typ III – adsorbenty specyficzne ujemne – na powierzchni mają
wiązania lub grupy atomów ze skupionym na ich peryferiach
ładunkiem ujemnym [2, 5].
Otrzymuje się je przeważnie przez nałożenie na powierzchnię
niespecyficznego adsorbentu (typu I), a w szczególności na powierzchnię
grafitowanej sadzy, monomolekularnej warstwy cząsteczek lub
mikrocząstek grupy B. Innym sposobem jest chemiczne modyfikowanie
powierzchni adsorbentów innych typów, wbudowując odpowiednie grupy
funkcyjne jak np. – CN [4, 6].
3. Parametry charakteryzujące strukturę porów ciał stałych:
Powierzchnia właściwa ciała stałego (S) – równa jest sumie
powierzchni zewnętrznej i wewnętrzne wyrażana jest w m2/g ciała stałego.
Możliwa jest odwrotna relacja między powierzchnią właściwą a średnim
promieniem porów. Im większa jest powierzchnia właściwa (S>500 m2/g),
tym mniejsze są wartości promieni porów (R). Stąd duża powierzchnia
właściwa wskazuje na obecność niewielkich porów, natomiast o obecności
makroporów świadczy mała powierzchnia właściwa (S<10 m2/g) [2].
Średni promień porów (wyrażany w nm. lub Å) – jest on wartością
średnią promieni porów dla danego materiału porowatego [1].
Całkowita objętość porów (Vp) jest wyrażana w cm3 czystego
adsorbatu na 1g porowatego ciała stałego. Objętość całkowita porów
odpowiada objętości ciekłego adsorbatu, który wypełnia pory zawarte w
jednostce masy adsorbatu [4].
4. Metody otrzymywania adsorbentów
4.1. Adsorbenty nieporowate otrzymuje się poprzez:
strącanie krystalicznych osadów, jak np. BaSO4;
mielenie ciał stałych (szklistych lub krystalicznych);
niepełne spalanie substancji organicznych (tzw. czarne sadze) lub
krzemoorganicznych (tzw. białe sadze);
hydrolizę chlorowcobezwodników kwasu ortokrzemowego np. SiCl4
lub SiF4 w silnie przegrzanej parze wodnej, uzyskując tzw. aerozole
krzemionkowe;
obróbkę zwykłej sadzy polegającą na ogrzewaniu jej w temperaturze
3000°C pod zmniejszonym ciśnieniem, w atmosferze gazu
obojętnego. W tej temperaturze cząsteczki sadzy przybierają postać
wielościanów pokrytych grafitem (sadze grafitowane) [1, 7].
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
93
4.2. Adsorbenty porowate otrzymuje się przez:
syntezę (aglomerację) - która polega na zbudowaniu sztywnego
szkieletu adsorbentu z małych cząstek o rozmiarach koloidalnych;
cząstki te (korpuskuły) zlepiają się lub zrastają w miejscach zetknięcia,
tworząc szkielet o olbrzymiej powierzchni wewnętrznej; w ten sposób
otrzymuje się m.in. żele krzemionkowe, uwodniony Al2O3;
wywarzanie porów w litym materiale wyjściowym – polega na
działaniu na porowate lub nieporowate ciała (koks, szkło),
aktywnymi gazami lub cieczami [1, 5, 7].
Przykłady:
Węgiel aktywny - z bardzo rozwiniętą powierzchnią (rozmiary porów
od kilku do kilkudziesięciu nm.) – powstaje podczas działania na
nieaktywny węgiel gazami utleniającymi w temperaturze od 1123 do 1223 K;
wówczas część węgla ulega spaleniu [1].
Szkła porowate - otrzymuje się działając kwasami na szkło sodowo-
borowe. Rozmiary porów zależą od obróbki cieplnej szkła i końcowego
przemywania roztworami NaOH lub KOH [1].
Metale porowate, jak np. nikiel Raney’a otrzymuje się poprzez
wyługowanie NaOH stopu Ni z Al; w stopie tym podczas krzepnięcia
wydzielają się obydwa metale, jako oddzielne fazy; po rozpuszczeniu glinu
w NaOH pozostaje porowaty szkielet niklowy [1].
5. Podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji
5.1. Równowaga adsorpcyjna.
W stanie równowagi, który ustala się pomiędzy gazem lub parą
a powierzchnią ciała stałego, stężenie gazu na tej powierzchni jest z reguły
większe niż wewnątrz fazy gazowej, bez względu na rodzaj i własności
gazu i powierzchni. W każdym ciele stałym atomy na powierzchni
podlegają działaniu niezrównoważonych sił przyciągania, skierowanych
prostopadle do płaszczyzny powierzchni. Przywrócona zostaje częściowo
równowaga sił dzięki adsorpcji cząsteczek gazu [8].
Dane eksperymentalne dowodzą, że niezależnie od sposobu opisu
zjawisk adsorpcyjnych, równowagowy rozkład cząsteczek adsorbatu
pomiędzy powierzchnią adsorbentu i fazą gazową, zależy od ciśnienia
adsorbowanego gazu i temperatury procesu, tj.
𝑎 = 𝑓 (𝑝,𝑇)T) (1)
Mateusz Niścior
94
gdzie:
a – ilość zaadsorbowanej substancji przypadająca na jednostkę powierzchni
lub masyadsorbentu,
p – ciśnienie adsorbatu w warunkach równowagi,
T – temperatura [8].
5.1.1. Stan równowagi adsorpcyjnej rozpatrywanyw trojaki
sposób
W zależności od warunków eksperymentu mierzalność adsorpcji może
być przedstawiona w następującej postaci:
Jeżeli temperatura jest stała (T=const), wówczas równowagę można
opisać równaniem izotermy adsorpcji:
a=f(p)T
Rys. 1 Izotermy adsorpcji [8]
Jeżeli ciśnienie jest stałe (p=const), równowagę adsorpcyjną można
opisać równaniem izobary adsorpcji:
a = f (T)p
Rys. 2 Izobary adsorpcji [8]
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
95
Gdy ilość zaadsorbowanej substancji jest stała (a=const.),
równowagę można opisać równaniem izostery adsorpcji:
a = f (T)a
Rys. 3 Izostery adsorpcji [8]
Spośród wielu modeli teoretycznych opisujących równowagę adsorpcji
można wymienić najbardziej znane i popularne: r-nie Gibbsa, Henry’ego,
Freundlicha, Langmuira, BET oraz teoria potencjałowa. Niektóre z wyżej
wymienionych równań izoterm oparte są na modelu siatkowym natomiast
teoria potencjałowa zakłada dyfuzyjny charakter warstwy adsorpcyjnej.
5.2. Równanie powierzchniowej adsorpcji Gibbsa
Gibbs (1878) wyprowadził matematycznie uniwersalne równanie,
opisujące adsorpcję. W przypadkucząsteczek substancji rozpuszczonej
np. związków organicznych, adsorpcję określa się terminem nadmiaru
powierzchniowego: ,który oznacza różnicę między liczbą moli substancji
nagromadzonej w fazie powierzchniowej o jednostkowej powierzchni,
a ilością tejże substancji zawartej w równoważnej ilości fazy objętościowej
[2, 4].
Równanie to ma następującąpostać:
(2)
gdzie:
Ž2– nadmiar powierzchniowy składnika 2,
a – aktywność substancji rozpuszczonej w roztworze,
ζ– napięcie powierzchniowe,
R – stała gazowa,
T – temperatura [2, 4].
Mateusz Niścior
96
Nadmiar powierzchniowy może być dodatni lub ujemny.Równanie
adsorpcji Gibbsa wiąże adsorpcję cząstek substancji rozpuszczonej na
powierzchni rozpuszczalnika ze zmianą napięcia powierzchniowego.
Cząsteczki substancji rozpuszczonej gromadzą się na powierzchni
swobodnej roztworu, powodując obniżenie napięcie powierzchniowe
rozpuszczalnika, gdy:
podczas, gdy cząsteczki substancji podwyższających napięcie
powierzchniowe „uciekają” z powierzchni do wnętrza cieczy [2].
5.3. Równanie adsorpcji Henry’ego
Równowagę adsorpcyjną w układzie gaz – ciało stałe można
przedstawić następująco:
W przypadku jednorodnej powierzchni stężenie substancji w warstwie
powierzchniowej ajest proporcjonalne do stężenia substancji c w fazie
gazowej:
(3)
gdzie K jest stałąrównowagi adsorpcji [2].
Wiadomo, że dla gazów doskonałych i dlatego możliwe jest
wyznaczenie całkowitej ilości zaadsorbowanej N w stałych warunkach
temperatury i objętości [2,4]:
(4)
WielkośćN wyraża sięczęsto liczbąmoli adsorbatu na 1g adsorbentu.
Zamiast wielkości N można wielkość adsorpcji, wyrazić, jako ilość
substancji zaadsorbowanej Nt, przypadającą na jednostkę powierzchni
adsorbentu:
a (5)
gdzie:
Nt- wyraża liczbęmikromoli na 1 cm2lub liczbęcząsteczek na 1nm2 ,
ls-grubośćwarstwy adsorpcyjnej,
s -powierzchnia właściwa adsorbentu [2, 4].
Przy małym ciśnieniu gazu wielkośćjego adsorpcji N (na 1g adsorbentu)
lub Nt (na jednostkę powierzchni adsorbentu) jest proporcjonalna do
stężenia lub ciśnienia w fazie objętościowej. Jest to zależnośćanalogiczna
do równania Henry’ego opisującego rozpuszczalność gazów w cieczach.
Równanie(4) jest postacią najprostszego równania izotermy adsorpcji,
zwane równaniem Henry’ego, a jego stała– stała Henry’ego [2].
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
97
W odróżnieniu od wielkości N, zależnej od powierzchni właściwej
adsorbentu, wielkości Nt zależy jedynie od natury składników układu
adsorbent + adsorbat przy stałych p i T [2].
Wielkości te określane sąabsolutnymi wielkościami adsorpcji dla
nieporowatych lub szeroko porowatych adsorbentów o jednorodnej
powierzchni stałymi fizyko-chemicznymi [2, 9]
Zamiast stężenia powierzchniowego a lub całkowitej ilości zaadsorbowanej
substancji N często wygodniej jest stosować wielkość wyrażająca
stopień pokrycia powierzchni adsorbentu:
(6)
gdzie: amoraz nmoznaczająwielkości odpowiadające całkowitemu
pokryciu powierzchni jednocząsteczkowąwarstwa danego adsorbatu [9].
Z równania (6) wynika, że pokrycie powierzchni w obszarze Henry’ego
jest proporcjonalne do ciśnienia substancji w fazie gazowej [2, 9].
5.4. Równanie adsorpcji Freundlicha
Adsorpcja na granicy faz ciało stałe - roztwór ciekły, jest bardziej
złożona od adsorpcji gazów. Wielkość adsorpcji zależy od oddziaływania
pomiędzy każdym ze składników roztworu,a adsorbentem.
Niezależnie od tego czy mamy do czynienia z adsorpcją z fazy gazowej
lub ciekłej, stan równowagi adsorpcyjnej opisywany jest przez empiryczne
równanie Freundlicha.
Równanie to ma postać:
a=kcn (7)
gdzie:
a – oznacza liczbę moli substancji zaadsorbowanej przez 1g adsorbentu,
c – stężenie molowe roztworu w stanie równowagi adsorpcyjnej,
w przypadku gazu stężenie zastępujemy ciśnieniem,
k i n – wielkości stałe (zależne od temperatury, rodzaju adsorbentu
i substancji adsorbowanej), gdzie n<1 [4, 10].
Przeważnie stosuje się równanie, które określa masę substancji
zaadsorbowanej i ułamkową wartość wykładnika potęgowego:
(8)
gdzie:
x – oznacza masę substancji zaadsorbowanej z roztworu przez
m gramów adsorbentu,
k, c, n – pozostałe oznaczenia jak wyżej [2].
Mateusz Niścior
98
Rys. 4. Izoterma adsorpcji Freundlicha [2].
Wykres izotermy Freundlicha w ogólnym jego przebiegu jest zbieżny
do wykresu izotermy Langumira, różni się tylko od niej jednakże brakiem
prostej proporcjonalności między ilością zaadsorbowanej substancji
a stężeniem w zakresie małych stężeń [2]:
(9)
Równanie Freundlicha jest rzadko stosowane.Zjawisko adsorpcji na
ciele stałym jest szeroko wykorzystywane w praktyce laboratoryjnej m.in.
w przemyśle.Stanowi ono podstawę oczyszczania i rozdzielania związków
w chromatografii. Ma ogromne znaczenie w reakcjach heterogenicznych –
w katalizie kontaktowej [11].
5.5. Równanie adsorpcji Langmuira
Langmuir podał model adsorpcji opisującej maksymalną adsorpcję
w postaci monowarstwy.
Model ten bazuje na następujących założeniach:
na powierzchni adsorbentu jest określona liczba miejsc aktywnych
(proporcjonalna do wielkości powierzchni), którymi mogą być
określone ściany mikrokrystalitów, defekty sieciowe lub
w przypadku adsorbentów złożonych, granice faz;
na każdym z tych miejsc może zaadsorbować sie tylko jedna
cząsteczka adsorbatu, czyli adsorbent pokrywa się warstwą
monomolekularną;
proces adsorpcji zachodzi na miejscach aktywnych;
cząsteczki zaadsorbowane na miejscach adsorpcji nie oddziałują
wzajemnie na siebie;
proces adsorpcji charakteryzuje się dynamiczną równowagą
pomiędzy adsorpcją i procesem odwrotnym do adsorpcji – desorpcją.
wiązanie z adsorbentem może mieć charakter fizyczny lub
chemiczny, lecz dostatecznie silne, aby cząsteczki zaadsorbowane
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
99
nie przemieszczały sie po powierzchni- mamy, więc tu do czynienia
ze zlokalizowana adsorpcja [2, 4].
Przy takich założeniach równowagę adsorpcyjna można przedstawić
następująco:
cząsteczka gazu + wolne miejsce na powierzchni ↔ zlokalizowany
kompleks adsorbentu adsorpcyjny [1]
Równanie na stałą równowagi tego procesu można zapisać w postaci:
(10)
gdzie:
Nt0 - stężenie powierzchniowe wolnych miejsc aktywnych na
powierzchni adsorbentu,
- stopień pokrycia powierzchni adsorbentu wolnymi miejscami
aktywnymi,
Nt – stężenie powierzchniowe zajętych miejsc aktywnych (stężenie
powierzchniowe substancji zaadsorbowanej) [2,4, 12].
Stopień pokrycia powierzchni θ lub tak zwany, ułamek zapełnienia
powierzchni określa wzór:
(11)
gdzie:
n - liczba moli substancji zaadsorbowanej przez daną masę adsorbentu
(liczba zajętych centrów adsorpcyjnych),
nm - liczba moli, przy której następuje zapełnienie wszystkich centrów
adsorpcyjnych [10].
Zgodnie z tą definicją ( )
Szybkość adsorpcji jest proporcjonalna do ciśnienia gazu i do ułamka
powierzchni nieobsadzonej [1, 2]:
(12)
Szybkość desorpcji jest proporcjonalna do ułamka powierzchni pokrytej
[1,2]:
(13)
Szybkość adsorpcji i desorpcji w stanie równowagi są sobie równe [2]:
(14)
Po prostych przekształceniach otrzymujemy związek między stopniem
pokrycia powierzchni, a ciśnieniem w postaci:
(15)
gdzie: - nazywany współczynnikiem adsorpcji [4, 13].
Uwzględniając definicję stopnia pokrycia :
Mateusz Niścior
100
(16)
lub oznaczając przez: a – liczbę moli substancji zaadsorbowanej przez
jednostkową masę adsorbentu i odpowiednio ,
otrzymujemy:
(17)
Powyższa zależność nosi nazwę izotermy Langmuira[1, 13].
Przebieg tej zależności a=f(p) przedstawia rys. 5:
Rys. 5. Adsorpcja wg teorii Langmuira, powierzchnia pokryta warstwą adsorbatu: a)
schemat b) izoterma adsorpcji [9].
Można spostrzec, że adsorpcja związków powierzchniowo czynnych
przebiega zgodnie z izotermą Langmuira [9].
Dla małych ciśnień p wyraz bp jest dużo mniejszy od jedności i można
go (w mianowniku) pominąć, wówczas a=bp. Odpowiada to odcinkowi
OR na wykresie, czyli takiego etapowi adsorpcji, w którym cała
powierzchnia adsorbentu jest zajęta cząsteczkami adsorbowanymi.W miarę
wzrostu ciśnienia p ilość adsorbowanej substancji na powierzchni wzrasta
coraz wolniej i w końcu przestaje wzrastać. Równowaga adsorpcyjna
normuje się i dalszy wzrost ciśnienia nie zmienia ilości zaadsorbowanej
substancji – odcinek Rμ [2].
Przy dużych wartościach ciśnienia p wyraz . W mianowniku
możemy pominąć 1, wówczas otrzymujemy [1,14]:
(18)
Krzywa adsorpcji w stosunku do osi p jest w tym przypadku
równoległa.
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
101
Stałe ami b w równaniu Langmuira można wyznaczyć w prosty sposób
z danych doświadczalnych, wystarczy przekształcić równanie do postaci
[4,14]:
(19)
Kreśląc zależność , otrzymujemy linię prostą o nachyleniu
, przecinającą oś rzędnych w punkcie. Znając am, można obliczyć liczbę
centrów aktywnych na powierzchni 1g adsorbentu [14].
5.6. Równanie adsorpcji BET
Izoterma Langmuira służy do opisu wielu przypadków adsorpcji
fizycznej. W tego typu adsorpcji następuje,jednak często tworzenie wielu
warstw molekularnych. Spowodowane jest to tym, że, ten sam rodzaj sił,
odpowiedzialnych za adsorpcję fizyczna pierwszej warstwy adsorbatu,
oddziałuje również pomiędzy nią a dalszymi cząsteczkami, zbliżającymi się
do powierzchni adsorbentu [13].
Ilość substancji zaadsorbowanej przez jednostkową masę adsorbentu
opisuje równanie, które wyprowadzili S. Brunauer, H. Emmett, J. Teller
(1938r), jako funkcję ciśnienia gazu. Równanie to znane jest pod nazwą
BET [1].
Równanie BET ma postać:
(20)
gdzie:
a, am, p – mają znaczenie identyczne jak w równaniu Langumira,
p0 –
jest prężnością pary nasyconej adsorbatu,
C – jest pewną funkcją temperatury, określoną przez różnicę między
ciepłem adsorpcji w pierwszej monomolekularnej warstwie i ciepłem
skraplania. [14].
Równanie (20) jest izotermąwielomolekularnej adsorpcji pary Brunauera,
Emmetta i Tallera. Równanie BET wypełniło lukę w interpretacji izoterm
adsorpcji. Przyjęte ono zostało, jako ogólna metoda wyznaczania
powierzchni właściwej adsorbentów na podstawie danychdotyczących
adsorpcji. Równanie to można, bowiem przedstawić w postaci liniowej:
(21)
Mateusz Niścior
102
i wówczas przedstawiając izotermę adsorpcji w układzie współrzędnych
vs. można nm i c wyznaczyć z nachylenia prostej i punku
przecięcia jej z osia rzędnych. Mianowicie zaś odcinek
. Znając wartość nm można przy pomocy powyższego równania
obliczyć powierzchnie właściwą danego adsorbentu. Podstawowy pomiar
powierzchni właściwej adsorbentów metodą BET sprowadzi sie przy
pomocy niskotemperaturowej (-195ºC) izotermy adsorpcji azotu
przyjmując [2,14].
Szczególnie typowe odchylenie dopasowania krzywej teoretycznej do
danych doświadczalnych polega na tym, że równanie BET zakłada zbyt
małą adsorpcjępod niskimi ciśnieniami i zbyt dużąpod wysokimi [13, 14].
Typowy wykres izotermy BET przedstawiony jest na rys. 6:
Rys. 6. Izotermy adsorpcji typu BET [14].
Na wykresie zaznaczono punkt przegięcia krzywej. Położenie tego
punktu szacunkowo określa wartość am na podstawie, której obliczono
powierzchnię właściwą adsorbentu.
W przypadku, gdy i ciśnienie gazu zaadsorbowanego jest
znacznie mniejsze od prężności pary nasyconej, równanie BET przechodzi
w równanie Langmuira [7].
6. Równanie Kelvina
6.1. Kondensacja kapilarna
W przypadku porowatych adsorbent6w na powierzchni kapilar,
zwyjątkiem miejsc ich silnego zwężenia, adsorpcja w obszarze małych
wartości p/p0, zachodzi podobnie jak adsorpcja na adsorbentach
nieporowatych. Na ścianach szerokich kapilar w obszarze podwyższonego
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
103
ciśnienia paryadsorpcja jest wielowarstwowa. Ciepło adsorpcji przy
tworzeniu siętakich warstw jest bliskie ciepłu kondensacji. Z tego powodu
własności adsorbatu w tym przypadku są podobne do własności cieczy.[9].
Kondensacją tego typu nazywamy zjawisko wcześniejszej kondensacji
adsorbatu w porach, za nim zostanie osiągnięte ciśnienie pary nasyconej po
nad płaską powierzchnią [9].
Zjawisko kondensacji kapilarnej wynika stąd, że adsorpcyjne warstwy
adsorbatu, zgromadzone na ścianach kapilar porowatego adsorbentu mają
wklęsłą powierzchnię i ciśnienie pary nasyconej nad nimi jest niższe niż
nad równą powierzchnią. Z tej przyczyny kondensacja pary na tych
zakrzywionych warstwach zachodzi przy mniejszych ciśnieniach niż
wynosi ciśnienie pary nasycone adsorbowanej substancji [9].
Przypadki kondensacji kapilarnej i kapilarnego odparowania, biegnące
w porach adsorbentów wykorzystuje się do ilościowego opisu rozkładu
objętości i powierzchniporów według ich wielkości [2, 9]
W sytuacji cieczy znajdującej się w cylindrycznej kapilarze istnieje
pewna zależność pomiędzy promieniami kapilary rk, a krzywizny menisku
cieczy rl (rys.7):
Rys. 7. Zależność pomiędzy promieniami kapilary rk, a krzywizny menisku cieczy rl [4].
𝑟𝑘 = 𝑟𝑙𝑐𝑜𝑠𝜑 (22)
gdzie: jest kątem zwilżania ścianek porów ciekłym adsorbatem [4].
Zależność między prężnością pary nasyconej p nad powierzchnią
zakrzywioną o promieniu krzywizny rl i prężnością pary nasyconej p0 nad
płask powierzchnią cieczy opisuje równanie Kelvina:
𝑙𝑛𝑝
𝑝0= −
2𝜎∗𝑉𝑚𝑜𝑙
𝑟𝑙∗𝑅𝑇 (23)
gdzie:
p – prężnością pary nasyconej nad zakrzywionym meniskiem cieczy
po – prężnością pary nasyconej nad płaską powierzchnią cieczy
Vmol – objętość molowa ciekłego adsorbatu
Mateusz Niścior
104
rl – promień krzywizny menisku cieczy
R – stała gazowa
T – temperatura bezwzględna [8]
Po podstawieniu równania (22) do wyrażenia (23) otrzymamy równanie
opisujące zależność prężności pary nasyconej od promienia kapilary [2]:
(24)
W sytuacji, gdy ciecz silniej zwilża ściany kapilar kąt = 0 i wówczas
cos= 1. W takim przypadku promień kapilary jest praktycznie równy
promieniowi krzywizny menisku cieczy [4].
Danemu ciśnieniu względnemu p/po odpowiada, więc ściśle określona
wartość szerokości kelvinowskich dk [9].
Ponieważ najpierw następuje proces adsorpcji, a dopiero potem proces
kondensacji kapilarnej, wobec tego skroplona para adsorbatu nie zwilża
bezpośrednio ścianek kapilar, ale znajdujące się już na nich warstwy
zaadsorbowane. Z uwagi na obecnośćwielowarstwowego filmu pomierzch-
niowego w obszarze występowania kondensacji kapilarnej, szerokości
kelvinowskie dknie sąszerokościami porów, tylko wolnych przestrzeni,
zawartych między warstewkami adsorpcyjnymi, pozostając na ściankach
porów opróżnionych z ciekłego adsorbatu podczas desorpcji, przy
określonym ciśnieniu względnym p/po. Szerokości tych porów dpsą, więc
większe od ich szerokości kelvinowskich dko grubośćwarstwy adsorpcyjnej
l [1, 4]:
(25)
Grubość warstwy adsorpcyjnej l, będąca funkcją ciśnienia względnego
p/po, może być określona z izotermy adsorpcji par danego adsorbatu na
adsorbencie nieporowatym, o podobnymcharakterze chemicznym, co
badany adsorbent i o znanej wielkości powierzchni właściwej - adsorbent
standardowy. Dla węglowych substancji takim adsorbentem standardowym
jestgrafityzowana nieporowata sadza [2, 4, 9].
Na każdym n-tym etapie desorpcji zachodzi wyparowanie ciekłego
adsorbatu z porów, których efektywne szerokości mieszcząsię w przedziale
wielkości odpowiadających temu etapowi. Równolegle z procesem
wyparowywania skondensowanego adsorbatu z porów o szerokościach
odpowiadających temu etapowi, maleje również grubość warstwy
adsorpcyjnej w porach już opróżnionych na wszystkich dotychczasowych
etapach z n-tym włącznie [2].
Objętość adsorbatu V, która desorbowała na n-tym etapie przy
określonym ciśnieniu względnemu p/po, określamy na podstawie
otrzymanej doświadczalnie izotermy sorpcji danego adsorbatu na badanym
adsorbencie uwzględniając poprawkę na zmianę grubości warstwy
adsorpcyjnej w porach jużopróżnionych (wyznaczoną z izotermy adsorpcji
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
105
par danego adsorbatu na adsorbencie standardowym). Pamiętając, że
określonemu ciśnieniu względnemu p/po odpowiada ściśle określona
wartość szerokości kelvinowskich dk, którą możemy obliczyćz równania
Kelvina przy założeniu odpowiedniego kształtu porów oraz znając grubość
warstwy adsorpcyjnej przy danym p/powyznaczamy rozkład objętości
i powierzchni mezoporów względem ich średnicy [1, 2].
Teoria objętościowego wypełniania mikroporów
Podstawowe rozróżnienie zjawisk adsorpcyjnych przebiegających
w mikroporach i na powierzchni porów przejściowych (mezoporów) lub
adsorbentów nieporowatych wymaga różnych ujęć teoretycznych przy ich
opisie i interpretacji. Wszystkie rozpatrywane powyżej teorie adsorpcji
fizycznej, niezależnie od ich pozornychróżnic, wychodzą z tego samego
wzorca fizycznego. Wzorzec ten sprowadza się do pojęcia geometrycznej
powierzchni rozdziału faz, na której występuje adsorpcja z wytworzeniem
jednej lub kilku kolejnych warstw adsorpcyjnych [5, 15]
Wyobrażenie o mikroporach, jako o obszarach przestrzeni w ciele
stałym, współmiernych rozmiarami z cząsteczkami adsorbowanymi,
pozwala wnioskować, że przy dowolnym charakterze oddziaływań
adsorpcyjnych (pod wpływem sił dyspersyjnych, elektrostatycznych i in.),
warunkujących adsorpcję fizyczną w całym obszarze mikroporów,
występuje pole adsorpcyjne wytwarzane przez ciało stałe. Ograniczona
przestrzeń adsorpcyjna mikroporów uwarunkowuje fakt, że następne
adsorbujące się w mikroporach cząsteczki nie tworzą warstw
adsorpcyjnych. W mikroporach adsorpcja charakteryzuje się objętościowym
wypełnieniem przestrzeni adsorpcyjnej, z tej racji podstawowym
parametrem geometrycznym charakteryzującym adsorbent mikroporowaty
jest objętość mikroporów, a nie ich „powierzchnia” [5].
Teorię dobrze opisującą przebieg izoterm adsorpcji uzyskanych
w układach:mikroporowate sorbenty węglowe – pary dobrze adsorbujących
się na nich substancji jest, opracowana przez Dubinina i współpracowników,
teoria objętościowego wypełniania mikroporów – umożliwia ona ilościową
charakterystykę zjawisk zachodzących w najdrobniejszych porach [3, 9].
6.2. Równanie Dubinina-Raduszkiewicza
Podstawowe równanie teorii objętościowego wypełniania mikroporów,
znane, jako równanie Dubinina-Raduszkiewicza, ma ogólną postać:
(26)
gdzie:
V – ob.jętość przestrzeni adsorpcyjnej zajęta przez adsorbat
w temperaturze pomiaru T i przy ciśnieniu względnym [p/po, cm3/g]
Vo – graniczna objętość przestrzeni adsorpcyjnej [cm3/g]
Mateusz Niścior
106
A – różniczkowa molowa praca adsorpcji [kJ/mol]
- współczynnik określający adsorbat;
Eo – charakterystyczna energia adsorpcji dla adsorbatu standardowego
[kJ/mol] [5,9].
Różniczkowa molowa praca adsorpcji A opisywana, jako zmiana
swobodnej energii adsorpcji Gibbsa (potencjał termodynamiczny):
𝐴 = −∆𝐺 = 𝑅𝑇𝑙𝑛𝑝
𝑝0 (27)
gdzie:
po – ciś. pary nasyconej adsorbowanej substancji w temperaturze T [mm
Hg]
p – ciśnienie tej pary w warunkach równowagi adsorpcyjnej, [mmHg]
R – stała gazowa, kJ/(mol K)
T – temperatura, [K][9].
Iloczyn Eo jest równy E, gdzie E jest charakterystyczną energią adsorpcji
dla adsorbatu właśnie stosowanego (parametr charakteryzujący adsorbent).
Współczynnik , charakteryzujący adsorbat, można w przybliżeniu obliczyć,
jako:
𝛽 =𝑃
𝑃0=
𝛼
𝛼0=
𝑉𝑚𝑜𝑙
𝑉𝑚𝑜𝑙 0
(28)
gdzie: P, , Vmol oznaczają kolejno parachorę, polaryzowalność
i objętość molową adsorbatu użytego w procesie adsorpcji, natomiast P0
,a0,Vmol 0– oznaczają te same wielkości odnoszące się do adsorbatu
przyjętego, jako standard (najczęściej benzen) [7, 13].
Podstawiając do równania (26) zależność (27) na różniczkową molową
pracę adsorpcji A otrzymujemy [12,14]:
𝑉 = 𝑉0 ∗ 𝑒−
𝑅𝑇𝑙𝑛𝑝0𝑝
𝛽𝐸0
(29)
6.3. Metoda wyznaczania objętości mikroporów z danych
izoterm adsorpcji
Zlogarytmowanie wzoru (29) daje nam równanie Dubinina–
Rduszkiewicza w postaci liniowej:
(30)
Przedstawiając izotermę adsorpcji w układzie współrzędnych lnV od
otrzymamy prostą, a z niej wartości Vo oraz E, które zgodnie
z teorią Dubinina objętościowego wypełniania mikroporów, oznaczają
kolejno: objętość mikroporów oraz charakterystyczną energię adsorpcji
(rys. 8) [4, 9].
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
107
Rys. 8. Wyznaczanie parametrów równania Dubinina-Raduszkiewicza [9].
7. Podsumowanie
W niniejszym opracowaniu przedstawiono charakterystykę procesu
adsorpcji, podstawową klasyfikację adsorbentów wraz z metodami ich
syntezy oraz opisano podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji.
Proces adsorpcji to niezwykłe zjawisko, a jego odkrycie pozwoliło na
dalszy rozwój nauki i techniki. Na całym świecie istnieją ośrodki naukowe
zajmujące sie badaniem tego procesu oraz możliwym wykorzystaniem go
w życiu codziennym. Naukowcy prześcigają się w produkcji, co raz to
nowszych adsorbentów o jeszcze lepszych właściwościach.
To właśnie za sprawą swoich wyjątkowych właściwości takim jak
m.in. duża objętość porów, duża powierzchnia właściwa, uniwersalność
syntezy, stabilność chemiczna, łatwość modyfikacji – adsorbenty znalazły
szereg istotnych zastosowań w życiu codziennym, które postaram się
przedstawić w następnym artykule.
Podziękowania
Chciałbym szczególnie podziękować Panu Profesorowi Jackowi
Goworkowi za wsparcie merytoryczne w opracowaniu niniejszego
artykułu.
Mateusz Niścior
108
Literatura
1. Natkański P.,2010: Procesy sorpcyjne. Zakład Technologii Chemicznej,
Uniwersytet Jagielloński, Kraków
2. Ościk J., 1983: Adsorpcja, PWN,Warszawa
3. Dubinin M. M., Quart.,1959: Rev., 9, 101; 1960: Chem. Rev., 60, 235
4. Sarbak Z., 2000: Adsorpcja i adsorbenty – Teoria i zastosowanie,
Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań
5. Barczak M., Dąbrowski A., 2008:Wiad. Chem.,62
6. Jaroszewska-Manaj J, Metody identyfikacji związków
organicznych.chem.uw.edu.pl [Dostęp 23.07.14]. Dostępny w Internecie:
7. Atkins P.W., 2001: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa
8. Praca zbiorowa (red. Janusz Ryczkowski ) 2012: Adsorbenty i katalizatory.
Wybrane Technologie a Środowisko. Uniwersytet Rzeszowski, Rzeszów
9. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska.
nw.pwr.wroc.pl [Dostęp 27.07.14]. Dostępny w Internecie:
http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_i_ad
sorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_4).pdf
10. Redlich O,. Paterson D.L.O., 1959: J. Phys. Chem.,63, 1024
11. PigońK, Z. Ruziewicz, 2005: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa
12. DutkiewiczE.T.,1998: Fizykochemia powierzchni, WNT, Warszawa
13. AGH im. Stanisława Staszica w Krakowie, Adsorpcja,
home.agh.edu.pl[Dostęp 05.07.14]. Dostępny w Internecie:
home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc
14. Snyder R.L., 1964: J. Chromatogr.,16, 55
15. Kokotailo G.T., Lawton S.L., Olson D.H., Meier W.M., 1978:Nature.272, 437
,
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
109
Zjawisko adsorpcji na ciałach stałych
Streszczenie W niniejszym opracowaniu zarysowano charakterystykę procesu adsorpcji – jednego
z podstawowych zjawisk powierzchniowych, występujący na granicy zetknięcia się dwóch
faz. Proces ten polega na zmianie stężenia substancji na powierzchni właściwej. Zmiana
stężenia na granicy faz może być procesem fizycznym przebiegającym dzięki ogólnie siłom van der Waalsa lub też może być spowodowana procesem chemicznym z tworzeniem
związków chemicznych.
Przedstawiono również charakterystykę struktury porowatych ciał stałych określanych
wspólnym mianem adsorbentów, na powierzchni, których zachodzi zjawisko adsorpcji. Opisano także ich podstawową klasyfikację wraz z metodami syntezy.
Opisano również podstawowe modele i równania izoterm adsorpcji. Spośród wielu modeli
teoretycznych opisujących równowagę adsorpcji wymieniono najbardziej znane takie jak:
równanie Gibbsa, Henry’ego, BET, Freundlicha czy Langmuira. Wyjaśniono zjawisko
kondensacji kapilarnej oraz teorię objętościowego wypełniania mikroporów.
Proces adsorpcji to niezwykłe zjawisko, a jego odkrycie pozwoliło na dalszy rozwój nauki
i techniki. Na całym świecie istnieją ośrodki naukowe zajmujące się badaniem tego procesu
oraz możliwym wykorzystaniem go w życiu codziennym. Naukowcy prześcigają się w produkcji co raz to nowszych adsorbentów o jeszcze lepszych właściwościach.
To właśnie za sprawą wyjątkowych właściwości takich jak m.in. duża objętość porów, duża
powierzchnia właściwą, uniwersalność syntezy, stabilność chemiczna, łatwość modyfikacji,
znalazły szereg istotnych zastosowań w życiu codziennym, które postaram się przedstawić w następnym artykule.
Słowa kluczowe: adsorpcja, adsorbenty, powierzchnia właściwa, równania adsorpcji,
metody otrzymywania.
The phenomenon of adsorption on the solids
Abstract In this paper outlines the characteristics of the adsorption process - one of the fundamental surface
phenomena, occurring at the interface of the two phases. This process involves changing the
concentration of the specific surface area. The change in concentration at the interface of a
physical process can be generally extending through van der Waals forces, or may be due to a chemical process with the formation of chemical compounds.
It also presents the structural characteristics of porous solids referred to collectively as adsorbents,
which occurs on the surface adsorption phenomenon. Also described is the primary classification,
together with synthetic methods. Also describes the basic models and equations of adsorption isotherms. Among the many
theoretical models describing adsorption equilibrium lists the best-known such as Gibbs, Henry,
BET, Freundlich and Langmuir. Clarified the phenomenon of capillary condensation and the
theory of volume filling of micropores. The adsorption process is an extraordinary phenomenon, and its discovery led to further
development of science and technology. All over the world there are research centers involved in
the study of this process and the possible use of it in everyday life. Scientists are trying to make
the production what it once newer adsorbents with even better properties. This is due to unique properties such as, but large pore volume, high surface area proper, versatile
synthesis, chemical stability, ease of modification, were a number of important applications in
everyday life, which will try to explain in the next article.
Keywords: adsorption, adsorbents, surface area, adsorption equation, the method of preparation.
110
Mateusz Niścior1
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
1. Wstęp
Na dzień dzisiejszy znamy bardzo wiele adsorbentów o różnym
charakterze chemicznym i różnej strukturze geometrycznej powierzchni.
W niniejszej pracy chciałbym przedstawić jedynie niektóre podstawowe
zagadnienia dotyczące struktury, metod otrzymywania i zastosowania
adsorbentów, a właściwie opiszę najważniejsze z nich i najczęściej
stosowane.
2. Materiały porowate
Materiały porowate według IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry) to ciała stałe posiadające pory, jamy, kanały lub
szczeliny, których głębokość jest większa niż szerokość [1]. Należące do
tej grupy zeolity, węgle aktywne, żele krzemionkowe czy stosunkowo
niedawno odkryte uporządkowane materiały mezoporowate skupiają na
sobie uwagę ze względu na potencjalne wykorzystanie ich np. w adsorpcji,
katalizie i nanotechnologii. Ze względu na właściwości sorpcyjne materiały
te wykorzystywane są do rozdzielania mieszanin ciekłych i gazowych,
usuwania zanieczyszczeń z gleby i wody oraz wielu innych procesach.
3. Charakterystyka podstawowych grup adsorbentów
3.1. Żele krzemionkowe
Żele krzemionkowe stanowią jedną z podstawowych grup adsorbentów
stosowanych komercyjnie. Jest to ciało stałe o ogólnym wzorze xSiO2
x yH2O występujące w licznych formach bezpostaciowych. Cząstki żelu
krzemionkowego zbudowane są z tetraedrów SiO4 ułożonych w postaci
przestrzennej nieuporządkowanej sieci [2].
1 [email protected], UMCS, Wydział Biologii I Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii,
http://www.binoz-programy.umcs.lublin.pl
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
111
Rys. 1 Układ tetraedrów SiO4 w krystalicznym (a) i amorficznym szklistym
(b) żelu krzemionkowym [2]
Porowate żele krzemionkowe otrzymuje się według poniższych metod:
polikondensacji kwasu ortokrzemowego – jest to podstawowa
i najczęstsza metoda syntezy żelu krzemionkowego, w wyniku której
początkowo powstają łańcuchy krzemowo-tlenowe, a następnie
poprzez wzrost łańcucha oraz liczne rozgałęzienia tworzy się hydrożel,
stosunek SiO2 do H2O nie jest stały i zależy przede wszystkim od
warunków syntezy żelu;
agregacja cząstek koloidalnej krzemionki - reakcja kwasu siarkowego
z krzemianem sodu, następnie poddanie otrzymanej mieszaniny
koagulacji dzięki siłom Van der Waalsa oraz usunięciu powstałego
siarczanu sodu; proces ten można regulować dodając do układu
koagulantu. [3, 4].
Odpowiednio dobierając parametry syntezy jak m.in. stężenie
krzemionki, temperatury czy pH możemy regulować właściwości
końcowego materiału (np. objętość porów, powierzchnię właściwą).
Żele krzemionkowe w zależności od rozmiarów porów dzielą się na trzy
grupy:
wąsko-porowate żele krzemionkowe – posiadają powierzchnia
właściwą rzędu 600 m2/g, objętość porów ok. 0,7 cm
3/g, średnica
porów poniżej 2 nm;
średnio-porowate żele krzemionkowe – ich powierzchnia właściwa
wynosi od 550 do 650 m2/g, objętość porów ok. 1 cm
3/g, średnica porów
2-50 nm;
szeroko-porowate żele krzemionkowe – powierzchnia wewnętrzna od
250 do 270 m2/g, objętość porów ok. 0,7 cm
3/g, średnica porów powyżej
50 nm. [5].
Ze względu na silne powinowactwo z wodą, a także dużą pojemność
adsorpcyjną żele krzemionkowe znalazły zastosowanie przede wszystkim
do osuszania gazów przemysłowych, powietrza, freonów, różnych
produktów (pochłaniacze pary wodnej, oparów w kuchniach domowych,
Mateusz Niścior
112
gazów w ekstraktorach). W przemyśle petrochemicznym stosuje się je do
oddzielania węglowodorów alifatycznych od aromatycznych w lżejszych
frakcjach ropy naftowej, chromatograficznego rozdziału substancji
organicznych, pochłaniania tlenków siarki i azotu [4].
3.2. Uporządkowane mezoporowate materiały krzemionkowe (OMS)
Mezoporowate adsorbenty krzemionkowe stanowią szeroką grupę
nieorganicznych uporządkowanych materiałów porowatych. Otrzymanie
jednorodnej i uporządkowanej porowatej struktury o charakterze
mezoporów jest o wiele trudniejsze niż w przypadku innych adsorbentów.
Dzięki takim właściwościom jak wysoki stopień uporządkowania oraz
możliwość modyfikacji powierzchni materiały te są idealne w roli
adsorbentów. Ponadto materiały te wykazują wysoką odporność
hydrotermalną oraz uniwersalność syntezy, co spowodowało duże
zainteresowanie tymi materiałami [6]
W latach 90-tych XX wieku, firma Mobil wytworzyła materiały zwane
M41S. Ogromną zaletą syntezy tych związków była możliwość regulacji
wielkości porów, gęstości rozmieszczenia centrów aktywnych na
powierzchni oraz składu chemicznego. Tradycyjne zeolity nie miały takiej
zalety. Szczególne znaczenie dla przemysłu paliwowego było otrzymanie
adsorbentów dla związków wielkocząsteczkowych [6]
Materiały krzemionkowe MCM-41 (MCM – Mobil Composition
of Matter) stanowią grupę związków z rodziny M41S – są to pierwsze
zsyntetyzowane materiały mezoporowate o uporządkowanej strukturze.
Charakteryzują się heksagonalnym ułożeniem cylindrycznych porów
o wąskiej średnicy oraz dużą powierzchnią wewnętrzną. Cechą różniącą je
od typowych zeolitów jest wielkość porów, dzięki której są cenne, jako
adsorbenty dla cząstek o dużych rozmiarach. Ściany materiałów MCM-41
są amorficzne, pomimo to mają one budowę krystaliczną ze względu na ich
uporządkowaną i powtarzającą się strukturę [6]
Mezoporowate materiały krzemionkowe MCM-48 posiadają regularną
trójwymiarową strukturę. Syntetyzowane są przy wysokim stosunku
krzem/surfaktant (0,65-1,5) i w obecności innych związków organicznych
np. etanolu, metanolu. Źródłem krzemu jest tetraetoksysilan (TEOS) [6]
Materiały M41S z powodu dużych rozmiarów porów przykuły uwagę
wielu badaczy. Mimo to rozmiary te nadal miały pewne ograniczenia ze
względu na cienkie ściany, które były termicznie niestabilne. Dlatego też,
w 1998 roku, otrzymano nowe związki nazywane SBA. Najlepiej
zbadanym adsorbentem z tej grupy jest SBA-15 o heksagonalnej symetrii,
hydrotermiczny, różniący się od MCM-41 budową: grubością ścian,
średnicą porów, stabilnością [4, 6]
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
113
Powierzchnia właściwa SBA-15 wyznaczona doświadczalnie jest
pięciokrotnie większa niż obliczona teoretycznie. Wynika z tego, że
w budowie SBA-15 oprócz heksagonalnych mezoporów, znajdują się
w całej objętości materiału również pory o mniejszych rozmiarach,
stanowiące ponad ¾ jego powierzchni właściwej, Te mikropory są
zlokalizowane w dużej części w ścianach SBA-15 [6]
Grubsze ściany krzemionkowe to cecha odróżniająca SBA-15 od materiału
MCM-41, posiadającego znacznie cieńsze ściany. Rozmiar porów oraz
grubość ścian mogą być dopasowywane po przez zmiany temperatury
ogrzewania (35-140ºC) oraz czasu prowadzenia syntezy (11-72h) [7].
3.3. Aluminożele – tlenek glinowy
Tlenek glinowy (aktywowany tlenek glinu) – jest przedstawicielem
adsorbentów, których główny składnik stanowią różne typy tlenku glinu
(powyżej 90%) oraz zwierają również niewielkie ilości innych tlenków
(np. Na, Si, Fe,Ti). Otrzymywane są na drodze dehydratacji wodorotlenku
glinu [2].
Ze względu na zakres temperatur, w których otrzymuje się tlenek glinu,
aluminożele dzielą się na dwie główne grupy:
tlenki niskotemperaturowe, oznaczane jako γ-Al2O3, uzyskiwane są
w temperaturach do 600oC. Są to uwodnione tlenki zawierające
w cząsteczce 0-6 cząsteczek wody;
tlenki wysokotemperaturowe (δ- Al2O3) to bezwodny Al2O3,
otrzymywany w temperaturach z zakresu 900-1000oC [2].
Poza tą klasyfikacją występuje także α- Al2O3, otrzymywany powyżej
1200oC.
Aluminożele znalazły zastosowanie głównie do osuszania powietrza
z lotnych związków fluoru [8].
Najczęściej stosowaną, jako adsorbent strukturą tlenku glinu jest
γ-Al2O3 o powierzchni właściwej 100-200 m2/g. Według badań Lippensa
i Periego adsorbent ten ma budową podaną na rys. 2. Według tego modelu
powierzchnię tworzą jony tlenu O2-
oraz jony glinu Al3+
, przy czym tylko
¾ pozycji odpowiadających jonom glinu jest wypełnione, pozostałe zaś
tworzą tzw. defekty powierzchni [2].
Mateusz Niścior
114
Rys. 2 Model budowy powierzchni γ-Al2O3; 1- defekty powierzchniowe,
2- jony Al3+, 3- jony O2-[2]
3.4. Węgle aktywne
Węgle aktywne są najstarszymi adsorbentami szeroko stosowanymi
także obecnie. Otrzymywane są na drodze karbonizacji materiału
węglowego bez dostępu powietrza. W wyniku przeprowadzonej
karbonizacji otrzymuje się węgle aktywne o bardzo małej powierzchni
właściwej rzędu kilku m2/g. Aby zwiększyć porowatość takiego materiału,
poddaje się go aktywacji najczęściej dwutlenkiem węgla lub parą wodną
w temperaturach 700-1100oC [9].
Węgle aktywne należą do grupy ciał grafitowych. Kryształy węgli
aktywnych zbudowane są z nieregularnych ułożonych sześcioczłonowych
pierścieni węglowych. Rozmiary tych krystalitów osiągają wymiary
2,3x0,9 nm. Szkielet węgli aktywnych zbudowany jest z krystalitów
nieregularnie ze sobą powiązanych. W zależności od stopnia wzajemnego
ułożenia krystalitów tylko część wewnętrznej powierzchni węgli
aktywnych, osiągającej 2000 m2/g, dostępna jest dla adsorbujących się
cząsteczek. Z tego powodu powierzchnia właściwa węgli aktywnych,
określana przede wszystkim przez mikropory, zawiera się w przedziale od
400 do 900 m2/g [10, 11].
Powierzchnia węgli aktywnych jest bardzo niejednorodna
geometrycznie i chemicznie. Do sieci węglowych na krawędziach
pierścieni sześcioczłonowych przyłączone są różne grupy, wodór, związki
tlenowe itp. Zależy to od metody otrzymywania i obróbki węgla [11, 12].
Dubinin wyróżnił dwa krańcowe typy strukturalne ze względu na
złożoną strukturę porowatą węgli aktywnych:
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
115
I typ strukturalny – węgle zawierające przede wszystkim mikropory
o rozmiarach promieni 1-3 nm. (10-30Å).
II typ strukturalny – węgle zawierające zarówno mikropory, jak i pory
o promieniu większym niż 3 nm. [2].
Surowcami wyjściowymi do produkcji mogą być zarówno substancje
naturalne jak: węgle kopalne, materiały pochodzenia drzewnego, pestki
owoców; a także tworzywa syntetyczne: żywice syntetyczne (np. fenolowo-
formaldehydowe), włókna wiskozowe czy polimery i kopolimery chlorku
winylu czy akrylonitrylu. Dodatkowe informacje dotyczące tej grupy
adsorbentów zostały zawarte w rozdziale [9].
3.5. Zeolity
Bardzo ważną grupą adsorbentów porowatych są zeolity, zaliczane do
klasy tzw. sit molekularnych. Grupę tę stanowią krystaliczne
glinokrzemiany metali alkalicznych, metali dwuwartościowych lub ziem
alkalicznych składające się z przestrzennie ułożonych tetraedrów
(czworościanów) SiO4 i AlO4-. Czworościany glinowo tlenowe różnią się
od krzemowo tlenowych ładunkiem elektrycznym [13].
Tetraedry - podstawowe jednostki strukturalne zeolitów, łącząc się ze
sobą wspólnymi atomami tlenu, tworzą trójwymiarową strukturę, przy
czym:
8 tetraedrów tworzy sześcian;
12 tetraedrów tworzy piramidę heksagonalną;
24 tetraedry tworzą kubooktaedr [2‚4].
Część z atomów krzemu jest zwykle podstawiona atomami glinu
(o mniejszej wartościowości), w wyniku czego w strukturze generowany
jest ładunek ujemny. W wolnych przestrzeniach struktury zeolitu, prócz
cząsteczek wody, znajdują się kationy metali grup I i II, które kompensują
ten ładunek. Najczęściej spotykanymi kationami są: Na+, K
+, Ca
2+,
Mg2+
,Sr2+
i Ba2+
. Kationy te mają pewną swobodę poruszania się [2].
Skład chemiczny zeolitów przedstawia uproszczony wzór sumaryczny:
𝑀2 𝑛 𝑂 ∗ 𝐴𝑙2𝑂3 ∗ 𝑥𝑆𝑖𝑂2 ∗ 𝑦𝐻2𝑂
gdzie:
n – oznacza wartościowość kationu,
x i y – są liczbami charakterystycznymi dla danego zeolitu, [2,14].
Regularna struktura szkieletu sit molekularnych skutkuje
jednorodnością średnicy porów (od 0,3 do 1,1 nm.). Wolne przestrzenie
wewnątrz zeolitów tworzą systemy kanałów, wpływające na właściwości
Mateusz Niścior
116
sorpcyjne tej grupy materiałów. Wyróżnia się trzy typy kanałów, system
nieprzenikających kanałów o jednakowych rozmiarach; dwuwymiarowe
systemy kanałów oraz trójwymiarowy układ przecinających się kanałów [14].
Kubooktaedry zeolitów maja na swej powierzchni sześć pierścieni
czteroczłonowych o symetrii oktaedrycznej i osiem pierścieni sześciu-
członowych tworzących dwie grypy o symetrii tetraedrycznej [2].
Rys. 3 a) Model kubooktaedru; b) połączenie tetraedrów w kubooktaedr (kółka biało
oznaczają atomy tlenu, a kółka czarne atomy krzemu bądź glinu [2]
Najbardziej rozpowszechnionymi w praktycznym zastosowaniu
zeolitami są zeolity typu :
typu A (rys 4.a) charakteryzują się niską zawartością krzemu, przy
czym stosunek molowy SiO2 do Al2O3 jest bliski 2. Struktura komórki
elementarnej tego typu zeolitów składa się z 12 tetraedrów SiO4 oraz
12 tetraedrów AlO4 oraz odpowiedniej liczby kationów metali.
W szkielecie struktury zeolitu A każdy kubooktaedr połączony jest
z sześcioma sąsiednimi kubooktaedrami za pośrednictwem
czteroczłonowych pierścieni. Osiem połączonych w taki sposób
kubooktaedrów glinokrzemianowych zamyka pomiędzy sobą
sferyczną przestrzeń, do której w czasie procesu adsorpcji mogę
dostać się cząsteczki adsorbatu poprzez sieć prowadzących do niej
ośmioczłonowych okien [15, 16];
typu X i Y w przeciwieństwie do zeolitów typu A wykazują
zwiększoną odporność względem kwasów oraz odporność na
podwyższoną temperaturę. Zeolity te zbudowane są ze 192 tetraedrów,
przy czym podstawową jednostką strukturalną są kubooktaedry,
zbudowane z 24 tetraetrów SiO4 i AlO4. Moduł krzemowy waha się od
2,2 do 3 dla zeolitów typu X oraz od 3,1 do 6 dla typu Y [2, 14].
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
117
a) b)
Rys. 4. Zeolity typu: a) A, b) X [2]
Na rozmiar okien prowadzących do wnętrza przestrzeni w sieciach
krystalicznych zeolitów ma wpływ także ładunek i wymiary kationów
wchodzących w ich skład. Średnica okien w przypadku odmiany sodowej
zeolitu A (4A) wynosi ok. 0,42 nm., odmiany wapniowej (5A) ok. 0,48 nm.,
a odmiany potasowo-sodowej (3A) ok. 0,38 nm. W przypadku odmiany
sodowej zeolitu X (13X) średnica okien wynosi ok. 0,8-1 nm., natomiast
w przypadku odmiany wapniowej (10X) ok. 0,7 nm. Podobnie dla
wszystkich odmian zeolitu Y [2].
Klasyfikacja krystalograficzna znanych aktualnie zeolitów, zapro-
ponowana przez Meiera dzieli je na 7 grup. Zeolity typu A, X oraz
Y mieszczą się w tzw. grupie fojazytu [2,4]
Zeolity są minerałami występującymi w przyrodzie, jak i mogą być
otrzymywane syntetycznie. Syntetyczne zeolity stanowią znacznie większą
grupę materiałów (ponad 150). Zeolity pochodzenia naturalnego powstały
w wyniku wietrzenia skał wulkanicznych. Obecnie znanych jest około
40 grup [2,17].
Spotykanymi na terenie Polski przykładami zeolitów są:
klinoptylolit;
chabazyt;
filipsyt;
natrolit [4].
Ogólny schemat syntezy zeolitów ma następujący przebieg:
Otrzymanie żelu z wodnych roztworów glinianu i krzemianu sodu,
w stałym, wysokim pH (dodatek NaOH lub KOH);
Krystalizacja w autoklawie, przy niskim ciśnieniu pary wodnej,
w temperaturach z zakresu 25-175oC;
Sprasowanie kryształków z lepiszczem i uformowanie granulek [18].
Otrzymane w ten sposób zeolity poddaje się zwykle różnym
modyfikacjom, w celu poprawy ich właściwości sorpcyjnych.
Działanie sitowe zeolitów polega na tym, że cząsteczki różnych
adsorbatów, dzięki różnicy w wielkościach i strukturze, przedostają się lub
Mateusz Niścior
118
nie przez opisane okna do wewnętrznych obszarów sieci krystalicznej sit
molekularnych. Zatrzymywane są oczywiście tylko te cząsteczki adsorbatu,
które przechodzą do wnętrza zeolitów [2].
3.6. Szkła porowate
Szkła porowate są otrzymywane ze szkła sodowo – boro krzemowego
w wyniku obróbki termicznej i działania kwasami. Rozpuszczają się
wówczas tlenki Na2O i B2O3. Wiązania Si – O – Si w sieci krzemowo
tlenowej nie ulegają rozerwaniu i szkielet krzemionki stanowi podstawową
strukturę szkła porowatego. Struktura ta zależy od struktury szkła
wyjściowego oraz warunków jego termicznej obróbki. Zmiana składy szkła
wyjściowego i obróbka termiczna pozwalają otrzymać szkła porowate
o określonych wymiarach porów. Przez zmianę czasu trawienia roztworem
kwasu solnego można regulować głębokość porów szkła porowatego.
Średnie wymiary porów nie ulegają wówczas zmianie, W celu otrzymania
szerszych porów szkło otrzymane przez trawienie kwasem można
potraktować dodatkowo 0,5N roztworem KOH w ciągu 1-2 godzin w temp.
293K. Rozpuszcza się wówczas drobno zdyspergowana krzemionka
i zwiększa się ogólna objętość porów, maleje zaś wielkość powierzchni
właściwej szkła porowatego. Wymiary (szerokość) porów szkieł
porowatych mogą zawierać się w przedziale od kilku do kilki tysięcy Å [2].
4. Zastosowanie adsorbentów porowatych w procesie adsorpcji
W związku z ciągłym zaostrzaniem dopuszczalnych limitów emisji
zanieczyszczeń, przemysł został zmuszony do ulepszania technologii
pozwalających na usuwanie zanieczyszczeń z wody i gazów
poprodukcyjnych. Dwie główne stosowane do tego celu metody to
adsorpcja i rozdział za pomocą membran. Dzięki nim udaje się
z powodzeniem usuwać np. takie związki chemiczne, jak SO2, NOx oraz
lotne związki organiczne [6].
Zhao i wsp. dowiedli, że materiały MCM-41 zatrzymują lotne związki
organiczne, takie jak benzen, czterochlorek węgla czy n-heksan znacznie
lepiej niż dotychczas stosowane adsorbenty np. zeolity i węgle aktywne
[19]. Ueno i wsp. badali przydatność materiałów SBA-15 i SBA-16 do
adsorpcji benzenu, toluenu i ksylenu. Wyniki tych badań wskazują, że
wymienione materiały mają lepszą selektywność dla benzenu niż dla
toluenu i ksylenu [20]. W 2002 przedstawili konstrukcję mikrofluidalnego
urządzenia, które zawiera sproszkowany uporządkowany mezoporowaty
materiał krzemionkowy i ma służyć do wykrywania mieszaniny benzenu,
toluenu i o-ksylenu. Urządzenie to wykrywa benzen na poziomie już
ok. 100 ppb [21].
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
119
Mezoporowate materiały używane do oczyszczania wody z zanieczyszczeń
zarówno antropogenicznych, jak i naturalnych powinny spełniać kilka
głównych kryteriów. Wymagania stawiane przed takim materiałem to
przede wszystkim: sprawny rozdział, szybka kinetyka reakcji, wysoka
pojemność i selektywność oraz możliwość łatwej regeneracji.
Liu i wsp. zaprojektowali adsorbent dla rtęci wykorzystując metodę
posyntezowej funkcjonalizacji materiału MCM-41 grupami merkapto-
propylowymi [22]. Pojemność sorpcyjna tego materiału dla rtęci wynosiła
505 mg/g a oczyszczana przez niego woda spełniała wymagania stawiane
wodzie pitnej [23].
Metale toksyczne takie, jak arsen i chrom tworzą w wodach gruntowych
i ściekach przemysłowych aniony tlenkowe. Liu i wsp. opracowali selektywny
adsorbent dla tych jonów otrzymywany na drodze posyntezowej
funkcjonalizacji nanoporowatej krzemionki N-(2-etyloamino)-3-
propyloamino-trimetoksysilanem i traktowaniu otrzymanego produktu
roztworami soli Cu(II). Adsorbent ten jest selektywny dla chromianów
i arsenianów nawet w obecności konkurencyjnych anionów siarczanowych.
Niestety w warunkach kwasowych, jakie panują w wodach, w których
odnotowano zanieczyszczenia wymienionymi anionami tlenowymi,
etylenodiaminowe grupy funkcyjne ulegają protonacji i w związku z tym
mogą uwalniać toksyczne jony Cu2+. Yoshitake i wsp. zsyntetyzowali
sorbent dla anionów tlenowych poprzez funkcjonalizację materiałów z grup
SBA i MCM grupami aminowymi [6]
Przydatność tego adsorbenta była oceniana w warunkach kwasowych,
a protonowane aminy wykazały sprawną adsorpcję chromianów
i arsenianów bez ryzyka powstania
5. Adsorpcja zmiennociśnieniowa (PSA)
Adsorpcja zmiennociśnieniowa (PSA) jest techniką rozdzielania
i oczyszczania gazów [24]. Istnieje obecnie kilka technologii opartych na
podobnych zasadach selektywnej sorpcji wybranych związków. Na bazie
technologii PSA opracowano wiele zbieżnych procesów, stosowanych do
separacji różnych gazów. Należą do nich TSA (adsorpcja zmienno-
temperaturowa), VSA (adsorpcja zmiennociśnieniowa, pod niskimi
ciśnieniami), VPSA i TPSA (hybrydy powyższych metod) [13, 25].
Najistotniejsze procesy przemysłowe dokonywane przy jej użyciu to:
Osuszanie gazów;
Odzysk rozpuszczalników: benzyny, benzenu, toluenu, ksylenów,
acetonu, niższych alkoholi, eterów, estrów, węglowodorów
parafinowych, chlorowcopochodnych węglowodorów;
Frakcjonowanie powietrza: na tlen, azot i inne;
Mateusz Niścior
120
Produkcja i separacja wodoru z gazów procesowych (np. reforming
metanu, przemysł rafineryjny);
Separacja metanu i ditlenku węgla z gazów wysypiskowych;
Rozdział propanu i butanu z gazu ziemnego;
Separacja izoparafin;
Odwodnianie alkoholu, [3, 26-27].
5.1. Rozdzielanie analityczne substancji organicznych metodą
chromatograficzną
Chromatografia adsorpcyjna – podstawą rozdziału jest niejednakowa
skłonność składników mieszaniny do adsorpcji fizycznej i chemicznej na
powierzchni fazy stacjonarnej (ciało stałe). Jako fazę stacjonarną stosuje się
np. żel krzemionkowy, węgiel aktywny, tlenki, siarczany i fosforany
wapnia. Fazę ruchomą stanowią ciecze bądź gazy [11, 24].
Adsorbenty stosowane w chromatografii adsorpcyjnej powinny
charakteryzować się szczególnie rozwiniętą powierzchnią, bowiem
substancja adsorbowana wiąże się z nią pod postacią warstewki
monomolekularnej. Tego typu właściwości wykazują szczególnie tlenek
glinu i węgiel aktywny [24].
Zastosowanie tlenku glinowego jako adsorbenta z reguły ogranicza się
do związków o niezbyt wielkiej polarności. Związki silnie polarne (cukry,
aminokwasy), związane z Al2O3, niełatwo ulegają elucji [2].
Węgiel aktywny szczególne wykazuje powinowactwo do związków
aromatycznych; ich elucja może być przeprowadzona przy użyciu
rozpuszczalników o budowie aromatycznej [6].
Zdolność adsorpcyjna związków organicznych zależy więc od ich
polarności oraz wielkości i polaryzowalności cząsteczek. Konkretne grupy
związków można ułożyć w niżej przytoczony szereg, w zależności od ich
wzrastającego powinowactwa do polarnych środków adsorbujących:
chlorowcopochodne węglowodorów < etery < aminy trzeciorzędowe,
związki nitrowe < estry < ketony, aldehydy < aminy pierwszorzędowe
< amidy kwasowe < kwasy karboksylowe [24].
Podobne obserwacje odnoszą się do stosowanych rozpuszczalników.
Wynika z nich, że zaadsorbowana substancja może zostać wyparta
z adsorbenta przez rozpuszczalnik wykazujący większe powinowactwo do
tego adsorbenta niż wymywana substancja [2, 3].
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
121
5.2. Osuszanie powietrza przy wykorzystaniu adsorbentów
Osuszanie powietrza polega na zmniejszaniu zawartości wilgoci
w powietrzu.
Wymagane cechy adsorbentów:
znaczna intensywność pochłaniania wilgoci z powietrza;
stałe własności chemiczne i mechaniczne w procesie osuszania
i regeneracji;
możliwość łatwej i niezbyt kosztownej regeneracji;
brak własności toksycznych, korozyjnych, przykrego zapachu;
niska cena [28].
Osuszanie przez uzdatnianie powietrza wentylacyjnego:
hale basenów i pływalni: dla zapobieżenia skraplaniu wody na
ścianach, a tym samym rozwojowi grzybów i pleśni;
hale lodowisk: dla usuwania usuwanie wilgoci znad tafli lodu w celu
zapobieżenia zamgleniu i narastaniu lodu na powierzchni tafli;
kuchnie, łazienki, jadalnie, szatnie: dla obniżenie ilości pary wodnej,
usunięcia przykrych zapachów;
pralnie, suszarnie: dla obniżenia poziomu zawilgocenia, skrócenia
czasu suszenia i poprawienia komfortu pracy [28].
Osuszenie powietrza w pomieszczeniu:
biblioteki, galerie, muzea, archiwa - przechowywane obiekty są
podatne na oddziaływanie wilgoci, utrzymanie wilgotności
względnej φ<55%;
przechowywanie materiałów higroskopijnych, wrażliwy na zbrylanie
i pleśnienie;
niektóre procesy produkcyjne (przemysł spożywczy - przy produkcji
suchego makaronu, suszenie drewna, φ <15%;
ochrona maszyn i urządzeń podatnych na korozję (np. w stacjach
pomp, przepompowniach, φ 5-35%. [28].
Adsorpcyjne środki suszące:
Żel krzemionkowy nasączony chlorkiem kobaltu zwany jest
niebieskim żelem – chlorek kobaltu po nasączeniu wodą zmienia
barwę z jaskrawo niebieskiej na czerwoną. Ta zmiana następuje przy
ściśle określonej zawartości wody w żelu, dzięki czemu można
uchwycić moment nasycenia środka osuszającego wodą. Czas
oddziaływania do nasycenia wynosi 0,5 do 1s;
Zeolity – glinokrzemiany alkaliczne lub wapniowe, bardzo silnie
porowate. Nazwa pochodzi z gr. dzeo = wrzeć (kipieć), zein =
gotować i lithos = kamień (skała) co oznacza "wrzące kamienie"
i nawiązuje do ich cechy charakterystycznej : pod wpływem
Mateusz Niścior
122
ogrzewania zawarta w nich woda "wrze" = "pieni się" pokrywając
powierzchnię pęcherzykami i uwalniając zawartą w nich wodę.
Występują w przyrodzie, ale znaczenie mają produkowane
syntetycznie zeolity Bayera [28].
5.3. Ochrona środowiska
Oczyszczanie wód i ścieków: usuwanie pestycydów, detergentów,
substancji odpowiedzialnych za smak, barwę, i zapach, wody,
węglowodorów alifatycznych i aromatycznych, fenoli i ich pochodnych,
metali ciężkich, bakterii i wirusów, niskocząsteczkowych związków
organicznych, odchlorowania;
Oczyszczanie przemysłowych gazów odlotowych: adsorpcja SO2,
SO3, H2S, CS2, NH3, NOx i innych gazów toksycznych. Biorąc pod
uwagę obecność w gazach odlotowych tlenu i pary wodnej to obok
adsorpcji na węglu aktywnym zachodzi także m.in. katalityczne
utlenianie i inne reakcje wtórne;
Oczyszczanie powietrza: zabezpieczenie dróg oddechowych przed
substancjami toksycznymi (we wszystkich dziedzinach przemysłu
chemicznego i innych, w technice wojskowej; pochłanianie chloru,
tlenków siarki, tlenków azotu, siarkowodoru amoniaku merkaptanów
, rtęci, substancji promieniotwórczych i innych);
Dezodoryzacja powierza; usuwanie nieprzyjemnych zapachów
z powietrza, np. fenoli, merkaptanów pirydyny, amin, i innych;
Oczyszczanie spalin pojazdów samochodowych: na nośniku
węglowym z osadzonymi katalizatorami następuje dopalanie nie
spalonego w silniku paliwa a także adsorpcja tlenków siarki i azotu;
Rolnictwo: oczyszczanie ścieków, adsorpcja środków ochrony
roślin;
Górnictwo: utylizacja zasolonych wód kopalnianych [26, 29‚30].
5.4. Inne
Magazynowanie energii: adsorpcyjne gromadzenie gazu ziemnego,
metanu, wodoru i innych nośników energii pod ekonomicznym
i bezpiecznym ciśnieniem;
Przemysł chemiczny: eliminacja substancji szkodliwych,
odbarwianie roztworów, odzyskiwanie cennych składników z gazów
produkcyjnych itd.;
Przemysł petrochemiczny: izomeryzacja i uwodornienie, wytwarzanie
nośników węglowych, niezbędnych do utrzymania fazy aktywnej
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
123
katalizatora w stanie zdyspergowanym, w procesach katalitycznych
takich jak hydroodsiarczanie, hydroodazotowanie;
Przemysł farmaceutyczny: synteza, rozdział i oczyszczanie
niektórych preparatów;
Przemysł spożywczy: dekofinacja kawy, oczyszczanie i odbarwianie
syropów cukrowych, odbarwianie olejów i tłuszczów, odbarwianie
oraz polepszanie własności i smaku napojów alkoholowych
(spirytus, koniak, piwo);
Przemysł metalurgiczny: do otrzymywania metali szlachetnych z ich rud;
Medycyna: do oczyszczania krwi, do dializy, w zatruciach
pokarmowych;
Przemysł elektrotechniczny: jako produkt elektrodowy [11, 29, 31].
6. Podsumowanie
W niniejszym opracowaniu zarysowano charakterystykę podstawowych
typów adsorbentów porowatych, ich strukturę, metody otrzymywania oraz
ogromny wachlarz zastosowań.
Materiały porowate stanowią bardzo niezwykle interesującą grupę
adsorbentów z uwagi na liczne zalety predestynujące ich zastosowania
w adsorpcji. Do zalet tych należą m.in. rozwinięta powierzchnia właściwa,
duża stabilność hydrotermalna, uniwersalność syntezy, stabilność
chemiczna, łatwość modyfikacji.
Potencjalne zastosowania owych materiałów obejmują przede
wszystkim procesy adsorpcyjne i katalityczne, oczyszczanie wód i ścieków,
przemysłowych gazów odlotowych, oczyszczanie i osuszanie powietrza
czy magazynowanie energii (metan, wodór).
Od jakiegoś czasu obserwujemy znaczny wzrost zainteresowania
materiałami porowatymi, co przekłada się na powstawanie, co raz to
nowych, bardziej udoskonalonych materiałów. Prym wiodą w tym
Chińczycy oraz badacze krajów wysokorozwiniętych, którzy nieustanie
odkrywają nowe adsorbenty, tzw. materiały nowej generacji, o lepszych
właściwościach, a co za tym idzie zastosowaniach.
Przedstawione powyżej liczne przykłady wykorzystania adsorbentów
w wielu sferach życia pokazują jak bardzo są one przydatne a czasami
nieodzowne w dzisiejszym świecie.
Mateusz Niścior
124
Literatura
1. IUPAC, 1994: Recommendations for the characterization of porous solids,
Pure Appl. Chem.,66, 1739
2. Ościk J., 1983: Adsorpcja, PWN, Warszawa
3. Natkański P.,2010: Procesy sorpcyjne, Zakład Technologii Chemicznej,
Uniwersytet Jagielloński, Kraków
4. Sarbak Z., 2000: Adsorpcja i adsorbenty – Teoria i zastosowanie,
Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań
5. Sing K. S., Everett D. H., Haul R. A., Moscov L., Pierotti R. A., Rouquerol J.,
Siemieniewska T., 1985: Pure Appl. Chem., 603
6. Zhao D., Huo Q., Feng, Chmelka B.F, Stucky G.D., 1998: J Am. Chem. Soc.,
120, 548
7. Kokotailo G.T., Lawton S.L., Olson D.H., Meier W.M., 1978: Nature 272, 437
8. Barczak M., Dąbrowski A., 2008: Wiad. Chem.,62
9. Chand Bansal R., Goyal M, 2009: Adsorpcja na węglu aktywnym, WNT,
Warszawa
10. Jankowska H., Świątkowski A., Choma J., 1985: Węgiel aktywny., WNT,
Warszawa
11. Dubinin M. M., Walker Jr., P. L. 1966: Structure and properties of activated
carbons, Chemistry and Physics of Carbon, London
12. Wastewater Engineering; Metcalf & Eddy; third edition, 317,1991: Adsorpcja
na węglu aktywnym, lenntech.pl [Dostęp 06.07.14]. Dostępny w Internecie:
http://www.lenntech.pl/adsorpcja.htm
13. Redlich O,. Paterson D.L.O., 1959: J. Phys. Chem., 63, 1024
14. Pigoń K, Z. Ruziewicz, 2005: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa
15. Atkins P.W., 2001: Chemia Fizyczna, PWN, Warszawa
16. Barrer R.M., 1949: Nature, 164, 112
17. AGH im. Stanisława Staszica w Krakowie, Adsorpcja, home.agh.edu.pl
[Dostęp 05.07.14]. Dostępny w Internecie:
home.agh.edu.pl/~stypula/wyk8.doc
18. Dutkiewicz E.T., 1998: Fizykochemia powierzchni, WNT, Warszawa
19. X.S. Zhao, Q. Ma, G.Q.M. Lu, 1998: Energy fuels, 12, 1051-1054
20. Y. Ueno, A. Tate, O. Niwa, H. Szhou, T. Yamada, I. Honma, 2005: Anal.
Bioanal. Chem., 382, 804-809
21. Y. Ueno, T. Horiuchi, M. Tomita, O. Niwa, H.-S. Zhou, T. Yamada, I.
Honma, 2002: Anal. Chem., 74, 5257-5262
22. J. Aguado, J.M. Arsuaga, A. Arencibia, 2008: Micropor. Mesopor. Mater.,
109, 513-524
23. A.M. Liu, K. Hidajat, S. Kawi, D.Y. Zhao, 2000: Chem. Commun, 1145-1146
24. Chromatograficzne metody rozdziału substancji, umb.edu.pl [Dostęp
05.07.14]. Dostępny w Internecie:
http://www.umb.edu.pl/photo/pliki/WF_jednostki/zaklad-chemii-
organicznej/kosmetologia-chemia_kosmetyczna-2013-2014/skrypt-
chromatografia.pdf
,
Adsorbenty porowate – rodzaje i zastosowanie
125
25. Brunauer S., Emmett P. H., Teller E., 1938: Adsorption of gasses in
monomolecularlayers, Journal of the American Chemical Society, 60, 309-319
26. Warych J.,1994: Oczyszczanie przemysłowych gazów odlotowych, WNT,
Warszawa
27. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska.
nw.pwr.wroc.pl [Dostęp 27.07.14]. Dostępny w Internecie:
http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_i_ad
sorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_4).pdf
28. Politechnika Śląska, 2014: Osuszanie powietrza przy wykorzystaniu
sorbentów, pdf
29. Kokotailo G.T., Chu P., Lawton S.L., Meier W.M., 1978: Nature, 275, 119
30. Zarzycki R., Pustelnik P., Wolborska A., Rzeczyńska B., Solnica J., 1993:
Ochrona środowiska, 4, 35
31. Procesy katalityczne i adsorpcyjne w ochronie środowiska,
nw.pwr.wroc.pl [Dostęp 27.07.14]. Dostępny w Internecie:
32. http://www.nw.pwr.wroc.pl/~trawczynski/wyklady/Procesy_katalityczne_
i_adsorpcyjne_CWICZENIA_lab_INSTRUKCJE/(_346wiczenie_3).pdf
Mateusz Niścior
126
Adsorbenty porowate - rodzaje i zastosowanie
Streszczenie W niniejszym artykule przedstawiono charakterystykę podstawowych grup adsorbentów
porowatych takich jak żele krzemionkowe, zeolity, aluminożele, węgle aktywne, uporządkowane
mezoporowate materiały krzemionkowe czy szkła porowate. Porowate materiały są bardzo
ciekawą grupą adsorbentów ze względu na liczne zalety, które określają ich zastosowanie w adsorpcji. Korzyści te obejmują między innymi: bardzo dobrze rozwiniętą powierzchnię
właściwą, dużą stabilność hydrotermalną, wszechstronność syntezy stabilność chemiczną,
łatwość modyfikacji.
Opisano również szereg zastosowań adsorbentów porowatych w procesie adsorpcji. Do najważniejszych z nich należą: oczyszczanie powietrza z przemysłowych gazów odlotowych,
oczyszczenie wód i ścieków, frakcjonowanie powietrza na tlen i azot, magazynowanie energii,
osuszanie powietrza, w zatruciach pokarmowych i wiele innych zastosowań. Opisano także
analityczny sposób rozdzielania substancji metodą chromatograficzną oraz technikę rozdzielania
i oczyszczania gazów - tak zwaną adsorpcję zmiennociśnieniową (PSA).
Powyższe liczne przykłady wykorzystania adsorbentów w wielu sferach życia, pokazują nam, jak
bardzo są one przydatne i niezbędne w dzisiejszym świecie.
Słowa kluczowe: adsorpcja, adsorbenty porowate, adsorpcja zmiennociśnieniowa,
chromatografia adsorpcyjna, zastosowanie adsorbentów
Porous adsorbents - types and application
Abstract
This article presents the characteristics of the main groups of porous adsorbents such
as silica gels, zeolites, activated carbons, ordered mesoporous silica materials or porous
glass. Porous materials are very interesting group of adsorbents because of the numerous advantages that determine their application in adsorption. These benefits include: a well-
developed surface area, high stability hydrothermal synthesis versatility chemical stability,
ease of modification.
Also described is a variety of uses porous adsorbents adsorption process. The most important of these include: air purification of industrial waste gases, water and sewage
purification, fractionation of air into oxygen and nitrogen, energy storage, drying air and
food poisoning, and many other applications. Also describes the analytical method for the
separation of substances by chromatography and separation technique and purification of gas - the so-called pressure swing adsorption (PSA).
These numerous examples of the use of adsorbents in many spheres of life show us how
they are useful and necessary in today's world.
Keywords: adsorption, porous adsorbents, pressure swing adsorption, adsorption
chromatography, the use of adsorbents
127
Magdalena Bartosiak1, Agnieszka Dobrzańska
Biosensory w służbie zdrowiu
1. Wstęp
Temat biosensorów jest obecnie dynamicznie rozwijającą się dziedziną
biotechnologii, przeżywa swój renesans, zwłaszcza w obszarze
diagnostycznym. Idea bioczujników zrewolucjonizowała samokontrolę
chorych dotkniętych wieloma różnymi schorzeniami, w szczególności
pacjentów z cukrzycą. W artykule omówione zostaną zagadnienia
biosensorów, ich podział, mechanizm działania oraz zastosowanie
diagnostyczne.
2. Rys historyczny
W środowisku specjalistów za „ojca biosensorów” uważa się profesora
Lelanda Clarka, amerykańskiego biochemika, twórcę słynnej elektrody
Clarka. Opublikował on pracę na temat elektrody tlenowej – ten pierwszy
bioczujnik zawierał oksydazę glukozową (GOx) immobilizowaną na
elektrodzie platynowej. Został on wykorzystany do wykrywania oraz
mierzenia poziomu glukozy [1].
Od tamtego momentu wielu naukowców podejmowało temat
biosensorów zapoczątkowany przez Clarka. Z biegiem czasu opracowano
różnorodne rodzaje przetworników oraz znacząco urozmaicono część
receptorową sensorów; Liedberg oraz jego zespół opracowali podstawy
wykorzystywania przeciwciał w immunosensorach [2,3], natomiast pomysł
włączenia bakterii jako biologicznego elementu w elektrodach
mikrobiologicznych zrewolucjonizował przemysł bioczujników [4,5].
Obecnie biosensory są szeroko wykorzystywane w medycynie, zarówno
do celów diagnostycznych jak i leczniczych, ale także w przemyśle
spożywczym, monitoringu środowiska czy walce z bioterroryzmem.
1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”
Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska
128
3. Charakterystyka biosensorów
3.1. Budowa biosensorów
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry,
pol. Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej) definiuje
biosensory jako urządzenia wykorzystujące reakcje biochemiczne
przeprowadzane przez wyizolowane enzymy, organelle lub całe komórki,
do detekcji związków chemicznych na drodze sygnałów elektrycznych,
termicznych lub optycznych [6].
Newman wraz ze współpracownikami zaproponowali następującą
definicję biosensora: „niewielkie narzędzie analityczne zawierające
detektor biologiczny lub pochodzący od biologicznego, zintegrowany
wewnątrz lub ściśle powiązany z fizykochemicznym przetwornikiem;
zazwyczaj celem takiego urządzenia jest nadanie dyskretnego lub ciągłego
cyfrowego sygnału elektronicznego który jest proporcjonalny do sygnału
analitu lub pokrewnej grupy analitów” [7].
W praktyce, biosensory to urządzenia zdolne do detekcji specyficznych
biologicznych próbek oraz zamiany samej ich obecności lub stężenia na
sygnały, które mogą być łatwo wykryte i zanalizowane. W budowie
wszystkich bioczujników wyróżniamy 3 zasadnicze elementy:
element rozpoznający, zwany także elementem czułym czy częścią
receptorową: na przykład przeciwciała, białka receptorowe, kwasy
nukleinowe, antygeny czy enzymy; wykrywają one „sygnał”
ze środowiska;
przetwornik: zamienia sygnał biologiczny na elektroniczny;
wzmacniacz, procesor: przekazuje i prezentuje wynik [8].
,
Biosensory w służbie zdrowiu
129
Rys. 1 Schematyczna budowa biosensora; na podstawie: Muszyńska M. Biosensory
http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Biosensory
Kluczowym elementem każdego biosensora jest przetwornik.
Wykorzystuje on zmianę właściwości fizycznych towarzyszącą zachodzącej
reakcji. Może to być zmiana ciepła zaabsorbowanego lub wyemitowanego
podczas reakcji (sensory korzystające z tego typu przetworników to
biosensory kalorymetryczne), ale także zmiana rozkładu ładunków
prowadząca do powstania potencjału elektrycznego (biosensory potencjo-
metryczne) czy ruch elektronów powstających podczas reakcji redoks
(biosensory amperometryczne). Opracowano także przetworniki
korzystające z różnicy w świetle wyemitowanym lub zaabsorbowanym
pomiędzy reagentami i produktami (biosensory optyczne), lub takie opierające
się o masę reagentów lub produktów (biosensory piezoelektryczne) [9].
Sygnał elektryczny pochodzący z przetwornika jest często słaby,
posiada wysokie szumy. Aby podnieść stosunek sygnału do szumu
wykorzystuje się „wzorcowy” sygnał linii bazowej pochodzący
z podobnego przetwornika, nie dającego sygnału od próbki. Znikoma
różnica pomiędzy sygnałami jest wzmacniana i podawana jako
odczytywalny sygnał wyjściowy. Opisany powyżej proces redukuje
Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska
130
niechciany szum sygnałowy. Analogiczny sygnał generowany przez
wzmacniacz jest najczęściej zamieniany na impuls cyfrowy
i przekazywany do mikroprocesora. Dane są przetwarzane, zamieniane na
jednostki stężenia i transmitowane na urządzenie prezentujące wyniki lub
magazynowane w pamięci aparatu [10].
3.2. Podział biosensorów
Wyróżnia się dwa zasadnicze systemy klasyfikacji biosensorów:
na podstawie typu użytego materiału biologicznego (elementu czułego)
oraz na podstawie rodzaju przetwornika.
Wśród bioczujników pierwszego typu występują biosensory w których
element czuły działa na zasadzie biologicznego powinowactwa: pomiędzy
analitem i elementem czułym wytwarza się selektywne wiązanie na
zasadzie ligand-receptor [11];elementem tym mogą być immunoglobuliny
– biosensory tego typu wykrywają interakcje antygen-przeciwciało [12];
w ich budowie wykorzystywane są zarówno przeciwciała mono- jak
i poliklonalne; takie czujniki nazywane są inaczej immunosensorami.
Kolejnym rodzajem elementu receptorowego mogą być kwasy nukleinowe –
może to być jednoniciowy lub dwuniciowy łańcuch DNA lub RNA;
hybrydyzuje on ze specyficznymi dla siebie komplementarnymi sekwencjami,
niskocząsteczkowymi związkami chemicznymi lub białkami które posiadają
powinowactwo do kwasów nukleinowych. Takie biosensory wykorzys-
tywane są do szybkiej, prostej i ekonomicznej diagnostyki chorób
genetycznych i zakaźnych, umożliwiają także detekcję interakcji i uszkodzeń
DNA [13]. Ostatnim rodzajem elementu rozpoznającego opartego o zjawisko
powinowactwa są receptory – elementem czułym jest białkowy receptor
który ma za zadanie wyzwolić kaskadę sygnałową przekazującą informację
na przetwornik.
W klasyfikacji na podstawie elementu czułego kolejna grupa
biosensorów to urządzenia biokatalityczne: elementem czułym są
unieruchomione cząsteczki enzymu; przykład: paski wskaźnikowe
z immobilizowaną GOx używane przez cukrzyków do samodzielnej
kontroli poziomu glukozy we krwi [11].
Ostatnimi w tej grupie są biosensory komórkowe: ich elementem
rozpoznającym są całe komórki lub tkanki [14]. Łączą one system
biokatalityczny z wykorzystaniem powinowactwa, dlatego w różnych
źródłach bywają wyodrębniane lub zaliczane do grupy biologicznego
powinowactwa lub biokatalitycznej. Tu zaliczamy czujniki posiadające
bakterie jako materiał biologiczny. Sensory te są tańsze w produkcji oraz
nie wymagają tak dokładnego oczyszczania jak w przypadku enzymów
[15] lecz mają dłuższe czas odpowiedzi i regeneracji (patrz punkt 3.3) [16].
,
Biosensory w służbie zdrowiu
131
Wśród biosensorów komórkowych wyróżnia się typ jednokomórkowy,
stosowany między innymi przy szacowaniu poziomu cholesterolu
– mikroorganizmy będące źródłem oksydazy cholesterolowej immobilizowane
na poliakryloamidzie lub agarze na elektrodzie tlenowej [17].
Wyodrębniono również typ wielokomórkowy oraz połączenie biosensora
komórkowego z enzymem: na przykład skojarzenie oczyszczonego NAD
(dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) pochodzącego od Neurospora
crassa z bakteriami z gatunku Escherichia coli (o dużej zawartości
deaminazy nikotynamidowej); w reakcji katalizowanej przez deaminazę
powstaje amoniak, którego detekcja jest podstawą do oszacowania ilości
NAD+ [18]. Ostatnim wyszczególnianym wśród biosensorów komór-
kowych typem jest typ komórkowy nie wykorzystujący mikroorganizmów
– ciekawą ilustracją tego rodzaju sensora jest przytwierdzenie miazgi
bananowej do elektrody tlenowej, które zaowocowało powstaniem
dopamino-wrażliwego bioczujnika; miazga bananowa jest bogata
w oksydazę polifenolową, a izoforma enzymu wykryta w bananach cechuje się
wysoką selektywnością w stosunku do dopaminy [19].
Klasyfikacja biosensorów na podstawie rodzaju przetwornika obejmuje
czujniki elektrochemiczne (a wśród nich potencjometryczne, amperometryczne
i kalorymetryczne), a także optyczne, piezoelektryczne oraz termiczne [10].
Podstawa działania tych biosensorów została opisana powyżej.
3.3. Wymogi dla biosensorów
Każdy nowo opracowywany biosensor musi spełniać kilka wymagań
– tylko wtedy jest on uznawany za sprawny, udany i możliwy do
komercyjnej produkcji. Pośród tych wymogów znajduje się selektywność
– bioczujnik powinien być wysokoselektywny w stosunku do analizowanej
substancji; powinien także odznaczać się minimalną (a najlepiej zerową)
aktywnością krzyżową z cząstkami mającymi podobną strukturę
chemiczną, a także czułość - urządzenie powinno być zdolne do pomiaru
w takim zakresie jaki spodziewamy się otrzymać od analizowanej
substancji, z minimalnymi dodatkowymi krokami takimi jak wstępne
czyszczenie i wstępne zagęszczenie próbek. Sensor musi odznaczać się
liniowością odpowiedzi – zakres liniowej odpowiedzi systemu powinien
pokrywać się z zakresem stężeń w którym w którym substancja będzie
analizowana. Kolejnym istotnym kryterium jest powtarzalność wyników
– próbki o tym samym stężeniu analizowane kilkukrotnie powinny dawać
tą samą odpowiedź urządzenia. Ważną kwestią jest szybki czas odpowiedzi
oraz szybki czas regeneracji – odpowiedź urządzenia powinna być
wystarczająco szybka aby można uznać, iż monitoruje ono stan w czasie
rzeczywistym. Czas regeneracji powinien być szybki aby urządzenie można
Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska
132
było jak najszybciej wykorzystać ponownie. Ostatnim wymienianym
warunkiem jest stabilność i długość życia urządzenia. Większość związków
chemicznych jest niestabilna w różnych warunkach biochemicznych
i środowiskowych. Element biologiczny wykorzystany w urządzeniu
powinien być dobrany tak, aby biosensor był aktywny na długi czas – wtedy
czujnik jest użyteczny, nadaje się do sprzedaży.
4. Diagnostyczne zastosowanie biosensorów
Wykazując dużą czułość i specyficzność, biosensory znajdują szerokie
zastosowanie przy monitorowaniu zmian fizykochemicznych w organizmie.
Umożliwia to wczesną diagnozę i leczenie wielu przewlekłych chorób.
Wczesne wykrycie choroby może zapobiec jej dalszemu rozwojowi oraz
znacznie obniżyć koszty opieki medycznej pacjenta.
Jednymi z najpopularniejszych chorób przewlekłych, których przebieg
monitoruje się za pomocą bioczujników są cukrzyca i choroby układu
krążenia. W przypadku chorób układu krążenia uzyskanie prawidłowego
stanu fizjologicznego organizmu wymaga utrzymania stałego poziomu
cholesterolu, a cukrzycy – glukozy [20].
4.1. Biosensory stosowane do pomiaru glukozy
U podstaw cukrzycy leżą zaburzenia poziomu glukozy we krwi.
Zarówno wyższy, jak i niższy poziom cukru może stanowić zagrożenie
życia człowieka. W diagnostyce i leczeniu niewątpliwie kluczowy jest
nieustanny monitoring poziomu glukozy we krwi. W 2012 roku biosensory
glukozowe stanowiły około 85% światowego rynku biosensorów [21].
Ogromna liczba diabetyków sprawdzających poziom cukru sprawiła, że
glukoza jest najczęściej badanym parametrem. Pierwszy bioczujnik do
pomiaru cukru, zawierający immobilizowany na elektrodzie tlenowej
enzym, stworzyli w 1962r. Lyons i Clark. Pomiar poziomu cukru mierzony
był pośrednio przez pomiar tlenu potrzebnego do ultlenienia cząsteczki
glukozy przez immobilizowany enzym – oksydazę glukozy. W 1973 roku,
Guilbault i Lubrano zaprojektowali amperometryczny (anodowy) biosensor
do monitorowania cukru za pomocą nadtlenku wodoru – produktu
pośredniego rozkładu glukozy [20]. Istnieją różne rodzaje czujników
glukozowych, które można podzielić na dwie grupy: enzymatyczne
(nakłucie palca i pomiar gleukometrem oraz badanie poziomu glukozy
z moczu) oraz ciągły (nieinwazyjne, minimalnie inwazyjne i inwazyjne)[22].
Zdecydowana większość bioczujników glukozowych należy do
biosensorów elektrochemicznych. Charakteryzują się one wysoką
czułością, powtarzalnością, niskim kosztem oraz łatwością w eksploatacji
i konserwacji. Wśród glukozowych sensorów elektrochemicznych możemy
,
Biosensory w służbie zdrowiu
133
wyróżnić biosensory typu amperometrycznego, potencjometrycznego lub
konduktometrycznego. Najczęściej badanymi w ciągu kilku ostatnich
dekad i często spotykanymi na rynku medycznym bioczujnikami
są enzymatyczne amperometryczne biosensory glukozy. Sensory
amperometryczne monitorują generowanie prądu w wyniku bezpośredniej
lub pośredniej wymiany elektronów między układem biologicznym,
a elektrodą [23].
Zasadniczo, pomiar glukozy opiera się na interakcji cukru z jednym
z 3 enzymów: heksokinazy, oksydazy glukozowej (GOx) oraz glukozo-1-
dehydrogenazy (GDH) [21]. Test z udziałem heksokinazy, praktykowany
w wielu laboratoriach klinicznych, służy do pomiaru glukozy przy użyciu
spektrofotometrii. Sensory do pomiaru samodzielnego dla pacjenta oparte
są na GOx i GDH. Enzymy te różnią się wartością potencjału redoks,
rodzajem kofaktorów oraz specyficznością wobec glukozy. Standardowym
enzymem stosowanym do budowy sensora jest oksydaza glukozowa.
Wykazuje ona większa specyficzność w stosunku do substratu, jest tania,
łatwo ją otrzymać. Ponadto może wytrzymać skrajne warunki
środowiskowe, a tym pH, siła jonowa i temperatura, co zdecydowanie
ułatwia proces produkcji czujników [24].
Podstawowa koncepcja sposobu działania biosensora opiera się na
fakcie, że unieruchomiony GOx katalizuje utlenianie β-D-glukozy przy
użyciu tlenu cząsteczkowego do kwasu glukonowego i nadtlenku wodoru.
Do osiągnięcia aktywności katalitycznej, oksydaza glukozowa wymaga
obecności kofaktora redoks – di nukleotydu flawinoadeninowego (FAD).
FAD pełni rolę początkowego akceptora elektronów i ulega redukcji do
FADH2. Następnie kofaktor ulega regeneracji podczas reakcji z tlenem,
co prowadzi do powstania nadtlenków wodoru. Nadtlenek wodoru utlenia
się na katalitycznej anodzie platynowej. Elektroda z łatwością rozpoznaje
liczbę przenoszonych elektronów, która jest proporcjonalna do liczby
cząsteczek glukozy obecnych we krwi.
Do elektrochemicznego wykrywania glukozy wykorzystuje się 3 główne
metody: pomiar zużycia tlenu, pomiar ilości nadtlenku wodoru
wytwarzanego w reakcji enzymatycznej lub przez rejestrację transferu
elektronu od GOx do elektrody przy użyciu im mobilizowanego enzymu.
Amperometryczne biosensory oparte na GDH obejmują dwa rodzaje:
jeden związany z ko faktorem NAD, a drugi z PQQ. Reakcja enzymatyczne
z udziałem GDH jest nie jest zależna od rozpuszczone tlenu. Jeśli GDH
rozpoznaje jako ko faktor PQQ reakcja przebiega według równania:
Glukoza + PQQ utl. -> Glukonolakton + PQQzred.
Mechanizm ten nie wymaga ani tlenu, ani NAD+. PQQ-NAD to bardzo
sprawny układ enzymatyczny, charakteryzujący się szybkim transferem
elektronów. Jego wadą jest wysoki koszt.
Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska
134
W roli kofaktora GDH występuje też NAD, który jest głównym
akceptorem elektronów podczas utleniania glukozy, w trakcie którego
pierścień NAD+ przyjmuje jon wodoru i 2 elektrony . W wyniku reakcji
powstaje glukonolakton oraz zredukowana forma NADH, która następnie
może ulec elektrochemicznemu utlenieniu [23].
Rys. 2. Schemat podstawowego mechanizmu działania biosensora glukozowego opartego na
OD [20]
4.2. Biosensory stosowane do pomiaru cholesterolu
Oznaczanie poziomu cholesterolu we krwi jest bardzo istotne z punktu
widzenia diagnostyki i leczenia hipercholesterolemii oraz zmian
patologicznych takich jak miażdżyca i choroby wieńcowej. Spośród
różnych metod dostępnych dla określenia poziomu cholesterolu,
m.in. Metody kolorymetrycznej, spektrofotometrii, chromatografii
cienkowarstwowej czy chromatografii gazowej, metody z użyciem
bioczujników są zdecydowanie prostsze, szybsze o wyższej czułości
i specyficzności. W biosensorach do oznaczania sterolu wykorzystuje się
esterazę cholesterolową, oksydazę cholesterolową, peroksydazę
unieruchomione na oktylowym żelu agarozowym, polimembranie
z mekrylanu 2-hydroksyetylu, nanorurkach węglowych, porowatym
silikonie, membranie celulozowej i wielu innych. Wszystkie te nośniki
enzymu, zarówno organiczne jak i nieorganiczne, posiadają liczne wady,
np.: wysoki koszt materiału nośnikowego i procedury immobilizacji, słaba
odporność na ataki drobnoustrojów, długi czas reakcji, zredukowana ilość
kompleksów enzym-substrat, interferencja metabolitów oraz niska
stabilność podczas przechowywania. Szansą w ulepszeniu biosensorów do
pomiaru cholesterolu jest zastosowanie jako membrany wysoce
usieciowionych żywic epoksydowych [26].
Najpopularniejszym sensorem do badania poziomu cholesterolu jest
bioczujników wykorzystujący oksydaze cholesterolową. Oksydaza
cholesterolowa zawiera di nukleotyd flawinoadeninowy (FAD), jako
centrum aktywne zachodzącej reakcji redoks. W czasie reakcji
,
Biosensory w służbie zdrowiu
135
enzymatycznej, tlen działa jako fizjologiczny mediator na powierzchni
elektrody, które podlega utlenianiu, co skutkuje wytworzeniem nadtlenku
wodoru oraz cholest-4-enonu. Wzrost stężenia nadtlenku wodoru lub
zmniejszenie tlenu może być wykorzystane do określenia ilości
cholesterolu. Taki mechanizm pomiarowy posiada jedną wadę.
Mianowicie, zmiany stężenia tlenu w próbce wpływają na zmiany
w odpowiedzi elektrody, co podczas ponownego utleniania nadtlenkiem
wodoru prowadzi do zwiększenia zakłóceń za strony metabolitów takich
jak kwas askorbinowy i kwas moczowy [27]. W celu uniknięcia tego
problemu, stosuje się mieszaninę dwóch lub więcej enzymów, których
połączenie zwiększa selektywność w stosunku do analitu (podstawowy
enzym jakim jest oksydaza cholesterolowa, działa na cholesterol,
wytwarzając nadtlenek wodoru, który wychwytywany jest przez drugi
enzym, np. peroksydazę).
Jednorazowe biosensory monitorujące poziom cholesterolu mierzą
całkowity poziom sterolu, który określany jest przy użyciu jednorazowych
pasków im mobilizowanych z Fe3O4, oksydazy cholesterolowej i esterazy
cholesterolowej. Kombinacja tych dwóch enzymów umożliwia wykrycie
zarówno zestryfikowanej, jak i wolnej formy cholesterolu [20].
5. Podsumowanie
Biosensory to urządzenia stosowane głównie w analityce medycznej do
wykrywania lub ilościowego oznaczania określonych substancji
w badanym materiale klinicznym, np. metabolitów w płynach ustrojowych.
Są to połączenia obiektów biologicznie aktywnych, do których zaliczyć
można m.in. enzymy, z czujnikiem przetwarzającym efekt towarzyszący
zachodzącej reakcji chemicznej na sygnał analityczny. Dzięki wysokiej
specyficzności i czułości, biosensory znajdują szerokie zastosowanie przy
monitorowaniu zmian fizykochemicznych w organizmie. Umożliwia to
wczesną diagnozę i leczenie wielu przewlekłych chorób. Jednymi
z najpopularniejszych chorób przewlekłych, których przebieg monitoruje
się za pomocą bioczujników są cukrzyca i choroby układu krążenia,
np. hipercholesterolemia. Wczesne wykrycie stanów patologicznych
niejednokrotnie zapobiega dalszemu rozwojowi choroby u pacjenta.
Łatwość w stosowaniu biosensorów, umożliwia chorym indywidualne
monitorowanie odpowiednich substancji (większość cukrzyków
samodzielnie kontroluje poziom glukozy we krwi) [20, 23, 28].
Magdalena Bartosiak , Agnieszka Dobrzańska
136
Literatura
1. Heineman W.R., Jensen W.B., Leland C., Clark 1918-2005, Biosens Bioelectron, 2006, s. 1403-1404
2. Weiner P.H., Parcher J.F. Improved urea electrode, Anal Chem, 1973, s.417-419 3. Docolomanský P., Gemeiner P., Mislovicová D., Stefuca V., Danielsson B.
Screening of concanavalin A-bead cellulose conjugates using an enzyme thermistor with immobilized invertase as the reporter catalyst, Biotechnol Bioeng, 1994, s.286-292
4. Timur S., Anik U., Odaci D., Gorton L. Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube (CNT) modified electrodes, Electrochem commun, 2007, s.1810-1815
5. Turner A.P., Karube I., Wilson G.S., Oxford U.K. Oxford University Press, 1987, Biosensors: Fundamentals and applications, s. 770
6. Fetz V., Knauer S.K., Bier C., von Kries J.P., Stauber R.H. Translocation biosensors – cellular system integrators to dissect CRMI – dependant nuclear export by chemicogenomics, Sensors, 2009, s.5423-5445
7. Newman J.D., Setford S.J. Enzymatic biosensors, Mol. Biotechnol, 2006, s.249-268
8. Bohunicky B., Mousa S.A. Biosensors: The new wave in cancer diagnosis, Nanotechnol Sci Appl, 2011, s.1-10
9. Scheller F., Schubert F. Structure and function of transducer. Amsterdam: Elsevier Science Ltd, Biosensors, 1992, s.10-34
10. Thakur M.S., Ragavan K.V. Biosensors in food processing, J Food Sci Technol, 2013, s.625-641
11. Thévenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification, Biosens Bioelectro, 2001,s.121-131
12. North I. Immunosensors: antibody-based biosensor,. Trends Biotechnol, 1985, s.180-186
13. Fjota M. Electrochemical sensors for DNA interactions and damage, Electroanalysis, 2002, s.1449-1463
14. Pancrazio J.J., Whelan J.P., Borkholder D.A., Ma W., Stenger D.A. Development and application of cell-based biosensors, Ann Biomed Eng, 1999, s. 697-711
15. Aravamudhan S., Kumar A., Mohapatra S., Bhansali S. Sensitive estimation of total cholesterol in blood using Au nanowires based micro-fluidic platform, Biosens Bioelectron, 2007, s.2289-2294
16. Riechel T., Rechnitz G. Hybrid bacterial and enzyme membrane electrode with nicotinamide adenine dinucleotide response, J Memb Sci, 1978, s.243-250
17. Singh S., Solanki P.R., Pandey M.K., Malhotra B.D. Cholesterol biosensor based on cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase immobilized onto conducting polyaniline films, Sens Actuators B Chem, 2006, s.534-541
18. Hikuma M., Obana H., Yasuda T., Karube I., Suzuki S. A potentiometric microbal sensor based on immobilized Escherichiacoli for glutamic acid, Anal Chim Acta, 1980, s.61-67
19. Sidwell J.S., Rechnitz G.A., Bananatrode S. An electrochemical biosensor for dopamine, Biotechnol Lett, 1985, s.419-422
20. Ngoepe M. i in., Integration of biosensors and drug delivery technologies for early detection and chronic management of illness, Sensors, 2013, s.7680-7713
,
Biosensory w służbie zdrowiu
137
21. Zhu Z., Garcia-Gancedo L., Flewitt A.J., Xie H., Moussy F., Milne W.I. A critical review of glucose biosensors based on carbon nanomaterials: Carbon nanotubes and grapheme, Sensors, 2012, s.5996-6022
22. Stout P., Racchini J.R., Hilgers M.E., Noujaim S.E, Continuous glucose monitoring: Key challenges to replacing episodic SMBG, Diabetes Res. Clin. Pract, 2006, s.97-100
23. Yoo E.H., Lee S.Y. Glucose biosensors: an overview of use in clinical practice, Sensors, 2010, s.4558-4576
24. Heller A., Feldman B. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management, Chem. Rev, 2008, s.2482-2505
25. Guilbault G.G., Lubrano G.J An enzyme electrode for the amperometric determination of glucose, Anal. Chim. Acta, 1973, s.439-455
26. Pundir C.S. i in. An amperometric cholesterol biosensor based on epoxy resin membrane bound cholesterol oxidase, Indian J Med Res, 2012, s.633-640
27. Ahn K.W., Sampson N.S. Cholesterol oxidase senses subtle changes in lipid bilayer structure, Biochemistry, 2004, s.827-836
28. Portalwiedzy.onet.pl
Biosensory w służbie zdrowiu
Streszczenie
Biosensory są urządzeniami szeroko wykorzystywanymi w branży medycznej, zarówno
w celach diagnostycznych jak i leczniczych. Ich historię zapoczątkował profesor Leland
Clark, opracowując pierwsze urządzenie oparte o oksydazę glukozową immobilizowaną na elektrodzie platynowej. Po tym przełomowym wynalazku wielu naukowców kontynuowało
i rozwijało tę dziedzinę, co zaowocowało powstaniem wielu typów biosensorów. Obecni
badacze dzielą bioczujniki na dwie zasadnicze grupy: ze względu na rodzaj posiadanego
elementu czułego oraz przetwornika. Współcześnie biosensory cieszą się największą popularnością w badaniach i terapii cukrzycy oraz chorób układu krążenia, zwłaszcza
hipercholesterolemii co sprawia, iż w tych dziedzinach rozwój bioczujników postępuje
najszybciej.
Słowa kluczowe: biosensor, cukrzyca, hipercholesterolemia, cholesterol, glukoza
Biosensors in service in public health
Abstract
Biosensors are widely utilized in medical business, both to diagnose and treat patients. Their
history began when professor Leland Clark created his first device, which was based on the glucose oxidase immobilized on the platinium electrode. After that crucial invention many
scientists continued and developed the field of biosensors, a lot of types of sensors appeared.
Current researchers divide biosensors into two major groups: on the basis of nature
of recognition or the type of transducer. Nowadays biosensors have the greatest popularity among the studies and therapy of diabetes and the circulatory system dideases, especially
hypercholesterolaemia - development of biosensors is the most dynamic in these branches
of medicine.
Keywords: biosensors, diabetes, hypercholesterolemia, cholesterol, glucose
138
Adrian Odrzywolski1
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
1. Wstęp
Aptamery są w głównej mierze kwasami nukleinowymi (DNA, bądź
RNA), choć również występują w postaci peptydów. Dzięki specyficznej
strukturze przestrzennej potrafią wiązać się niekowalencyjnie z różnymi
cząsteczkami. Są relatywnie niewielkie, najczęściej ich długość waha
się między 15 a 40 nukleotydów, zaś najdłuższe nie przekraczają
100 nukleotydów.
Ich główne założenie i proces wytwarzania zostały przedstawione
w 1990 roku niezależnie przez dwie grupy naukowców: Szostaka i Golda.
Grupa Golda opracowała metodę selekcji takich cząsteczek RNA, który
wiązały się z polimerazą DNA faga T4 [1]. Metoda ta została nazwana
SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment).
Grupa Szostaka z kolei stworzyła cząsteczki RNA, które wiązały się
z różnymi barwnikami organicznymi [2]. Ponadto wprowadzili oni termin
aptamer (łac. apto znaczy pasować).
Ich odmienna struktura i właściwości fizykochemiczne w znaczący
sposób odbiegają od przeciwciał. Nie są wrażliwe na czynniki
denaturujące, w tym zmiany temperatury, są znacznie mniejsze, jak
również są w pełni produkowane in vitro, co pozwala na automatyzację ich
procesu wytwarzania. Przez to stanowią realne zastępstwo dla przeciwciał.
2. Wytwarzanie aptamerów
Jak wspomniano we wstępie, w celu wytworzenia aptameru, stosuje
się metodę SELEX. Podstawowa selekcja w tej metodzie przebiega
w 3 etapach [3]. Pierwszym z nich jest stworzenie na drodze syntezy
kombinatorycznej biblioteki DNA, składającej się z 1012
-1015
losowych
oligonukleotydów. Dobór długości aptameru zależy od empirycznych
badań danej grupy cząsteczek, niekiedy wspomaganej analizą in silico.
Każda taka cząsteczka zawiera stałe sekwencje dla odpowiednich starterów
na obu końcach do selekcji za pomocą reakcji PCR, które flankują
sekwencje losową.
1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności
i Biotechnologii, Katedra Biotechnologii, Żywienia Człowieka i Towaroznawstwa Żywności,
http://www.up.lublin.pl/foodscience/;
,
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
139
Kolejnym krokiem po wygenerowaniu biblioteki oligonukleotydów jest
jej inkubacja z badaną substancją. Pod względem masy, bardzo wiele
cząsteczek może być brana pod uwagę – zarówno niskocząsteczkowe
związki organiczne jak np. ATP [4], nieorganiczne jony metali, np. rtęci
[5], czy też wielkocząsteczkowe jak białka bądź kwasy nukleinowe. Należy
jednak zwrócić uwagę na fakt, że nie do każdej cząsteczki da się stworzyć
aptamer. Przede wszystkim, badana cząsteczka powinna wykazywać
ogólny ładunek dodatni (co wynika z charakteru samych aptamerów, które
będąc kwasami nukleinowymi, mają ładunek ujemny), być hydrofilową,
oraz tworzyć wiązania wodorowe. Suma wszystkich tych cech daje
pewność, że uzyska się aptamer o dużym powinowactwie do analizowanej
cząsteczki [6]. Następnie po inkubacji biblioteki DNA z badaną substancją,
separuje się aptamery na takie które uległy związaniu z nią, oraz na takie
które pozostały niezwiązane. W tym celu używa się wielu różnych metod
takich jak: chromatografia powinowactwa, czy elektroforeza kapilarna [7].
Ostatnim krokiem jest powielenie aptamerów związanych z ligandem
za pomocą metody PCR i stworzeniem tym samym potomnej biblioteki.
Potomna biblioteka z kolei jest wykorzystywana ponownie do selekcji
aptamerów, na opisanej powyżej zasadzie. Zazwyczaj konieczne jest
przeprowadzenie 10-15 takich rund selekcyjnych, aż uzyska się niewielką
grupę aptamerów o najwyższym powinowactwie. Warto jednak zwrócić
uwagę, że stosując np. elektroforezę kapilarną, proces selekcji można
zminimalizować do 4 rund [7].
Poza klasyczną metodą SELEX, istnieje bardzo duża liczba modyfikacji
tej metody, które pokrywają zapotrzebowanie na oznaczenie badanej
substancji w niekiedy bardzo specyficznych materiałach [3]. Spośród nich,
warto zwrócić uwagę na komórkowy-SELEX. Został opisany pierwszy raz
w 2006 roku przez Shangguan i współ. [8] Ten sposób selekcji różni się od
standardowego protokołu tym, że zamiast użycia pojedynczych substancji
wobec których aptamery mają być swoiste, używa się całych komórek.
Zazwyczaj uzyskuje się szereg różnych aptamerów wiążących się
z różnymi elementami błony komórkowej. Jest to szczególnie istotne, do
tak skomplikowanych celów, jak badanie komórek nowotworowych.
Dodatkowo, stosując selekcję negatywną w postaci komórek zdrowych,
zyskuje się aptamery specyficzne dla danego typu nowotworu.
3. Porównanie wybranych cech aptamerów i przeciwciał
Chociaż przeciwciała i aptamery wykazują podobieństwa co do ich
działania, to sposób w jaki funkcjonują całkowicie się różni od siebie.
Porównując obie cząsteczki, nie trudno dostrzec jak dużą konkurencją dla
przeciwciała mogą być aptamery [3, 9].
Adrian Odrzywolski
140
Stabilność aptamerów. W porównaniu do przeciwciał aptamery
są wyjątkowo stabilne. Utrzymują swoją strukturę przy wyższych
temperaturach niż przeciwciała, są również niewrażliwe na zmiany pH czy
na zmiany warunków redoks. W przeciwieństwie do przeciwciał nie
posiadają hydrofobowego jądra, stanowiącego siłę napędową fałdowania
się białka i wpływających na procesy agregacji.
W przypadku utraty swojej struktury drugorzędowej w wyniku działania
czynników denaturujących, aptamery łatwo odzyskują swoją strukturę,
podczas gdy białka w takiej sytuacji w dużej mierze tracą swoje
właściwości na stałe. Praktycznym aspektem tego jest odporność aptamerów
na przechowywanie i powtarzanie cyklów rozmrażania/zamrażania, co jest
niedopuszczalne przy przeciwciałach.
Degradacja. Aptamery są pod tym względem bardzo delikatne.
Nukleazy są obecne w każdym środowisku i są bardzo odporne na różne
czynniki. Warunkuje to z jednej strony konieczność zadbania o sterylność
środowiska pracy, a z drugiej zastosowanie odpowiednich modyfikacji
w strukturze aptamerów, aby zmniejszyć ich podatność na działanie
nukleaz. Przeciwciała, choć są również podatne na degradację przez
proteazy, to proces przebiega wolniej i jest mniej dotkliwy, niżeli
w przypadku aptamerów.
Rozmiar. Przeciwciała są to bardzo duże cząsteczki. Zależnie od klasy,
ich masa cząsteczkowa waha się od 150 kDa (IgG – najczęściej używane
do badań) do 900 kDa (IgM). Z kolei aptamery to cząsteczki stosunkowo
niewielkie. Przykładowo natywny łańcuch cząsteczki RNA o długości
76 nukleotydów, ma masę około 23 kDa (waha się zazwyczaj między
5 kDa a 65 kDa). W znacznym stopniu ułatwia to na przykład przenikanie
ich przez różnego rodzaje bariery takie jak bariera krew-mózg, czy też
bariera kłębuszkowa w nerkach.
Powinowactwo. Aptamery bardzo często mają powinowactwo
na poziomie przeciwciał monoklonalnych i mieści się ono w przedziale
nano-, pikomolarnym.
Immunogenność. Do tej pory nie stwierdzono, aby aptamery
powodowały wykrywalną reakcję immunologiczną. W przypadku
przeciwciał jednak, sytuacja jest zupełnie odwrotna. Większość przeciwciał
może ją powodować.
Bazując na powyższych danych można stwierdzić, że aptamery
dorównują przeciwciałom, a niekiedy również je przewyższają. Głównym
problemem ograniczającym ich przydatność jest ich podatność na
degradację. W środowisku jest obecna ogromna ilość nukleaz, które
z łatwością przeprowadzają cięcie nici polimeru. Skutkuje to krótkim
okresem ich półtrwania. Konieczne zatem jest wprowadzenie szeregu
modyfikacji łańcucha polimeru, aby w jak największym stopniu przeszkodzić
,
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
141
w hydrolizowaniu wiązań fosfodiestrowych. Jedną z ważniejszych
stosowanych modyfikacji aptamerów są modyfikacje przy 2’-OH rybozy.
Dokonuje się tutaj zamiany grupy hydroksylowej na 2’-NH2, 2’-F, bądź też
2’-O-CH3. Ponadto stosuje się modyfikacje końców nici, chroniąc tym
samym aptamery przed działaniem egzonukleaz. W tym celu przeprowadza
się najczęściej dodanie do końca 3’ odwróconej tymidyny. Do końca 5’
z kolei można zastosować przyłączenie PEG, amin, reszt fosforanowych,
kwasów tłuszczowych, cholesterolu czy innych [11, 12, 13].
4. Zastosowanie aptamerów
Aptamery podobnie jak przeciwciała, mogą być wykorzystane do wielu
różnych celów. Poniżej zostały zestawione przykłady głównych sposobów
wykorzystania aptamerów.
4.1. Inhibicja
Jednym z pierwszych aptamerów wykazujących zdolność inhibicji,
był opisany w 1990 roku aptamer wiążący się do białka Tat wirusa HIV-1.
Został on uzyskany jednak nie dzięki zastosowaniu metody SELEX,
a poprzez nadekspresję w linii komórkowej CEM-SS. W wirusie HIV
występuje białko Tat, które pełni rolę aktywatora replikacji. W celu jego
aktywacji, konieczna jest odpowiedź trans-aktywacyjna (TAR). Zastosowany
apatmer był 60 nukleotydową cząsteczką RNA, która była podobna do TAR.
Łącząc się z białkiem Tat, blokował przekazywanie sygnału do replikacji
i tym samym przeciwdziałał namnażaniu się wirusa [13].
Pierwszym sukcesem w leczeniu chorób przy użyciu aptamerów był lek
o nazwie Macugen®. Stosuje się go w przypadku stwierdzenia mokrej
postaci zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Jest to
postępująca choroba oczu, która nieleczona skutkuje najpierw utratą
centralnego widzenia, a ostatecznie ślepotą. Dotyka ona najczęściej ludzi
powyżej 50 roku życia. Chociaż nie są znane przyczyny powstawania tej
choroby, to została ona powiązana z neowaskularyzacją w obrębie
naczyniówku, która jest stymulowana przez czynnik VEGF. Działanie
Macugenu® w tej chorobie polega na związaniu się z izoformą 164 VEGF,
co skutkuje zablokowaniem jego aktywności [14, 15]. Na podobnej
zasadzie działa szereg innych aptamerów, które wiążą się z: interferonem
γ [16], elastazą neutrofilową [17], czynnikiem krzepnięcia VIIa [18], czy
czynnikiem krzepnięcia krwi IXa [19].
W 2002 roku Ulrich H. i wsp. [20] zademonstrowali możliwość
wykorzystania aptamerów do walki z chorobą Chagasa. Jest to choroba
zwierząt i ludzi wywoływana przez świdrowca Trypanosoma cruzi,
przenoszona przez pluskwiaki z rodziny Reduviidae. W celu
Adrian Odrzywolski
142
przeprowadzenia selekcji, zostały wybrane receptory pasożyta wobec
czterech białek gospodarza, po czym uzyskano grupę aptamerów RNA
specyficznych do nich. Stwierdzono, że po zastosowaniu tychże
aptamerów, inwazja została obniżona o 50-70%.
4.2. Biosensory
Bardzo interesującym zagadnieniem jest zastosowanie aptamerów
w biosensorach. Biosensor to układ, który pozwala na detekcje określonej
substancji. Dobry biosensor powinien być selektywny, czuły, dawać
jednoznaczny sygnał z możliwie najmniejszym tłem.
Jest wiele różnych typów biosensorów, dlatego stworzono wiele różnych
ich klasyfikacji. Han i wsp.[9] zaproponował podział biosensorów na:
zmieniające strukturę pod wpływem badanej cząsteczki;
w układzie kanapkowym;
z odłączającym się aptamerem;
w układzie kompetencyjnym.
Biosensor zmieniający strukturę pod wpływem badanej cząsteczki
polega na tym, że aptamer występuje w postaci luźnego łańcucha, który
pod wpływem połączenia z badaną cząsteczką ulega zmianie
konformacyjnej. Zmiana ta pociąga za sobą z kolei jedną z trzech
możliwości: albo czynnik sygnałowy związany z aptamerem ulega
przemieszczeniu, albo ulega zmianie rozmiar całego kompleksu aptamer-
cząsteczka, albo aptamer zyskuje możliwość wiązania innych cząsteczek,
które powodują powstanie sygnału.
Mechanizm ten został z powodzeniem wykorzystany między innymi
do oznaczania kokainy [21]. W tym eksperymencie, aptamer rozpoznający
kokainę został połączony z kompleksem rutenu – Ru(bpy)2(dcbpy)NHS.
Następnie tak zmodyfikowany aptamer został połączony ze złotą elektrodą
za pomocą tiolo-Au. Po pojawieniu się kokainy na płytce, aptamer
z częściowo stabilnej struktury ulega zmianie do całkowicie stabilnej,
co z kolei powoduje przemieszczenie się kompleksu rutenu w kierunku
elektrody. Powoduje to pojawienie się sygnału dzięki reakcji
elektrochemiluminescencji między złotą elektrodą, a kompleksem rutenu.
Taki układ z powodzeniem można zastosować nie tylko do kokainy, ale
również do wielu innych związków takich jak alkaloid występujący
w ziarnach kakao – teofilina [22], czy też białkowy czynnik występujący
we krwi – PDGF [23].
Biosensor w układzie kanapkowym, znany również w oznaczaniu
za pomocą przeciwciał polega na ułożeniu warstwami kolejnych
odczynników. W przypadku aptamerów, stosuje się dwa rodzaje: aptamer-
białko-aptamer, bądź aptamer-białko-przeciwciało. Wymogiem tego trybu
,
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
143
jest to, aby białko posiadało dwa różne miejsca rozpoznawane przez aptamer
i przeciwciało. Jako przykład tej metody, może posłużyć metoda oznaczania
płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) [24], czy trombiny [25].
Biosensor z odłączającym się aptamerem przedstawia odmienną
mechanikę w porównaniu do aptamerów wspomnianych powyżej. W tym
trybie aptamer nie ma bezpośredniego wpływu na sygnał. Jego celem jest
oddysocjowanie się od sprzęgniętej z nim komplementarnej nici i związać
się z badaną cząsteczką. Jednymi z pierwszych stosujących tę metodę byli
Han i wsp.[26] Celem badania było oznaczenie ilości ATP w roztworze.
W tym celu zastosowano złotą elektrodę w postaci płytki, do której były
dołączone nici komplementarne do aptameru. W podstawowej formie
płytki, aptamery z nićmi komplementarnymi są zhydrydyzowane.
Następnie po dodaniu ATP i podniesieniu temperatury do 60°C, aptamery
oddysocjowują i łączą się z ATP. Po przywróceniu standardowych
warunków i odpłukaniu aptamerów związanych z ATP, niektóre nici
komplementarne nie były zhydrydyzowane. Następnie dodając trzecią nić
związaną z ferrocenem, łączy się ona z wolnymi nićmi komplementarnymi.
Zbadanie różnicy w pomiarze napięcia pozwala na określenie ilości ATP.
System z odłączającym się aptamerem powodzeniem zastosowano również
do oznaczania: trombiny [27] czy też lizozymu [28].
Ostatni wymieniony typ biosensora, to biosensor w układzie
kompetycyjnym. Opiera się na rywalizowaniu o związanie się
z aptamerem, między dwoma typami badanej cząsteczki – oznaczonej
jakimś znacznikiem, oraz nieoznaczonej. Metoda ta posłużyła między
innymi do oznaczenia poziomu trombiny [29]. Po związaniu aptameru
do podłoża przygotowuje się w różnych proporcjach mieszaninę trombiny
nieznakowanej i znakowanej fluoresceiną, po czym bada się absorbancję.
Następnie przygotowuje się mieszaninę z nieznaną ilością nieznakowanej
trombiny i dokonuje pomiaru. Otrzymany wynik będzie proporcjonalny do
ilości badanej substancji.
4.3. Dostarczanie leków
Dostarczanie substancji aktywnych do konkretnych komórek jest bardzo
istotnym elementem każdej terapii. Im bardziej specyficzne jest dostarczenie
leku tym jest on skuteczniejszy i nie wywołuje niepożądanych efektów.
Ma to szczególne znaczenie w przypadku terapii przeciwnowotworowych.
Powyższa idea leży u podstaw prób stosowania aptamerów
w dostarczaniu substancji cytotoksycznych. Jako przykład, może służyć
dostarczanie deksorubicyny za pomocą aptameru. Deksorubicyna jest
antybiotykiem z grupy atracyklin uzyskany z Streptomyces peuceticus. Jego
działanie polega na interkalacji w strukturę DNA, przez co blokuje on jego
Adrian Odrzywolski
144
replikację. Ma to szczególne znaczenie w przypadku komórek
szybkodzielących się, jakimi są m.in. komórki nowotworowe. W badaniu
Hu i wsp. [30] został wykorzystany aptamer wiążący się z białkiem MUC1,
który często ulega dużej nadekspresji u gruczolakoraków. Zbadano stopień
cytotoksyczności dla MUC1-dodatnich linii komórkowych: ludzkiego raka
piersi (MCF-7), ludzkiego raka płuc (A549), oraz MUC1-negatywnych:
ludzkiego raka wątroby (HepG2), ludzkiego zwykłego raka wątroby (L02),
które zostały uzyskane przez wyciszenie danego genu. Wyniki wskazywały
na znaczne obniżenie wchłaniania deksorubicyny w próbach negatywnych,
w porównaniu do prób pozytywnych.
Innym, szeroko stosowanym sprzęgnięciem substancji aktywnej
z aptamerem, jest użycie cząsteczki siRNA czyli małego, interferującego
RNA, które pozwala na zablokowanie ekspresji danego genu. Ten
mechanizm został wykorzystany do zatrzymania ekspresji genów wirusa
HIV poprzez związanie z mRNA wirusa i aktywacje jego degradacji [31].
W tym celu stworzono hybrydę aptamer-siRNA i zarażono wirusem HIV
humanizowane myszy. Stwierdzono, że następuje znaczne obniżenie ilości
cząsteczek wirusa u mysz, u których zastosowano hybrydę, w porównaniu do
tych, które dostały tylko cząsteczkę siRNA. Takie połączenie aptamer-
siRNA wykorzystywane jest również przeciw: komórkom raka piersi [32],
czerniakowi [33], czy raka płuc [34].
5. Podsumowanie
Aptamery mają bardzo wiele możliwości zastosowań, chociaż znane
są od niedawna. Dzięki ich cechom fizykochemicznym możliwym stało się
stworzenie narzędzia, które w wielu sytuacjach wyręcza przeciwciała.
Dzięki ich właściwości wiązania się z wysoką specyficznością, bardzo
dobrze pełnią rolę dostarczania substancji aktywnych do wybranego celu,
wizualizacji za pomocą biosensorów, czy też pełnienia roli jako
samodzielnego środka do inhibicji określonych cząsteczek. Ich niewielki
rozmiar, relatywnie niskie koszty produkcji, wytrzymałość na zmienne
warunki środowiska, oraz brak problemów etycznych pozwala sądzić,
że zainteresowanie nimi będzie w najbliższych latach rosło. Warunkiem
na to, aby mogły całkowicie przejąć funkcję przeciwciał, jest znalezienie
dobrego sposobu na usunięcie ich podstawowej wady – degradacji przez
nukleazy, oraz łatwego wypłukiwania z organizmu.
,
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
145
Podziękowania
Autor pragnie podziękować dr Adamowi Waśko za cenne sugestie przy
pisaniu tego artykułu. Również dziękuje dr hab. n. med. Radosławowi Roli
za konstruktywne uwagi i przychylną recenzję pracy.
Literatura
1. Tuerk C., Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 1990 vol. 249,
s. 505-510
2. Ellington A. D., SzostakJ. W., In vitro selection of RNA molecules that bind
specific ligands, Nature, 1990 vol. 346, s. 818-822
3. Stoltenburg R., Reinemann C., Strehlitz B., SELEX—A (r)evolutionary method
to generate high-affinity nucleic acid ligands, Biomolecular Engineering, 2007
vol. 24, s. 381-403
4. Huizenga D. E., Szostak J. W., A DNA aptamer that binds adenosine and ATP,
Biochemistry, 1995 vol. 34, s. 656-665
5. Li D, Wieckowska A, Willner I., Optical analysis of Hg2+ ions by
oligonucleotide-gold-nanoparticle hybrids and DNA-based machines,
Angewandte Chemie International Edition in English, 2008 vol. 47, s.3927-3931
6. Wilson D. S.,Szostak J. W., In vitro selection of functional nucleic acids,
Annual Review of Biochemistry, 1999 vol. 68, s. 611-647
7. Mendonsa S. D., Bowser M. T., In vitro evolution of functional DNA using
capillary electrophoresis, Journal of the American Chemical Society, 2004
vol. 124, s.20-21
8. Shangguan D., Li Y., Tang Z., Cao Z. C., Chen H. W., Mallikaratchy P., Sefah
K., Yang C. J., Tan W., Aptamers evolved from live cells as effective
molecular probes for cancer study, Proceedings of the National Academy
of Sciences, 2006 vol. 103, s. 11838-11843
9. Han K., Liang Z., Zhou N., Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors,
Sensors, 2010 vol. 10, s. 4541-4557
10. Manoharan M., Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with
improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action,
Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002 vol. 12, s. 103-128;
11. Shea R. G., Marsters J. C., Bischofberger N., Synthesis, hybridization
properties and antiviral activity of lipid-oligodeoxynucleotide conjugates,
Nucleic Acids Research, 1990 vol. 18, s. 3777-3783
12. Ostendorf T., Kunter U., Grone H. J., Bahlmann F., Kawachi H., Shimizu F.,
Koch K. M., Janjic N., Floege J., Specific antagonism of PDGF prevents renal
scarring in experimental glomerulonephritis, Journal of the American Society
of Nephrology, 2001 vol. 12, s. 909-918
13. Sullenger B. A., Gallardo H. F., Ungers G. E., Gilboa E., Overexpression
of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus
replication, Cell, 1990 vol. 63, s. 601-608
14. Klussmann S., The Aptamer Handbook. Functional Oligonucleotides and
Their Applications, Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006
Adrian Odrzywolski
146
15. Centrum informacji o Leku [online], [dostęp: 6 luty 2014]. Dostępny w World
Wide Web: http://leki-informacje.pl/lek/epar/726,macugen.html
16. Kubik M. F., Bell C., Fitzwater T., Watson S. R., Tasset D. M., Isolation
and characterization of 2l-fluoro-, 2l-amino-, and 2l-fluoro-/amino-modified
RNA ligands to human IFN-gamma that inhibit receptor binding, The Journal
of Immunology, 1997 vol. 159, s. 259-267
17. Bless N. M., Smith D., Charlton J., Czermak B. J., Schmal H., Friedl H. P.,
Ward P. A., Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase
in lung inflammatory injury, Current Biology, 1997 vol. 7, s. 877-880
18. Rusconi C. P., Yeh A., Lyerly H. K., Lawson J. H., Sullenger B. A., Blocking
the initiation of coagulation by RNA aptamers to factor VIIa, Current Issue
of Thrombosis and Haemostasis, 2000 vol. 84, s. 841-848
19. Rusconi C. P., Scardino E., Layzer J., Pitoc G. A., Ortel T. L., Monroe D.,
Sullenger B. A., RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor
IXa, Nature, 2002 vol. 419, s. 90-94
20. Ulrich H., Magdesian M. H., Alves M. J. M., Colli W., In vitro selection
of RNA aptamers that bind to cell adhesion receptors of Trypanosoma cruzi
and inhibit cell invasion, The Journal of Biological Chemistry, 2002 vol. 277,
s. 20756-20762
21. Li Y., Qi H., Peng Y., Yang J., Zhang C., Electrogenerated
chemiluminescence aptamer-based biosensor for the determination of cocaine,
Electrochemistry Communications, 2007 vol. 9, s. 2571-2575
22. Ferapontova E. E., Olsen E. M., Gothelf K. V., An RNA aptamer-based
electrochemical biosensor for detection of theophylline in serum, Journal
of the American Chemical Society, 2008, vol. 130, s. 4256-4258
23. Lai R. Y., Plaxco K. W., Heeger A. J., Aptamer-based electrochemical
detection of picomolar platelet-derived growth factor directly in blood serum,
Analytical Chemistry, 2007 vol. 79, s. 229-233
24. Wang J., Meng W., Zheng X., Liu S., Li G., Combination of aptamer with
gold nanoparticles for electrochemical signal amplification: Application
to sensitive detection of platelet-derived growth factor, Biosensors and
Bioelectronics, 2009 vol. 24, s. 1598-1602
25. Fang L., Lu Z., Wei H., Wang E., A electrochemiluminescence aptasensor
for detection of thrombin incorporating the capture aptamer labeled with gold
nanoparticles immobilized onto the thio-silanized ITO electrode, Analytica
Chimica Acta, 2008 vol. 628, s. 80-86
26. Han K., Chen L., Lin Z., Li G., Target induced dissociation (TID) strategy
for the development of electrochemical aptamer-based biosensor,
Electrochemistry Communications, 2009 vol. 11, s. 157-160
27. Yoshizumi J., Kumamoto S., Nakamura M., Yamana K., Target-induced
strand release (TISR) from aptamer–DNA duplex: A general strategy for
electronic detection of biomolecules ranging from a small molecule to a large
protein, Analyst, 2008 vol 133, s. 323-325
28. Peng Y., Zhang D., Li Y., Qi H., Gao Q., Zhang, C., Label-free and sensitive
faradic impedance aptasensor for the determination of lysozyme based
,
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
147
on target-induced aptamer displacement, Biosensors and Bioelectronics, 2009
vol. 25, s. 94-99
29. Lee M., Walt D. R., A Fiber-Optic Microarray Biosensor Using Aptamers
as Receptors, Analytical Biochemistry, 2000 vol. 282, s. 142-146
30. Hu Y., Duan J., Zhan Q., Wang F., Lu X., Yang X., Novel MUC1 Aptamer
Selectively Delivers Cytotoxic Agent to Cancer Cells In Vitro, Public Library
of Science, 2012 vol. 7
31. Neff C. H., Zhou J., Remling L., Kuruvilla J., Zhang J., Li H., Smith D. D.,
Swiderski P., Rossi J. J., Akkina R., An Aptamer-siRNA Chimera Suppresses
HIV-1 Viral Loads and Protects from Helper CD4+ T Cell Decline in
Humanized Mice, Science translational medicine, 2011 vol. 3
32. Thiel K. W., Hernandez L. I., Dassie J. P., Thiel W. H., Liu X., Stockdale K.
R., Rothman A. M., Hernandez F. J., McNamara J. O. 2nd, Giangrande P. H.,
Delivery of chemo-sensitizing siRNAs to HER2+-breast cancer cells using
RNA aptamers, Nucleic Acids Research, 2012 vol. 40, s. 6319-6337
33. Li L., Hou J., Liu X., Guo Y., Wu Y., Zhang L., Yang Z., Nucleolin-targeting
liposomes guided by aptamer AS1411 for the delivery of siRNA for the
treatment of malignant melanomas, Biomaterials, 2014
34. Lai W. Y., Wang W. Y., Chang Y. C., Chang C. J., Yang P. C., Peck K.,
Synergistic inhibition of lung cancer cell invasion, tumor growth and
angiogenesis using aptamer-siRNA chimeras, Biomaterials, 2014 vol. 35,
s. 2905-2914
Adrian Odrzywolski
148
Aptamery jako nowe narzędzie terapeutyczne
Streszczenie Aptamery zostały opisane po raz pierwszy w 1990. Są to zazwyczaj krótkie odcinki kwasów
nukleinowych, które mają określoną strukturę przestrzenną i wiążą się specyficznie z badaną
cząsteczką. Ich produkcja opiera się na stworzeniu puli losowych cząsteczek
oligonukleotydów, zsyntezowanych za pomocą chemii kombinatorycznej, oraz na szeregu rund selekcyjnych, nazywanych SELEX. Pozwala to na wyizolowanie tylko najlepiej
dopasowanych aptamerów do badanej cząsteczki. Dzięki swoim właściwościom wiązania
się specyficznie z badaną cząsteczką, są uważane za alternatywę dla przeciwciał.
W przeciwieństwie do nich, są odporne na działanie proteaz oraz na działanie czynników denaturujących. Również są relatywnie tanie i nie budzą wątpliwości natury etycznej.
Z drugiej strony, ich głównych problemem są nukleazy, które występują w każdym
środowisku. Aby przeciwdziałać ich aktywności należy stworzyć doskonalsze metody
modyfikacji aptamerów. Aptamery są doskonałym narzędziem do wielu typów badań:
dobrze sprawdzają się jako biosensory, czyli jako cząsteczki służące do wykrywania
różnych czynników, jak również do dostarczania leków docelowo do chorych komórek, czy
jako inhibitory szkodliwych cząsteczek.
Słowa kluczowe: aptamery, przeciwciała, SELEX
Aptamers as a new therapeutic tool
Abstract Aptamers were described for the first time in 1990. These are typically short stretches
of nucleic acids that have a specific spatial structure and bind specifically to the analyzed
molecule. Their production is based on creation of a pool of random oligonucleotides
molecules, synthesized using combinatorial chemistry, and the number of selection rounds, called SELEX. This allows to isolate only the best fitting aptamers to the analyzed molecule.
Due to their properties of binding specifically to the target, are considered as an alternative
to antibodies. In contrast to antibodies, are resistant to proteases and denaturing agents. Also
they are relatively cheap and do not raise any ethical concerns. On the other hand, their main problem are nucleases that are present in every environment. To counter their activity, there
is need to develop better methods of modification of aptamers. Aptamers are an excellent
tool for many types of studies: work well as biosensors, that is, as molecules for the
detection of various factors, as well as for delivery medicines to diseased cells, or as inhibitors of harmful agents.
Keywords: aptamers, antibodies, SELEX
149
Jan Sobstyl1, Paulina Sobstyl
2, Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna
Schab, Magdalena Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka,
Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne
wybranych przeciwciał monoklonalnych
1. Wstęp
Przeciwciała (immunoglobuliny) są glikoproteinami i należą do
najważniejszych cząsteczek układu odpornościowego. Posiadają niezwykłą
zdolność do swoistego łączenia się z antygenem i odgrywają zasadniczą
rolę w obronie organizmu przed bakteriami, wirusami i pasożytami
zewnątrzkomórkowymi oraz w mniejszym stopniu grzybami, a także
pasożytami i bakteriami wewnątrzkomórkowymi. Występują w płynach
ustrojowych wszystkich kręgowców. Na skutek wniknięcia antygenu do
organizmu, limfocyty B po kooperacji z limfocytami T ulegają aktywacji,
proliferacji i różnicowaniu w komórki intensywnie wytwarzające
i wydzielające przeciwciała. Komórki te mogą dalej się dzielić,
a końcowym etapem ich różnicowania są komórki plazmatyczne.
Przeciwciała mogą stanowić nawet 75-90% białek syntetyzowanych przez
te komórki. Wszystkie przeciwciała zbudowane są z czterech łańcuchów
polipeptydowych: dwóch lekkich L (light) i dwóch ciężkich H (heavy)
połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi. U człowieka wyróżnia się pięć
klas przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Podział ten opiera się
na różnicach w budowie łańcuchów ciężkich, w których wyróżnia się
odpowiednio łańcuch α (alfa), δ (delta), ε (epsilon), γ (gamma), μ (mi).
Zarówno w łańcuchach lekkich jak i ciężkich można wyróżnić, leżące na
N-końcu, części zmienne V i na C-końcu części stałe C. Kolejność
aminokwasów części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich definiuje
konfigurację przestrzenną, z której bezpośrednio wynika swoistość
przeciwciała do danego antygenu. W strukturze przeciwciała po trawieniu
papainą wyróżnia się dwa fragmenty Fab zawierające miejsca wiążące
określony antygen, oraz fragment krystalizujący Fc dla którego receptory
1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny
w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Zakład Genetyki Klinicznej Uniwersytetu
Medycznego w Lublinie ul. Radziwiłłowska 11 20-080 Lublin 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny
w Lublinie, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Zakład Genetyki Klinicznej Uniwersytetu
Medycznego w Lublinie ul. Radziwiłłowska 11 20-080 Lublin
Jan Sobstyl , Paulina Sobstyl , Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna Schab, Magdalena
Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka, Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
150
znajdują się na wielu komórkach efektorowych i biorący udział między
innymi w aktywacji układu dopełniacza[1,2]. Swoistość wiązania się
immunoglobuliny z antygenem jest cechą, która dała nadzieje na leki nowej
generacji działające bezpośrednio na czynnik chorobotwórczy, niezależnie
od tego czy jest to patogen czy zmutowane komórki własnego organizmu.
W 1975 r. Georges Köhler i Cesar Milstein opracowali metodę produkcji
przeciwciał monoklonalnych (PM), za co 9 lat później otrzymali Nagrodę
Nobla [3]. Metoda ta pozwalała na produkcję przeciwciał wyłącznie
mysich, obecnie dzięki inżynierii genetycznej i zastosowaniu nowych
technik: „phage display” oraz techniki tworzenia zwierząt transgenicznych
możliwa jest produkcja przeciwciał ludzkich. Ponadto przeciwciała
monoklonalne stosuje się nie tylko jako swoiste leczenie, ale też
w diagnostyce chorób, oraz w badaniach naukowych [5].
2. Metody produkcji przeciwciał monoklonalnych
Metoda opracowana przez Milsteina i Kohlera tzw. „klasyczna”
polegała na fuzji limfocytów B wytwarzających swoiste przeciwciała
i komórek szpiczaka. Limfocyty B pobierane były od zimmunizowanej
odpowiednim antygenem myszy, a następnie izolowane ze śledziony.
Na skutek fuzji powstają linie komórkowe zwane hybrydoma. Limfocyt B
nadawał przeciwciałom swoistość względem antygenu, natomiast komórka
szpiczaka, jako komórka nowotworowa, nieśmiertelność oraz rybosomy
i dobrze rozwinięty aparat Golgiego.
W metodzie „phage display” (metoda ekspozycji bibliotek fagowych),
wbudowuje się geny dla części zmiennych zarówno łańcuchów lekkich jak
i ciężkich do genomu faga włókienkowego, na skutek czego dochodzi do
ekspresji kodowanych białek na powierzchni faga. Następnie izoluje się
fagi na kolumnach opłaszczonych antygenem swoistym do cząsteczek
na powierzchni faga.
W technice produkcji PM ludzkich z zastosowaniem zwierząt
transgenicznych wprowadza się osobno miniloci dla segmentów genowych
uczestniczących w syntezie przeciwciał (segmenty V, D, J, i w przypadku
łańcucha ciężkiego oraz V, J i części stałej łańcucha ) do
embrionalnych komórek macierzystych myszy z zablokowanymi genami
dla ich własnych immunoglobulin. Otrzymane transgeniczne myszy
immunizuje się i uzyskuje limfocyty B, zdolne do produkcji swoistych
w stosunku do danego antygenu przeciwciał [2,4]. Immunizacja
transgenicznych myszy Xenomouse (Abgenix) i HuMab Mouse (Medarex),
zawierających wymienione immunoglobulinowe łańcuchy ciężkie i kappa
na ludzkie odpowiedniki, pozwala na uzyskanie znaczących ilości ludzkich
przeciwciał, które nie wymagają dalszej obróbki biotechnologicznej [5].
,
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał monoklonalnych
151
3. Nazewnictwo i podział przeciwciał monoklonalnych
W celu uporządkowania i ujednolicenia nazw PM wprowadzono
międzynarodowe zasady nazewnictwa, w zależności od pochodzenia
danego preparatu. Wszystkie PM zawierają końcówkę „-mab”. Jeśli
przeciwciało w całości pochodzi od myszy, wówczas przed wspólną
końcówkę dodaję się literę „o” (np. edrecolomab). Przeciwciała w których
części zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich pochodzą od myszy,
natomiast części stałe od człowieka, nazywa się chimerycznymi. Zawierają
one około 75% sekwencji ludzkich. W tym przypadku końcówka
poprzedzona jest wstawką „xi” (w nazewnictwie polskim „ksy”,
np. infilksymab). Przeciwciała w których tylko tzw. regiony hiperzmienne
części zmiennych są pochodzenia mysiego, a pozostałe sekwencje są od
człowieka, nazywa się humanizowanymi. Zawierają one około 95%
sekwencji ludzkich. W przypadku tych przeciwciał dodaję się wstawkę
„zu” (np. trastuzumab). Przeciwciała pochodzenia w całości ludzkiego
zawierają wstawkę „u” (np. adalimumab). Wyróżnia się jeszcze przeciwciała
pochodzące od szczura, wówczas dodaję się wstawkę „a” (-amab), oraz
od chomika ze wstawką „e” (-emab) [6].
4. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych
Stosowanie przeciwciał monoklonalnych pochodzenia mysiego wiąże
się z indukcją odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko
przeciwciałom, a także z ryzykiem wystąpienia reakcji anafilaktycznej.
W związku z powyższym zazwyczaj nie można podawać wielokrotnie temu
samemu pacjentowi mysich PM. Wraz ze zwiększaniem sekwencji
ludzkich w strukturze przeciwciał, ten problem tracił na znaczeniu.
Przeciwciała mysie w związku z dużą masą cząsteczkową słabo
penetrowały tkanki docelowe, co wiązało się z obniżeniem skuteczności ich
działania. Obecnie możliwa jest produkcja mniejszych cząsteczek
zachowujących swoistość. Są to bądź pochodne przeciwciał wielbłądów
i rekinów, bądź monowalentne fragmenty Fab, Fab’ lub ich części
warunkujące swoistość czyli fragmenty Fv. Wyróżnia się także
jednołańcuchowe białka scFv (single chain Fv), z których można ponadto
stworzyć tzw. miniciała składające się z 2 cząstek scFv przyłączonych do
minifragmentu Fc. Tak zmienione PM charakteryzują się reagowaniem
z ukrytymi epitopami antygenów, zwiększoną penetracją i akumulacją
w tkankach docelowych. Przeciwciała monoklonalne można łączyć
z innymi cząsteczkami takimi jak radioizotopy, toksyny, leki, cytokiny
czy enzymy [2, 5].
Jan Sobstyl , Paulina Sobstyl , Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna Schab, Magdalena
Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka, Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
152
4.1. Radioimmunokoniugaty
Koniugaty PM z radioizotopami stosowane są głównie w onkologii,
zarówno w celach diagnostycznych (promieniowanie ) jak i w terapii
(promieniowanie ). Preparaty te znalazły zastosowanie w leczeniu
nowotworów układu chłonnego. Są to przeciwciała mysie anty-CD20
skoniugowane z izotopem itru (90
Y-ibritumomab tiuksetanu) oraz z jodem
131 (131
I-tositumomab). Obecnie terapię radioimmunokoniugatami
w chłoniakach agresywnych stosuje się w leczeniu konsolidującym po
chemioterapii indukcyjnej pierwszego rzutu lub w przypadkach nawro-
towych i opornych przed autologicznym przeszczepieniem macie-rzystych
komórek krwiotwórczych (auto-HSCT, autologous hematopoetic stem cell
transplantation). Do działań niepożądanych 90
Y-ibritumomabu tiuksetanu
należy głównie mielotoksyczność. Neutropenię obserwuje się u 30%
pacjentów, małopłytkowość u 10%, a niedokrwistość u 3% chorych.
W przypadku 131
I-tositumomabu toksyczność ograniczająca dawkę również
związana jest z mielotoksycznością. Podwyższony poziom TSH występuje
rzadko, a objawów hipotyreozy nie zaobserwowano [7, 8].
4.2. PM sprzężone z toksynami
Skoniugowanie przeciwciał monoklonalnych z toksynami niosło ze sobą
wiele nadziei, jak się jednak okazało takie połączenie skutkowało wysoką
immunogennością oraz toksycznym wpływem na wątrobę na skutek
niespecyficznego wychwytu. Do badań wykorzystuje się głównie
dyfterotoksynę, egzotoksynę A Pseudomonas oraz rycynę. Mechanizm
działania toksyny dyfterytu wytwarzanej przez Corynebacterium diphteriae
oraz egzotoksyny A wytwarzanej przez Pseudomonas aeruginosa jest,
mimo różnic w sekwencji, bardzo podobny. Obie toksyny katalizują
ADP-rybozylację dyftamidy, czynnika elongacyjnego EF-2 w cytozolu,
zahamowanie procesu translacji i w konsekwencji śmierć komórki.
Zastosowanie immunotoksyn pozwala niszczyć wybrane komórki, nie
powodując szkody pozostałym. W badaniach klinicznych intensywnie
badane są immunotoksyny wiążące się z komórkami nowotworów
hematologicznych. Taką immunotoksyną jest skoniugowane przeciwciało
anty-CD25 ze skróconą egzotoksyną A. Wykazano jej skuteczność wobec
przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej i neoplazji komórek T.
Dyfterotoksynę jak na razie skutecznie łączy się nie z PM a z IL-2.
Powstały w ten sposób lek o nazwie Ontak stosowany jest w leczeniu
chłoniaka skóry wywodzącego się z limfocytów T. Na komórkach tego
nowotworu zaobserwowano dużą koncentrację receptorów dla IL-2. W celu
zmniejszenia toksyczności wobec przypadkowych komórek, toksyny
zostają poddane mutacjom (zmiana w dyfterotoksynie Leu390 i Ser525
,
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał monoklonalnych
153
na Phe). Powoduje to znaczne obniżenie powinowactwa immunotoksyny
do komórek przypadkowych, nie wpływając tym samym na zdolność
przemieszczenia się toksyny do cytozolu komórki. Immunotoksyny poddaje
się również mutacjom mającym na celu zwiększenie powinowactwa do
receptora, dzięki czemu uzyskuje się większą cytotoksyczność [9, 10].
4.3. Przeciwciała monoklonalne sprzężone z lekami oraz terapia
ADEPT
W przeciwieństwie do immunotoksyn, koniugaty leków i PM nie
powodują tak nasilonej immunogenności. Wraz z PM sprzęgano tradycyjne
leki przeciwnowotworowe (np. doksorubicynę) jak i silne toksyny nie
podawane systemowo jak aurystatyna E, inhibitory polimerazy tubuliny
czy kalicheamycyna. Do leczenia zarejestrowano koniugat PM anty-CD30
i aurystatyny E, tzw. brentuksymab wedotyna, stosowany do leczenia wznowy
ziarnicy złośliwej i chłoniaka anaplastycznego wielkokomórkowego.
Najczęściej występujące objawy uboczne to zmęczenie, podwyższona
temperatura, nudności, neutropenia oraz obwodowa neuropatia [11,12].
Nieco innym połączeniem PM oraz leku jest terapia ADEPT (antibody-
directed enzyme prodrug therapy). W tej terapii PM swoiste to komórek
nowotworu nie jest połączone z lekiem, a z enzymem który przekształca
podany w drugiej kolejności prolek w postać aktywną leku. Prolek jest
formą nietoksyczną, a przejście w formę letalną dla komórek występuje
wyłącznie w miejscu w którym występuje podany wcześniej enzym
połączony z PM, a więc wyłącznie na komórkach nowotworu. Przed
podaniem proleku należy wcześniej oczyścić krew z enzymu. Taka terapia
pozwala na uniknięcie ogólnoustrojowego działania toksycznego leku, którego
stężenie skumulowane jest jedynie w obrębie tkanki nowotworowej [15].
4.4. PM sprzężone z cytokinami
Podejmuje się próby leczenia chorób nowotworowych z użyciem
immunocytokin, czyli przeciwciał monoklonalnych sprzężonych
z cytokinami. Cząsteczka taka działa poprzez wiązanie i niszczenie
komórki docelowej w mechanizmie ADCC (cytotoksyczność komórkowa
zależna od przeciwciał) bądź aktywację dopełniacza. Cytokiny z kolei
aktywują i stymulują proliferację komórek efektorowych.[2] Immuno-
cytokiny można podzielić na dwie kategorie: duże białka fuzyjne
z cytokinami sprzężonymi z łańcuchami ciężkimi całych przeciwciał
(IgG, >150kDa), lub małe białka fuzyjne, z cytokinami sprzężonymi
z fragmentami scFv przeciwciał (>28kDa). Pierwsze są preferowane, jeśli
wymagany jest długi okres półtrwania w krążeniu. Z kolei drugie, mniejsze
immunocytokiny, obecne są przez krótki okres w krążeniu i preferuje się je
Jan Sobstyl , Paulina Sobstyl , Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna Schab, Magdalena
Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka, Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
154
w celu uniknięcia efektów ubocznych wynikających z długotrwałej
obecności w organizmie. Połączenie cytokiny z przeciwciałem wcale nie
gwarantuje dotarcia cytokiny do miejsca docelowego. Po pierwsze większość,
antygenów zlokalizowanych jest w strukturach okołonaczyniowych
i immunocytokiny muszą opuścić naczynie krwionośne, aby dotrzeć do
miejsca objętego chorobą. Po drugie wysokie wartości punktu
izoelektrycznego, glikozylacja, oraz duży rozmiar są molekularnymi
mechanizmami, które prowadzą do obniżenia stężenia cytokin w miejscu
docelowym i tym samym zmniejszonej skuteczności terapeutycznej.
Jednym z przykładów immunocytokiny jest IL-2 połączona z fragmentem
przeciwciała skierowanego przeciwko jednej z cząsteczek adhezyjnych
o nazwie EpCAM, obecnej na powierzchni komórek nowotworowych
pochodzenia nabłonkowego (rak okrężnicy, jajnika, płuc, gruczołu
krokowego). Do objawów ubocznych należą uogólniony zespół
przesiąkania włośniczek, hipotensję, gorączkę, złe samopoczucie oraz
nudności. Immunocytokinę sprzężoną z IL-12 stosuje się w badaniach
w leczeniu mięsaka Kaposiego, chłoniaka T komórkowego, oraz
chłoniaków nieziarniczych. Po stosowaniu zaobserwowano następujące
objawy uboczne: gorączka, dreszcze, zmęczenie, utrata wagi, nudności oraz
podwyższony poziom transaminaz. Koniugat z TNF- obecnie jest
sprawdzany w badaniach klinicznych pod względem skuteczności
w leczeniu czerniaka złośliwego. Do objawów ubocznych należą nudności
i wymioty oraz lekkie dreszcze [13, 14].
4.5. Przeciwciała bispecyficzne
Przeciwciała takie wytwarza się łącząc ze sobą dwie różne
immunoglobuliny, czego konsekwencją jest powstanie cząsteczki
o czterech fragmentach Fab. Jest możliwe również stworzenie przeciwciał
o czterech fragmentach Fab, z których każdy jest różny od siebie
(tzw. hybrydy hybryd, kwadroma), lub stworzenie koniugatów cząsteczek
scFv. Mechanizm działania bispecyficznego przeciwciała polega na tym,
że jedna para fragmentów Fab wiąże się swoiście z antygenem
nowotworowym (np. EpCAM, CEA, CD20, HER-2/neu, MUC-1),
natomiast druga para jest swoista w stosunku do komórek układu
odpornościowego (np. limfocyty T, komórki NK), działających zabójczo na
komórki nowotworowe [2]. Przykładem takiej cząsteczki jest
katumaksomab, trójfunkcyjne przeciwciało o dwóch miejscach wiążących
antygen i funkcjonalnej domenie Fc. Dwie domeny Fab wiążą się poprzez
EpCAM (epithelial cell-adhesion molecule) do komórek nowotworu,
pozostałe dwa fragmenty Fab do limfocytów T poprzez cząsteczkę CD3.
Następnie katumaksomab aktywuje komórki pomocnicze, łącząc się
,
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał monoklonalnych
155
domeną Fc z
immunologicznych komórek efektorowych w obszarze guza prowadzi do
polepszenia eliminacji komórek guza poprzez różnorodne immunologiczne
mechanizmy zabijania komórek. Ekspresja EpCAM występuje
w większości nowotworów nabłonkowych. Komórki nowotworowe obecne
w wysięku w jamie otrzewnej i spowodowanego tym wodobrzusza
w przebiegu raka piersi, jajnika, żołądka czy jelita grubego posiadają
w 70-100% ekspresję EpCAM. W zdrowych komórkach, również
obserwuje się ekspresję EpCAM, jednak co ciekawe ligand ten nie jest
dostępny dla przeciwciała, ponieważ chroniony jest on blaszką podstawną.
Co więcej jama otrzewnej wyścielona jest komórkami mezotelialnymi na
których nie występuje ekspresja EpCAM [16].
4.6. Inne modyfikacje PM
Zauważono, iż przeciwciała łączą się z antygenem w sposób bardzo
zbliżony do połączenia enzymu z substratem. Stworzono więc przeciwciała
o właściwościach enzymu: stabilizujące stan przejściowy, zmniejszające
energię aktywacji danej reakcji chemicznej, oraz przyspieszające ją
ok. miliona razy. W badaniach próbuje się wykorzystać te przeciwciała
np. w terapii uzależnień oraz detoksykacji po przedawkowaniu kokainy,
z użyciem abzymu przekształcającego kokainę do neutralnego metabolitu,
a także w leczeniu zakażenia HIV, z zastosowaniem abzymu inaktywującego
glikoproteinę gp120 uczestniczącą w procesie zakażenia limfocytów przez
wirus HIV [2].
5. Podsumowanie
Przeciwciała monoklonalne stosowane są w leczeniu już od ponad
30 lat. Postęp w technologii, a także rozwój diagnostyki molekularnej
i inżynierii genetycznej wpłynął na wprowadzenie do praktyki klinicznej
wielu przeciwciał monoklonalnych takich jak katumaksomab,
brentuksymab wedotyna, 90
Y-ibritumomab tiuksetanu, 131
I-tositumomab
oraz wielu innych. Wymagane są dalsze badania nad przeciwciałami
monoklonalnymi, w celu zwiększenia ich specyficzności oraz zmniejszenia
toksyczności ogólnoustrojowej. Niemniej jednaj leczenie PM w coraz
większym stopniu staje się ważnym elementem w farmakoterapii oraz
pozwala na mniej uciążliwe oraz bardziej selektywne leczenie.
Jan Sobstyl , Paulina Sobstyl , Karol Terlecki, Paulina Chwil, Katarzyna Schab, Magdalena
Amarowicz, Marcin Urbańczuk, Dominika Mulawka, Paulina Mulawka, Lidia Kotuła
156
Literatura
1. Sala K. Przeciwciała – budowa i podział, dostęp 5.02.2014, http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Przeciwciala-budowa-i-podzial/
2. Gołąb J., Jakóbsiak M., Lasek W., Stokłosa T. Immunologia, Wyd. 6, Warszawa, PWN, 2012, ISBN 978-83-01-17108-7
3. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984. Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013. dostęp 6.02.2014 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/
4. Powroźnik B., Kubowicz P., Pękala E. Przeciwciała monoklonalne w terapii celowanej, Postepy Hig Med Dosw. (online), 2012; 66: 663-673
5. Monoclonal Antibody Production, A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, National Academy Press, Washington, DC 1999
6. Sosińska-Mielcarek K., Jassem J. Przeciwciała monoklonalne w leczeniu nowotworów litych, Onkologia w Praktye Klinicznej 2005, tom 1, nr 4, str. 225-232
7. Wróbel T. Przeciwciała monoklonalne anty-CD20 w terapii chłoniaków agresywnych, Hematologia 2010; 1, 4: 342-351
8. Kaminski et al., Radioimmunotherapy with iodine 131I tositumomab for relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma: updated results and long-term follow-up of the University of Michigan experience, Blood, 15 August 2000, Volume 96, Number 4, 1259-1266
9. Maj J., Jankowska-Konsur A. Wybrane aspekty leczenia chłoniaków pierwotnie skórnych, Dermatologia Praktyczna 1/2011, 5-11
10. Łepeta K., Łasica A. M., Jagusztyn-Krynicka E. K. Zastosowanie produktów w terapiach antynowotworowych, Post. Mikrobiol., 2010, 49, 4, 255-268
11. Balwierz W., Dzikowska K., Szurgot M., Klekawka T., Moryl-Bujakowska A. Postępy w leczeniu chłoniaka Hodgkina u dzieci i młodzieży, Acta Haematologica Polonica 44, 2013, 182-187
12. Younes A., Bartlett N. L., Leonard J. P., Kennedy D. A., Lynch C. M., Sievers E. L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) for Relapsed CD30-Positive Lymphomas, N Engl J Med 2010; 363:1812-1821
13. Szyda A., Rossowska J., Pajtasz-Piasecka E., D. Duś Czy komórki dendrytyczne modyfikowane wektorami retrowirusowymi z genami cytokin staną się narzędziem terapeutycznym?, Postepy Hig Med Dosw. (online), 2006; 60: 552-562
14. List T., Neri D. Immunocytokines: a review of molecules in clinical development for cancer therapy, Clin Pharmacol. 2013; 5(Suppl 1): 29-45
15. Sharma S. K. ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy) & Translational Therapeutics, dostęp 11.02.2014, http://www.ucl.ac.uk/cancer/oncology/adept
16. Heiss M., Murawa M, Koralewski P., Kutarska E., Kolesnik O. O., Ivanchenko V. V., Dudnichenko A. S., Aleknaviciene B., Razbadauskas A., Gore M., Ganea-Motan E., Ciuleanu T., Wimberger P., Schmittel A., Schmalfeldt B., Burges A., Bokemeyer C., Lindhofer H., Lahr A., Parsons S. L. (2010), The trifunctional antibody catumaxomab for the treatment of malignant ascites due to epithelial cancer: Results of a prospective randomized phase II/III trial, Int. J. Cancer, 127: 2209-2221
,
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych przeciwciał monoklonalnych
157
Charakterystyka oraz możliwości terapeutyczne wybranych
przeciwciał monoklonalnych
Streszczenie
Przeciwciała (immunoglobuliny) są glikoproteinami i należą do najważniejszych cząsteczek układu odpornościowego. Posiadają niezwykłą zdolność do swoistego łączenia się
z antygenem i odgrywają zasadniczą rolę w obronie organizmu przed bakteriami, wirusami
i pasożytami zewnątrzkomórkowymi oraz w mniejszym stopniu grzybami, a także
pasożytami i bakteriami wewnątrzkomórkowymi. Swoistość wiązania się immunoglobuliny z antygenem jest cechą która dała nadzieje na leki nowej generacji, działające bezpośrednio
na czynnik chorobotwórczy, niezależnie od tego czy jest to patogen czy zmutowane
komórki własnego organizmu. W 1975 r. Georges Köhler i Cesar Milstein opracowali
metodę produkcji przeciwciał monoklonalnych (PM), za co 9 lat później otrzymali Nagrodę Nobla. Przeciwciała monoklonalne można łączyć z innymi cząsteczkami takimi jak
radioizotopy, toksyny, leki, cytokiny czy enzymy. Przeciwciała monoklonalne w tym
katumaksomab, brentuksymab wedotyna, 90Y-ibritumomab tiuksetanu, 131I-tositumomab
są obecnie wykorzystywane do leczenia wielu chorób.
Słowa kluczowe: przeciwciała monoklonalne, katumaksomab, brentuksymab wedotyna,
90Y-ibritumomab tiuksetanu, 131I-tositumomab
Characteristics and therapeutic abilities of the chosen monoclonal
antibodies
Abstract
Antibodies (immunoglobulins) are glycoproteins and one of the most important molecules
of the immune response system. Antibodies have an unique ability to bind specifically to the antigen and play an essential role in the organism defense against bacteria, viruses,
extracellular parasites and to a lesser extent fungus, intracellular parasites, and intracellular
bacteria. Specifically binding to the antigen made immunoglobulins a potential new
generation of medicine, which acts direct to the disease causative agent, whether this is a pathogen or a mutated body’s own cell. In the 1975 Georges Köhler and Cesar Milstein
discovered the principle for production of monoclonal antibodies (mAb), and were awarded
a Nobel Prize 9 years later. Monoclonal antibodies may be fused with other molecules such
as radioisotopes, toxins, medicines, cytokines and enzymes. Monoclonal antibodies such as catumaxomab, brentuximab vedotin, 90Y-ibritumomab tiuxetan, 131I-tositumomab are
increasingly used in the treatment of many diseases.
Keywords: monoclonal antibodies, catumaxomab, brentuximab vedotin, 90Y-ibritumomab tiuxetan, 131I-tositumomab
158
Katarzyna Szałapata1, Monika Osińska-Jaroszuk
1, Anna Jarosz-Wilkołazka
1
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia
stosowane w różnych dziedzinach życia
1. Wprowadzenie
Enzymy proteolityczne (określane również jako peptydazy lub proteazy)
stanowią dużą grupę białek enzymatycznych odpowiedzialnych za
hydrolizę wiązania peptydowego w różnych biocząsteczkach. Są one
szeroko rozpowszechnione w świecie organizmów żywych, występują
zarówno u zwierząt, roślin, jak i mikroorganizmów. U zwierząt, poza
trawieniem składników odżywczych dostarczanych z pobieranym
pokarmem, enzymy te są zaangażowane w kilka istotnych procesów takich
jak aktywacja proenzymów i prohormonów czy mechanizmy obronne
np. aktywacja układu dopełniacza lub kaskady krzepnięcia krwi [1, 2].
Mimo tego, że proteazy pełnią ważne funkcje regulacyjne, mogą
stanowić również zagrożenie dla homeostazy organizmu poprzez zaburzenie
prawidłowego funkcjonowania białek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych.
Uniknięcie negatywnych skutków niekontrolowanej proteolizy osiągane
jest m.in. dzięki regulacji ekspresji, sekrecji i aktywacji proenzymów oraz
degradacji enzymu. Jedno z ważniejszych miejsc wśród procesów
kontrolnych zajmuje regulacja poprzez naturalną inhibicję, a proces
równowagi pomiędzy miejscowo występującymi proteazami oraz
skierowanymi przeciwko nim inhibitorami decyduje o równowadze
funkcjonowania komórki, tkanki, a nawet całego organizmu [3, 4].
Celem niniejszej pracy jest przybliżenie tematyki związanej
z klasyfikacją inhibitorów proteaz i mechanizmem ich działania oraz
przedstawienie praktycznych zastosowań tych cząsteczek w różnych
dziedzinach życia.
1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział
Biologii i Biotechnologii, Zakład Biochemii http://www.fungi.umcs.lublin.pl/
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
159
2. Klasyfikacja inhibitorów proteaz
Pod względem budowy chemicznej cząsteczki inhibitorów proteaz
w znacznej większości są białkami lub peptydami. Możemy jednak spotkać się
również z inhibitorami, które są polisacharydami, polifenolami, glikolipidami,
triterpenami lub niebiałkowymi związkami niskocząsteczkowymi [5, 6].
Podstawowe kryterium podziału inhibitorów proteaz jako cząsteczek
regulujących katalityczną aktywność enzymów proteolitycznych opiera się
na klasyfikacji według trzech różnych zasad: typu inhibowanej proteazy,
mechanizmu reakcji wiązania do proteazy oraz sekwencji aminokwasowej
inhibitora [4].
2.1. Klasyfikacja według typu inhibowanej proteazy
Biorąc pod uwagę typy hamowanej proteazy inhibitory można podzielić
na dwie duże grupy, pierwsza z nich to inhibitory niespecyficzne, natomiast
druga obejmuje inhibitory klasowo specyficzne [4].
Inhibitory niespecyficzne są odpowiedzialne za regulację enzymów
proteolitycznych z różnych klas. W niektórych przypadkach może
dochodzić do sytuacji, w której jeden inhibitor kontroluje wszystkie klasy
proteaz. Do grupy tej zaliczamy α2-makroglobulinę, która jest dużym
białkiem o niskiej specyficzności względem rodzaju hamowanego enzymu.
Posiadając tak szerokie spektrum działania, α2-makroglobulina odgrywa
ważną rolę w wielu fizjologicznych procesach organizmów zwierzęcych [7].
W odróżnieniu od inhibitorów niespecyficznych, inhibitory klasowo
specyficzne hamują aktywność proteolityczną proteaz pochodzących
wyłącznie z odpowiadających im klas katalitycznych. W ten sposób zostały
wyróżnione m.in.:
inhibitory proteaz serynowych (wśród których najbardziej znane
są tzw. Kuniny, inhibitory Kazala, inhibitory z rodziny Bowmana-
Birka, serpiny i hirudyny);
inhibitory proteaz cysteinowych (takie jak cystatyny, stefiny,
kininogeny czy tyropiny);
inhibitory metaloproteaz (np. rodzina TIMP);
inhibitory proteaz asparaginowych [3, 4, 8].
Godnym podkreślenia jest fakt, że ten rodzaj klasyfikacji inhibitorów
powstał jako pierwszy. Był on powszechnie stosowany przez długi czas,
a obecnie również cieszy się popularnością ze względu na swoją prostotę.
Jednak biorąc pod uwagę, że nie odnosi się on do tak ważnych cech
inhibitorów jak mechanizm wiązania cząsteczki inhibitora do cząsteczki
enzymu czy opis sekwencji aminokwasowej inhibitorów, utworzone
zostały inne metody klasyfikacji tych cząsteczek.
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
160
2.2. Klasyfikacja według mechanizmu reakcji wiązania do
proteazy
Zdecydowana większość inhibitorów proteaz pracuje według schematu,
w którym podstawową zasadą jest zablokowanie miejsca aktywnego
enzymu. Zatem klasyfikacja według mechanizmu reakcji wiązania
inhibitora do proteazy opiera się na różnych typach interakcji pomiędzy
inhibitorem a hamowanym enzymem. Wyróżniamy tutaj między innymi
podział inhibitorów na działające według mechanizmu pułapkowania,
inhibitory kanoniczne lub inhibitory działające według mechanizmu
„samobójczego” [4]. Szerszy opis tych reakcji zamieszczony został
w Podrozdziale 2.
2.3. Klasyfikacja według sekwencji aminokwasowej inhibitora
W roku 2004 Rawlings i wsp. [9] podjęli próbę klasyfikacji inhibitorów
proteaz na podstawie homologii ich sekwencji aminokwasowych.
Wynikiem tej pracy było wydzielenie 48 rodzin inhibitorów [4, 10].
Obecnie z klasyfikacją i nomenklaturą wszystkich inhibitorów
enzymów proteolitycznych, dla których są znane sekwencje
aminokwasowe, można się zapoznać dzięki wirtualnej, systematycznie
aktualizowanej bazie MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/).
Dotychczas inhibitory wprowadzone do bazy zostały zaklasyfikowane do
76 rodzin oraz 39 klanów [4, 11].
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
161
Rys. 1 Przykładowy ekran systemu MEROPS przedstawiający informacje dotyczące
wybranej rodziny inhibitorów [11]
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
162
System MEROPS dostarcza informacji w dziedzinie mechanizmu
inhibicji danej rodziny inhibitorów, jej homologów, rozpowszechnienia
występowania wśród organizmów żywych oraz struktury cząsteczki.
Dodatkowo dzięki bazie danych można szukać powiązań i interakcji
pomiędzy inhibitorami a wybranymi enzymami proteolitycznymi (Rys. 1).
3. Mechanizm reakcji inhibicji
Wśród reakcji inhibicji enzymów proteolitycznych możemy wyróżnić
ich dwa główne mechanizmy. Pierwszy z nich opisuje reakcje
nieodwracalnego pułapkowania - ang. „trapping” reactions (Rys. 2A).
Reakcje te zachodzą wyłącznie z udziałem endopeptydaz i są wynikiem
konformacyjnych zmian w strukturze inhibitora wywołanych przez
rozszczepienie wewnętrznego wiązania peptydowego przez proteazę
gospodarza. Obecnie zidentyfikowano trzy rodziny inhibitorów, które
są zaangażowane w te reakcje: rodzina I4 (serpiny), rodzina I39
(α2-makroglobulina) oraz rodzina I50 (wirusowe inhibitory kaspaz) [8‚10].
Mechanizm pułapkowania jest najbardziej charakterystyczny dla
α2-makroglobuliny. W przypadku wszystkich klas enzymów proteolitycznych
dochodzi do ich związania w tym samym miejscu cząsteczki makroglobuliny.
Związanie to prowadzi do zmian konformacyjnych w strukturze inhibitora
i zablokowania możliwości interakcji innych białek z przechwyconym
przez inhibitor białkiem enzymatycznym. Nowo powstały kompleks
makroglobulina - proteaza jest bardzo szybko wychwytywany w procesie
endocytozy. Następnie kompleksy te mogą ulegać degradacji w systemie
endosomalnym lub lizosomalnym. Jedna cząsteczka α2-makroglobuliny
może wiązać i przenosić maksymalnie dwie cząsteczki proteazy [4, 7].
Pojęcie mechanizmu „samobójczego” zostało wprowadzone ze względu
na znaczne zmiany zachodzące w strukturze inhibitora, do których
dochodzi po jego połączeniu się z odpowiadającą mu proteazą.
Rozszczepienie wewnętrznego wiązania peptydowego inhibitora prowadzi
do jego zniszczenia, które skutkuje uszkodzeniem miejsca aktywnego
inhibitora. W wyniku tych zmian inhibitor nieodwracalnie wiąże się
z enzymem i powoduje jego inaktywację [4].
Do nieodwracalnej inhibicji może dochodzić również w sytuacji, gdy
reaktywna elektrofilowa grupa inhibitora tworzy wiązanie kowalencyjne
z resztą aminokwasową w miejscu aktywnym enzymu [8‚10].
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
163
Rys. 2 Schemat mechanizmów reakcji inhibicji enzymów proteolitycznych: (A)
nieodwracalne pułapkowanie („trapping” reactions) (B) i (C) odwracalne mocne związanie
(tight-binding reactions) [8]. Cząsteczki proteazy zostały oznaczone kolorem jasnoszarym, miejsce aktywne enzymu kolorem czarnym, a cząsteczki inhibitora ciemnoszarym.
Drugim typem reakcji inhibicji są reakcje odwracalnego mocnego
związania (Rys. 2B i C) – ang. tight-binding reactions, które są znacznie
bardziej rozpowszechnione niż opisane powyżej reakcje nieodwracalne.
Zaliczamy tutaj inhibitory działające według standardowego kanonicznego
mechanizmu (mechanizmu Laskowskiego). Inhibitor jest tu powoli
uwalniany ze względu na stabilność konformacyjną pętli, która może
naśladować naturalny substrat. Taki mechanizm reakcji można wykazać
jedynie w przypadku inhibicji proteaz serynowych. W pozostałych
przypadkach mamy do czynienia z inhibitorami, które fizycznie blokują
miejsce aktywne proteazy dzięki wysokiemu powinowactwu wiązania się
w pozycji po obu stronach miejsca aktywnego [8].
4. Wybrane zastosowania inhibitorów proteaz
Enzymy proteolityczne pełnią niezwykle istotną rolę w procesach
metabolicznych we wszystkich organizmach. Ponieważ reakcja hydrolizy
wiązania peptydowego jest reakcją nieodwracalną, wszystkie związane
z nią anomalie prowadzą do powstawania patologicznych zjawisk takich
jak procesy nowotworowe i zapalne lub zwiększenie podatności na infekcje
wirusowe, bakteryjne czy pasożytnicze. Dlatego też istnienie efektywnego
systemu regulacji aktywności aparatu proteolitycznego jest warunkiem
koniecznym do utrzymania homeostazy organizmu.
Inhibitory enzymów proteolitycznych, jako jeden z elementów składowych
układu kontrolowanej proteolizy, znalazły zastosowanie nie tylko w przemyśle
medycznym i farmaceutycznym, ale także zaczęły cieszyć się popularnością
w obszarach tematyki ekologicznej ochrony upraw rolnych. Coraz częściej
używa się ich również w metodach chromatografii powinowactwa
wykorzystywanej do oczyszczania preparatów proteaz. Niniejszy podrozdział
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
164
ma na celu nakreślenie obecnego statusu zastosowań tych związków
oraz przedstawienie przyszłych perspektyw dla ich wykorzystania.
4.1. Przemysł medyczny i farmaceutyczny
4.1.1 Leczenie choroby Alzheimera
Choroba Alzheimera jest zespołem zaburzeń neurodegeneracyjnych
mózgu, które prowadzą do demencji. Według statystyk schorzeniem tym
obarczona jest co dziewiąta osoba po 80. roku życia [12].
Chorobie tej towarzyszą patologiczne zmiany w mózgu, w wyniku
których powstają sploty neurofibrylarne oraz płytki starcze. Płytki starcze
określane są również mianem blaszek lub złogów amyloidowych. W swojej
strukturze posiadają rdzeń, który stanowi β-amyloid, dystroficzne neuryty
oraz komórki astro- i mikrogleju. Molekularnym podłożem choroby
Alzheimera jest mutacja w trzech różnych genach. Pierwszym z nich jest
gen APP (ang. Amyloid Precursor Protein), kodujący białko prekursorowe
amyloidu. Kolejny gen ryzyka to gen kodujący enzym rozkładający
insulinę oraz inne małe peptydy (ang. insulin-degrading enzyme – IDE).
Z nielicznymi przypadkami tej choroby związany jest również polimorfizm
apolipoproteiny E (ApoE) [13].
W patogenezie choroby decydującą rolę odgrywa białko prekursorowe
amyloidu, podlegające przemianom, w które zaangażowane są β- oraz
γ-sekretaza. Na początku lat dziewięćdziesiątych została sformułowana
hipoteza kaskady amyloidowej, według której złogi amyloidowe powstają
w wyniku odkładania się hydrofobowego peptydu Aβ42, co jest
skorelowane z najwcześniejszymi krytycznymi zmianami istotnymi
w rozwoju choroby [12, 13].
Jednym z proponowanych rodzajów terapii jest obniżenie aktywności
β-sekretazy poprzez zastosowanie inhibitorów hamujących działanie
enzymu. Poszukiwania prowadzone są wśród peptydowych analogów
substratu tzw. peptydomimetyków. Ograniczeniem tej terapii jest jednak fakt,
że dotychczas wytworzone niskocząsteczkowe inhibitory hamują poza
samym enzymem docelowym również aktywność innych proteaz
asparaginianowych (np. katepsyny D). Nie spełniają też podstawowego
wymagania, jakie jest stawiane lekom, ponieważ nie przekraczają bariery
krew-mózg. Dlatego też leczenie choroby Alzheimera z wykorzystaniem
inhibitorów proteaz pozostaje nadal tematem otwartym [12, 14].
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
165
4.1.2 Leczenie chorób nowotworowych
Jednym z ważniejszych mechanizmów mających miejsce w procesach
nowotworzenia jest zdolność komórek nowotworowych do przekroczenia
barier pozakomórkowych oraz przerzutowania do odległych miejsc
w obrębie organizmu. Białkami odpowiedzialnymi za te zjawiska są
wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe enzymy proteolityczne, które remodelują
komórki tkanki łącznej i błony podstawnej. Do najważniejszych z nich
należą metaloproteazy macierzowe (MMP), proteinazy serynowe
(urokinaza), proteinazy asparaginianowe (katepsyna D) oraz proteinazy
cysteinowe (katepsyny B, H, S oraz L) [8].
W powszechnym mniemaniu istnieje przekonanie, że powstawanie
guzów nowotworowych związane jest z tym, iż aktywność proteolityczna
istotnych enzymów przestaje podlegać kontroli inhibitorów. W związku
z tym egzogenne inhibitory proteaz mogą być czynnikami, które zahamują
postępy choroby. Jednak w rzeczywistości problem ten jest o wiele bardziej
złożony, ponieważ leczenie wymaga użycia specjalistycznych narzędzi,
które skierowane byłyby wyłącznie przeciwko enzymom powiązanym
z onkogenezą, a nie z ważnymi fizjologicznymi funkcjami pełnionymi
w organizmie [8, 15].
Badania prowadzone na modelach zwierzęcych z wykorzystaniem
CA-074 – inhibitora katepsyny B potwierdziły skuteczność specyficznej
i ukierunkowanej terapii. Naukowcy zaobserwowali zmniejszenie wzrostu
guzów oraz zahamowanie angiogenezy wielu typów nowotworów (badano
m.in. komórki raka trzustki, czerniaka oraz raka piersi) [16].
Innymi celami, przeciwko którym można by było skierować tego
rodzaju terapię, ze względu na mnogość ról pełnionych w procesie
nowotworzenia, są metaloproteazy. Jednak różnorodność tej klasy
enzymów oraz szeroki wachlarz pełnionych przez nie funkcji fizjolo-
gicznych uniemożliwia zastosowanie całej puli przeznaczonych dla nich
inhibitorów [17].
Obiecującymi metodami leczenia są metody skojarzone, w których
wykorzystywane są inhibitory kompleksów proteasomów w połączeniu
z tradycyjną chemioterapią. Zablokowanie aktywności tych
multikatalitycznych kompleksów w procesach onkogenezy pozwala na
zaindukowanie obumierania komórek nowotworowych. Zakłócanie przez
inhibitory proteasomów szlaku ubikwityna-proteasom, prowadzi do
akumulacji białek zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego.
Finalnym efektem tej terapii jest zahamowanie procesu podziałów
komórkowych w obrębie guza i wymuszenie indukcji apoptozy komórek
nowotworowych [17].
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
166
4.2. Zastosowanie inhibitorów proteaz w ochronie upraw rolnych
Endogenne roślinne inhibitory proteaz stanowią jedną ze strategii
obronnych przeciw czynnikom chorobotwórczym, pasożytom i organizmom
roślinożernym. Głównym celem ich działania są proteolityczne czynniki
wirulencji bakterii fitopatogennych, grzybów, różnego rodzaju pasożytów
oraz wirusów poprzez utrudnianie poboru substancji odżywczych, a także
uniemożliwianie uchylania się przed mechanizmami obronnymi organizmu
gospodarza. Dodatkowo hamują one również działanie proteaz układu tra-
wiennego, uniemożliwiając pobór azotu organicznego pochodzącego z żyw-
ności, który pełni kluczową rolę w procesach wzrostu i rozwoju [8, 18, 19].
Biorąc pod uwagę silne hamujące działanie naturalnych roślinnych
inhibitorów proteaz względem czynników wirulencji, uzasadnione jest
poszukiwanie nowych cząsteczek, które wykazywałaby potencjalne
właściwości ochronne, a zarazem idealnie wpisywałyby się w przyjazne dla
środowiska metody zwalczania szkodników.
Największe zainteresowanie wzbudziło zastosowanie inhibitorów
proteaz jako środków ochrony przeciwko insektom, gdyż to właśnie owady
powodują co roku najpoważniejsze straty gospodarcze. Za działające
w najbardziej destrukcyjny sposób uważane są larwy motyli i ciem
(Lepidoptera). Owady w zdecydowanej większości powodują bezpośrednie
straty rolne w wyniku żywienia się plonami, ale także straty pośrednie
poprzez przenoszenie licznych cząsteczek wirusowych lub wtórnych
zakażeń bakteryjnych [8].
Dodatkową zaletą stosowania inhibitorów proteaz w ochronie roślin przed
roślinożernymi pasożytami jest to, że powodują one również skumulowaną
ochronę przed nicieniami, bakteriami, grzybami oraz wirusami.
Takie skumulowane działanie można zaobserwować w przypadku
patogennego nicienia – mątwika burakowego (Heterodera schachtii),
u którego w układzie pokarmowym w przeważającej większości występują
enzymy proteolityczne z klasy proteaz cysteinowych. W tym przypadku
z powodzeniem stosowano pochodzący z heterologicznej ekspresji roślinny
inhibitor proteaz cysteinowych fitocystatynę (rodzina I25) [8].
4.3. Zastosowanie inhibitorów proteaz w biotechnologii
4.3.1. Metody zapobiegające niekontrolowanej proteolizie
Jednym z bardzo częstych problemów spotykanych w praktyce
laboratoryjnej jest trudność w uzyskaniu preparatów białkowych. Sytuacja
ta związana jest z obecnością natywnych enzymów proteolitycznych
w badanym materiale biologicznym. W celu uniknięcia niepożądanej
proteolizy wykorzystuje są preparaty niskocząsteczkowych inhibitorów
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
167
proteaz o szerokim spektrum działania hamującym aktywność proteaz
z wielu różnych klas katalitycznych. Wśród składników najczęściej
wykorzystywanych koktajli znajdują się: pepstatyna A (proteazy
asparaginianowe), E-64 (proteazy cysteinowe), chymostatyna (proteazy
serynowe), antypaina (proteazy cysteinowe i serynowe) oraz leupeptyna
(proteazy cysteinowe, serynowe i treoninowe). W przypadku zahamowania
aktywności metaloproteaz stosowane są środki chelatujące takie jak EDTA
czy 1,10-fenantrolina [4].
Często do niepożądanej proteolizy dochodzi również w przypadku
heterologicznej ekspresji białek w różnego rodzaju układach
ekspresyjnych. W takich sytuacjach można wykorzystać szczepy
bakteryjne i grzybowe naturalne lub uzyskane w wyniku działania metod
inżynierii genetycznej, dla których profil enzymów proteolitycznych jest
stosunkowo ubogi. Jednak szczepy te mimo wielu zalet mogą nie
wykazywać pożądanych cech na wystarczająco wysokim poziomie, aby
móc je swobodnie stosować w bioprocesach. W takich sytuacjach dąży się
do zmodyfikowania warunków hodowli w taki sposób, aby obniżyć ryzyko
uszkodzenia lub całkowitego zniszczenia rekombinowanego białka. Aby
uchronić cenny produkt procesu biotechnologicznego, stosowane są dodatki
niskocząsteczkowych inhibitorów proteaz serynowych i asparaginowych
w podłożach hodowlanych [4].
4.3.2. Oczyszczanie proteaz metodami chromatografii
powinowactwa
Innym ważnym z biotechnologicznego punktu widzenia aspektem jest
zastosowanie inhibitorów proteaz w procesie oczyszczania białek na drodze
chromatografii powinowactwa. Ten rodzaj chromatografii jest dość
prostym jednostopniowym procesem oczyszczania cząsteczek z układu
złożonej mieszaniny poprzez wysoce specyficzne wiązanie ich z ligandem
znajdującym się na unieruchomionym złożu. W zależności od rodzaju
oczyszczanej proteazy docelowej można tutaj wykorzystywać inhibitory
o wąskiej specyficzności lub odwrotnie - o szerokim spektrum działania
jako cząsteczki ligandu. Jednak należy zwrócić szczególną uwagę na to, jak
silny rodzaj wiązania powstanie pomiędzy oczyszczanym enzymem
a ligandem, gdyż proces ten nie zajdzie efektywnie, jeśli powstałe wiązanie
będzie za słabe. W sytuacji odwrotnej, gdy powstałe wiązanie będzie zbyt
silne, niemożliwa stanie się prawidłowa elucja preparatu [20].
Wręcz idealnymi narzędziami do tworzenia ligandów w chromatografii
powinowactwa są inhibitory proteaz pochodzenia bakteryjnego i grzybowego.
Zawdzięczają to swojej wysokiej tolerancji na drastyczne zmiany wartości
pH, temperatury i siły jonowej, dzięki czemu mogą z powodzeniem
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
168
wytrzymywać niekorzystne warunki unieruchamiania na matrycy oraz
kilkukrotne cykle elucji.
Ciekawym przykładem oczyszczania preparatów enzymatycznych jest
oczyszczanie dwuetapowe, w którym wykorzystywane są różnice
w specyficzności działania wybranych inhibitorów. W pierwszym etapie, gdy
oczyszczamy surowy preparat zawierający białka, możemy zastosować
inhibitory proteaz o szerokim spektrum działania. Natomiast w etapie
drugim, gdy chcemy uzyskać już homogenny preparat proteazy,
wykorzystujemy jako ligand inhibitor o wysokiej specyficzności względem
oczyszczanego enzymu [4, 20, 21].
5. Podsumowanie
Przedstawiony w artykule szeroki wachlarz zastosowań inhibitorów
enzymów proteolitycznych w wielu dziedzinach przemysłu i nauki pozwala
na stwierdzenie, że są one grupą związków, które z pełnym sukcesem
wkroczyły na rynek biotechnologiczny. Ponadto badania prowadzone nad
nowymi metodami ich wykorzystania są prężnie rozwijane w wielu
placówkach naukowych. Warty podkreślenia jest jednak fakt, że aby badać
kolejne obiecujące cząsteczki inhibitorów, należy rozszerzyć badania
z wykorzystaniem nowych organizmów modelowych i dokładnie poznać
ich degradom. Praca nad tym ważnym aspektem badań z pewnością
przyczyni się do odkrycia nowych, niezwykle cennych biotechnologicznie
substancji.
Literatura
1. Garcia-Carreno F. L. Protease inhibition in theory and practice,
Biotechnology Education, 1992 vol. 3, no. 4, s. 145-150
2. Chapman H. A., Riese R. J., Shi G. Emerging roles for cysteine proteases
in human biology, Annual Review of Physiology, 1997 vol. 59, s. 63-88;
3. Grzywnowicz K., Inhibitory proteaz z grzybów jako potencjalne farmaceutyki,
Biotechnologia, 2004 vol. 3(66), s. 69-77
4. Dunaevsky Y. E., Popova V. V., Semenova T. A., Beliakova G. A.,
Belozersky M. A. Fungal inhibitors of proteolytic enzymes: Classification,
properties, possible biological roles, and perspectives for practical use,
Biochimie, 2013, s. 1-11
5. Doljak B., Cateni F., Anderluch M., Procida G., Zilic J., Zacchigna M.
Glycolipids as selective thrombin inhibitors from the fungus Stereum hirsutum,
Drug Development and Industrial Pharmacy, 2006 vol. 32, s. 635-644
6. Cateni F., Zilic J., Zacchinga, Procida G. Cerebrosides with antiproliferative
activity from Euphorbia peplis L., Fitoterapia, 2010 vol. 81, s. 97-103
7. Hibbets K., Hines B., Williams D. An overview of proteinase inhibitors,
Journal of Veterinary Internal Medicine, 1999 vol. 13, s. 302-308
,
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane w różnych dziedzinach życia
169
8. Sabotic J., Kos J. Microbial and fungal protease inhibitors – current and
potential applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2012 vol.
93, s. 1351-1375
9. Rawlings N. D., Tolle D. P., Barrett A. J. Evolutionary families of peptidase
inhibitors, Biochemical Journal, 2004 vol. 378, s. 705-716
10. Rawlings N. D., Peptidase inhibitors in the MEROPS database, Biochimie,
2010 vol. 92, s. 1463-1483
11. http://merops.sanger.ac.uk/inhibitors/ (stan na dzień 8.02.2014 r.);
12. Nawrot B. Proteazy aspartylowe w chorobie Alzheimera, Szkoła Wiosenna
2005: Genetyczne podstawy chorób neurodegeneracyjnych, 2005, s. 9-17
13. Selkoe D. J., The molecular pathology of Alzheimer’s disease, Neuron, 1991
vol. 6, s. 487-498
14. Fear G., Komarnytsky S., Raskina I. Protease inhibitors and their
peptidomimetic derivatives as potential drugs, Pharmacology & Therapeutics,
2007 vol. 113, s. 354-368
15. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects, Nature
Reviews Drug Discovery, 2006 vol. 5(9), s. 785-799
16. Farlan R., Gobec S. Inhibitors of cathepsin B, Current Medicinal Chemistry,
2006 vol. 13(19), s. 2309-2327
17. Rastogi N., Mishra D. P. Therapeutic targeting of cancer cell cycle using
proteasome inhibitors, Cell Division, 2012 vol. 7(26), s. 1-17
18. Markiewicz M., Barnyk A., Białka aktywne biologicznie obecne w soku
pokrochmalnianym, Ziemniak Polski, 2010 vol. 2, s. 1-5
19. Haq S. K., Atif S. M., Khan R. H. Protein proteinase inhibitor genes in combat
against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection,
Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004 vol. 431(1), s. 145-159
20. Sabotic J., Koruza K., Gabor B., Peterka M., Barut M., Kos J., Brzin J. The
value of fungal pro tease inhibitors in affinity chromatography, Affinity
Chromatography, 2012 Chapter 15, s. 307-332
21. Gamboa A. G., Batista K. A., Lopes F. M., Fernandes K. F. The use of papain
inhibitor immobilized onto polyaniline for bioaffinity chromatography
of cysteine proteases, Separation and Purification Technology, 2013 vol. 120,
s. 467-472
Katarzyna Szałapata, Monika Osińska-Jaroszuk, Anna Jarosz-Wilkołazka
170
Inhibitory proteaz jako wielofunkcyjne narzędzia stosowane
w różnych dziedzinach życia
Streszczenie
Enzymy proteolityczne, pełniąc istotne funkcje metaboliczne oraz regulatorowe w organizmach żywych, wymagają odpowiedniego systemu regulacji. Jest on częściowo zapewniany dzięki
działaniu naturalnych inhibitorów proteaz. Poza pełnieniem czysto biologicznych funkcji
regulatorowych cząsteczki inhibitorów są również ciekawymi narzędziami biotechnologicznymi.
Dzięki swojej wielofunkcyjnej naturze możliwe stało się ich wykorzystanie w przemyśle medycznym i farmaceutycznym w leczeniu wielu schorzeń, zastosowanie w metodach
oczyszczania enzymów proteolitycznych oraz nawet jako środków ochrony upraw.
Kontynuując poszukiwania nowych organizmów wytwarzających cząsteczki inhibitorów
proteaz, możemy spodziewać się, że staną się one bogatym źródłem cennych biotechnologicznie substancji.
Słowa Kluczowe: inhibitory proteaz, proteazy, zastosowanie inhibitorów proteaz
Protease inhibitors as multifunctional tools used in different fields of life
Abstract
Proteases perform important metabolic and regulatory functions in living organisms and require appropriate regulatory system, which is partially ensured by natural protease
inhibitors. Protease inhibitor molecules in addition to their biological function are also
interesting biotechnological tools. Thanks to their multifunctional nature they are used
in medical and pharmaceutical industries in treating various disorders. Furthermore they are used in purification of proteolytic enzymes and during crop protection. Continuing the
search for new organisms which produce protease inhibitor molecules we can expect that
they will become a rich source of valuable biotechnological substances.
Keywords: protease inhibitors, protease, applications of protease inhibitors
171
Marta Głogowska1
Zawartość sodu i potasu
w tkankach ludzkiego przełyku
1. Wstęp
Czynność przełyku polega na transporcie pokarmu z gardła do żołądka.
Ściana przełyku nie ma zdolności wchłaniania pokarmu ani trawienia
i składa się z błony śluzowej z nabłonkiem wielowarstwowym płaskim,
utkania podśluzowego, błony mięśniowej i błony zewnętrznej. Mięśnie
w górnej 1/3 części są poprzecznie prążkowane, w dolnej występują
mięśnie gładkie. Wyściółka przełyku jest wilgotna w celu ułatwienia
przesuwania przełykanego pokarmu, a powierzchnia komórek utrzymujących
wydzielany śluz, pokryta jest fałdami [1].
Metale biogenne koncentrują się różnie w zależności od stanu zdrowia
pacjentów, co wskazuje na fakt, że mogą one odgrywać istotną rolę
w kancerogenezie. Sód jest kationem płynu pozakomórkowego, bez
którego nie byłaby możliwa prawidłowa praca błon komórkowych.
Sprawne i właściwe funkcjonowanie organizmu, zależne jest od pracy
i kondycji pojedynczych komórek, a sód jest niezastąpiony w utrzymaniu
prawidłowej gospodarki wodnej oraz gospodarki kwasowo-zasadowej
w organizmie człowieka. Pobudza on pracę wielu enzymów i ma wpływ na
przewodzenie impulsów przez neurony, stąd jego bezpośrednie działanie
na stopień, kurczliwości mięśniowej (wspomaga prawidłową pracę nerwów
i mięśni). Sód jest także jednym z istotnych składników kości i stawów,
a spożycie sodu jest ważnym elementem zdrowia publicznego, ponieważ
jego ograniczenie pozwala na zmniejszenie średniego ciśnienia tętniczego
dla całej populacji [2]. Sód odnajdziemy prawie we wszystkich produktach
spożywczych. Oprócz najprostszej postaci soli kuchennej, sód znajdziemy
głównie w gotowych i przetworzonych daniach. Stosowany, jako naturalny
środek konserwujący w największych ilościach znajduje się w żywności
wysoko przetworzonej. Produkty z wysoką zawartością sodu to, pieczywo,
sery żółte, warzywa konserwowe, przekąski (paluszki, chipsy, orzeszki
ziemne solone), gotowe przyprawy, wędliny i wyroby mięsne [2]. Potas
natomiast jest naturalnym składnikiem większości produktów
spożywczych. Jego najważniejszymi źródłami są warzywa i owoce.
1 [email protected], Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie, Wydział Geograficzno-Biologiczny, Zakład
Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka, www.wsp.krakow.pl;
Marta Głogowska
172
W organizmie znajduje się przede wszystkim wewnątrz komórek. Spełnia
wiele funkcji fizjologicznych i bierze udział w podobnych procesach jak
sód, spełniając funkcję dopełniającą. Zatem równowaga pomiędzy sodem
i potasem w organizmie jest kluczowa dla jego prawidłowego funkcjo-
nowania [3].
W regulacji ciśnienia tętniczego krwi podstawowe znaczenie odgrywa
zdolność nerek do wydalania lub zatrzymywania sodu [3]. Większość
badań pokazuje, że ograniczenie spożycia sodu wiąże się z obniżeniem
wartości ciśnienia tętniczego a ten efekt jest największy u osób z wysokim
ciśnieniem tętniczym, otyłych i w starszym wieku, jednak odpowiedź
organizmu na ograniczenie spożycia sodu jest zmienna osobniczo i może
nie prowadzić do istotnego obniżenia ciśnienia u osób z prawidłowym
ciśnieniem tętniczym. Z kolei wysokie spożycie potasu wpływa na
obniżenie ciśnienia tętniczego, co może być spowodowane zdolnością
potasu do zwiększenia wydalania sodu przez nerki oraz bezpośrednim
wpływem naczyniorozkurczowym potasu. Okazuje się, że otyłość, niska
aktywność fizyczna oraz niskie spożycie potasu ma większy wpływ na
wartości ciśnienia tętniczego niż wysokie spożycie sodu. Duże stężenie
sodu w organizmie zakłóca pracę nerek i w efekcie końcowym powoduje
ich uszkodzenie. Negatywnie wpływa na osoby cierpiące na cukrzycę.
Wywołuje ponadto dolegliwości ze strony wątroby, uczucie znużenia,
zmęczenia i ospałości [4‚10].
2. Cel Pracy
Badania przeprowadzono w celu stwierdzenia wzajemnego stosunku
metali biogennych (sodu i potasu) w tkankach ludzkiego przełyku. Coraz
częściej stwierdza się podwyższony poziom tych pierwiastków u człowieka,
co niesie za sobą konsekwencje zdrowotne. Nie do końca określone jest
jednak stężenie kationów Na+ i K
+ w przełyku, co może być istotną
informacją, wskazującą na prawidłowość działania pomp sodowo
– potasowych w tym narządzie.
3. Materiał i metody
Badaniom poddano próbki ludzkich tkanek pochodzących z przełyku
(n= 24 próbki). Niezmienione patologicznie, zdrowe tkanki przełyku
pobierano w trakcie sekcji zwłok od kobiet i mężczyzn w wieku (20-90 lat),
a średnia waga każdego wycinka wynosiła 0,5-2 g. Materiał pozyskiwany
był przez wyspecjalizowanego w tym zakresie patomorfologa, który
bezpośrednio po pobraniu niezmienionej morfologicznie tkanki, umieszczał
ją w sterylnej, polietylenowej probówce o pojemności 11 cm3, a następnie
wkładał do zamrażarki o ustalonej temperaturze -20C. Materiał do badań
,
Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku
173
pochodził od osób z Krakowa i okolic i był bezpośrednio odbierany
z Zakładu Patomorfologii 5 Wojskowego Szpitala Klinicznego z Polikliniką
w Krakowie. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy
Okręgowej Izbie Lekarskiej w Krakowie (opinia nr 46/KBL/OIL/2012).
W celu określenia w badanym materiale zawartości sodu i potasu,
zastosowano metodę mineralizacji na mokro z użyciem stężonego kwasu
azotowego (V) 65%, który jest silnym kwasem utleniającym,
umożliwiającym całkowity rozkład substancji do prostych, stałych związków
nieorganicznych. Technika przeprowadzona zastała w mineralizatorze
VELP Scientifica DK20. Wysuszony materiał był przenoszony do
szklanych żaroodpornych kolb i zalewany 2 ml stężonego kwasu
azotowego (V). Mineralizacja odbywała się w temperaturze 100C i trwała
ok. 6 godzin. Otrzymane mineralizaty zlewano do polietylenowych
probówek o pojemności 5 cm3, uzupełniano wodą destylowaną i szczelnie
zamykano korkiem.
Uzyskane po mineralizacji roztwory posłużyły do analizy zawartości
wybranych pierwiastków metodą płomieniowej spektrofotometrii
absorpcyjnej (FAAS) przy użyciu spektrofotometru BUCK 200A firmy
Cole-Parmer (Fot. 1), z użyciem płomienia acetylenowo-powietrznego
i odpowiednich lamp z katodą wnękową (HCL).
Rys. 1. Spektrofotometr BUCK 200A [opracowanie własne]
Zasada działania ASA polega na wprowadzeniu rozpylonej próbki
do płomienia, a następnie, w wyniku przemian fizyko – chemicznych,
doprowadzeniu analitu do postaci wolnych atomów, na które kierowane
jest promieniowanie elektromagnetyczne generowane przez lampę z katodą
wnękową, które jest absorbowane przez wolne atomy analitu zgodnie
z regułami Kirchhoffa - Bunsena. W ten sposób zmierzono absorbancję dla
sodu i potasu. Wartości absorbancji przeliczono na zawartość metali
Marta Głogowska
174
w roztworach otrzymanych po mineralizacji, na podstawie krzywej
kalibracyjnej wyznaczonej dla roztworów wzorcowych z wykorzystaniem
specjalnego oprogramowania. Otrzymane wyniki przeliczono, podając
zawartość analitów w mikrogramach danego metalu na gram suchej masy
tkanki (µg•g-1
s.m.).
4. Analiza wyników badań
Średnia zawartość sodu w tkankach przełyku osiągnęła wartość
2276,806±320,618 µg•g-1
s.m., natomiast średnia zawartość potasu
w tkankach przełyku jest dużo niższa i wynosi 1143,237±39,545 µg•g-1
s.m.
Omówione wyniki przedstawiono na wykresie 1. Ponadto analiza korelacji
Pearsona nie wykazała istnienia zależności pomiędzy omawianymi
pierwiastkami w tkankach przełyku.
Wykres 1. Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet i mężczyzn
Tkanki pozyskane z przełyku kobiet i mężczyzn, przyporządkowano
dodatkowo do dwóch grup wiekowych: 20-50 lat (pacjenci młodsi) oraz
51-90 lat (pacjenci starsi). Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet
mających 20-50 lat wyniosła 3009,876±9,815 µg•g-1
s.m. U kobiet
mających 51-90 lat średnia zawartość sodu była niższa i wyniosła
2141,273±604,866 µg•g-1
s.m. Średnia zawartość sodu u mężczyzn
mających 20-50 lat wyniosła 1611,952±14,030 µg•g-1
s.m. U mężczyzn
mających 51-90 lat średnia zawartość sodu była nieco wyższa i wyniosła
2363,492±616,991 µg•g-1s.m. Omówione wyniki zilustrowano na wykresie 2.
PRZEŁYK
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
śód potas
g
•g-1
s.m
.
,
Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku
175
Wykres 2. Średnia zawartość sodu w przełyku kobiet i mężczyzn
Średnia zawartość potasu u kobiet mających 20-50 lat wyniosła
713,530±14,393 µg•g-1
s.m. U kobiet mających 51-90 lat średnia zawartość
potasu była znacznie wyższa i wyniosła 2172,465±1223,357 µg•g-1
s.m.
U mężczyzn mających 20-50 lat, średnia zawartość potasu była niska
i wyniosła 573,812±25,129 µg•g-1
s.m., z kolei u mężczyzn mających 51-90
lat poziom potasu wyniósł 1128,540±545,596 µg•g-1
s.m. Omówione wyniki
zilustrowano na wykresie 3.
Wykres 3. Średnia zawartość potasu w przełyku kobiet i mężczyzn
ZAWARTOŚĆ SODU W TKANKACH PRZEŁYKU
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
kobiety 20-50 kobiety 51-90 mężczyźni 20-50 mężczyźni 51-90
g
•g-1
s.m
.
ZAWARTOŚĆ POTASU W TKANKACH PRZEŁYKU
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
kobiety 20-50 kobiety 51-90 mężczyźni 20-50 mężczyźni 51-90
g
•g-1
s.m
.
Marta Głogowska
176
5. Wnioski
Przełyk jest narządem nie zaangażowanym w czynną absorpcję
elektrolitów [11], jednak otrzymane wyniki (2276,806 µg•g-1
s.m.)
wskazują, na wysoką zawartość sodu w jego śluzówce. Niższą wartość
(1700,158 µg•g-1
s.m. sodu) otrzymano w badaniach z 2012 roku [12].
Średnia zawartość potasu w przełyku (1143,237 µg•g-1
s.m.) jest dużo
niższa, niż zawartość sodu. Podobną wartość (1308,872 µg•g-1
s.m.)
otrzymano w innej pracy [12]. Jony Na+ i cząsteczka ATP przyłączają się
do pompy sodowo-potasowej, a hydroliza ATP powoduje zmianę struktury
białka i transport jonów Na+ na drugą stronę błony, po której przyłączane
są jony K+. Następuje uwolnienie jonów Na
+ i przetransportowanie jonów
K+ na drugą stronę. W ten sposób pompa sodowo-potasowa wytwarza
gradient jonowy, który pełni w komórce bardzo ważną rolę, gdyż
kontroluje jej objętość [13]. Z przeprowadzonych badań wynika, że
w tkankach przełyku więcej jest sodu niż potasu, z kolei zgodnie z zasadą
działania pompy sodowo – potasowej sytuacja powinna być odwrotna.
Wyniki sugerują, że wzrost średniej koncentracji jonów Na+ wewnątrz
komórek może być związany z nadmiernym spożyciem sodu i zaburzeniem
homeostazy wewnątrzustrojowej.
Literatura
1. Bochenek A., Reicher M. Anatomia człowieka, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2010, s.150-151
2. Pohl H.R., Wheeler J.S., Murray H.E. Sodium and potassium in health and disease, 2013; (13), s.29-47
3. Geleijnse J.M., Kok F.J., Grobbee D.E. Blood pressure response to changes in sodium and potassium intake: a metaregression analysis of randomised trials, Journal of Human Hypertension, 2003; (17), s. 471-480
4. Geleijnse J.M., Kok F.J., Grobbee D.E. Impact of dietary and lifestyle factors on the prevalence of hypertension in Western populations, European Journal of Public Health, 2004; (14), s. 235-239
5. Dietary reference intakes for water, potassium, sodium, chloride, and sulfate, 2004 6. Sacks F.M., i in. Effects on blood pressure of reduced dietary sodium
and the dietary approaches to stop hypertension (DASH) diet, New England Journal of Medicine, 2001; (344), s. 3-10
7. U.S. Department of Health and Human Services, 7th Report of the US Joint National Committee on prevention, Detection Evaluation, Treatment of Hypertension, JNC 7 Express, 2003; s. 8
8. Bertino M., Beauchamp G.K., Engelman K., Long-term reduction in dietary sodium alters the taste of salt, American Journal of Clinical Nutrition, 1982; (36), s.1134-1144
9. Blais, C.A., et al., Effect of dietary sodium restriction on taste responses to sodium chloride: a longitudinal study, American Journal of Clinical Nutrition, 1986; (44), s. 232-243
,
Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku
177
10. Geleijnse J.M., Grobbee D.E., Kok, F.J. Impact of dietary and lifestyle factors on the prevalence of hypertension in Western populations, Journal of Human Hypertension, 2005; (19), s. 1-4
11. Lachowicz L. Czynność układu trawiennego. Fizjologia-podstawy fizjologii lekarskiej, Warszawa. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1994; s. 565-578
12. Głogowska M. Zawartość sodu i potasu w komórkach ludzkiego przełyku, żołądka, jelita cienkiego i jelita grubego u pacjentów krakowskich szpitali, Badania w dydaktykach nauk przyrodniczych, 2012; s. 32-35
13. Stryer L. Biochemia, Warszawa, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003
Zawartość sodu i potasu w tkankach ludzkiego przełyku
Streszczenie Przełyk transportuje pokarm do żołądka, jednak nie zachodzi w nim wchłanianie. Sód jest kationem płynu pozakomórkowego, bez którego nie byłaby możliwa prawidłowa praca błon komórkowych. Potas w organizmie znajduje się przede wszystkim wewnątrz komórek. Spełnia wiele funkcji fizjologicznych i bierze udział w podobnych procesach jak sód, spełniając funkcję dopełniającą, zatem równowaga pomiędzy sodem i potasem w organizmie jest kluczowa dla jego prawidłowego funkcjonowania. Badania przeprowadzono w celu stwierdzenia wzajemnego stosunku metali biogennych (sodu i potasu) w tkankach ludzkiego przełyku. Coraz częściej stwierdza się podwyższony poziom tych pierwiastków u człowieka, co niesie za sobą konsekwencje zdrowotne. Badaniom poddano próbki ludzkich tkanek pochodzących z przełyku (n=24 próbki), które pobierano w trakcie sekcji zwłok od kobiet i mężczyzn w wieku 20-90 lat. Zawartość badanych pierwiastków określono za pomocą metody spektrofotometrycznej płomieniowej (ASA). Średnia zawartość sodu w tkankach przełyku wynosi 2276,806 µg•g-1s.m., natomiast średnia zawartość potasu jest dużo niższa i wynosi 1143,237 µg•g-1s.m. Badania wskazują na brak równowagi kationów Na+ i K+ w tkankach przełyku, a wzrost średniej koncentracji jonów Na+ wewnątrz komórek może być związany z nadmiernym spożyciem sodu i zaburzeniem homeostazy wewnątrzustrojowej. Słowa kluczowe: sód, potas, przełyk, ASA
The content of sodium and potassium in human esophagus tissues
Abstract Esophagus translocates food to the stomach but does not occur in the absorption. Sodium is a cation of the extracellular fluid, without which it would be not possible properly work of the cell membranes. Potassium in the body is found primarily intracellularly and performs many physiological functions and is involved in similar processes as sodium, functioning as complementary, so the balance between sodium and potassium in the body is essential for its proper functioning. The study were performed to determine the relationship between biogenic metals (sodium and potassium) in the tissues of human esophagus. Increasingly found elevated levels of these elements in man, which have health consequences. The study involved a samples from human esophagus tissues (n=24 samples), which were taken during the autopsy from women and men (20-90 years). The average content of the analyzed elements was determined by Atomic Absorption Spectrometry method (ASA). The average content of sodium in esophagus tissues is 2276.806 µg•g-1d.m., while the average content of potassium is much lower (1,143.237 µg•g-1d.m.). Studies indicate to imbalance between cations Na+ and K+ in the tissues of the esophagus, and the increase of the average concentration of Na+ inside cells may be associated with excessive intake of sodium and disorder of intrasystemic homeostasis. Keywords: sodium, potassium, esophagus, ASA
178
Kamila Wlizło1, Jolanta Polak
1, Anna Jarosz-Wilkołazka
1
Lakaza – niebieski enzym
dla kolorowej biotechnologii
1. Wprowadzenie
Metody biotechnologiczne są stosowane w codziennym życiu od tysięcy
lat. Współczesna biotechnologia znalazła zastosowanie w wielu obszarach
przemysłowych a jej zakres jest tak szeroki, że podzielono ją na
odpowiednie grupy skupiające określone dziedziny nauki i przemysłu.
Biotechnologia czerwona, obejmuje procesy związane z produkcją
nowych biofarmaceutyków, rozwojem diagnostyki genetycznej, genoterapii
i ksenotransplantologii; biotechnologia zielona, odnosi się do inżynierii
genetycznej stosowanej w celu doskonalenia produkcji roślinnej
i zwierzęcej; najszerszą grupę stanowi biotechnologia biała określana też
mianem biotechnologii przemysłowej. Procesy białej biotechnologii są
stosowane w wielu gałęziach przemysłu i są oparte na zastosowaniu
bioprocesów i biokatalizy [1]. Przykładem biokatalizatorów, które mogą
zainteresować wiele dziedzin przemysłu są lakazy [EC 1.10.3.2], enzymy
zaliczane do klasy oksydoreduktaz. Lakazy są znane ze swojej bardzo
niskiej specyficzności substratowej i przez to mogą stanowić alternatywę
dla stosowanych obecnie procesów syntezy, obniżając koszty produkcji
i zmniejszając szkodliwe oddziaływanie przemysłu, przede wszystkim
chemicznego, na środowisko naturalne [2].
2. Występowanie i funkcje lakaz w przyrodzie
2.1. Lakazy roślinne
Pierwszym gatunkiem roślin wyższych, gdzie stwierdzono obecność
lakazy było drzewo lakowe Rhus vernicifera a pierwsza praca na ten temat
została opublikowana w 1883 [3]. Oprócz tego, istnieją doniesienia
o gatunkach roślin, w których nie tylko wykazano obecność lakaz, ale
również stwierdzono jej występowanie w postaci kilku izoform. Przykła-
dami takich roślin są między innymi sosna taeda (Pinus taeda), gdzie
stwierdzono obecność aż ośmiu izoform lakazy, oraz topola (Populus
1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie- Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Biochemii, http://fungi.umcs.lublin.pl/w_pl/;
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
179
trichocarpa), w której ksylemie wykazano ekspresję pięciu form tego
enzymu [4]. Dodatkowo, dane literaturowe wskazują na występowanie
w przyrodzie gatunków roślin, wytwarzających oksydazy miedziowe, które
są bardzo podobne do lakaz. Do najbardziej znanych tego typu gatunków
roślin należą tytoń szlachetny (Nicotiana tabacum), klon jawor (Acer
pseudoplatanus) oraz kukurydza zwyczajna (Zea mays) [5].
Funkcją wszystkich lakaz roślinnych, bez względu na gatunek, jest jej
udział w wieloenzymatycznym układzie, związanym z syntezą ligniny
w komórkach drewna. W procesie tym, lakazy wspólnie z innymi enzymami
oksydoredukcyjnymi - peroksydazami, zaangażowane są w łączenie
monomerów tzw. monolignoli, którymi są alkohole: p-kumarylowy,
koniferylowy i synapinowy, w dimery homomolekularne, zawierające
wiązania węgiel - węgiel lub węgiel - tlen, które w dalszych etapach mogą
być sprzęgane do oligomerów i polimerów ligninowych [4,6]. Nie jest to
jedyny proces, w którym uczestniczą lakazy, ponieważ biorą one także
udział w procesach związanych z naprawą uszkodzonych fragmentów
tkanek roślinnych [7].
Lakazy roślinne są glikoproteidami zewnątrzkomórkowymi, wydzielanymi
do apoplastu, co możliwe jest dzięki obecności w ich strukturze fragmentu
węglowodanowego. Stanowi on od 22% do 45% cząsteczki enzymu
i najczęściej zbudowany jest z mannozy, N-acetyloglukozaminy i galaktozy,
natomiast jego główną funkcją jest utrzymywanie aktywności enzymu
poprzez ochronę cząsteczki przed enzymami proteolitycznymi a także
utrzymywanie jego stabilności termicznej [8].
2.2. Lakazy grzybowe
Pierwsza praca dotycząca lakaz grzybowych została opublikowana
w 1896 roku [9]. Większość opublikowanych prac, opisujących lakazy
grzybowe, dotyczy gatunków ligninolitycznych, wywołujących białą
zgniliznę drewna. Przede wszystkim są to szczepy należące do typu
podstawczaków (Basidiomycota), między innymi Trametes versicolor,
Trametes gallica, Trametes villosa, Lentinula edeodes, Pleurotus ostreatus
[5,9], Trametes hirsute [10] czy Cerrena unicolor [11]. Istnieją również dane
literaturowe na temat występowania lakaz u gatunków należących do typu
workowców (Ascomycota), jak na przykład Myceliophotra thermofila czy
Chaetomium termophilum [12,13].
W przeciwieństwie do roślin, główną funkcją lakaz grzybowych jest
degradacja kompleksu ligninowego drewna zarówno drogą enzymatyczną,
jak i nieenzymatyczną, dostarczając tym samym niezbędnych grzybom
makroelementów [7]. Lakazy grzybowe, podobnie jak lakazy roślinne,
są glikoproteidami zewnątrzkomórkowymi, zawierającymi w swojej
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
180
strukturze komponent cukrowy. Stanowi on od 10% do 25% cząsteczki
enzymu i chroni ją przed działaniem proteaz, co ważne jest ze względu na
udział lakaz grzybowych w procesie patogenezy roślin. Ponadto w cyklu
rozwojowym grzybów enzym ten jest zaangażowany w proces
morfogenezy, pigmentacji oraz tworzenia zarodników [14,15].
2.3. Lakazy bakteryjne
Szerokie występowanie lakaz w przyrodzie obejmuje również
organizmy prokariotyczne. Podobnie jak u grzybów, lakazy wytwarzane
przez bakterie mogą mieć formę monomeru lub oligomeru [13]. Pierwszą
bakterią, u której stwierdzono obecność lakazy jest szczep Azospirillum
lipoferum, gdzie enzym zaangażowany jest w proces melanizacji [16, 17].
Z kolei w przypadku szczepu Bacillus subtilis i Anabaena azollae,
wytwarzane lakazy związane są z procesami pigmentacji endospor i tym
samym biorą udział w ich ochronie przed promieniami UV [5].
Lakazy wytwarzane przez organizmy prokariotyczne są enzymami
wewnątrzkomórkowymi, dlatego też nie posiadają w swojej strukturze
komponentu węglowodanowego, ale w przeciwieństwie do lakaz
grzybowych, enzymy bakteryjne wykazują większą stabilność w wysokich
wartościach temperatury czy pH [5].
3. Charakterystyka lakaz grzybowych
3.1. Budowa molekularna
Lakazy grzybowe są glikoproteidami mogącymi występować
jako monomery, dimery lub oligomery, a ich masa cząsteczkowa może
wahać się od 60 kDa do 100 kDa [15]. O ile masa cząsteczkowa czy
elementy struktury jak komponent węglowodanowy, są różne w zależności
od źródła określonej lakazy, tak cecha charakterystyczna lakaz jaką jest ich
centrum aktywne, wydaje się być strukturą dość konserwatywną [4].
W skład centrum aktywnego lakazy grzybowej wchodzą cztery atomy
miedzi (II) (Rys. 1.), należące do trzech typów - typ 1 (T1), typ 2 (T2) oraz
dwa atomy miedzi typu 3 (T3), różniące się między innymi cechami
spektroskopowymi [18].
W formie utlenionej, atom T1, wykazuje maksimum absorbancji
przy długości fali 610 nm, przez co nadaje lakazom charakterystyczną,
niebieską barwę. Jest ona wynikiem kowalencyjnego wiązania pomiędzy
atomem miedzi a resztą cysteiny znajdującej się w centrum aktywnym
enzymu [19]. Atom miedzi T1 wiąże się także za pomocą wiązań
koordynacyjnych z dwoma resztami histydyny i jedną resztą metioniny [5],
a także charakteryzuje się wysokim potencjałem oksydoredukcyjnym
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
181
(+790 mV) w wyniku, czego stanowi on miejsce utleniania substratu [20].
Dodatkowo analiza spektroskopowa elektronowego rezonansu magnetycznego
(EPR) wykazała aktywności paramagnetyczne atomu miedzi T1 [19].
Rys. 1. Cząsteczka lakazy z Coriolus zonatus oraz jej centrum aktywne [18]
Podobne wyniki otrzymano w przypadku atomu miedzi T2, który
wykazuje aktywności paramagnetyczne, nie wykazując natomiast
absorbancji w świetle widzialnym. Atom ten zlokalizowany jest blisko
atomu miedzi T3, który z kolei w utlenionej formie wykazuje maksimum
absorbancji przy długości fali 330 nm, jednakże obecność mostka
hydroksylowego pomiędzy dwoma atomami miedzi T3 skutkuje brakiem
sygnału EPR [13].
Zarówno atom miedzi T2 jak i dwa atomy miedzi T3 pełnią ważną rolę
w aktywności katalitycznej lakaz, tworząc tzw. trójatomowy klaster T2/T3, który
jest miejscem wiązania i redukcji tlenu cząsteczkowego do wody [19, 21].
3.2. Mechanizmy reakcji katalizowanych przez lakazy
Ogólny mechanizm reakcji katalizowanych przez lakazy, zakłada
wytwarzanie produktu poprzez utlenienie czterech cząsteczek substratu
do rodników i zredukowania jednej cząsteczki tlenu do dwóch cząsteczek
wody [8]. Proces ten może odbywać się trzema drogami: w bezpośrednim
utlenianiu substratu (2.2.1.), w pośrednim utlenianiu substratu z udziałem
mediatora (2.2.2.) i poprzez reakcję sprzęgania (2.2.3.).
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
182
3.2.1. Bezpośrednie utlenianie substratu
Reakcje bezpośredniego utlenienia substratu są najprostsze spośród
trzech wyróżnianych typów i przebiegają zgodnie z ogólnym opisem
mechanizmu reakcji katalizowanej przez lakazę. Zredukowany substrat jest
utleniany przy udziale miedzi T1 z centrum aktywnego enzymu a powstałe
elektrony są przekazywane następnie z atomu miedzi T1 do klastra T2/T3,
gdzie dochodzi do redukcji tlenu cząsteczkowego do wody [5] (Rys. 2).
Rys. 2. Schemat bezpośredniego utlenienia substratu przez lakazę; na podstawie [20]
Transformacjom w wyniku bezpośredniego utlenienia substratu ulegają
proste związki organiczne takie jak fenole, oraz ich pochodne zawierające
grupy aminowe, metoksylowe, karboksylowe czy sulfonowe [20].
3.2.2. Utlenianie substratu z udziałem mediatora
Drugi typ katalizowanych reakcji (tzw. LSM – ang. Laccase-Mediator-
System) przebiega z udziałem mediatora i dotyczy substratów, które mają
zbyt duży potencjał oksydoredukcyjny w porównaniu do potencjału lakazy,
lub są za duże, aby dopasować się do jej centrum aktywnego. W takich
sytuacjach stosuje się tzw. mediatory czyli niskocząsteczkowe związki,
pośredniczące pomiędzy enzymem a utlenianym substratem. Mediatory
posiadają specyficzne grupy funkcyjne (-NO, -NOH) a do najbardziej
znanych mediatorów zalicza się sól diamonową 2,2’-azyno-bis
[3-etylbenzotiazoliny-6-kwasu sulfonowego] (ABTS) i hydroksy-
benzotriazol (HBT) [3, 18].
Tego typu reakcja odbywa się dwuetapowo. Początkowo, związkiem
utlenianym przez enzym jest mediator, który w kolejnym etapie utlenia
substrat a równocześnie ulega redukcji [20].
Rys. 3. Schemat utlenienia substratu z udziałem mediatora; na podstawie [20]
Stosowanie mediatorów znacznie poszerza zakres potencjalnych substratów
utlenianych przez lakazy. Dzięki tym związkom istnieje szansa na
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
183
zastosowanie mechanizmu LMS w takich dziedzinach przemysłu, jak
delignifikacja i wybielanie pulpy drzewnej, usuwanie ksenobiotyków ze
środowiska, w tym policyklicznych węglowodorów aromatycznych (PAH)
i innych zanieczyszczeń trudnych do usunięcia tradycyjnymi metodami, jak
również w syntezie organicznej [8, 18].
3.2.3. Reakcja sprzęgania
Ostatni typ reakcji katalizowanych przez lakazę stanowią reakcje
sprzęgania. Mechanizm tych reakcji jest bardzo podobny do
bezpośredniego utleniania substratów, z tą różnicą, że powstające w reakcji
rodniki są niestabilne i ulegają spontanicznym reakcjom
nieenzymatycznego sprzęgania tworząc dimery, oligomery jak również
polimery, które stanowią produkty reakcji w postaci nowych struktur
fenolowych [20].
Rys. 4. Schemat utlenienia substratu z wytworzeniem wysoko reaktywnych
intermediatów w czasie reakcji sprzęgania; na podstawie [20]
Powstające struktury łączą się przez wytworzenie wiązań węgiel - węgiel,
węgiel - tlen, węgiel - azot lub azot - azot, przy czym reakcje te zachodzą
w łagodnych warunkach. Sprawia to, że reakcje sprzęgania są obiektem
zainteresowań ze strony przemysłu, jako potencjalna alternatywa pozwalająca
na obniżenie kosztów prowadzonych procesów z zachowaniem wydajności
i przy jednoczesnym zmniejszeniu szkodliwych oddziaływań na środowisko
naturalne [2].
4. Możliwość zastosowania reakcji katalizowanych przez lakazy
w przemyśle
Lakazy mogą prowadzić utlenianie szerokiej gamy substratów od
związków fenolowych, w tym naturalnie występujących flawonoidów
[10,22], przez niskocząsteczkowe pochodne benzenowe i poliaminy, po
związki niefenolowe, wymagające obecności mediatora w czasie ich
utleniania [18,23]. Tak niska specyficzność substratowa lakaz, wpływa na
wysokie zainteresowanie tymi enzymami przez wiele gałęzi przemysłu,
zaczynając od przemysłu papierniczego, poprzez spożywczy i tekstylny,
kończąc na przemyśle farmaceutycznym i związanym z biosensorami [24].
W dalszej części pracy przedstawionych zostanie kilka najważniejszych
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
184
dziedzin przemysłu, gdzie zastosowanie lakaz jest intensywnie badane lub
nawet wdrożone w ramach wprowadzania metod biotechnologicznych.
4.1. Przemysł papierniczy
Popularyzacja zachowań pro-ekologicznych zakłada wykorzystywanie
surowców wtórnych, co dotyczy również przemysłu papierniczego
i produkcji papieru makulaturowego, co przyczynić ma się do zwiększenia
ochrony środowiska naturalnego. Niemniej jednak, produkcja wysokiej
jakości papieru, wymaga pozyskania podstawowego do tego celu surowca,
jakim jest celuloza pochodząca z drewna. Główną przeszkodą w procesie
pozyskiwania celulozy jest zawarta w ścianie komórkowej roślin i trudna
do rozłożenia, lignina [25]. Tradycyjnie stosowane metody, mające na celu
usunięcie ligniny, wykorzystują agresywne substancje jak między innymi
ług warzelny, czy związki chloru będące źródłem zanieczyszczeń
środowiska naturalnego [3,26]. Mniejsza emisja zanieczyszczeń
towarzyszy mechanicznej delignifikacji drewna, co więcej, ilość masy
otrzymanej w tym procesie jest niemal dwukrotnie większa od tej
otrzymanej w metodach chemicznych. Niemniej jednak jest to proces
kosztowny, wymagający dużego nakładu energii, a papier otrzymany w
jego wyniku posiada gorsze właściwości mechaniczne, w porównaniu do
papieru otrzymanego w chemicznej delignifikacji [5].
Istnieje wiele danych literaturowych podających, że lakazy mogą
z powodzeniem przeprowadzać zarówno proces delignifikacji jak
i wybielania otrzymanej pulpy drzewnej w warunkach przyjaznych dla
środowiska [4,6,27,28]. Pozwala na to aktywność ligninolityczna, którą
w naturze obserwuje się w przypadku wady drewna, jaką jest biała zgnilizna.
Wada ta powstaje na skutek rozkładu ligniny, celulozy i hemicelulozy przez
grzyby ligninolityczne. W końcowej fazie rozkładu, w komórkach drewna
pozostaje więcej białej celulozy niż brązowej ligniny (Rys. 5.).
Rys. 5. Drewno rozkładane w procesie białej zgnilizny drewna [29]
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
185
Co więcej niektóre badania donoszą, że stosowanie lakaz poprawia
właściwości mechaniczne otrzymywanego papieru. Cały proces odbywa się
z udziałem mediatorów jak na przykład kwasy fenolowe [13] czy kwas
3-hydroksyantranilowy, jak w przypadku lakazy ze szczepu Pycnoporus
cinnabarinus [27].
Dodatkowo, w niektórych pracach pojawiają się informacje o powstających
dwóch obszarach badań dotyczących produktów przemysłu drzewnego.
Pierwszy dotyczy projektowania materiałów ligninocelulozowych zawiera-
jących komponenty fenolowe, tzw. funkcjonalizacja włókien celulozy
i wykazujących nowe właściwości związane z odpornością i stabilnością
oraz wykorzystania lakaz do poprawy stopnia zwartości drewnianych
elementów przez sprzęganie enzymatyczne ligniny in situ, bez
wykorzystania toksycznych klejów zawierających formaldehyd [18].
4.2. Synteza barwnych produktów
Część reakcji katalizowanych przez lakazy związana jest z wytworzeniem
niestabilnych intermediatów, które na drodze nieenzymatycznej tworzą
barwne produkty [20]. Znaczna część tych produktów może zostać
wykorzystywana przez przemysł tekstylny do barwienia włókien
naturalnych jak celuloza, włókna lniane czy wełna, ale także sztucznych
materiałów jak poliamid czy poliester. Barwienie tego typu materiałów
barwnikami syntetyzowanymi przy udziale lakazy, zostało opatentowane
przez duńską firmę Novo Nordisk, która dodatkowo opatentowała
barwienie włókien keratynowych, w tym włosów. Novo Nordisk nie jest
jedyną firmą na rynku, posiadającą tego rodzaju patent. Patenty przyznano
również takim znanym koncernom jak L’Oreal, Wella czy Henkel [7].
Niemniej jednak prace nad poszukiwaniem nowych prekursorów
i tworzeniem nowych barwników nie ustają, czego dowodem są ciągle
ukazujące się prace na ten temat.
Synteza barwników z udziałem lakazy stanowi realną alternatywę dla
stosowanych obecnie sztucznych barwników. Synteza z zastosowaniem
biokatalizatora odbywa się w łagodnych warunkach w środowisku
wodnym, bez stosowania toksycznych substancji, jest przy tym ekono-
miczna, a otrzymane produkty są przyjazne dla środowiska naturalnego [11].
Z pomocą lakaz otrzymywane są barwniki, wśród których możemy
wyróżnić barwniki azowe, zawierające w swojej strukturze podwójne
wiązanie pomiędzy dwoma atomami azotu oraz barwniki fenoksazynowe,
charakteryzujące się obecnością szkieletu fenoksazynowego. Innego
rodzaju barwniki określa się ogólnie, jako barwniki fenolowe lub
niefenolowe i są one syntetyzowane z prostych fenolowych bądź
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
186
niefenolowych prekursorów, głównie pochodnych o-, m-, p-hydroksylowych,
metoksylowych, aminowych oraz sulfonowych [7].
Część barwnych polimerów z powodzeniem syntetyzowana jest w homo-
lub heteromolekularnych transformacjach z naturalnie występujących fenoli
jak kwas galusowy, syryngowy, ferulowy, a także katechina czy katechol [21,
30]. Uzyskano w ten sposób barwniki głównie w odcieniach brązu i czerwieni
(Rys. 7.) [30].
Rys. 6. Barwniki uzyskane w procesie heterotransformacji kwasu galusowego i
syryngowego (d), katechiny i katecholu (e), kwasu ferulowego i syryngowego (f).
Płytki a-c stanowią odpowiednie kontrole prekursorów bez dodatku lakazy [30]
Dużą zaletą uzyskanych barwników oprócz koloru, jest ich zdolność
do barwienia włókien keratynowych (Rys. 8.) co jest cechą pożądaną
w przypadku produkcji farb do włosów [30].
Rys. 7. Włókna keratynowe niebarwione (a) oraz barwione produktami
heterotransformacji kwasu gallusowego i syryngowego (b), katechiny i katecholu
(c) oraz kwasu ferulowego i syryngowego (d) [30]
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
187
Innymi badanymi naturalnymi prekursorami są również takie flawonoidy
jak kwercetyna i moryna [10] oraz rutyna [22]. Jednakże powstające
w homomolekularnych transformacjach ciemne barwniki koloru brązowego
mogą być wykorzystane głównie przez przemysł tekstylny [10, 22,30].
Barwne produkty otrzymane przy udziale lakazy wykazują dobre
właściwości barwiące w stosunku do materiałów tekstylnych pochodzenia
naturalnego takich jak len [10] czy wełna (Rys. 8.) [20].
Rys. 8. Porównanie barwników syntetyzowanych w hodowlach płytkowych i ich
kolorów po zabarwieniu próbek wełnianych [opracowanie własne]
Wzmocnienie efektu barwiącego oraz skrócenie procesu barwienia
i syntezy barwnika, można uzyskać poprzez syntezę barwników in situ.
Proces ten polega na dodaniu do włókien celulozowych lakazy jako
biokatalizatora oraz określonego prekursora stosowanego do syntezy
konkretnego barwnika, na przykład 2,5-DABS [31] czy katechol [32].
Takie wykorzystanie enzymatycznej syntezy barwnika bezpośrednio na
włóknie wymaga zużycia mniejszej ilości wody i prekursorów barwników
co czyni ten proces bardziej ekonomicznym. Dodatkowo przebiega on
w niższej temperaturze i jest bardziej przyjazny środowisku.
Niemniej jednak, otrzymanie lakazy i jej oczyszczenie na skalę
przemysłową jest w dalszym ciągu zbyt kosztowne, co utrudnia
komercjalizację produkcji barwników drogą biokatalizy. Interesującym
rozwiązaniem, może okazać się synteza barwników przy udziale biomasy
grzybowej. W takich układach, immobilizowana grzybnia wydziela lakazę
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
188
do płynnego podłoża hodowlanego, zawierającego roztwór odpowiedniego
prekursora a cały proces syntezy barwników odbywa się w łagodnych
warunkach, w środowisku o określonych parametrach pH i temperatury [11].
4.3. Degradacja barwników i bioremediacja
Tematyka związana z barwnikami, dotyczy nie tylko syntezy barwnych
produktów przy udziale lakazy jako biokatalizatora. W przypadku
przemysłu tekstylnego enzymy te mogą działać dwukierunkowo,
w syntezie lub degradacji barwników. Jednakże pojęcie degradacji dotyczy
w głównej mierze barwników syntetycznych wykorzystywanych
w koloryzacji różnego rodzaju materiałów tekstylnych. Bardzo często
związki te zawierają w swojej strukturze aromatyczne pochodne oraz
chlorki metali co jest szkodliwe dla środowiska naturalnego. Dodatkowym
problemem jest ich wysoka rozpuszczalność, co stanowi przeszkodę
w usuwaniu tych związków ze zbiorników wodnych. Stosowane obecnie
metody oczyszczania środowiska z barwników syntetycznych są mało
efektywne, a przy tym często nieekonomiczne [33].
Stąd też zastosowanie lakaz w procesie dekoloryzacji i degradacji
barwników spotkało się z dużym zainteresowaniem badaczy i stanowi
alternatywną drogę usuwania barwników ze środowiska naturalnego [6].
Na tym jednak, udział lakazy się nie kończy. Innym sposobem na
wykorzystanie tych biokatalizatorów w oczyszczaniu środowiska
z barwników syntetycznych jest przeprowadzenie reakcji sprzęgania.
Podczas tego procesu barwniki ulegają polimeryzacji do nierozpuszczalnych
agregatów. Tworzą one z kolei osady, które z pomocą filtracji stają się
łatwe do usunięcia ze zbiorników wodnych [24].
Istnieje cały szereg szczegółowych danych dotyczących degradacji
konkretnych sztucznych barwników przez organizmy grzybowe,
z dokładnym procentowym określeniem procesu dekoloryzacji.
Jednymi z najczęściej badanych rodzajów grzybów stosowanych
w procesach odbarwiających jest rodzaj Trametes oraz Pleurotus. Trametes
versicolor wykazał zdolność do dekoloryzacji 90% barwnika Poly R-478
w obecności alkoholu weratrylowego [4]. T. trogii badano z kolei pod
kątem zdolności do dekoloryzacji i detoksyfikacji ścieków przemysłowych
z udziałem i bez udziału mediatora. Stosowanie lakazy tego szczepu bez
udziału mediatora przyniosło jedynie 10% degradację zanieczyszczeń,
podczas gdy zastosowanie mediatora w postaci HBT znacznie zwiększyło
intensywność reakcji [6]. Natomiast lakaza ze szczepu T. villosa oprócz
degradacji oranżu metylowego, z powodzeniem przeprowadzała reakcję
sprzęgania pomiędzy aminami aromatycznymi a katecholem powodując
wytrącenie zanieczyszczeń w formie osadów [34]. Dobre parametry
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
189
dekoloryzacji wykazał w badaniach szczep Pleurotus chrysosporium
powodując degradację barwników Cibanon Blue (87%), Cibanon Golden-
Yellow (74.8%) Cibanon Red (71%) oraz Indanthrene Direct Black (51%)
[6]. W badaniach nad szczepem P. sajor- caju otrzymano degradację
barwników azowych takich jak Acid Red 18 (90%), Acid Black 1 (87%)
i Direct Blue 71 (72%) [35]. Pojawiają się również prace dotyczące
dekoloryzacji barwników z udziałem lakaz unieruchomionych, jak na
przykład lakaza ze szczepu Paraconiothyrium variabile unieruchomiona na
nośniku alginianowo- żelatynowym. Zastosowanie tego typu układu
pozwoliło na dekoloryzację barwnika Amido Black 10D w 80% [36].
Z kolei lakaza z P. ostreatus wykazała zdolność do degradacji
antrachinowego barwnika SN4R (66%), a przy zastosowaniu ABTS jako
mediatora wydajność degradacji osiągnęła 90% [37].
Warto zaznaczyć, że oprócz szeroko zakrojonych badań laboratoryjnych,
stosowanie lakaz grzybowych do degradacji i dekoloryzacji barwników
syntetycznych jest wdrożone już od niemal dwudziestu lat. W 1996 roku
firma Novo Nordisk opatentowała preparat lakazy dostępny pod handlową
nazwą DeniLite®. Gen dla tego enzymu oryginalnie pochodzący ze
szczepu grzybowego Myceliophtora termophila, przeniesiono do szczepu
Aspergillus oryze, gdzie ulega on ekspresji [38]. Był to pierwszy
komercyjny preparat lakazy stosowany z udziałem mediatora, służący do
wybielania tekstyliów takich jeans. Dodatkowo w 2001 roku indyjska firma
Zytex, opracowała formułę opartą na katalizie według mechanizmu LMS,
służącą do enzymatycznej degradacji błękitu indygowego. Nazwa
handlowa produktu to Zylite [33].
Oprócz usuwania ze środowiska naturalnego syntetycznych barwników,
lakaza może również posłużyć, jako narzędzie w degradacji trudnych
do utylizacji ksenobiotyków, jak na przykład policykliczne węglowodory
aromatyczne (PAH), chlorofenole czy herbicydy.
Podobnie jak w przypadku dekoloryzacji barwników, również do badań
nad rozkładem ksenobiotyków wykorzystano rodzaj Trametes.
Wymieniony wcześniej szczep T. versicolor wytwarza lakazę zdolną do
rozkładu takich herbicydów jak diketonitryl, w obecności, ABTS jako
mediatora [4]. Z kolei bisfenol A, organiczny związek z grupy fenoli,
z powodzeniem rozkładany jest przez lakazę pochodzącą ze szczepu
T. villosa, ulegającą ekspresji po przeniesieniu do szczepu Aspergillus sp.
Oprócz tego, bisfenol A jest rozkładany in vivio jak również in vitro przez
lakazę ze szczepu P. ostreatus [39]. Dodatkowo lakaza szczepu T. villosa
ma zdolność prowadzenia reakcji sprzęgania 2,4,6-nitrotoluenu (TNT)
z katecholem lub z kwasem syryngowym, prowadząc do remediacji gleby
skażonej trotylem [24]. Sprzęganiu z substancjami humusowymi gleby,
mogą ulegać również takie ksenobiotyki jak 3,4-dichloroanilina czy
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
190
chlorofenole, które w postaci związanej są mniej dostępne dla organizmów
glebowych, stając się tym samym mniej toksyczne [9].
Duży problem wśród zanieczyszczeń glebowych stanowią
zanieczyszczenia węglowodorami aromatycznymi. Są to wysoce toksyczne,
karcynogenne i mutagenne związki, powstające między innymi w trakcie
zużywania paliw kopalnych [5,33]. Niemniej jednak również i tego typu
związki mogą zostać rozłożone z wykorzystaniem lakaz grzybowych jak na
przykład żółta lakaza z P. ostreatus, w przypadku której obserwuje się
zdolność do degradacji antracenu (95% w dwa dni) [9].
4.4. Przemysł spożywczy
Dzięki swoim właściwościom katalitycznym, lakaza znalazła
zastosowanie również w przemyśle spożywczym a najbardziej znanym jest
zastosowanie lakazy w procesie stabilizacji i klarowania win. Obecne
w winie antocyjany, katechiny i inne polifenole mogą być utleniane
z udziałem jonów żelaza czy miedzi i/lub enzymów co powoduje obniżenie
jakości wina poprzez zmianę jego klarowności, smaku i koloru [6,24].
Cechy organoleptyczne wina jak również jego trwałość w trakcie
przechowywania, poprawia się przez usuwanie polifenoli na przykład
z użyciem dwutlenku siarki. Jednakże usuwanie tych związków powinno
się odbywać w sposób selektywny, ponieważ usunięcie wszystkich
polifenoli również prowadzi do pogorszenia jakości wina. W celu pozbycia
się polifenoli powinny one zostać utlenione, następnie przejść etap
polimeryzacji oraz wytrącania [40].
Rozwiązaniem okazało się zastosowanie lakazy. W 1986 roku Cantarelli
i wsp. przedstawili dowody na skuteczne usuwanie polifenoli z czerwonego
wina [40]. Zastosowana w badaniach lakaza pochodziła ze szczepu
Polyporus versicolor i pozwoliła na usunięcie katechin (70%) oraz
antocyjanidyn (90%) w ciągu trzech godzin. Metoda ta okazała się również
skuteczna przy oczyszczaniu soku winogronowego, z którego usunięto 50%
polifenoli [40]. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że
usuwanie polifenoli z udziałem lakazy jest znacznie skuteczniejsze niż
działanie takimi enzymami jak tanaza, fenolaza i antocyjanidaza [24].
Jedyną wadą wykorzystania lakazy jest konieczność filtracji wina w celu
usunięcia strąconego osadu oraz samego enzymu, ponieważ lakaza nie jest
dodatkiem do żywności dopuszczonym w przemyśle spożywczym (JECFA,
FAO/WHO Food Additives Systems Dates) [24]. Niemniej jednak, lakaza
wykorzystywana jest, jako produkt handlowy pod nazwą Suberaza®
w produkcji korków winiarskich. Dzięki niej usuwa się związki fenolowe
zawarte w korkach naturalnych, odpowiadające za gorycz, zapach,
cierpkość i niekorzystnie wpływających na organoleptyczne cechy win
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
191
[20]. Podobne metody zastosowano również przy usuwaniu polifenoli
naturalnie występujących w sokach owocowych [12,21].
Działem przemysłu spożywczego, w którym stwierdzono pozytywne
działanie lakazy jest również piekarnictwo. Wykazuje ona bowiem
działanie oksydacyjne prowadzące do wzmocnienia struktury glutenu
zawartego w cieście. Zwiększa również objętość, delikatność i zwartość
uzyskanego pieczywa [6,12].
5. Podsumowanie
Otrzymywane drogą biokatalizy produkty oraz prowadzone procesy nie
ustępują jakością i wydajnością produkcji w stosunku do tradycyjnych,
chemicznych metod, a niekiedy okazują się być nawet lepsze. Lakaza jest
enzymem, który w przyszłości znajdzie szereg zastosowań w wielu
gałęziach przemysłu, eliminując przy tym kosztowne i szkodliwe dla
środowiska procesy. W chwili obecnej otrzymanie lakazy na skalę
przemysłową w dalszym ciągu jest procesem kosztownym stąd też
konieczność prowadzenia dalszych badań, dotyczących udoskonalania
procesu wytwarzania tego enzymu jak również zastosowania bioukładów
opierających się na organizmach, mogących przeprowadzić proces
biokatalizy z udziałem lakazy.
Podziękowania
Praca współfinansowana ze środków Narodowego Centrum Nauki
(NN 302 633040).
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
192
Literatura
1. http://www.nauka.gov.pl/strategiczne-obszary-
badawcze/biotechnologia_24019,archiwum,1.html (6.02.2014 r.)
2. Mikolasch A., & Schauer F. Fungal laccases as tools for the synthesis of new
hybrid molecules and biomaterials, Applied Microbiology And
Biotechnology, 2009 vol. 82, s. 605-624
3. Riva S. Laccases : blue enzymes for green chemistry, Trends in
Biotechnology, 2006 vol. 24, s. 219-226
4. Mayer A. M., & Staples R. C. Laccase : new functions for an old enzyme,
Phytochemistry, 2002 vol. 60, s. 551-565
5. Dwivedi U. N., Singh P., Pandey V. P., & Kumar A. Structure–function
relationship among bacterial, fungal and plant laccases, Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic, 2011 vol. 68, s. 117-128
6. Imran M., Asad M.J., Hadri S.H., Maehmood S. Production and industrial
application of laccase enzyme, Journal of Cell and Molecular Biology, 2012 vol.
10, s. 1-11
7. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka A. Fungal laccases as green catalysts for dye
synthesis, Process Biochemistry, 2012 vol. 47, s. 1295-1307
8. Kunamneni A., Camarero S., García-Burgos C., Plou F. J., Ballesteros A.,
& Alcalde M. Engineering and applications of fungal laccases for organic
synthesis, Microbial Cell Factories, 2008 vol. 7, s. 32
9. Baldrian P. Fungal laccases - occurrence and properties, FEMS Microbiology
Reviews, 2006 vol. 30, s. 215-242
10. Kim S., López C., Güebitz G., & Cavaco‐Paulo A. Biological coloration
of flax fabrics with flavonoids using laccase from Trametes hirsuta,
Engineering in Life Sciences, 2008 vol. 8, s. 324-330
11. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka A. Whole-cell fungal transformation
of precursors into dyes, Microbial Cell Factories, 2010 vol. 9, s. 1-12
12. Brijwani K., Rigdon A., & Vadlani P. V. Fungal laccases: production,
function, and applications in food processing. Enzyme Research, 2010 vol.
2010, s. 1-10
13. Morozova O. V, Shumakovich G. P., Gorbacheva M. A., Shleev S. V, &
Yaropolov A. I. Blue laccases, Biochemistry (Moscow) 2007 vol. 72, s. 1136-1150p
14. Robert V., Mekmouche Y., Pailley P. R., & Tron T. Engineering laccases:
in search for novel catalysts, Current Genomics, 2011 vol. 12, s. 123-129;
15. Thurston C. F., The structure and function of fungal laccases, Microbiology,
1994 vol.140, s. 19-26
16. Claus, H, & Filip, Z. The evidence of a laccase-like enzyme activity in a
Bacillus sphaericus strain, Microbiological Research 1997 vol. 152, s. 209-216
17. Diamantidis G., Aline E., & Potier P. Purification and characterization of the
first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum,
Soil Biology and Biochemistry, 2000 vol. 32, s. 919-927
18. Rivera-Hoyos C. M., Morales-Álvarez E. D., Poutou-Piñales R. A., Pedroza-
Rodríguez A. M., RodrÍguez-Vázquez R., & Delgado-Boada J. M. Fungal
laccases, Fungal Biology Reviews, 2013 vol. 27, s. 67-82
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
193
19. Claus H. Laccases : structure, reactions, distribution, Micron, 2004 vol. 35, s. 93-96
20. Polak J., & Jarosz-Wilkołazka, A. Reakcje katalizowane przez lakazę– mechanizm
i zastosowanie w biotechnologii, Biotechnologia, 2007 vol. 4, s. 82-94
21. Arora D. S., & Sharma R. K. Ligninolytic fungal laccases and their
biotechnological applications, Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010
vol 160, s. 1760-1788
22. Uzan E., Portet B., Lubrano C., Milesi S., Favel A., Lesage- Messen L.,
& Lomascolo A. Pycnoporus laccase- mediated bioconversion of rutin
to oligomers suitable for biotechnology applications, Applied Microbiology
And Biotechnology, 2011 vol. 90, s. 97-105
23. Witayakran S., & Ragauskas A. J. Synthetic applications of laccase in green
chemistry, Advanced Synthesis & Catalysis, 2009 vol. 351, s. 1187-1209
24. Kudanga T., Nyanhongo G. S., Guebitz G. M., & Burton S. Potential
applications of laccase-mediated coupling and grafting reactions: a review,
Enzyme and Microbial Technology, 2011 vol. 48, s. 195-208
25. Leonowicz A., Matuszewska A., Luterek J., Ziegenhagen D., Cho N.,
Hofrichter M., & Rogalski J. Biodegradation of lignin by white rot fungi,
Fungal Genetics and Biology,1999 vol. 185, s. 175-185
26. http://ippc.mos.gov.pl/ippc/custom/48%20-%20rozdzial_3.pdf (6.02.2014 r.);
27. Camarero S., Ibarra D., Mart T., Romero J., Guti A., & del Rio C. Paper pulp
delignification using laccase and natural mediators, Enzyme and Microbial
Technology, 2007 vol. 40, s. 1264-1271
28. Jeon J.-R., & Chang Y.-S. Laccase-mediated oxidation of small organics:
bifunctional roles for versatile applications, Trends in Biotechnology, 2013 vol.
31, s. 335-341
29. http://botit.botany.wisc.edu/Resources/Toms%20Fungi/Basidiomycota/Hymeno
mycetes/General_--Wood_rotters/White_rot_Stromatoscypha_tjv.jpg.html
(6.02.2014 r.)
30. Jeon J-R., Kim E-J, Murugesan K., Park H-K, Kim Y-M, Kwon J-H, Kim W-G.,
Lee J-Y., Chang Y-S. Laccase-catalysed polymeric dye synthesis from plant-
derived phenols for potential application in hair dyeing : Enzymatic
colourations driven by homo- or hetero-polymer synthesis, Microbial
Biotechnology, 2010 vol. 3, s. 324-335
31. Blanco C. D., González M. D., María J., Monmany D., & Tzanov T. Dyeing
properties, synthesis,isolation and characterization of an in situ generated phenolic
pigment, covalently bound to cotton, Enzyme and Microbial Technology, 2009 vol.
44, s. 380-385
32. Kim S. Y., Zille A., Murkovic M., & Cavaco-Paulo A. Enzymatic
polymerization on the surface of functionalized cellulose fibers, Enzyme
and Microbial Technology, 2007 vol. 40, s. 1782-1787
33. Couto S. R., Luis J., & Herrera T. Industrial and biotechnological applications
of laccases : A review, Biotechnology Advances, 2006 vol. 24, s. 500-513
34. Zille A., Munteanu F., Georg M. G., & Cavaco-Paulo A. Laccase kinetics
of degradation and coupling reactions, Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 2005 vol. 33, s. 23-28
Kamila Wlizło, Jolanta Polak, Anna Jarosz- Wilkołazka
194
35. Murugesan K., Arulmani M., Nam I.-H., Kim Y.-M., Chang Y.-S., &
Kalaichelvan P. T. Purification and characterization of laccase produced
by a white rot fungus Pleurotus sajor-caju under submerged culture condition
and its potential in decolorization of azo dyes, Applied Microbiology And
Biotechnology, 2006 vol. 72, s. 939-46
36. Mogharabi M., Nassiri-Koopaei N., Bozorgi-Koushalshahi M., Nafissi-
Varcheh N., Bagherzadeh G., & Faramarzi M. A. Immobilization of laccase
in alginate-gelatin mixed gel and decolorization of synthetic dyes,
Bioinorganic Chemistry And Applications, 2012, vol. 13, s. 205-2016
37. Hou H., Zhou J., Wang J., Du C., & Yan B. Enhancement of laccase
production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization
of antraquinone dye, Process Biochemistry, 2004 vol. 39, s. 1415-1419
38. Piscitelli A., Pezzella C., Giardina P., Faraco V., & Giovanni S. Heterologous
laccase production and its role in industrial applications, Bioengineered
Bugs, 2010 vol. 1, s. 252-262
39. Fukuda T., Uchida H., Takashima Y., & Uwajima T. Degradation
of Bisphenol A by purified laccase from Trametes villosa, Biochemical
and Biophysical Research Communications, 2001 vol. 706, s. 704-706
40. Minussi R. C., Pastore M., & Dura, N. Potential applications of laccase in the
food industry, Trends in Food Science and Technology, 2002 vol. 13, s. 205-216
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
Streszczenie W dobie popularyzacji ochrony środowiska, tradycyjne procesy chemiczne stosowane
w przemyśle są wypierane lub modyfikowane przez stosowanie rozwiązań
biotechnologicznych. Dziedziną biotechnologii związaną z przemysłem jest biała
biotechnologia. Obejmuje ona bioprocesy i biokatalizy związane z przetwarzaniem surowców do pożądanych produktów, redukując przy tym ilość zanieczyszczeń uwalnianych
do środowiska naturalnego. Podstawowym narzędziem białej biotechnologii są enzymy
służące jako biokatalizatory. Przykładem takiego enzymu jest lakaza, będąca powszechnie
występującą w przyrodzie oksydoreduktazą, utleniającą różnorodne substraty z jednoczesną redukcją tlenu cząsteczkowego do wody. Obecność lakaz stwierdzono w roślinach
wyższych, bakteriach, ale głównym źródłem tych enzymów są grzyby ligninolityczne.
W środowisku naturalnym lakazy biorą udział w wielu procesach, przede wszystkim
w syntezie ligniny u roślin lub jej degradacji przez grzyby, gdzie dodatkowo zaangażowane są w procesy patogenezy, morfogenezy oraz detoksyfikacji. Cechą charakterystyczną lakaz
ich jej niska specyficzność substratowa, co przyczyniło się do dużego zainteresowania tymi
enzymami przez wiele gałęzi przemysłu. Szeroko zakrojone badania dotyczą zastosowania
lakaz w przemyśle papierniczym, gdzie stosowane są do usuwania ligniny i wybielania pulpy drzewnej, w przemyśle tekstylnym, gdzie mogą być stosowane do syntezy
niskotoksycznych barwników oraz rozkładzie barwników syntetycznych, bioremediacji
gleby i ochronie środowiska. Znany jest również przykład zastosowania lakazy w przemyśle
spożywczym, w procesie klarowania i stabilizacji win. Niemniej jednak otrzymywanie lakaz na skalę przemysłową jest wysoce kosztowne, dlatego też konieczne są dalsze badania
w celu obniżenia kosztów oraz intensyfikacji produkcji.
Słowa kluczowe: lakazy, biała biotechnologia, przemysł tekstylny
,
Lakaza – niebieski enzym dla kolorowej biotechnologii
195
Laccase – a blue enzyme of colourful biotechnology
Abstract In these days of eco-friendly behaviour, the traditional, chemical industry processes are
replaced or modified by biotechnological solutions. Field of biotechnology, strictly
connected to the industry is white biotechnology. It includes bioprocesses and biocatalysis
in processing of many materials to certain products with reduced environmental pollutants. Basic elements of white biotechnology are enzymatic biocatalysts, for example, laccases.
Those enzymes are oxidoreductases, widely distributed in environment and catalyse
oxidation of substrates with the contaminant reduction of oxygen to water in four-electron
transfer process. Laccases are present in higher plants, bacteria but their main sources are ligninolytic fungi. The enzymes are involved in lignin polymerization in plants and in its
depolymeryzation by fungi in which are involved also in the pathogenesis, morphogenesis
and detoxification. Because of their low- substrate specificity, laccases are interesting
enzymes in industrial application. According to many research, this enzymes are potentially
useful in paper industry in delignification and paper pulp bleaching processes, in textile
industry, in dyes synthesis and degradation of synthetic dyes, as well as in the
bioremediation of soil and in environmental protection. Laccases are also known enzymes
used in wine stabilization in food industry. Nevertheless, production of laccases in industry scale is too expensive, thus for intensification and reducing costs, more research need to be done.
Key words: laccases, white biotechnology, textile industry
196
Ewelina Zielińska1, Monika Michalak-Majewska
2, Damian Zieliński
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
1. Wstęp
Tłuszcze są złożonymi substancjami organicznymi rozpowszechnionymi
zarówno w świecie roślinnym, jaki i zwierzęcym, głównie jako substancje
odżywcze i zapasowe. W roślinach znajdują się one przede wszystkim
w owocach i nasionach, natomiast w organizmach zwierzęcych występują
w prawie wszystkich tkankach.
Ważną grupę lipidów stanowią tak zwane biooleje, czyli naturalne oleje
roślinne pozyskiwane metodą tłoczenia na zimno (oleje dziewicze) lub
metodą rafinacji. Biooleje charakteryzują się wysoką zawartością
niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT), do których
zalicza się między innymi: kwas linolowy, kwas linolenowy i kwas
arachidonowy. Ponadto zawierają one substancje biologicznie czynne takie
jak: witaminy, fosfolipidy i fitosterole [1].
Biooleje, a wśród nich liczna grupa egzotycznych olejów roślinnych,
cieszą się, szczególnie w ostatnich latach, dużą popularnością. Głównie ze
względu na możliwe działanie biologiczne oraz na szeroką gamę
zastosowań praktycznych w różnych gałęziach przemysłu. Innym
powodem tak dużej popularności egzotycznych olejów roślinnych są
względy marketingowe. Producenci, aby przyciągnąć uwagę klientów
zamieszczają na etykietach swoich produktów egzotycznie brzmiące nazwy.
Najpowszechniejszym zastosowaniem większości naturalnych lipidów
roślinnych jest wykorzystanie ich do celów spożywczych. Oleje ze względu
na swoje wysokie walory smakowe znajdują zastosowanie zarówno do
smażenia, jak i jako dodatki do sałatek.
Tłuszcze stosuje się w farmacji i kosmetyce jako nośniki lub podłoża
do substancji czynnych, przy produkcji leków, maści, zastrzyków, kremów.
W medycynie wykorzystywane są ze względu na zawarte w nich substancje
czynne [1].
1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności
i Biotechnologii, SKN Technologii Żywności, www.skntz.up.lublin.pl; 2 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności
i Biotechnologii, Katedra Technologii Owoców, Warzyw i Grzybów, www.up.lublin.pl;
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
197
Ze względu na rosnące zainteresowanie egzotycznymi olejami poszukuje
się wciąż nowych możliwości ich zastosowania. Niniejsza praca przedstawia
obecne, jak również nowe kierunki wykorzystania lipidów zawartych
w wybranych gatunkach pestkowców egzotycznych (awokado właściwym,
kawie arabskiej, oliwce europejskiej, migdale zwyczajnym i orzechu
kokosowym).
2. Omówienie podstawowych pojęć
Lipidy (tłuszczowce) to grupa substancji o zróżnicowanej budowie.
Wspólną cechą lipidów jest ich nierozpuszczalność w wodzie,
a rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, np. eterze czy
chloroformie. Większość lipidów spełnia funkcję materiału zapasowego,
rolę ochronną lub strukturalną. Podstawowym kryterium przynależności do
tej grupy związków jest zawartość długołańcuchowych kwasów
tłuszczowych oraz obecność co najmniej jednego wiązania estrowego.
Tłuszcze dzielone są na poszczególne grupy na podstawie różnych
kryteriów: ze względu na budowę (proste, złożone), pochodzenie
(zwierzęce, roślinne), właściwości fizyczne i chemiczne (stałe, półstałe,
ciekłe) oraz przeznaczenie (spożywcze, techniczne) [2].
Owoce tropikalne zwane inaczej owocami egzotycznymi lub owocami
południowymi – to grupa różnorodnych owoców importowanych z krajów
o ciepłym klimacie – ze strefy klimatu tropikalnego i subtropikalnego.
Owoce egzotyczne ze względu na budowę dzielone są na:
owoce jagodowe (owoce cytrusowe, banan, kiwi, granat daktyl, kaki,
karambola, papaja);
owoce ziarnkowe (figa);
owoce pestkowe (awokado, mango, orzech kokosowy, pistacja,
migdał, pekan);
orzechy (makadamia, kasztan, orzech nadnerczy);
strąki (orzech ziemny);
torebki (orzech brazylijski) [3].
Pestkowce są to owoce zamknięte, niepękające, które powstały
z jednego lub większej ilości owocolistków. Wewnętrzną częścią owocu
pestkowców jest endokarp tworzący z reguły twardą, zwykle zdrewniałą
warstwę otaczającą jedno, rzadziej dwa lub trzy nasiona, czyli pestkę.
Łupiny nasienne występują zazwyczaj w postaci cienkich, błoniastych
okryw. Mezokarp, czyli otaczająca pestkę środkowa warstwa owocni
zazwyczaj tworzy gruby, soczysto – mięsisty lub kleisto – włóknisty
miąższ, który otoczony jest egzokarpem, czyli błoniastą lub skórzastą
okrywą. Jadalnymi częściami większości pestkowców jest mezokarp
(np. awokado, mango) lub nasiona (np. kokos) [4].
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
198
3. Charakterystyka wybranych gatunków pestkowców
tropikalnych
3.1. Awokado właściwe (Persea american Mill.)
Awokado należy do rodziny wawrzynowate (Lauraceae). Jest
zimozielonym, rozłożystym i nisko rozgałęziającym się drzewem
wysokości 10-20m.
Owoce awokado mają zazwyczaj kształt gruszkowaty, czasami prawie
okrągły. Osiągają ponad 30cm długości i do 15cm szerokości. Mają cienko
– skórzastą jędrną okrywę, która może być gładka, pomarszczona lub
szorstka o rożnej barwie – zielonej, fioletowej, czarniawej. Miąższ jest
jasnozielony, białawy lub żółtawy o konsystencji masła. Jest bezwonny
o łagodnym orzechowym smaku. Łatwo odchodzi od okrywy oraz od
jajowatej lub okrągławej, twardej, jasnej pestki o średnicy 5-7cm [5].
Obecnie znanych jest wiele odmian, które różnią się wielkością,
kształtem i składem chemicznym owoców oraz porą kwitnienia
i dojrzewania. Ojczyzną awokado są tropikalne lasy Meksyku i Ameryki
Środkowej. Obecnie głównymi rejonami uprawy są: USA, Meksyk,
Brazylia, Izrael, Indonezja, Wyspy Karaibskie, Nowa Zelandia, Republika
Południowej Afryki.
Owoc awokado charakteryzuje się szczególnie wysoką zawartością
tłuszczu (od 5 aż do 32%), zawartość cukrów jest niższa i wynosi
od 1.2 do 10%. Poza tym w owocach występuje białko, związki mineralne
i witaminy [5].
3.2. Kawa arabska (Coffea arabica L.)
Należy do rodziny marzanowate (Rubiaceae). Jest zimozielonym krzewem
lub małym, nisko i silnie rozgałęzionym drzewem o wysokości do 8m.
Owoce kawy są krótkoszypułkowe i gruboszypułkowe. W stanie
dojrzałym przybierają barwę pomarańczowoczerwoną, czerwonobrązową
do czerwonawoczarnej. Rosną gęsto upakowane i ściśnięte. Są owalne
z dyskowatym wgłębieniem na końcu. Zewnętrzna okrywa owocu kawy jest
jędrna, słabo błyszcząca. Pod spodem znajduje się soczysty, czerwony
miąższ oraz miękka, cienka, szklisto-żółta jego wewnętrzna warstwa, która
otacza dwa leżące obok siebie nasiona. Nasiona są owalne, na zewnątrz
wybrzuszone, a od środka płaskie z podłużną bruzdą. Dodatkowo osłonięte
są błoniastą okrywą.
Rodzaj kawa obejmuje około 60 gatunków, ale dwoma głównymi
botanicznymi gatunkami kawy są: arabika (Coffea arabica) i robusta
(Coffea canephora). Różnią się one budową krzewu, wymaganiami
klimatycznymi oraz kształtem, wielkością i składem chemicznym ziaren.
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
199
Kawa arabska wywodzi się prawdopodobnie z Etiopii. Obecnie kawa
rośnie w pasie 25º na północ i 25º na południe od równika, a jej głównymi
producentami są Brazylia, Kolumbia i Wietnam [6].
Palone ziarno kawy zawiera: 1-3% wody, 21-26% błonnika, 12-14%
tłuszczu, 0.5-2% kofeiny, 1-1.5% substancji garbnikowych [5].
3.3. Migdałowiec zwyczajny (Amygdalus communis)
Należy do rodziny różowatych (Rosaceae). Jest długowiecznym
drzewem lub krzewem o wysokości do 10m, mającym szarą, łuskowatą
korę, kulistą koronę oraz lancetowate, naprzemianległe, piłkowane
i błyszczące liście.
Zewnętrzna i środkowa część owocni pozostaje cienka, skórzasta, lekko
omszona i niejadalna. Jadalną częścią owocu migdała jest duże, jajowate,
spłaszczone nasienie, które ma brązowo-rdzawą skórkę i biały miąższ. Jego
smak w zależności od odmiany uprawnej jest słodki lub gorzki. Długość
nasienia wynosi 2-4cm, a szerokość 1-2cm.
Znane są liczne odmiany migdała, które uprawiane w różnych krajach
można podzielić na trzy typy: o miękkich, półtwardych i twardych
pestkach. Ojczyzną migdałowca zwyczajnego prawdopodobnie jest
centralna Azja, Chiny i Japonia. Obecnie uprawiany jest w krajach
śródziemnomorskich w Europie, Azji i Afryce Południowej, w USA
(głównie Kalifornii), południowej Afryce i Australii.
W skład migdałów wchodzi 11-12% wody, 45-60% tłuszczu, 16% białka.
Ważniejszymi składnikami mineralnymi są wapń, fosfor i magnez. W składzie
migdałów ważnym elementem są również witaminy B1, B2 i PP [7].
3.4. Oliwka europejska (Olea europaea)
Należy do rodziny oliwkowatych (Oleaceae). Oliwka jest wolno
rosnącym drzewem, wiecznie zielonym, które osiąga dojrzałość w wieku
25-30 lat, natomiast może żyć wiele lat, nawet do 1000. Dorasta do 8-12m
wysokości. Korona jest nieregularnie rozgałęziona o stosunkowo wiotkich
i nieco zwisających gałęziach.
Owoce oliwki mają mięsisty miąższ i twardą pestkę. Barwa owoców
w czasie dojrzewania zmienia się z zielonej na czarną. Średnia masa owocu
wynosi od 2 do 12g. Oliwki mają kształt podłużnie owalny lub kulisty.
Stosunek miąższu do pestki waha się od 4:1 do 8:1 [8].
Na świecie uprawia się około 1275 odmian drzew oliwnych, ale tylko
kilkadziesiąt z nich ma znaczenie ekonomiczne. Najpopularniejszymi
odmianami w europie są: Arbequina, Picudo, Picual, Koroneki, Tsounati,
Coratina, Cima di Bitonto. Ojczyzną oliwki jest rejon śródziemnomorski.
Aktualnie uprawiana jest w Hiszpanii, Włoszech, Grecji, Turcji, Syrii, Izraelu,
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
200
Libanie, Tunezji, Algierii, Maroku Libanie, Egipcie, USA i Australii.
Zawartość oleju w oliwce waha się od 10 do 30%, a wody 40-60% [9].
3.5. Kokos właściwy (Cocos nucifera L.)
Należy do rodziny arekowate (Arecaceae). Palmę kokosową najczęściej
uprawia się w formie wysokiej, której pień osiąga 20-30 m, a na jego
szczycie rozwija się pióropusz z 25-30 liści. Istnieje także forma niska,
której wysokość sięga 8-10 m.
Młode owoce początkowo są zielone, ale po dojrzeniu przyjmują barwę
żółtą, pomarańczową, czerwoną lub brązową. Dojrzałe owoce mają długość
20-30cm i wagę do 2.5kg. Owoc składa się z trójwarstwowej owocni:
gładkiej i cienkiej warstwy zewnętrznej, która zwana jest epikarpem,
włóknistego mezokarpu i endokarpu – twardej skorupy, która otacza
nasiono powszechnie zwane orzechem kokosowym. Pod skorupą znajduje
się cienka, brązowa okrywa nasienna, która wyścielona jest od wewnątrz
białym bielmem. W środku nasiono ma pustą przestrzeń, którą w stadium
dojrzałości wypełnia płynne bielmo, czyli mleko kokosowe [3].
Znanych jest wiele odmian, ale w ciągu ostatnich lat sadzi się odmiany
niskopienne (np. ‘Golden Dwarf’), ponieważ z nich łatwiej zbierać owoce.
Kokos właściwy pochodzi prawdopodobnie z Azji Południowo-Wschodniej
lub Polinezji. Aktualnie występuje i jest uprawiany w tropikach na całym
świecie, a głównymi producentami są Filipiny, Indonezja, Indie i Malezja [4].
Dojrzałe jądro orzecha kokosowego zawiera około 50% wody, 25-35%
tłuszczu, 8% cukrów i 4% białka. Natomiast kopra zawiera 7% wody,
60-70% tłuszczu, 14% cukrów i 7% białka [5].
4. Charakterystyka i obecne kierunki wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
4.1. Awokado i olej z awokado
Jedną z możliwości wykorzystania awokado jest sporządzanie masła,
czyli mieszanki przetartego owocu z sokiem z cytryny i ziołami, które
można wykorzystywać do każdego rodzaju pieczywa, naleśników, grzanek
i jako komponent potraw słodkich [3].
Z owoców awokado pozyskuje się olej awokadowy, który jest żółto-
zielony lub brązowo-zielony i ma delikatny, przyjemny zapach. Olej
wydobywa się z wysuszonego miąższu przez tłoczenie na zimno lub przez
macerację świeżej miazgi wodą i odwirowanie. W składzie kwasów
tłuszczowych (tabela 1) przeważa kwas oleinowy, a pozostałe to: kwas
linolowy, kwas palmitynowy, kwas stearynowy, kwas linolenowy.
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
201
Ponadto w składzie oleju z awokado występuje fosfatydocholina
(lecytyna), która należy do fosfolipidów. Lecytyna jest niezbędna
w funkcjonowaniu tkanki nerwowej ludzi i zwierząt. Bierze udział
w gospodarce cholesterolem, pełni funkcje ochronne wobec wątroby,
posiada również właściwości emulgujące. Olej z awokado zawiera ponadto
fitosterole, skwalen, białko, sole mineralne oraz witaminy: A, B, C, D, E,
K, PP. Tłuszcz znajdujący się w owocu awokado zalicza się do olejów
nieschnących. Ze względu na swoją wysoką jakość olej z owoców awokado
wykorzystywany jest w medycynie, przemyśle kosmetycznym oraz
w przemyśle spożywczym [10].
W przemyśle spożywczym olej z awokado wykorzystywany jest ze
względu na swoje właściwości emulgujące w produkcji mas czekoladowych,
sosów i kremów. Olej z awokado jest pożywny i lekkostrawny. Może być
stosowany do obróbki termicznej potraw, ze względu na swoją odporność
termiczną [10].
W przemyśle kosmetycznym olej z awokado należy do szczególnie
cenionych olejów o wielokierunkowym wykorzystaniu, między innymi
do ochrony, odżywiania, regeneracji i regulacji gospodarki wodno-
lipidowej skóry. Olej z awokado w kosmetyce używany jest jako czysty
olej lub jako dodatek do kosmetyków przeznaczonych dla skóry suchej,
wrażliwej, dojrzałej. Olej ten jest źródłem nienasyconych kwasów
tłuszczowych takich jak kwas linolowy i kwas oleinowy oraz ich estrów.
Kwasy te będąc składnikiem błon biologicznych chronią naturalny czynnik
nawilżający (NMF – ang. natural moisturising factor), a ponadto tworzą
na powierzchni skóry film ochronny, który zapobiega utracie wody
w procesie fizjologicznego parowania – transepidermalnej utraty wody
(TEWL – ang. transepidermal water loss). Zawarte w oleju kwasy
tłuszczowe wolne lub zestryfikowane, wypełniają obszary, gdzie naturalna
bariera lipidowa ulega zniszczeniu. Ma to szczególne znaczenie
w przypadku nienasyconych kwasów tłuszczowych, których deficyt
powodowany jest wolnorodnikowymi procesami utleniania. Procesy te są
przyczyną zakłóceń w funkcjonowaniu błon biologicznych jako barier
chroniących komórkę np. przed nadmierną utratą wody. Sucha skóra
charakteryzuje się wzrostem zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych
oraz jednoczesną redukcją kwasu linolowego. Aby zachować prawidłowe
proporcje kwasów oraz poprawić stan naskórka należy stosować na skórę
kosmetyki bogate w nienasycone kwasy tłuszczowe. Kwas linolowy
charakteryzuje się dodatkowo posiadaniem właściwości głębokiego
nawilżania. Natomiast zawarte w oleju witamina E i karoten przyczyniają
się do wzmocnienia bariery tłuszczowej skóry oraz do zmniejszenia TEWL
przez ochronny wpływ na lipidy i lipoproteiny błon biologicznych [11].
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
202
Tłuszcz z awokado używany jest w leczeniu chorób skórnych,
zwłaszcza w egzemach i liszajach. We Francji na bazie tłuszczu z awokado
wyprodukowano preparat do leczenia twardzin skóry (sklerodermii), egzem
oraz schorzeń tkanki okołozębowej i chorób zwyrodnieniowych stawów [5].
4.2. Olej z kawy
Z palonych ziaren kawy, na bazie naturalnego, zimnotłoczonego oleju
słonecznikowego, nowoczesną metodą S-CO2 (ang. supercritical carbon
dioxide) otrzymywany jest ekstrakt w postaci oleju o ciemnożółtym kolorze
i charakterystycznym zapachu dla palonych ziaren kawy. Ekstrakt zawiera
w swoim składzie kwas palmitynowy, kwas stearynowy, kwas oleinowy,
kwas linolowy oraz kwas α-linolenowy (tabela 1). Bogaty jest także
w fitosterole, witaminę E, znaczne ilości kofeiny i związki aromatyczne,
które odpowiedzialne są za charakterystyczny zapach palonej kawy.
Olejek kawowy, dzięki zawartym w nim składnikom, wzmacnia barierę
ochronną skóry, wykazuje działanie nawilżające, gojące, antybakteryjne,
antyoksydacyjne, regenerujące, ujędrniające, ponadto pobudza krążenie
i wykazuje właściwości aromatyczne. Olejek polecany jest do stosowania
zarówno do cery tłustej, jak i suchej, delikatnej, łuszczącej się
i podrażnionej. Stosowany jest do pielęgnacji twarzy i ciała oraz do
pobudzającego masażu. Obecnie wykorzystywany jest także w kosmetykach
redukujących grubość tkanki tłuszczowej i celulitis [12].
Tabela 1. Procentowy skład tłuszczów w wybranych gatunkach pestkowców
egzotycznych
Awokado
właściwe
Kawa
arabska
Migdałowiec
zwyczajny
Oliwka
europejska
Kokos
właściwy
Kwas oleinowy 60-80 8-10 58-81 55-83 (72) -
Kwas linolowy 10-20 40-50 - 3.5-21 (14) -
Kwas palmitynowy 4-12 30-45 6-9 7.5-20 (14) 11
Kwas stearynowy 2 5-9 0.5-1.5 - 6
Kwas linolenowy 2 0.1-3 12-33 - -
Kwas mirystynowy - - - - 18
Kwas laurynowy - - - - 44
Źródło: Opracowanie własne [10,12]
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
203
4.3. Migdały i olej z migdała
Z uwagi na dużą zawartość tłuszczu migdały dobrze łączą się
z pokarmami mącznymi, dlatego też stosuje się je w wyrobach
cukierniczych oraz mieszankach złożonych z suchych owoców (muesli)
i płatków zbożowych. Z roztartych i zalanych wodą nasion migdała
otrzymuje się mleczko migdałowe, tzw. orszadę, która jest odżywczą
emulsją, bogatą w tłuszcze, sole mineralne i związki zapachowe. Specjalnie
przygotowane mleczka migdałowe podawane są niemowlętom uczulonym
na białko mleka krowiego [5, 7].
Z nasion drzewa migdałowego otrzymuje się poprzez wyciskanie na
zimno olej migdałowy. Do najważniejszych kwasów tłuszczowych
występujących w oleju z nasion migdała należą: kwas oleinowy, kwas
linolenowy, kwas palmitynowy, kwas stearynowy (tabela 1). Ponadto olej
ten zawiera cenne fitosterole i tokoferole w ilości od 0.3 do 1%. Olej
z migdałów wykorzystywany jest w ciastkarstwie i cukiernictwie jako
dodatek do różnych mas, kremów cukierniczych, nadzień oraz ciasteczek.
W przemyśle kosmetycznym jest cennym składnikiem kremów do rąk
i mydeł ze względu na swoje nawilżające i zmiękczające działanie, a ze
względu na kojące właściwości polecany jest do pielęgnacji skóry dzieci [10].
Olej migdałowy ponadto wykorzystuje się do iniekcji podskórnych jako
rozpuszczalnik leków lipoidalnych (kamfory, hormonów, witamin
lipoidalnych), maści ocznych, zawiesin. Zawarte w oleju nienasycone
kwasy tłuszczowe wpływają łagodząco i zmiękczająco na skórę i błony
śluzowe oraz są czynnikiem wspomagającym leczenie w stanach zapalnych
przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i moczowych. Olej migdałowy
jest łagodnym środkiem przeczyszczającym, leczy rany, w połączeniu
z fosforem był stosowany do leczenia zaćmy [7].
4.4. Oliwa z oliwek
Dziewiczą oliwę z oczyszczonych, umytych, dokładnie roztartych,
zmielonych oliwek pozyskuje się mechanicznie trzema metodami:
przez tradycyjne tłoczenie w prasach hydraulicznych, przez wirowanie
lub w wyniku selektywnej filtracji. W skład oliwy z oliwek wchodzą
triacyloglicerole (skład kwasów tłuszczowych przedstawiono w tabeli 1),
które stanowią ok. 97–99%, natomiast 1–2% stanowią substancje
niezmydlające (SNZ), w skład których wchodzi ok. 230 związków
chemicznych, np. alifatyczne i triterpenowe alkohole, węglowodory
(np. skwalen), sterole (β- fitosterol), polifenole, aromatyczne związki lotne.
Liczną grupę stanowią związki o właściwościach antyoksydacyjnych
(np. polifenole, kwasy fenolowe, flawonoidy, pochodne oleuropeiny), które
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
204
ponadto nadają oliwie charakterystyczne cechy organoleptyczne oraz mają
pozytywny wpływ na organizm człowieka [9].
Oliwa z oliwek charakteryzuje się atrakcyjnym smakiem. Używana jest
do sałatek, sosu vinegrette oraz do smażenia w umiarkowanej temperaturze.
W niefiltrowanej oliwie z pierwszego tłoczenia zawarte są naturalne
przeciwutleniacze, które zwalczają wolne rodniki, zmniejszają ryzyko
chorób serca oraz opóźniają procesy starzenia komórek [11].
Zawarty w oliwie w dużych ilościach kwas oleinowy wpływa korzystnie
na ograniczenie zachorowań na astmę i alergiczne zapalenie błony śluzowej
nosa, co obserwowane jest wśród mieszkańców basenu Morza
Śródziemnego, gdzie oliwa jest podstawowym składnikiem diety. Ponadto
oliwa z oliwek, dzięki zawartym w niej składnikom zalecana jest do
stosowania przy miażdżycy, nieżycie i owrzodzeniu żołądka, kamicy
żółciowej, zaparciach oraz zapobiega tworzeniu się wolnych rodników.
Reguluje procesy trawienia, spowalnia procesy starzenia, wpływa na
wzrost kości u dzieci. Przeciwdziała zakrzepom. Asymiluje cukry
i wyrównuje ich poziom we krwi, dzięki czemu polecana jest osobom
chorym na cukrzycę [9, 11].
Oliwa z oliwek poza swoim kulinarnym znaczeniem ma również
szerokie zastosowanie w lecznictwie i kosmetyce. Stosowanie oliwy
z oliwek jako kosmetyku daje pożądane rezultaty. Smarowanie skóry
surową oliwą nadaje jej zdrowy, promienny wygląd oraz przynosi ukojenie
skórze narażonej na działanie niekorzystnych czynników atmosferycznych
i stresu. Zawarte w oliwie witaminy i składniki wnikają w głąb skóry,
powodując wygładzenie zmarszczek, odświeżenie, natłuszczenie. Oliwa
jest naturalnym, ale słabym filtrem UV. Zawarta w oliwie witamina F jest
jednym ze składników chroniących skórę przed utratą wilgoci. Przywraca
ona naturalną barierę i odbudowuje płaszcz lipidowy naskórka, likwidując
szorstkość skóry. Oliwa z oliwek stosowana jest do kąpieli, maseczek,
peelingów, jako substytut kremu oraz do masażu pobudzającego krążenie
krwi, dzięki któremu skóra staje się lepiej odżywiona i gładsza [11].
4.5. Tłuszcz kokosowy
Wysuszone bielmo orzecha kokosowego, zwane koprą, zawiera znaczne
ilości tłuszczu od 60 do 70%. Z kopry poprzez tłoczenie i rozgrzanie jej,
otrzymywany jest olej kokosowy, który w temperaturze pokojowej ma
postać stałą. Olej ten bezpośrednio po tłoczeniu lub ekstrakcji ma ciemną
barwę oraz nieprzyjemny smak i zapach. Po procesie rafinacji uzyskuje on
białą barwę oraz pozbawiony zostaje nieprzyjemnego smaku i zapachu.
Wyróżnia się on wysoką zawartością kwasów nasyconych, w tym kwasu
laurynowego, kwasu mirystynowego, kwasu palmitynowego oraz kwasu
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
205
stearynowego (tabela 1). Dzięki takiemu składowi tłuszcz kokosowy jest
odporny na utlenianie. Tłuszcz ten znajduje szerokie zastosowanie
w ciastkarstwie i cukiernictwie, gdzie używany jest do wyrobu ciast,
smażenia, powlekania krakersów, produkcji lodów i wyrobów
czekoladopodobnych. Jest również cennym komponentem przy produkcji
ciasta francuskiego i kruchego ze względu na zawartość kwasu
laurunowego [3, 10].
W przemyśle kosmetycznym stosuje się go jako czysty olej do ciała
lub masażu, dzięki temu, iż posiada działanie uspokajające i chłodzące.
Ponadto stosowany jest w preparatach do pielęgnacji zniszczonych
i suchych włosów oraz jako dodatek do kosmetyków przeznaczonych do
skóry suchej i pękającej oraz do skóry dojrzałej i uszkodzonej przez słońce.
Ma on również zastosowanie przy produkcji mydeł pieniących się
w morskiej wodzie. Stosowany jest również do wyrobu luksusowych
środków piorących oraz płynów kąpielowych i balsamów pod prysznic ze
względu na zawartość kwasu laurynowego [10].
Tłuszcz kokosowy znalazł także zastosowanie w przemyśle chemicznym,
gdzie używany jest w produkcji świec i aparatury włókienniczej. Z tłuszczu
kokosowego otrzymuje się także alkohole i kwasy tłuszczowe.
5. Nowe możliwości wykorzystania lipidów zawartych
w wybranych gatunkach pestkowców tropikalnych
Jednym z możliwych kierunków wykorzystania niektórych ze
wspomnianych wcześniej olejów, szczególnie oleju z migdałów, oleju
z awokado i oliwy z oliwek, jest produkcja tych olejów jako żywności
funkcjonalnej wzbogacanej dodatkowo np. w fitosterole i witaminę E.
Fortyfikowane oleje z owoców egzotycznych spełniałyby wymagania
stawiane żywności funkcjonalnej:
nie są w postaci proszku, kapsułki ani tabletki;
są produktem spożywczym pochodzącym z naturalnie występujących
składników;
są elementem codziennej diety;
ich konsumpcja sprzyjałaby wzmocnieniu mechanizmów obronnych
organizmu, zapobiegałaby chorobom serca [13].
Można przypuszczać, że olej z kawy stosowany obecnie w kosmetyce
znalazłby również zastosowanie w przemyśle spożywczym jako olej
konsumpcyjny. Byłby to szczególny produkt, przeznaczony dla wąskiej
grupy konsumentów. Głównym powodem wąskiego grona odbiorców
byłyby walory organoleptyczne, czyli: ciemniejsza barwa, charaktery-
tyczny smak i zapach palonych ziaren kawy oraz cena. Olej powinien być
pozyskiwany z najlepszych ziaren kawy, które byłyby poddane starannemu
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
206
paleniu, aby zachować specyficzny aromat. Ze względu na skład kwasów
tłuszczowych (wysoka zawartość kwasu linolowego, obecność kwasu
linolenowego i oleinowego) olej z kawy może być składnikiem sosów do
sałatek. Obecność nienasyconych kwasów tłuszczowych powoduje, że olej
ten nie powinien być stosowany do obróbki termicznej w wysokiej
temperaturze.
Olej migdałowy i tłuszcz kokosowy mogłyby znaleźć zastosowanie jako
oleje techniczne. Istnieje możliwość stosowania ich jako komponent do
różnego rodzaju środków smarowych, zarówno smarów nietoksycznych,
jak i podatnych na rozkład biologiczny. Takie smary mogłyby znaleźć
zastosowanie w różnego rodzaju maszynach i urządzeniach precyzyjnych.
Egzotyczne oleje roślinne mogą zostać wykorzystane jako paliwo
do silników Diesla zastępując tym samym olej napędowy. Oleje te mogą
być stosowane jako samodzielne paliwo silnikowe, jako domieszki do
paliwa oraz jako surowiec do produkcji biodiesla. Biodiesel to
przetworzony chemicznie na drodze transesteryfikacji olej roślinny. Paliwo
to przeznaczone jest do stosowania w silnikach Diesla, bez przeróbek
wymaganych do zastosowania surowego oleju roślinnego. Wynika to ze
zbliżonej lepkości biodiesla i oleju napędowego oraz krzepnięcia w niższej
temperaturze niż olej roślinny. Na rynku obserwuje się wzrost
wykorzystania olejów roślinnych jako paliw. Jest to spowodowane
rosnącymi cenami ropy naftowej. Zastosowanie olejów egzotycznych jako
paliwa byłoby uzasadnione ekonomicznie jedynie w krajach ich
pozyskiwania [14].
6. Podsumowanie
Owoce egzotyczne stanowią bogate źródło cennych składników,
które znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Obecnie na
rynku konsument ma dostęp do licznej grupy owoców tropikalnych oraz
produktów z nich otrzymywanych. Istotne jest przekazanie odbiorcom
informacji dotyczących możliwości wykorzystania nowego asortymentu.
Świadomy konsument może sam podjąć decyzję o tym czy chce korzystać
z różnorodności i bogactwa jakie niosą produkty otrzymywane z roślin
egzotycznych. Niektóre z zastosowań praktycznych mogą być dostępne
jedynie w miejscu naturalnego występowania lub uprawy omawianych
gatunków. Spowodowane jest to względami ekonomicznymi lub nietrwa-
łością niektórych produktów.
Najpowszechniejszymi kierunkami praktycznego zastosowania lipidów
zawartych w awokado właściwym, kawie arabskiej, migdałowcu
zwyczajnym, oliwce europejskiej oraz kokosie właściwym jest przemysł
spożywczy, przemysł kosmetyczny, przemysł farmaceutyczny i medycyna.
,
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów
wybranych gatunków pestkowców tropikalnych
207
Oleje pozyskane z wymienionych gatunków pestkowców egzotycznych
wyróżniają się wysokimi walorami smakowymi i zapachowymi,
charakterystycznymi dla surowców, z których zostały otrzymane. Stanowią
one źródło cennych składników odżywczych: witamin, nienasyconych
kwasów tłuszczowych, soli mineralnych, fitosteroli, lecytyny i innych.
Ze względu na bogactwo jakie niosą za sobą egzotyczne owoce, a wśród nich
liczna grupa pestkowców, stale powinny być poszukiwane nowe kierunki
wykorzystania zawartych w nich składników biologicznie aktywnych, w tym
lipidów.
Literatura
1. Naturalne lipidy – skuteczna bariera ochronna, Laboratoria.net, Innowacje,
Nauka, Technologie [online], [dostęp 24 stycznia 2014]. Dostępny w World
Wide Web: http://www.laboratoria.net/pl/technologie/3230.html
2. Kopcewicz J., Lewak S. Fizjologia roślin, Warszawa, PWN, 2007, s. 336-345,
413-415
3. Świetlikowska K., Kazimierczak R., Wasiak-Zys G. Surowce spożywcze
pochodzenia roślinnego, Warszawa, SGGW, 2008, s. 321, 336-340
4. Nowak B., Schulz B. Atlas owoców egzotycznych, Warszawa, Horyzont, 2002,
s. 17, 43-44, 73-75, 164-166
5. Lamer – Zarawska E. Owoce egzotyczne, Wrocław, Wydawnictwo Astrum,
2004, s. 62-669, 235-238, 275-283, 364-372
6. Wasilewski D. U źródeł kawy, Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2003, vol. 5,
s. 56-57
7. Hojden B. Zalety użytkowe i lecznicze migdałowca zwyczajnego, Wiadomości
Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 13
8. Procyk A. Oliwka europejska, Wiadomości Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 7
9. Wroniak M. Oliwa z oliwek znaczenie, technologia, klasyfikacja, Przemysł
Spożywczy, 2008, vol. 6, s. 26-31
10. Rutkowska J. Oleje niepospolite, Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2007,
vol. 1, s. 10-13
11. Portal Dbam o Zdrowie [online], [dostęp 16 stycznia 2014]. Dostępny
w World Wide Web: http://www.doz.pl
12. Lamer – Zarawska E. Tłuszcze z roślin egzotycznych stosowane
w kosmetykach, Wiadomości Zielarskie, 2001, vol. 5, s. 14-15
13. Jeznach M. Stan i perspektywy rozwoju rynku żywności funkcjonalnej,
Warszawa, Wydawnictwo SGGW, 2003, s. 11
14. Biodiesel – charakterystyka fizykochemiczna [online], [dostęp 27stycznia
2014]. Dostępny w World Wide Web: http://www.biodiesel.biz.pl
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska , Damian Zieliński
208
Możliwości praktycznego wykorzystania lipidów wybranych gatunków
pestkowców tropikalnych
Streszczenie Owoce tropikalne, zwane inaczej owocami egzotycznymi lub owocami południowymi, to grupa różnorodnych owoców importowanych z krajów strefy klimatu tropikalnego i subtropikalnego. Ze względu na budowę owoców wyróżnia się m.in. owoce pestkowe, których przedstawicielami są awokado, mango, orzech kokosowy, pistacja, migdał, pekan. Powszechnie konsumowanymi częściami większości pestkowców jest mezokarp, czyli środkowa warstwa owocni zazwyczaj tworząca gruby, soczysto-mięsisty miąższ (np. awokado, mango) lub nasiona (np. kokos). W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na inne wykorzystanie owoców egzotycznych, a mianowicie jako potencjalne źródło lipidów. Dużą popularnością, szczególnie w ostatnich latach, cieszą się biooleje, czyli naturalne oleje roślinne pozyskiwane metodą tłoczenia na zimno lub metodą rafinacji. Wśród nich znajduje się liczna grupa egzotycznych olejów roślinnych, wykorzystywanych ze względu na możliwe działanie biologiczne, a także ze względów marketingowych. Producenci, aby przyciągnąć uwagę klientów, zamieszczają na etykietach swoich produktów egzotycznie brzmiące nazwy. Najpowszechniejszym zastosowaniem większości naturalnych lipidów roślinnych jest wykorzystanie ich do celów spożywczych, ale także w farmacji i kosmetyce jako nośniki lub podłoża dla substancji czynnych, przy produkcji leków, maści, zastrzyków, kremów. Niniejsza praca ma na celu przedstawienie obecnych, ale i wskazanie nowych kierunków wykorzystania lipidów zawartych w wybranych gatunkach pestkowców egzotycznych (awokado właściwym, kawie arabskiej, oliwce europejskiej, migdale zwyczajnym i orzechu kokosowym).
Słowa kluczowe: lipidy, owoce tropikalne, pestkowce
The possibility of the practical use of lipids contained in the selected
species of tropical drupes
Abstract Tropical fruit, otherwise known as exotic fruit or southern fruit, a group of a variety of fruits imported from tropical and subtropical climate zone. Due to the fruit construction, among others, include drupes, which are representatives of avocado, mango, coconut, pistachio, almond, pecan. Commonly consumed part of the most drupes is mesocarp, which is the middle layer of the pericarp usually forming a thick, fleshy and juicy flesh (e.g. avocado, mango) or seeds (such as coconut). In recent years, more attention is paid to the other use of exotic fruit, namely as a potential source of lipids. Very popular, especially in recent years, are the bio-oils, that are natural plant oils obtained by cold pressing or by refining. Among them is a large group of exotic oils, used due to possible biological effects, as well as for marketing reasons. Producers to attract the attention of customers, put on the labels of their products exotic-sounding name. The most common use of most natural plant lipids is to use them for food, but also in pharmacy and cosmetics as carriers or base for the active substances in the production of medicines, ointments, injectables, creams. This paper aims to provide current, but also to identify new directions of use of lipids contained in the selected species of exotic drupes (avocado, Arabic coffee, European olive, almond and coconut). Keywords: lipids, tropical fruit, drupes
209
Magdalena Bartosiak1, Anna Cieślak
2
Zastosowanie enzymów amylolitycznych
i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
1. Wstęp
Enzymy są wyspecjalizowanymi białkami obecnymi w organizmach
żywych. Umożliwiają przeprowadzenie wielu reakcji chemicznych oraz są
niezbędne dla prawidłowego metabolizmu wszystkich organizmów. Mogą
być również wykorzystane poza organizmami dla przyspieszenia
wybranych reakcji chemicznych. Są stosowane od tysięcy lat (początkowo
w sposób nieświadomy), co jest związane ze znaczeniem mikro-
organizmów w wytwarzaniu wielu produktów spożywczych. Ich
skuteczność, specyficzność oraz łatwość stosowania spowodowały, że są
często używane w przetwórstwie żywności. Postępy biotechnologii
w ostatnich latach pozwoliły na dalsze udoskonalenie zastosowania
enzymów w przemyśle spożywczym. Znaleziono rozwiązania dla wielu
problemów technologicznych i wytyczono drogę dla wielu nowych
ekscytujących możliwości. Najbardziej znanym przykładem korzyści
odniesionych dzięki nowoczesnej technologii z zastosowaniem enzymów
jest rozkład skrobi do cukrów prostych. Zastosowanie procesu
enzymatycznego nie wymaga specjalnych warunków, oszczędza energię
i zapobiega powstawaniu zanieczyszczeń [17, 20]. Amylazy są
odpowiedzialne za enzymatyczny rozkład cukrów, do osiągnięcia
aktywności wymagają obecności jonów wapnia, które poprawiają
stabilność enzymu i biorą udział w reakcji katalitycznej. Poznane zostały
różne rodzaje amylaz i różne możliwości ich klasyfikacji. Szerokie
zastosowanie w przemyśle spożywczym znalazły również enzymy
proteolityczne. Ich zdolność do hydrolizy białek jest wykorzystywana
głównie w serowarstwie, przy produkcji produktów mlecznych i ogólniej
modyfikacji składników żywności.
1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii
i Biotechnologii, Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron” 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Wydział Biologii i Biotechnologii,
Zakład Biochemii, Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
210
2. Enzymy amylolityczne
2.1. Ogólna charakterystyka enzymów amylolitycznych
Enzymy amylolityczne (amylazy) zaliczane są do podklasy hydrolaz
(EC. 3.2), czyli grupy enzymów, których zasada działania opiera się na
przerywaniu wiązania glikozydowego w procesie hydrolizy [1]. Hydrolazy
w roztworach wodnych katalizują przede wszystkim hydrolizę wiązań
glikozydowych, ale w przypadku obecności dużych stężeniach cukru mogą
katalizować reakcje kondensacji, a w szczególnych przypadkach również
reakcje transglikozylacji. Amylazy, odpowiedzialne za enzymatyczny
rozkład cukrów, do osiągnięcia aktywności wymagają obecności jonów
wapnia, które poprawiają stabilność enzymu i biorą udział w reakcji
katalitycznej. Aktywacja enzymów odbywa się przy udziale jonów
chlorkowych lub innych anionów. Ponadto różnią się między sobą
wartością optymalnej temperatury i pH, przy których wykazują
maksymalną aktywność[4].
Poznane zostały różne rodzaje amylaz i różne możliwości ich klasyfikacji.
Z punktu widzenia możliwości hydrolizy różnych wiązań glikozydowych
można je podzielić na hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe
(α-amylazy, β-amylazy), hydrolizujące wiązania α-1,6-glikozydowe
(izoamylazy i pululanazy) oraz hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe
i α-1,6-glikozydowe (glukoamylazy i niektóre pullanazy). Ze względu na
miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi amylazy
można sklasyfikować do endoamylaz (α-amylazy, amylazy znoszące
rozgałęzienia) oraz egzoamylaz (glukoamylazy i β-amylazy). Biorąc pod
uwagę rodzaj zachodzących procesów możemy je podzielić na enzymy
upłynniające (α-amylazy, izoamylazy, pululanazy) i scukrzające (β-amylazy,
glukoamylazy i niektóre α-amylazy). Podział enzymów amylolitycznych
może nastąpić również ze względu na źródło ich pochodzenia i konfigurację
centrum anomerycznego uwalnianych produktów hydrolizy [3].
W przemyśle największe znaczenia ma katalizowana przez enzymy
amylolityczne reakcja hydrolizy skrobi do cukrów prostych [2].
W zależności od stopnia hydrolizy [4] i sposobu rozrywania wiązania
glikozydowego [5] istnieje możliwość otrzymania wielu różnych
Enzym Rodzaj hydrolizowanego wiązania
α-amylaza α 1,4- glikozydowe wewnątrz łańcucha skrobi
β-amylaza α-1,4-glikozydowe między drugą a trzecią jednostka
glukozową, licząc od nieredukującego końca łańcucha
γ-amylaza α-1,4-glikozydowego
pullanaza 1,6 glikozydowe jedynie w przypadku kiedy łączy ono
łańcuchy połączone wiązaniem α-1,4
,
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
211
produktów, np.: glukoza, fruktoza, maltoza, dekstryny [4]. W procesie
hydrolizy skrobi najważniejszą rolę odgrywają α amylazy, βamylazy,
glukoamylazy oraz enzymy usuwające rozgałęzenia, głównie pullanazy [2].
2.2. α-amylaza: charakterystyka i zastosowanie
α-amylaza (EC 3.2.1.1,4-glukanohydrolaza α,1→4-glukanu) [5]
to endoenzym mający największe znaczenie w procesie upłynniania skrobi.
Posiada ona zdolność zrywania wiązania α 1,4- glikozydowego wewnątrz
łańcucha skrobi, powodując tym samym spadek lepkości obrabianego
kleiku skrobiowego [2]. Pierwszy etap procesu hydrolizy skrobi
z zastosowaniem α-amylazy polega na upłynnieniu skrobi przy użyciu
enzymu przez podgrzanie do temperatury 105°C na czas 2-5 minut oraz
przetrzymanie w temperaturze 90-100 °C przez 1 – 2 godziny. Stosowanie
tak wysokiej temperatury wymaga odpowiednio dużej termostabilności
enzymu. Ulepszenie tej cechy można otrzymać dzięki technologii
rekombinacji genetycznej [6].
Rys.1 Model upłynniania cząsteczki amylopektyny przy udziale alfa-amylazy
Pod względem biochemicznym α-amylazy to metylohydrolazy. Domena
katalityczna enzymu to domena typu α,β-1,8- beczułki zbudowanej
z naprzemiennie ułożonych ośmiu helis i ośmiu odcinków β fałdowych.
Szósta helisa ma charakter nieciągły i złożona jest z 2 krótkich odcinków
helikalnych połączonych odcinkiem łańcucha polipeptydowego. Po
rozciągnięciu naprzemiennie ułożone są odcinki beta-fałdowe i alfa-helisy
połączone pętlami. Najistotniejszą funkcję pełni pętla trzecia, łącząca
trzecią helisę i trzeci odcinek β-fałdowy. Jest ona stosunkowo długa
i zawiera reszty aminokwasów katalitycznych: jedną resztę kwasu
glutaminowego i dwie reszty kwasu asparaginowego. Miejsce, które łączy
substrat w tej domenie w centrum katalitycznym ma również
skomplikowaną strukturę. W miejscu wiążącym występuje 10 podmiejsc
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
212
ponumerowanych od 0 do 9 i w których wiążą się kolejne reszty
glukopiranozy. Wiązany jest tu oligosacharyd zbudowany z 10 reszt
glukopiranozy bądź to być część łańcucha amylozy czy amylopektyny.
Następnie następuje przecięcie wiązania między resztami, które są wiązane
w podmiejscach 6 i 7. Taka struktura miejsca wiążącego w centrum
aktywnym tłumaczy fakt, że α-amylaza hydrolizuje układ większych
substratów oraz hydrolizuje oligodekstryny o minimalnej długości 10 reszt.
W tym ostatnim przypadku hydroliza zachodzi dużo wolniej [7,8,9].
Najlepiej została poznana produkcja α-amylazy przez bakterie Bacillus
subtilis, jednak do zastosowań komercyjnych stosuje się α-amylazę
otrzymywaną ze szczepu bakterii Bacillus licheniformis, ponieważ enzym
ten wykazuje stabilność i aktywność w temperaturach przekraczających
90°C. Ponadto aktywność enzymu w małym stopniu zależna jest od pH
roztworu i stężenia jonów wapnia. Wyróżnić jeszcze możemy α-amylazę
pochodzenia grzybowego, która jest bardziej odporna na zmiany pH
środowiska reakcji, jednak wykazuje większa termo labilność [6].
2.3. β- amylaza: charakterystyka i zastosowanie
β- amylaza (EC 3.2.1.2,maltohydrolaza α-1→4-glukanu) [5] to główna
egzoamylaza stosowana w hydrolizie skrobi [2]. Hydrolizując wiązanie
α-1,4-glikozydowe [5] między drugą a trzecią jednostka glukozową, licząc
od nieredukującego końca łańcucha [2], zmieniają konfigurację α przy C1
glukozy w konfigurację β (stąd nazwa β-amylazy)[5]. Enzym ten najlepiej
działa w środowisku o temperaturze 55-56°C i pH około 5 [10].
Amylopektynę i glikogen rozkładają tylko w około 50%, ponieważ
wiązania α,l→6-glikozydowe przeszkadzają im w działaniu. Niestrawiona
reszta wykazuje wysoki stopień polimeryzacji i jest nazwana dekstryną
graniczną β-amylazy [5]. W wyniku działania na skrobię β-amylazą jako
produkt otrzymuje się maltozę oraz wspomniane wyżej dekstryny
graniczne[2]. Cząsteczka enzymu może hydrolizować około 252 000 wiązań
na minutę. Dla prawidłowego funkcjonowania enzymu są istotne grupy
sulfhydrylowe obecne e centrum aktywnym [5]. W odróżnieniu od innych
enzymów hydrolitycznych nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali.
Pod względem biochemicznym to oligomeryczne białko najczęściej
zbudowane z identycznych podjednostek. Każda podjednostka zawiera
centralnie położoną domenę katalityczną o charakterze αβ-1,8-beczułki.
Zbudowana jest ona z ośmiu helis i ośmiu odcinków β-fałdowych. Helisy
stanowią otulinę zewnętrzną, natomiast odcinki β-fałdowe wyściółkę
domeny. Ponadto wyróżnić można kieszeń katalityczna złożoną z dwóch
reszt kwasu glutaminowego bądź reszty kwasy glutaminowego i reszty
kwasy asparaginowego oraz reszty tyrozyny
,
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
213
Rys.2 Model upłynniania cząsteczki amylopektyny przy udziale β-amylazy
2.4. γ- amylaza
γ-amylaza (EC 3.2.1.3 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu,
glukoamylaza) to enzym umożliwiający wysoce specyficzną hydrolizę
wiązania α-1,4-glikozydowego. Pozyskiwany jest z transgenicznych
szczepów Aspergillus niger oraz Aspergillus awamori . Końcowym
produktem reakcji jest glukoza: enzym rozszczepia po jednej cząsteczce
glukoza aż do miejsca rozgałęzienia. γ-amylaza zdolna jest również do
hydrolizy wiązań α-1,6-glikozydowych. Jednak reakcja ta zachodzi z małą
wydajnością [2]. Enzym wykazuje największą aktywność w środowisku
o temperaturze 40-65°C. Ponadto charakteryzuje się dużą odpornością na
zmiany pH (1,8-8,8 dla A. niger i 1,8-10,5 dla A. awamori). Warto
zaznaczyć, że w przeciwieństwie do α-amylazy obecność jonów wapnia
działa inhibicyjnie na proces hydrolizy skrobi z udziałem β-amylazy [10]
Atak enzymu rozpoczyna się na nieredukującym końcu łańcucha
polimerowego, a powstała glukoza ma konformację β. W przypadku, gdy
stężenie glukozy bądź enzymu w środowisku reakcji jest wysokie możliwe
jest zajście reakcji odwrotnych, tj. repolimeryzacji glukozy do maltozy
i izomaltozy.
2.5. Pullanaza
Pullanaza (EC 3.2.1.41, pullulan-6-glukanohydrolaza) to enzym usuwający
rozgałęzienia zarówno w amylozie jak i amylopektynie. Przy użyciu tego
enzymu możliwa jest hydroliza wiązania 1,6 glikozydowego jedynie
w przypadku kiedy łączy ono łańcuchy połączone wiązaniem α-1,4 (np. w pul
lulanie, stąd nazwa enzymu). Poza tym, na skalę przemysłową produkowane
są również preparaty pullanaz mogące hydrolizować wiązanie
1,4-glikozydowe. Produktem końcowym reakcji z udziałem enzymu są oligo-
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
214
i poli- sacharydy, a optymalna temperatura do działania tego enzymu to 60°C.
Izolowany jest on głównie z bakterii mezofilnych lub termofilnych,
np.: Geobacillus stearothermophilus, Bacillus stearothermophilus [2, 11].
2.6. Zastosowanie enzymów amylolitycznych w przemyśle
Ze względu na specyficzność substratową enzymów, która zapobiega
powstawaniu niepożądanych produktów ubocznych, możliwości
prowadzenia reakcji enzymatycznych przy względnie niskich wartościach
temperatury, pH i ciśnienia w porównaniu do procesów chemicznych,
możliwości immobilizacji enzymów na stałych nośnikach, która usprawnia
wydajność procesu i zapobiega przedostawaniu się enzymów do gotowego
produktu [2, 12] preparaty enzymatyczne wciąż umacniają swoja pozycję
na rynku przemysłowym. Jednym z nich są preparaty enzymów
amylolitycznych, które opanowały niemal cały, szeroko pojęty, przemysł
spożywczy. Dzięki możliwości katalizowania procesu hydrolizy skrobi,
który może przebiegać w różnym stopniu, znajdują one zastosowanie
głównie przy produkcji syropów maltodekstrynowych (powstają po
procesie upłynnienia skrobi), glukozowych i maltozowych (dwa ostatnie
powstają po procesie scukrzania upłynnionej już wcześniej skrobi).
Poszczególne syropy charakteryzuje tzw. ekwiwalent dekstrozowy DE
(ang. Dextrose equivalent), wyrażony w procentowej zawartości cukrów
redukujących (zwykle rownoważnikow glukozy) na jednostkę suchej masy
produktu. Dla niezhydrolizowanej skrobi DE wynosi w przybliżeniu zero,
natomiast po zhydrolizowaniu jej do glukozy DE wzrasta do 100 [14].
Syropy glukozowe znajdują głównie zastosowanie w przemyśle
browarniczym, gorzelniczym oraz piekarniczym. Otrzymuje się z nich
syropy fruktozowe dodawane do konfitur, syropów i popularnych napojów
gazowanych typu Coca Cola [3, 15]. Z glukozy otrzymuje się też tzw.
polidekstrozę niskiej kaloryczności oraz sorbitol. Syropy maltodekstrynowe
stosowane są jako zagęszczacze, inhibitory krystalizacji, regulatory
wilgotności przetworów spożywczych [3, 13, 14]. Mogą być wykorzystywane
do ochrony związków małocząsteczkowych (np. aromatów żywności) przed
utlenianiem, ponieważ wykazują skłonność do kapsułkowania aromatów.
Obecnie biorą również udział w produkcji środków spożywczych dla
niemowląt i odżywek dla sportowców. Z kolei syropy maltozowe ogrywają
największa rolę w przemyśle cukierniczym. Służą do zapobiegania
krystalizacji sacharozy [13, 14]. Ich dodatek do żywności ułatwia kontrolę
wodochłonności. Syropy te stosuje się także jako wypełniacze i stabili-
zatory żywności przetworzonej[o]. Dzięki możliwości zapobiegania
tworzenia się kryształków lodu, syropy o dużej zawartości maltozy stosuje
się do produkcji lodów i mrożonej żywności. Ponadto wykorzystywane
,
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
215
są w procesie produkcyjnym napojów bezalkoholowych oraz żywności
dla diabetyków. Syropy ze skrobi stosuje się również jako substytuty
tłuszczów w żywności fat free [3, 13, 14]. Poza otrzymywaniem syropów
enzymy amylolityczne biorące udział w enzymatycznej hydrolizie skrobi
wykorzystywane są przy produkcji kwasów organicznych takich jak kwas
glukonowy, który znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym,
np.: glukoniany wapnia, żelaza i magnezu służą jako dodatki wzbogacające
produkty spożywcze w odpowiednie sole mineralne. Dodatkowo, enzymy
te usuwają zanieczyszczenia skrobiowe z różnego rodzaju produktów
spożywczych, np. służą do klarowania soków i win. Główną rolę w tym
procesie odgrywają α-amylazy o optimum pH 3-4. Bez amylaz upadłoby
gorzelnictwo i browarnictwo. Preparaty enzymatyczne używane są do
hydrolizy skrobi głównie pochodzenia roślinnego (kukurydza, maniok,
pszenica, ziemniaki). Natomiast przy produkcji piwa uczestniczą
w zacieraniu słodu i procesie klarowania, zwiększając wydajność warzelni
i obniżając koszty związane z budową i eksploatacją słodowni [3, 14].
Dzięki zdolności amylaz do zwiększania zawartości cukrów, a tym
samym możliwości wzmożenia fermentacji, wykorzystuje je także
piekarstwo. Zintensyfikowana przez enzymy fermentacja spulchnia ciasta,
zwiększa porowatość oraz poprawia zarówno kolor skórki jak i smak
i zapach pieczywa. Ponadto stosowane są przy produkcji pasz, gdzie
doskonalą ich przyswajalność [14].
3. Enzymy proteolityczne
3.1. Ogólna charakterystyka enzymów proteolitycznych
Enzymy proteolityczne stanowią najważniejszą grupę enzymów.
Katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach. Należą
do klasy 3 – hydrolaz. Enzymy proteolityczne możemy podzielić na trzy
grupy w zależności od funkcji, mechanizmu działania i struktury białka:
Mechanizm katalizy. W tej grupie proteaz wyróżniamy proteazy:
serynowe, cysteinowe, treoninowe, asparaginowe, glutaminianowe,
aspartylowe oraz metaloproteazy;
Rodzaj katalizowanej reakcji. Wszystkie proteazy katalizują tą samą
reakcję – hydrolizy wiązania peptydowego. Natomiast nie wszystkie
proteazy katalizują hydrolizę tego samego rodzaju wiązań
peptydowych. Jedną z cech na podstawie której dokonujemy podziału
proteaz jest położenie wiązania peptydowego, które ma ulec hydrolizie.
W tej grupie wyróżniamy: endopeptydazy, omegapeptydazy, egzo-
peptydazy, aminopeptydazy, karboksypeptydazy, dipeptydylo-
peptydazy, tripeptydylopeptydazy, peptydylodipeptydazy i dipeptydazy;
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
216
Struktury molekularnej i homologii – jest to najnowsza z grup
podziału. Zależy od znajomości sekwencji aminokwasowej
i struktury przestrzennej peptydu ulegającego hydrolizie.
Proteazy serynowe zawierają w centrum aktywnym serynę oraz
histydynę, jako dawcę ładunku dodatniego; hamowane przez
diizopropylofluorofosforan (DIFP) np. trypsyna, chymotrypsyna, elastaza,
trombina. Proteazy cysteinowe zawierają w centrum aktywnym grupę
tiolową cysteiny w bezpośrednim sąsiedztwie pierścienia imidazolowego His
np. katepsyna II, enzymy roślinne: papaina bromelaina, ficyna [7]. Proteazy
aspartylowe zawierają w centrum aktywnym 2 grupy karboksylowe, zarówno
w charakterze grupy nukleofilowej, jak i dawcy protonu, działają one
z reguły w środowisku o małym pH np. pepsyna, podpuszczka, katepsyna
IV, niektóre enzymy wenątrzkomórkowe zwierzęce oraz grzybowe.
Aktywność metaloproteaz zależna jest od obecności określonych jonów
metali (cynku, wapnia czy manganu) np. karboksypeptydaza A i B,
bakteryjna termolizyna czy kolagenaza [13].
Peptydazy nie wykazują najczęściej ścisłej specyficzności w stosunku
do rozkładanego substratu, natomiast charakteryzują się wybiórczością
w stosunku do położenia rozkładanego wiązania wewnątrz łańcucha
polipeptydowego (endopeptydazy) i na jego skraju (egzopeptydazy).
Endopeptydazy to enzymy, które hydrolizują wiązania peptydowe
znajdujące się wewnątrz cząsteczki białka czy peptydu rozkładając go na
mniejsze fragmenty. Należą do nich pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna.
Do endopeptydaz roślinnych zaliczane są: papaina, bromelanina,
aktynidyna i ficyna. Egzopeptydazy są enzymami, które hydrolizują
wiązania peptydowe znajdujące się na C- lub N- końcu białka, odczepiające
pojedyncze aminokwasy. Karboksypeptydazy to enzymy odczepiającymi
aminokwas na C końcu peptydu (wykazują specyficzność w stosunku do
sąsiedniego wolnego ładunku ujemnego grupy karboksylowej), natomiast
aminopeptydazy to enzymy odczepiającymi aminokwas na N końcu
peptydu (wykazują specyficzność w stosunku do sąsiedniego wolnego
ładunku dodatniego grupy aminowej) [7].
3.2. Zastosowanie enzymów proteolitycznych w przemyśle
3.2.1. Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego
W przemyśle spożywczym szerokie zastosowanie znalazły proteazy
asparaginowe, produkowane przez pleśnie z gatunków Mucor. Ich optimum
pH wynosi 4-4,5. Najważniejszym enzymem z tej grupy jest podpuszczka.
Jest stosowana w przemyśle serowarskim do koagulacji białek mleka.
Początkowo enzym ten był otrzymywany z żołądków cieląt. Kwaśne
,
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
217
proteazy pleśniowe nie hydrolizują kazeiny, tylko powodują jej ścinanie na
drodze koagulacji. Od preparatów kwaśnych proteaz wymagana jest
wysoka czystość. Zanieczyszczenia innymi protezami i lipazami, mogą
prowadzić do rozkładu kazeiny oraz powstania gorzkiego smaku. Kwaśne
proteazy są wytwarzane przez grzyby z rodzaju Mucor . Stosuje się
głównie do wyrobu serów typu cheddar. Proteaz pleśniowych używa się
również w piekarnictwie do poprawiania tekstury ciasta. Te enzymy są
również dodawane do piwa w celu zwiększenia jego klarowności
i ulepszenia warunków filtracji. W przemyśle mleczarskim proteazy
pleśniowe wykorzystywane są do stabilizacji zagęszczanego mleka
i produkcji hydrolizatów białkowych. Innym enzymem proteolitycznym
pochodzenia zwierzęcego, który ma zastosowanie przemysłowe jest
pepsyna, pozyskiwana z błony śluzowej żołądków kurcząt rzeźnych [2, 16].
Do hydrolizy białek soi używa się pepsynopodobne proteinazy kwaśne.
Proteazy wykorzystuje się dodatkowo do hydrolizy żelatyny. Żelatyna ma
małą wartość odżywczą, dlatego hydrolizaty dodaje się do napojów jako
niskokaloryczne wypychacze żołądka. Proteazy stosuje się również, aby
uzyskać produkty dietetyczne poprzez zmniejszanie wydzielania
natywnych enzymów. Stosowane są także do produkcji substytutu mleka
i kontroli gorzkiego smaku w hydrolizach białka. Dodatkowo, stosuje się je
w przetwórstwie rybnym, na rozdrobione resztki po rybie takie jak ości,
skóra czy płetwy działa się roztworem wodnym z proteazą. Za pomocą
pasteryzacji, denaturacji, odwirowania oddziela się substancje tłuszczowe
i produkt staje się rozpuszczalny [18]. Opracowano wiele procesów
polegających na sterowanej proteolizie białek żywnościowych w celu
polepszenia ich właściwości funkcjonalnych i smakowych. Do produkcji
autolizatów drożdżowych, wykorzystuje się własny kompleks enzymów
proteolitycznych komórek drożdżowych (tzw. endotrypsyny). Na drodze
enzymatycznej hydrolizy kwasów rybonukleinowych w drożdżach,
uzyskuje się z nukleotydów sól dwusodową kwasu 5’-inozynowego oraz
analogiczną sól kwasu 5’-guanilowego, które pod nazwą rybotydów lub
w skrócie IMP i GMP znajdują coraz szersze zastosowanie w przemyśle
spożywczym jako środki poprawiające smak [19, 13]. Lista zastosowań
enzymów proteolitycznych w technologii ciągle się powiększa.
3.2.2. Peptydazy pochodzenia zwierzęcego
W latach dziewięćdziesiątych skonstruowano rekombinowane
genetycznie drożdże i bakterie syntetyzujących proteazy podpuszczkowe
znane pod nazwą chymozyny. W serowarstwie wykorzystywana jest
kazeolityczna właściwość chymozyny (renniny), mającej zdolność ścinania
mleka na słodko w wyniku bardzo szybko przebiegających hydrolitycznych
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
218
zmian w jednej z frakcji kazeinowych. Następnie podpuszczka hydrolizuje
frakcje kazeinowe w czasie dojrzewania sera, powodując ich częściowe
doprowadzenie do stadium peptydów. Dalsza hydroliza peptydów do
aminokwasów i ich ewentualna dezaminacja lub dekarboksylacja jest
przypisywana działalności enzymów bakteryjnych. Wobec stale
zwiększającego się zapotrzebowania na podpuszczkę cielęcą zastępuje się
ją częściowo lub całkowicie innymi enzymami proteolitycznymi
o zbliżonym działaniu, jak pepsyną wołową lub wieprzową [17]. Enzymy
proteolityczne znalazły zastosowanie także w piwowarstwie. Używa się ich
do rozpuszczenia białek i zapobieżeniu zmętnieniom piwa przy jego
chłodzeniu [16].
3.2.3. Peptydazy pochodzenia roślinnego
Peptydazy pochodzenia roślinnego, mają duże znaczenie w przetwórstwie
żywności i innych gałęziach przemysłu. Najważniejszymi peptydazami
pochodzenia roślinnego, stosowanymi w przemyśle są: papaina, ficyna
i bromelaina. Enzymy roślinne stosowane są do zwiększania kruchości
mięsa. Enzymy roślinne atakują przede wszystkim białka tkanki łącznej
(kolagen i elastynę), a tylko w nieznacznym stopniu działają na włókna
mięśniowe, wpływając na tkankę łączną tylko w określonych warunkach.
Papaina wykorzystywana jest także w browarnictwie do klarowania piwa.
W przemyśle piekarskim dodatek tych enzymów bywa konieczny przy
stosowaniu pszenicy stepowej w celu rozluźnienia zbyt mocnego białka
glutenowego [20].
4. Podsumowanie
Enzymy to biokatalizatory powszechnie stosowane w przetwórstwie
żywności[2]. W praktyce stosowanie preparatów enzymatycznych
obejmuje prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego [13]. Używane
są one w początkowych etapach produkcji i często, w wyniku inaktywacji
w procesie np. gotowania, nie występują w gotowym produkcie.
Wyróżniamy różne grupy enzymów, które przyczyniają się do wytwarzania
i ulepszania produktów żywnościowych. Jednak to enzymy amylolityczne
i proteolityczne są najbardziej powszechne [2]. Największe korzyści
płynące z zastosowania takich biokatalizatorów to m.in.: podniesienie
jakości i wydłużenie trwałości produktów spożywczych, przyspieszenie
procesów technologicznych i zwiększenie wydajności tradycyjnie
stosowanych surowców oraz zmniejszenie kosztów produkcji [13, 14].
Wykorzystywane przez przemysł spożywczy enzymy sprzedawane
są w postaci preparatów wzbogaconych szeregiem substancji dodatkowych
takich jak stabilizatory, konserwanty, rozcieńczalniki, a produkowane
,
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych w przemyśle spożywczym
219
w większości przez mikroorganizmy (bakterie, grzyby), które coraz
częściej otrzymywane są metodami inżynierii genetycznej [2].
Literatura
1. Hill R., Needham J. The Chemistry of Life: Eight Lectures on the History of Biochemistry, London, England: Cambridge University Press, 1970
2. Kobus K. Transgeniczne mikroorganizmy w produkcji enzymów stosowanych w technologii żywności, Poznań, 2009
3. Kołodziejczyk A. Naturalne związki organiczne, Warszawa, Wyd. Naukowe PWN,, 2004
4. Grec M., Pastuch-Gawołek G. Enzymatyczna hydroliza skrobi do produktów małocząsteczkowych. Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Chemia Bioorganiczna i Bionieorganiczna Dla studentów kierunku Chemia, specjalność Chemia Bioorganiczna, Materiały wykonane w ramach realizowane na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01
5. Praca zbiorowa pod red. L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Warszawa, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003
6. Olempska-Beer Z., Merker R. I., Ditto M. D., DiNovi M. J. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms—a review, Regulatory Toxicology and Pharmacology 45, 2006
7. Stryer L., Tymoczko J. L., Berg J. M. Biochemia, PWN, 2007 8. Voet D., Voet J.G. Biochemistry, John Wiley&SONS, INC., 2011 9. Biotechnologia.pl 10. Pandey A., Nigam P., Soccol C.R., Soccol V.T., Singh D., Mohan R., Advances
in microbial amylases. Biotechnology and Applied Biochemistry 31, 2000 11. Domań-Pytka M., Bardowski J. Pullulan degrading enzymes of bacterial
origin. Critical Reviews in Microbiology, 30(2), 2004 12. MacCabe A.P., Orejas M., Tamayo E.N., Villanueva A., Ramo´n D.,
Improving extracellular production of food-use enzymes from Aspergillus nidulans. Journal of Biotechnology 96, 2005
13. Kączkowski J. Podstawy biochemii, WNT, Warszawa, 1993 14. http://www.cyfronet.krakow.pl/~rrlukasi/acro/przemysl/hydroliza_enzymatycz
na.pdf 15. Samborska K. Suszenie rozpyłowe enzymów – przyczyny inaktywacji oraz
metody i mechanizmy ich stabilizacj, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (73): 7-17, 2010
16. Bednarski W.., Reps A. Biotechnologia żywności, Warszawa, Wydawnictwa Naukowo – Techniczne., 2003: 29-315
17. Nowak D. Enzymy jako nowoczesne narzędzie technologiczne. Agro Przemysł 2/2008
18. Sumantha A., Larroche Ch., Pandey A. Microbiology and Industrial Biotechnology of Food – Grade Proteases: A Perspective. Food Technol, 2006
19. Przemysl spoz̊ywczy; Miesięcznik naukowotechniczny: Food industries; monthly devoted to the technical problems of food industries
20. Pijanowski E., Dłużewski M.., Dłużewska A., Jarczyk A. Ogólna technologia żywności, Warszawa, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 2004
Magdalena Bartosiak, Anna Cieślak
220
Zastosowanie enzymów amylolitycznych i proteolitycznych
w przemyśle spożywczym
Streszczenie
Enzymy są wyspecjalizowanymi białkami obecnymi w organizmach żywych, które umożliwiają przeprowadzenie wielu reakcji chemicznych i coraz częściej odgrywają ogromną rolę
w przetwórstwie żywności. W praktyce stosowanie preparatów enzymatycznych obejmuje
prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego. Największe korzyści płynące z zastosowania
biokatalizatorów to m.in.: podniesienie jakości i wydłużenie trwałości produktów spożywczych, przyspieszenie procesów technologicznych. Wyróżniamy różne grupy enzymów, które
przyczyniają się do wytwarzania i ulepszania produktów żywnościowych. Jednak to enzymy
amylolityczne i proteolityczne są najbardziej powszechne. Amylazy zaliczane do podklasy
hydrolaz, katalizują hydrolizę wiązania glikozydowego. Poznane zostały różne rodzaje amylaz i ich możliwości klasyfikacji, m.in. podzielić je można ze względu możliwości hydrolizy różnych
wiązań glikozydowych, miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi.
W przemyśle największe znaczenia ma katalizowana przez enzymy amylolityczne reakcja
hydrolizy skrobi do cukrów prostych. Natomiast enzymy proteolityczne katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach. Proteazy dzielimy na trzy grupy w zależności od
ich mechanizmu katalizy, rodzaju katalizowanej reakcji i struktury białka ulegającego katalizie.
Enzymy amylolityczne i proteolityczne znajdują szerokie zastosowanie w przemyśle
spożywczym.
Słowa kluczowe: amylazy, proteazy, przemysł spożywczy
Aplication of amylolytic and proteolytic enzymes in the food industry
Abstract
Enzymes are specialized proteins occuring in living organisms that allow to carry out many
chemical reactions and play a huge role in food processing. In practice, the application of enzymes include almost all branches of the food industry. The greatest benefits of using
biocatalysts include: improving the quality and extend the durability of food products
or acceleration of technological processes. There are a few different groups of enzymes that
contribute to the production and improvement of food products. However, amylolytic and
proteolytic enzymes are the most common ones. Amylases are included in the subclass
of hydrolases, catalyze the hydrolysis of the glycoside bond. At present we know a few
different types of amylases and their classification capabilities. They can be divided by the
ability of hydrolysis the glycosidic bonds or by various cleavage sites of glycoside bond in the starch molecule. In industry, the greatest importance is catalyzed by amylolytic
enzymes reaction of hydrolysis starch to sugars. In contrast, proteolytic enzymes catalyze
the hydrolysis of peptide bonds in proteins and peptides. Proteases can be divided into three
groups depending on their mechanism of catalysis, the type of catalyzed reaction catalyzed and structure of catalyzed protein. Proteolytic and amylolytic enzymes are widely used
in the food industry.
Key words: amylases, proteases, food industry
221
Maciej Gierada1, Rafał Rachwalik
2
Rola reakcji ubocznych
w procesie izomeryzacji α-pinenu
1. Wstęp
Jednym z monoterpenów bicyklicznych jest α-pinen. W naturze związek
ten występuje bardzo powszechnie. Jest głównym składnikiem olejków
eterycznych pozyskiwanych z praktycznie każdego drzewa iglastego. Przez
przemysł chemiczny związek ten pozyskiwany jest głównie z terpentyny
siarczanowej, będącej produktem ubocznym, otrzymywanym podczas
przeróbki drewna w procesie produkcji papieru. Terpentyna ta zawiera
około 60-70% α-pinenu oraz około 20% β-pinenu [1]. Ze względu na
obecność w cząsteczce α-pinenu wiązania podwójnego oraz czteroczło-
nowego pierścienia, związek ten ulega szeregu przemianom. Zalicza się
do nich m.in. proces izomeryzacji [2].
Prowadząc izomeryzację α-pinenu na stałych katalizatorach o charakterze
kwasowym otrzymuje się jako główny produkt kamfen [3]. Substancja ta
może być surowcem w procesie syntezy: kamfory, izoborneolu, borneolu
oraz octanu izobornylu. Wszystkie te związki znalazły zastosowanie
zarówno w przemyśle perfumeryjnym jak również i w przemyśle
farmaceutycznym [4]. Podstawową technologią otrzymywania kamfenu jest
poddanie izomeryzacji α-pinenu na uwodnionym TiO2 modyfikowanym
H2SO4 w temperaturze około 160°C [5]. Taki katalizator charakteryzuje się
relatywnie małą aktywnością, reakcje przebiegają stosunkowo wolno,
a poza tym przysparza wielu problemów, m.in. powoduje korozję
aparatury. Aby zoptymalizować proces produkcji kamfenu poszukuje się
innych, bardziej efektywnych katalizatorów [6].
Stwierdzono, że w procesie izomeryzacji α-pinenu uczestniczą kwasowe
centra aktywne, stąd badania nad optymalizacją procesu izomeryzacji tego
związku były prowadzone na różnego rodzaju katalizatorach posiadających
właściwości kwasowe. Jako katalizatory rozważano m.in. takie związki jak:
tlenki metali modyfikowane kwasem (np. ZrO2) [7] lub mieszaniny
tlenków metali [8], modyfikowane zeolity [9], porowate fosforany [10],
1 [email protected], Politechnika Krakowska, Wydział Inżynierii i Technologii Chemicznej,
Instytut Chemii i Technologii Organicznej http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php 2 Politechnika Krakowska, Wydział Inżynierii i Technologii Chemicznej, Instytut Chemii i Technologii
Organicznej http://www.chemia.pk.edu.pl/wiitch/index.php
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
222
heteropolikwasy [11] oraz aktywowane i modyfikowane materiały
warstwowe [12]. Jako produkty za każdym razem otrzymano mieszaninę
monoterpenów o składzie zmieniającym się wraz z upływem czasu trwania
procesu izomeryzacji. Skład ten zależał również od szeregu innych
czynników, takich jak: temperatura procesu, czy specyficzne właściwości
poszczególnych katalizatorów. Każdy z wyżej wymienionych układów
katalitycznych prowadził do otrzymania jako produktu głównego kamfenu
z selektywnością sięgającą około 30-50% [13].
Produkty izomeryzacji α-pinenu można podzielić na dwie grupy. Do
jednej z nich należą monoterpeny bicykliczne oraz tricykliczne takie jak:
kamfen, β-pinen, bornylen oraz tricyklen. Zatem są to związki utworzone
poprzez ekspansje pierścienia i jego wzrost. Podczas procesu izomeryzacji
α-pinenu powstają również związki o budowie monocyklicznej, do których
zalicza się: limonen, terpinolen, α- i β-terpinen, p-cymen i p-menten. Jak
widać, skład mieszany poreakcyjnej jest złożony. Bardzo trudno
wyeliminować powstawanie któregoś ze związków, gdyż poszczególne
izomery są produktami przejściowymi pomiędzy innymi, bardziej
stabilnymi termodynamicznie substancjami chemicznymi [14].
Zostało udowodnione, że centra aktywne typu Lewisa preferują
powstawanie produktów bi- oraz tri-cyklicznych, podczas gdy centra
aktywne typu Brønsteda zwiększają selektywność otrzymywania
produktów monocyklicznych. Gdy stosunek centrów aktywnych typu
Lewisa do Brønsteda jest wystarczająco wysoki, selektywność
otrzymywania kamfenu rośnie znacznie [15]. Przy mocnych centrach
kwasowych katalizatora i wysokich temperaturach prowadzenia procesu
w mieszaninie po izomeryzacji α-pinenu dominują produkty
monocykliczne, podczas gdy w obecności słabych centrów i w niskich
temperaturach dominującymi produktami będą monoterpeny bicykliczne
i tricykliczne, a wśród nich zdecydowanie najwięcej będzie kamfenu [16].
2. Cel i zakres pracy
Celem pracy jest określenie, czy podczas prowadzenia procesu
izomeryzacji α-pinenu w fazie ciekłej w obecności heteropolikwasów
reakcje uboczne pomiędzy produktami głównej reakcji zachodzą, a jeżeli
tak, to jaka jest ich rola i wpływ ten proces.
3. Metodyka badań
W reaktorze szklanym zaopatrzonym w płaszcz grzewczy oraz
mieszadło magnetyczne procesowi izomeryzacji poddano 20 cm3 α-pinenu.
Reakcję prowadzono w temperaturze 80°C z zastosowaniem układu
katalitycznego na bazie kwasu dodekawolframokrzemowego SiW12/SiO2
,
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu
223
(Aldrich)30 (zwany dalej dla uproszczenia zapisu SiW12/SiO2) oraz, dla
porównania, z zastosowaniem katalizatora na bazie kwasu
dodekawolframofosforowego PW12/SiO2(Aldrich)30 (zwany dalej
PW12/SiO2). Oba wyżej wymienione układy katalityczne zostały
sporządzone stosując metodę pierwszej wilgotności. Proces izomeryzacji
przeprowadzono dla różnych mas katalizatora, odpowiednio: 100 mg,
200 mg, 300 mg i 400 mg w takich samych warunkach temperaturowych.
Ponadto, transformacji poddano również produkty izomeryzacji α-pinenu,
a mianowicie limonen, terpinolen oraz α-terpinen. W określonych
odstępach czasowych, odpowiednio, 2 minuty od rozpoczęcia procesu
izomeryzacji, 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, oraz 360 minut
pobierano z mieszaniny reakcyjnej kolejne próbki. Próbki te następnie
poddano analizie na chromatografie gazowym BRUKER 430-GC
z detektorem FID. Warunki analizy: temperatura dozownika 270°C,
temperatura detektora 300°C, temperatura pieca 70°C, analiza z programem
temperaturowym 5 minut w temperaturze 70°C, następnie 5 minut
z narostem temperatury z szybkością 5°C/min do 95°C. Objętość
analizowanych próbek wynosiła 1µl. Czas analizy pojedynczej próbki
wynosił 10 minut.
4. Wyniki
Analizując dane zebrane podczas prowadzenia procesu izomeryzacji
α-pinenu, stwierdzono, że zachodzi proces izomeryzacji, a jego efektem jest
obecność w mieszaninie reakcyjnej szeregu związków monoterpenowych.
Na Rys. 1 przedstawiono zmianę konwersji α-pinenu w funkcji czasu
trwania procesu, w zależności od rodzaju i masy zastosowanego
katalizatora.
Zaobserwowano, że ilość katalizatora wpływa w znacznym stopniu
na konwersję α-pinenu. W przypadku jego niewielkich ilości reakcja
izomeryzacji α-pinenu zachodzi bardzo wolno, a konwersja zwiększa się
powoli i nieznacznie. Jednak wraz ze zwiększeniem zawartości katalizatora
w mieszaninie konwersja α-pinenu również zwiększa się. Przy
zastosowaniu 400 mg układu katalitycznego od samego początku
konwersja α-pinenu jest bardzo wysoka. Oznacza to, że przy tej zawartości
katalizatora obserwuje się praktycznie całkowite przereagowanie α-pinenu
już w początkowej fazie procesu. Ponadto, katalizator na bazie PW12/SiO2
jest aktywniejszy w rozważanym procesie, w porównaniu do SiW12/SiO2.
Zgodnie z literaturą, kamfen powinien być głównym produktem
izomeryzacji α-pinenu. Faktycznie tak jest, a świadczy o tym wykres
przedstawiający zmianę selektywności otrzymywania kamfenu w funkcji
czasu trwania procesu (Rys. 2).
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
224
Rys. 3 Porównanie zmiany konwersji α-pinenu w zależności od zastosowanego
katalizatora i jego ilości w funkcji czasu trwania procesu [opracowanie własne]
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 100 200 300 400
Ko
nw
ersj
a [%
]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. SiW12/SiO2
100 mg
200 mg
300 mg
400 mg
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 100 200 300 400
Ko
nw
ersj
a [%
]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. PW12/SiO2
100 mg
200 mg
300 mg
400 mg
,
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu
225
Rys. 4 Porównanie selektywności otrzymywania kamfenu na drodze izomeryzacji
α-pinenu w zależności od zastosowanego katalizatora i jego ilości w funkcji czasu
trwania procesu [opracowanie własne]
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
0 100 200 300 400
Sele
ktyw
no
ść [
%]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. SiW12/SiO2
100 mg
200 mg
300 mg
400 mg
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
0 100 200 300 400
Sele
ktyw
no
ść [
%]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. PW12/SiO2
100 mg200 mg300 mg
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
226
Selektywności otrzymywania tego związku, w odniesieniu do innych
monoterpenów, są prawie zawsze największe w przypadku każdego
z przeprowadzonych procesów izomeryzacji α-pinenu. Kamfen powstaje na
samym początku procesu izomeryzacji, a wraz z upływem czasu trwania
reakcji jego ilości, choć nieznacznie rosną, to utrzymują się na podobnym
poziomie. Początkowy wzrost selektywności otrzymywania kamfenu
związany jest z procesem stopniowej dezaktywacji katalizatora.
W momencie gdy powierzchnia katalizatora zostanie odpowiednio
zmodyfikowana poprzez osadzające się produkty reakcji (mogą to być
również produkty będące oligomerami monoterpenów) selektywność
otrzymywania kamfenu już nie zmienia się znacząco. Ponadto, na
selektywność otrzymywania kamfenu nie mają znaczącego wpływu
ewentualne reakcje uboczne, gdyż, co wynika z Rys. 2, selektywność
ta zależy jedynie od stosunku masowego α-pinen : katalizator.
Zaobserwowano, że zwiększenie ilości katalizatora wpływa na zmniejszenie
selektywności otrzymywania kamfenu. Podobne konkluzje zostały zawarte
w publikacji [13].
Oprócz kamfenu produktem końcowym izomeryzacji α-pinenu jest
p-cymen i p-menten (Rys. 3). Obecność w mieszaninie reakcyjnej obu tych
związków można tłumaczyć zachodzącymi procesami dysproporcjonowania,
ewentualnie odwodornienia. W początkowej fazie reakcji powstają znaczne
ilości limonenu, jednakże już po około 90 minutach od rozpoczęcia procesu
jego zawartość w mieszaninie jest znikoma. Świadczy to prawdopodobnie
o możliwości przegrupowania limonenu, czego efektem może być
otrzymanie innych związków. Analiza procesu izomeryzacji limonenu
wskazuje, że głównymi produktami tej reakcji w początkowej jej fazie jest
α-terpinen, natomiast pod koniec p-cymen oraz p-menten. Ciekawą
zależność zaobserwowano również dla α-terpinenu i terpinolenu.
W początkowej fazie procesu selektywności otrzymywania tych związków
rosną, jednakże już po 30 minutach reakcji selektywności maleją
stopniowo, aż do praktycznego ich zaniku pod koniec procesu. Świadczy to
o tym, że oba te związki mogą, podobnie jak limonen, ulegać reakcjom
następczym. Analiza produktów izomeryzacji terpinolenu wskazuje, że
głównym produktem tej reakcji jest α-terpinen, natomiast po
przeprowadzeniu izomeryzacji α-terpinenu w mieszaninie reakcyjnej
dominuje p-cymen i p-menten.
Przy zastosowaniu katalizatora PW12/SiO2 obserwacje izomeryzacji
α-pinenu niestety są utrudnione, gdyż wszystkie ewentualne reakcje
uboczne przebiegają bardzo szybko.
,
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu
227
Rys. 5 Porównanie selektywności otrzymywania poszczególnych związków
monoterpenowych w procesie izomeryzacji α-pinenu w funkcji czasu trwania
procesu w obecności 400 mg katalizatora [opracowanie własne]
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
0 100 200 300 400
Sele
ktyw
no
ść [
%]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. SiW12/SiO2
p-menten
alfa-terpinen
p-cymen
m-cymen
limonen
gamma-terpinen
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
0 100 200 300 400
Sele
ktyw
no
ść [
%]
Czas prowadzenia procesu [min]
kat. PW12/SiO2
p-menten
alfa-terpinen
p-cymen
m-cymen
limonen
gamma-terpinen
izo-terpinolen
terpinolen
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
228
5. Wnioski
Analiza otrzymanych wyników dała odpowiedź na pytanie o rolę reakcji
ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu:
Stwierdzono, że proces izomeryzacji α-pinenu to złożony proces,
podczas którego dochodzi do dynamicznej zmiany składu
mieszaniny reakcyjnej.
Reakcje uboczne w procesie izomeryzacji α-pinenu zachodzą
dopiero, gdy konwersja jest odpowiednio wysoka.
Poszczególne produkty reakcji następczych mogą być surowcami do
kolejnych reakcji.
Początkowo w procesie izomeryzacji α-pinenu reakcji ulega tylko
surowiec, w następnej kolejności reaguje limonen, terpinolen
i α-terpinen. Kolejność zachodzących reakcji ma istotne znaczenie,
gdyż każda z przemian zachodzi przy określonych zawartościach
monoterpenów w mieszaninie.
Stwierdzono również, że w procesie izomeryzacji α-pinenu
w obecności heteropolikwasów, oprócz zachodzenia procesu
izomeryzacji, obserwuje się również zachodzenie procesu
dysproporcjonowania i odwodornienia otrzymanych monoterpenów
jednopierścieniowych.
Na selektywność otrzymywania kamfenu nie mają znaczącego
wpływu obserwowane reakcje uboczne. Selektywność ta zależy
jedynie od stosunku masowego α-pinen : katalizator.
Literatura
1. Breitmaier E. Terpenes: Importance, general structure, and biosynthesis.
Terpenes: Flavors, Fragrances, Pharmaca, Pheromones, 2006: s. 1-9
2. Bazhenov Y.P., Kas' yanova L., Bokin A., Kutepov B., Khazipova A., Travkin
E., Shchadneva N., Khusnutdinov R., Dzhemilev U. Hydrogenation and
skeleton rearrangements of α-pinene on heterogeneous catalysts. Russian
journal of applied chemistry, 2003. 76(2): s. 234-237
3. Comelli N.A., PonziI E.N., Pinzi M.I. Effect of Lewis Sites in the
isomerization of α-pinene to camphene. 2nd Mercosur Congress on Chemical
Engineering, 4th Mercosur Congress on Process Systems Engineering,
Enpromer
4. Wang J., Hua W., Yue Y., Gao Z. MSU-S mesoporous materials: An efficient
catalyst for isomerization of α-pinene. Bioresource technology, 2010. 101(19):
s. 7224-7230
5. Gscheidmeier M., Haberlein H., Haberlein H.H., Haberlein J.T., Haberlein
M.C. Process for the preparation of camphene by the rearrangement
of a-pinene. 1998, U.S. Patent No. 5,826,202
,
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu
229
6. Bes̨ün N., Özkan F., Gündüz G. Alpha-pinene isomerization on acid-treated
clays. Applied Catalysis A: General, 2002. 224(1): s. 285-297
7. Comelli N.A., Ponzi E.N., Ponzi M.I. α-Pinene isomerization to camphene:
Effect of thermal treatment on sulfated zirconia. Chemical Engineering
Journal, 2006. 117(2): s. 93-99
8. Sidhpuria K.B., Tyagi B., Jasra R.V. ZrO2–SiO2 Mixed Oxides Xerogel and
Aerogel as Solid Acid Catalysts for Solvent Free Isomerization of α-Pinene
and Dehydration of 4-Methyl-2-Pentanol. Catalysis letters, 2011. 141(8):
s. 1164-1170
9. Rachwalik R., Olejniczak Z., Jiao J., Huang J., Hunger M., Sulikowski B.
Isomerization of α-pinene over dealuminated ferrierite-type zeolites. Journal
of Catalysis, 2007. 252(2): s. 161-170
10. Li Y., Wang C., Chen H., Hua W., Yue Y., Gao Z. Isomerization of α-Pinene
Over Porous Phosphate Heterostructure Materials: Effects of Porosity and
Acidity. Catalysis letters, 2009. 131(3-4): s. 560-565
11. Rocha K.A., Robles-Dutenhefner P.A., Kozhevnikov I.V., Gusevskaya E.V.
Phosphotungstic heteropoly acid as efficient heterogeneous catalyst for
solvent-free isomerization of α-pinene and longifolene. Applied Catalysis A:
General, 2009. 352(1): s. 188-192
12. Volzone, Masini O., Comelli N.A., Grzona L.M., Ponzi E.N., Ponzi M.I.
Production of camphene and limonene from pinene over acid di-and trioctahedral
smectite clays. Applied Catalysis A: General, 2001. 214(2): s. 213-218
13. Szücs-Balázs J.Z., Coroş M., Woiczechowski-Pop A., Blăniƫă G., Vlassa M.
Supported H4SiW12O40 catalysts for α-pinene isomerization. Central European
Journal of Chemistry, 2012. 10(4): s. 1208-1217
14. López C.M., Machado F.J., Rodríguez K., Arias D., Méndez B., Hasegawa M.
Gas‐versus liquid‐phase α-pinene transformation over faujasite‐like zeolites
and an amorphous silicoaluminate. Catalysis letters, 1999. 62(2-4): s. 221-226
15. Severino A., Esculcas A., Rocha J., Vital J., Lobo L. Effect of extra-lattice
aluminium species on the activity, selectivity and stability of acid zeolites
in the liquid phase isomerisation of α-pinene. Applied Catalysis A: General,
1996. 142(2): s. 255-278
16. Ferragina C., Cafarelli P., Perez G. Selective isomerization of α-pinene.
Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2002. 77(1): s. 173-179
Maciej Gierada, Rafał Rachwalik
230
Rola reakcji ubocznych w procesie izomeryzacji α-pinenu
Streszczenie Obiektem badań w tej pracy jest proces izomeryzacji α-pinenu, ze szczególnym
uwzględnieniem zachodzących ewentualnych reakcji następczych. Cały szereg czynności
wykonanych w ramach tej pracy miał za zadanie dostarczenie informacji niezbędnych do
odpowiedzi na pytanie: Czy podczas prowadzenia procesu izomeryzacji α-pinenu reakcje uboczne pomiędzy produktami zachodzą, a jeżeli tak, to w jaki sposób wpływają one na sam
proces izomeryzacji? W tym celu przeprowadzono serię doświadczeń, w których zbadano
wpływ dwóch typów heteropolikwasów naniesionych na nośnik krzemionkowy
tj. SiW12/SiO2(Aldrich)30 i PW12/SiO2(Aldrich)30 na proces izomeryzacji α-pinenu, przy różnych zawartościach katalizatora. Wszystkie procesy prowadzone były w 80°C
w reaktorze szklanym zaopatrzonym w płaszcz grzewczy i mieszadło magnetyczne. Analiza
próbek odbywała się przy zastosowaniu chromatografu gazowego BRUKER 430-GC
z detektorem FID. Zaobserwowano, że w pewnych warunkach prowadzenia izomeryzacji
α-pinenu selektywności otrzymywania poszczególnych związków monoterpenowych
zaczynają zmieniać się, co sugeruje o zachodzących reakcjach następczych. W celu
dogłębnego poznania zachodzących zjawisk, procesowi izomeryzacji, oprócz α-pinenu,
poddano limonen, terpinolen oraz α-terpinen, czyli monoterpeny powstające jako produkty izomeryzacji α-pinenu. Okazuje się, że reakcje następcze mają znaczący wpływ na skład
mieszaniny reakcyjnej. Ponadto dowiedziono, że początkowo izomeryzacji ulega tylko
surowiec, w następnej kolejności reaguje limonen, terpinolen i α-terpinen. Kolejność
zachodzących reakcji ma istotne znaczenie, gdyż każda z przemian zachodzi przy określonych zawartościach monoterpenów w mieszaninie. Na selektywność otrzymywania
kamfenu nie mają wpływu obserwowane reakcje uboczne.
Słowa kluczowe: α-pinen, heteropolikwas, izomeryzacja
Role of side-reactions in isomerization of α-pinene
Abstract This work presents study of α-pinene isomerization. The main attention was focused
on occurring side reactions. The goal of this work was to answer the question: How the side
reactions influence on the isomerization of α-pinene? All the processes were performed over
catalysts based on silica supported silicotungstic heteropoly acid (SiW12/SiO2(Aldrich)30) and phosphotungstic heteropoly acid (PW12/SiO2(Aldrich)30) in liquid phase in batch
reactor at 80°C. Analysis of samples were carried by gas chromatography using BRUKER
430-GC with the FID detector. The obtained data allowed to draw up graphs which
interpretation led to gain knowledge of process and side reactions. It has been found that under certain special conditions selectivity of obtaining particular monoterpenes varied
significantly. To deeply understand mechanisms of occurring side-reactions except
of α-pinene some other monoterpenes isomerized. It has been found that side reactions have
significant influence on distribution of the products. In addition, it has been demonstrated that initially only α-pinene is isomerized. Later, when conversion of α-pinene is high,
isomerisation of limonene occurs spontaneously. Next side-reaction is the isomerisation
of terpinolene. Finally, at the end of process α-terpinene is isomerised. The order
of proceeding reactions is important. Each of the reactions occurs at the specific contents of monoterpenes in a mixture. Moreover, occurring side-reactions do not influence
on selectivity toward camphene.
Keywords: α-pinene, heteropoly acid, isomerisation
231
Ewelina Zielińska1, Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
Suszenie sublimacyjne
– aspekty technologiczne i wyzwania
1. Wstęp
Problematyka utrwalania żywności stanowi jedno z największych
wyzwań przemysłu spożywczego. Celem przedłużania trwałości żywności
jest utrzymywanie jej w stanie możliwie nie zmienionym pod względem
cech fizycznych (zapachu, smaku, struktury), wartości odżywczej oraz
wartości higienicznej (brak zanieczyszczeń). W ostatnich latach wzrasta
zainteresowanie żywnością przetworzoną, wygodną i szybką do
przygotowania. Prowadzi to do dynamicznego rozwoju badań związanych
z poszukiwaniem jak najlepszych technologii, które zapewnią w jak
największym stopniu zachowanie cennych właściwości surowca.
Współczesnych konsumentów cechuje coraz większa świadomość
żywieniowa. Oczekują nie tylko produktów o przedłużonej trwałości, ale
także o wysokiej jakości. Producenci chcąc pozostać na rynku, starają się
zaoferować żywność coraz bardziej atrakcyjną dla wymagającego
konsumenta. Musi być ona pełnowartościowa, o właściwym smaku,
barwie, zapachu czy konsystencji.
Jednym ze sposobów utrwalania żywności, który zwiększa atrakcyjność
tego rodzaju produktów jest liofilizacja. Słowo to pochodzi z języka
greckiego i oznacza łatwo rozpuszczalny produkt. Liofilizacja to inaczej
suszenie sublimacyjne, które pozwala uzyskać susze o dobrych walorach
sensorycznych i wysokiej wartości odżywczej. Żywność liofilizowana
posiada wszystkie właściwości cenione przez konsumentów, a przede
wszystkim jest łatwo odtwarzalna do stanu wyjściowego. Ponadto dzięki
niewielkiej zawartości wody produkty te można długotrwale
przechowywać.
Historia suszenia sublimacyjnego sięga czasów starożytnych Inków,
którzy wykorzystywali tę metodę do wytwarzania potrawy zwanej obecnie
chudo, co oznacza zamrożone ziemniaki. Wysoko w Andach (2090-2400 m
n.p.m.) ziemniaki były rozkładane na ziemi i nocą zimne, górskie powietrze
powodowało ich zamrożenie. Rano zamrożone ziemniaki rozgniatano
i otrzymaną pulpę w ciągu dnia suszono na słońcu. Te czynności powtarzano
1 [email protected], Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Nauk o Żywności
i Biotechnologii, SKN Technologii Żywności, www.skntz.up.lublin.pl
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
232
przez kilkanaście dni i w efekcie otrzymywano produkt o wysokiej
zawartości węglowodanów, którego trwałość wynosiła nawet kilka lat [1].
Po raz pierwszy liofilizacja do produkcji żywności została zastosowana
w 1938 roku przez firmę Nestlé, a otrzymanym produktem była kawa
Nescafé [1].
Niniejsza praca ma na celu przedstawienie przebiegu procesu, a także
zwrócenie uwagi na jego wady i zalety.
2. Charakterystyka procesu
2.1. Definicja
Liofilizacja jest jedną z metod suszenia produktu, która polega na
usunięciu wody z zamrożonego materiału przez sublimację lodu,
z pominięciem fazy ciekłej. Proces ten może przebiegać tylko w warunkach
ujemnej temperatury oraz przy znacznie obniżonym ciśnieniu (poniżej
200 Pa). Warunki te minimalizują aktywność drobnoustrojów oraz
możliwość wystąpienia reakcji niepożądanych takich jak utlenianie lub
inne zmiany chemiczne i enzymatyczne, straty aromatu, degradację
witamin [2].
Liofilizacji poddać można każdy produkt spożywczy – warzywa,
owoce, zioła, grzyby, mięsa, ryby, sery, jogurty. Liofilizaty są podstawą
zup instant, wyrobów piekarniczych, a nawet niektórych produktów
cukierniczych. Główne zastosowanie tego procesu dotyczy produktów
termolabilnych – nie tylko żywności ale i preparatów farmaceutycznych,
suszenia kultur bakterii mleczarskich [3].
2.2. Przebieg procesu
Proces liofilizacji przebiega w trzech etapach:
Zamrażanie;
suszenie I;
suszenie II.
Przed suszeniem surowiec musi być odpowiednio przygotowany oraz
poprawnie dobrany np. właściwy stopień dojrzałości. Tak przygotowane
produkty należy ujednolicić, doprowadzić do odpowiedniego kształtu
i rozmiarów, aby następnie umieścić je w komorze liofilizatora [4].
Podstawową operacją w procesie liofilizacji jest sublimacja wody
z suszonego materiału. Aby to zjawisko mogło zajść, konieczne jest
zapewnienie odpowiednich warunków, które wynikają z wykresu fazowego
wody (rys. 1).
,
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
233
Rys. 1. Wykres fazowy wody [4]
Powyższy wykres przedstawia obszary istnienia poszczególnych faz
wody, wpływ ciśnienia i temperatury na przemiany fazowe oraz warunki
jakie muszą zostać spełnione dla zachowania równowagi faz. Z diagramu
wynika, że sublimacja może nastąpić tylko wtedy, gdy temperatura
i ciśnienie będą niższe niż w punkcie potrójnym czyli stanie, w jakim dana
substancja może istnieć w trzech fazach termodynamicznych równocześnie
w równowadze termodynamicznej. Punkt ten określony jest przez
temperaturę i ciśnienie punktu potrójnego. Niezbędne jest więc zamrożenie
produktu (w praktyce zamrożenie wstępne do – 40°C pod ciśnieniem
atmosferycznym). Dopiero następnym krokiem jest wytworzenie
w komorze liofilizatora znaczenie niższego ciśnienia, co skutkuje
rozpoczęciem procesu sublimacji. W pewnym momencie trwania procesu
powstaje stan równowagi pomiędzy lodem a parą wodną. Dostarczenie
ciepła, zwykle przez przewodzenie lub promieniowanie powoduje
zachwianie tej równowagi, efektem czego możliwe jest dalsze suszenie
sublimacyjne [4].
2.2.1. Zamrażanie
Istotny wpływ na jakość końcowego produktu ma proces zamrażania,
który jest pierwszym etapem procesu liofilizacji. W jego trakcie zamrożone
zostaje około 65-90% wody znajdującej się w materiale. Istnieją dwie
metody zamrażania: zamrożenie wstępne oraz tzw. samozamrożenie.
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
234
Zamrożenie wstępne polega na obniżeniu temperatury w warunkach
ciśnienia atmosferycznego. Ma ono zastosowanie przy liofilizacji owoców
czy warzyw. Szybkość zamrażania wpływa na kształt i rozmiary
powstających kryształków lodu, a co za tym idzie na porowatość suszonego
materiału oraz na szybkość wymiany ciepła i masy. Podczas powolnego
zamrażania cząsteczki lodu będą większe niż w przypadku szybkiego
zamrażania, co korzystnie wpływa na dynamikę ruchu pary wodnej w ich
obrębie czyli możliwość szybszego suszenia produktu [5]. Zbyt duże
kryształy w materiale o budowie tkankowej mogą jednak powodować
uszkodzenia mechaniczne komórek [1].
Samozamrażanie polega na odparowywaniu wilgoci z powierzchni
niezamrożonego surowca umieszczonego w komorze liofilizatora pod
wpływem wytwarzania próżni (nawet do 14% wody). Suszony materiał
ochładza się wskutek oddawania ciepła potrzebnego do parowania.
Rezultatem jest zamrożenie wolnej wody. Niekiedy stosuje się dodatkowo
rozpylanie ciekłego azotu lub kontakt z ochładzaną powierzchnią.
Na zachowanie pierwotnych właściwości materiału wpływa dodatnio
szybkie wytwarzanie próżni w komorze. Samozamrażaniu najczęściej
poddawane są surowce o konsystencji pasty. Może ono jednak powodować
znaczne zmiany właściwości produktu więc nie poleca się go do soków
owocowych, surowego mięsa oraz ryb [4].
W przypadku substancji ciekłych (soki owocowe, mleko, przeciery)
stosuje się metodę kombinowaną. Krystalizacji ulega woda tylko
w zewnętrznych warstwach substancji, a po umieszczeniu jej
w liofilizatorze ulega samozamrożeniu wskutek obniżania ciśnienia [2].
2.2.2. Pierwszy etap suszenia
Po etapie zamrażania w komorze urządzenia obniża się ciśnienie, które
umożliwia sublimację lodu. Proces ten zakończy się w momencie
osiągnięcia równowagi faz lód – para wodna. Dalszą sublimację umożliwia
dostarczenie utajonego ciepła sublimacji (2840 kJ/kg lodu) najczęściej
na drodze przewodzenia od ogrzewanej powierzchni, na której znajduje się
materiał lub na drodze promieniowania cieplnego [5]. Podwyższenie
efektywności dostarczania ciepła jest możliwe przez ogrzewanie produktu
z dwóch stron lub użycie kratownic zwiększających powierzchnię suszenia.
Udowodniono, że wpływa to na drugi etap suszenie skracając go
o 1,5 godziny w stosunku do użycia płyt grzejnych [6]. Konieczne jest
uzyskanie temperatury optymalnej, gdyż zbyt wysoka powoduje, że
sublimacja zostaje częściowo zastąpiona parowaniem, co wiąże się ze
znacznym pogorszeniem jakości produktu i wydłużeniem czasu suszenia [7].
,
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
235
W początkowym etapie suszenia woda usuwana jest z wierzchnich
warstw materiału, a następnie coraz głębszych. Wysublimowane kryształki
lodu tworzą kanaliki, przez które para wodna wydostaje się na zewnątrz
produktu do komory suszenia. Jej usunięcie możliwe jest dzięki
wymrożeniu na powierzchni kondensatora, umieszczonego między komorą
suszenia a pompą próżniową. Koniec pierwszego etapu suszenia następuje,
gdy na powierzchni kondensatora nie gromadzi się już lód [4].
2.2.3. Drugi etap suszenia
Drugi etap suszenia zwany jest suszeniem desorpcyjnym. Usuwana jest
wtedy woda silnie związana np. chemicznie. Stanowi ona 10-35%
całkowitej zawartości wody, dlatego też wpływ tego stadium na czas
i szybkość suszenia jest bardzo istotny [5]. Etap ten przebiega w warunkach
obniżonego ciśnienia z jednoczesnym podgrzewaniem materiału do wartości
granicznej. Dla produktów wrażliwych termicznie wynosi ona 10-35ºC, a dla
bardziej odpornych termicznie – nawet do 80ºC. Szybkość suszenia w tej
fazie znacznie spada więc może ona trwać dłużej niż właściwe suszenie
sublimacyjne. Suszenie desorpcyjne kończy się gdy materiał osiągnie
oczekiwaną wilgotność, na ogół około 2% [8].
3. Suszarki sublimacyjne stosowane w przemyśle spożywczym
Proces liofilizacji prowadzony jest w suszarkach sublimacyjnych.
Składają się one z podstawowych elementów uzasadnionych przebiegiem
procesu jakimi są: komora suszenia, kondensator pary, układ ogrzewania,
chłodzenia i wymrażania oraz układ próżniowy.
Suszony produkt znajdujący się na tacy jest ogrzewany przez płyty
grzejne, znajdujące się poniżej i powyżej tacy. Para wodna z produktu
przepływa między tacami a płytami grzejnymi i odpływa do komory, gdzie
ulega kondensacji w postaci lodu na chłodzonych przewodach. Komory
pracujące naprzemiennie są połączone ze zbiornikiem wody o temperaturze
około 20ºC, dzięki czemu następuje roztopienie lodu znajdującego się na
przewodach. Nadmiar wody, powstały ze skroplenia pary wodnej
i stopionego lodu, jest usuwany na zewnątrz [1].
Najbardziej podstawową częścią instalacji jest komora suszarnicza. Jej
budowa uzależniona jest od rodzaju suszonego materiału. Produkty stałe
umieszczane są na półkach lub tacach znajdujących się wewnątrz komory.
Liofilizacja cieczy może odbywać się przez napełnianie nią butelek lub
pojemników umieszczanych na półkach komory suszarniczej [8]. Innym
rozwiązaniem są urządzenia, w których ciecz jest rozpylana w cylindrycznej
wieży, gdzie na skutek „zamrażania wyparnego” (samo zamrażania
z jednoczesnym odparowaniem około 15% zawartej w nim wody)
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
236
następuje jego zestalenie. Częściowo wysuszony proszek opada i jest
suszony do odpowiedniej wilgotności [5].
Kondensator najczęściej znajduje się w osobnej komorze instalacji do
suszenia sublimacyjnego. Istotnym problemem jest pokrywanie się jego
powierzchni lodem, który należy stale usuwać. Innym sposobem usuwania
wilgoci jest jej adsorpcja w ciekłych roztworach higroskopijnych [8].
Kolejnym ważnym elementem jest źródło ciepła. Ciepło może być
doprowadzane przez ogrzewanie kontaktowe, za pomocą promienników
podczerwieni lub za pomocą mikrofal.
Najczęstszym sposobem jest umieszczanie surowca na półkach
ogrzewanych czynnikiem grzejnym. Jednak ogrzewanie za pomocą
promieniowania i mikrofal intensyfikuje proces suszenia [8].
Suszarki sublimacyjne mogą działać w trybie okresowym, półciągłym
i ciągłym. Najbardziej rozpowszechnionymi przemysłowymi liofilizatorami
są urządzenia okresowe. Dzielą się w zależności od typu stosowanego
kondensatora lodu:
znajdującego się w tej samej komorze co tace z produktem,;
znajdującego się w oddzielnej komorze połączonej ze strefą
sublimacji [5].
Suszarki sublimacyjne o działaniu półciągłym są urządzeniami
tunelowymi. Posiadają one śluzę wejściową i wyjściową, po zamknięciu
których uzyskuje się odpowiednie ciśnienie. Surowiec wprowadzany jest
okresowo do tunelu na wózkach. Najnowocześniejsze rozwiązania opierają
się na ciągłym przemieszczaniu się materiału na taśmach, jednak ciągłość
pracy można również osiągnąć poprzez zorganizowanie pracy kilku
samodzielnych suszarek okresowych według specjalnego przemiennego
schematu [5].
4. Koszty i wydajność procesu
Suszenie sublimacyjne posiada szereg zalet, jednak nie należą do nich
niewątpliwie aspekty ekonomiczne procesu. Liofilizacja jest kosztownym
i czasochłonnym sposobem suszenia. Powoduje to ograniczenie jej
powszechnego zastosowania. Koszty liofilizacji cztero-pięciokrotnie
przewyższają koszty suszenia rozpyłowego i ośmio-dziesięciokrotnie
jednoetapowego odparowania [9]. Sam koszt inwestycyjny urządzeń jest
około trzykrotnie większy niż innych typów suszarek. Metoda ta jest
również energochłonna. Koszt energii jest dwu-, trzykrotnie wyższy
w porównaniu z innymi metodami [5]. Istotny wpływ na opłacalność
procesu ma także czas jego trwania, który wynosi 12-24 godzin [4].
W celu zwiększenia wydajności, a zarazem obniżenia kosztów suszenia
sublimacyjnego poszukuje się rozwiązań intensyfikujących proces.
,
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
237
Zastosowanie promieniowania mikrofalowego jako źródła energii pozwala
przyspieszyć proces suszenia i przez co nawet kilkukrotnie skrócić czas jego
trwania. Innym rozwiązaniem jest połączenie ogrzewania za pomocą
promieniowania i mikrofal. Skraca to czas suszenia i zmniejsza zużycie
energii [5].
Obniżone ciśnienie utrzymywane podczas liofilizacji pochłania około
25% całkowitych kosztów procesu. Aby je zmniejszyć można płytko
zamrożony produkt suszyć pod ciśnieniem atmosferycznym z zastosowaniem
pompy ciepła, jednak istnieje większe ryzyko załamania struktury produktu
podczas suszenia [1].
Wraz ze spadkiem zawartości wody w suszu wydłuża się czas suszenia
i zwiększa zapotrzebowanie na energię. Dowiedziono, że susz jabłkowy
o wilgotności 16% po czterech miesiącach próżniowego przechowywania
nie odbiegał cechami jakościowymi od świeżego [10]. Wynika z tego, że
nie zawsze konieczne jest odwadnianie surowca do wilgotności 2-3% co
wiąże się z mniejszym nakładem kosztów. Inne badania dowodzą, że
oddzielenie cząstek lodu przed suszeniem sublimacyjnym wpłynęło by
pozytywnie na ograniczenie czasu i kosztów procesu liofilizacji [4].
Kwestia kosztów i wydajności liofilizacji jest wciąż tematem wielu
badań i powodem poszukiwania nowych rozwiązań. Zagadnieniom tym
poświęca się więcej czasu, aby udoskonalić suszenie sublimacyjne pod
każdym względem.
5. Właściwości suszonej sublimacyjnie żywności
Surowce poddane suszeniu sublimacyjnemu charakteryzują się wysoką
jakością. Zawdzięczają to znacznie zmniejszonej możliwości wpływu
szkodliwych zjawisk związanych z aktywnością biochemiczną
drobnoustrojów oraz degradacją termiczną na liofilizowany produkt. Dzięki
temu suszony materiał ma skład chemiczny w wysokim stopniu zbliżony
do naturalnego [4].
Na jakość produktu liofilizowanego ma wpływ wiele czynników między
innymi szybkość i charakter reakcji zachodzących w poszczególnych
etapach utrwalania tj. podczas procesu mrożenia, suszenia sublimacyjnego
i przechowywania [11]. Znaczący jest odpowiedni dobór surowca, jego
skład chemiczny, stopień dojrzałości, a także zastosowanie właściwej
obróbki wstępnej. Jednym ze sposobów jest blanszowanie, które powoduje
między innymi unieczynnienie poszczególnych enzymów i rozluźnienie
tkanki przed dalszymi procesami. Badania wykazały, że może ono
spowodować skrócenie czasu liofilizacji [12]. Ważny jest także dobór
metody zamrożenia produktu oraz szybkość przeprowadzenia tego etapu.
Dobór temperatury w fazie końcowego usuwania wilgoci może zaważyć na
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
238
ostatecznej wartości suszonego materiału. Badania wskazują, że warunkiem
koniecznym do uzyskania produktów o wysokiej jakości jest usunięcie 75-95%
wody. Aby jakość suszu sublimacyjnego była możliwie wysoka, należy
ustalić odpowiednie parametry suszenia [4].
Badania jakości suszu warzyw dowodzą, że w większości przypadków
wyróżniki jakościowe liofilizatu przewyższały dwukrotnie analogiczne
wyróżniki jakości suszu konwekcyjnego [13]. Suszenie sublimacyjne
umożliwia również otrzymanie proszków owocowych o wysokiej jakości
sensorycznej i strukturalnej, lepszej rozpuszczalności i dłuższym okresie
przydatności do spożycia [14]. Produkty liofilizowane, w porównaniu
z konwencjonalnym suszeniem charakteryzują się:
lepszym zachowaniem barwy i aromatu;
lepszym stopniem rehydratacji;
dobrze zachowaną strukturą komórkową.
6. Wady i zalet liofilizacji
Suszenie sublimacyjne to metoda utrwalania żywności, która posiada
szereg zalet. Żywność liofilizowaną cechuje wysoka jakość, przez co
zaliczana jest do grupy produktów spożywczych o najlepszych walorach
organoleptycznych oraz odżywczych. Jednak, jak każdy proces
przetwórczy, posiada również wady, a o ostatecznej ocenie procesu
decyduje końcowy bilans tych cech.
Na liczne zalety suszenia sublimacyjnego wskazują wyniki wielu prac
naukowych [1, 4, 5, 8, 9, 11]:
liofilizacja jest metodą usuwania wody gwarantującą otrzymanie
produktu o lepszej jakości w porównaniu z produktami suszonymi
innymi sposobami;
proces ten pozbawia produkty zawartej w nich wody niemal w 100%
lub pozostawia jej niewielką ilość, dzięki czemu otrzymuje się
produkt o delikatnej strukturze;
minimalna zawartość wody, na poziomie kilku procent, sprzyja
długotrwałemu przechowywaniu żywności pod warunkiem
właściwego jej zapakowania, uniemożliwiającego dostęp wilgoci
z atmosfery;
umożliwione jest wyeliminowanie łańcucha chłodniczego w obrocie
towarowym;
znaczne zmniejszenie masy produktu ułatwia transport i obrót
handlowy;
możliwe jest otrzymanie sterylnego, suchego produktu w handlowych
opakowaniach jednostkowych;
,
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
239
stosując metodę suszenia sublimacyjnego uzyskuje się susze
o znacznym zachowaniu właściwości fizycznych, chemicznych
i biologicznych surowca, a także o niezmienionej w stosunku do
niego wartości odżywczej;
liofilizacja umożliwia zachowanie związków zapachowych oraz
barwy, które są stabilne w trakcie właściwego przechowywania;
suszenie sublimacyjne nie powoduje degradacji witamin i nie niszczy
aktywności biologicznej produktu;
możliwe jest suszenie produktów zawierających substancje
termolabilne, przy zachowaniu ich wysokiej zawartości np. witaminy
C, -tokoferolu, karotenoidów;
wyeliminowana zostaje możliwość negatywnego wpływu
drobnoustrojów;
minimalizowane są procesy enzymatycznego i nieenzymatycznego
brunatnienia;
obecność wody w stanie stałym podczas suszenia sublimacyjnego
chroni pierwotną strukturę materiału, co prowadzi do zachowania
jego kształtu i wyglądu, z nieznacznym zmniejszeniem objętości;
do żywności suszonej sublimacyjnie nie dodaje się chemicznych
środków konserwujących, co ma istotne znaczenie przy produkcji
tzw. zdrowej żywności;
produkty liofilizowane posiadają dużą szybkość ponownego
uwadniania, co wynika z dużej porowatości produktu;
liofilizaty odznaczają się bardzo dobrą rozpuszczalnością i są silnie
higroskopijne;
żywność liofilizowana, odpowiednio zapakowana, nadaje się do
spożycia w każdych warunkach wilgotności, w wysokich i w niskich
temperaturach (używana przez alpinistów, astronautów), zachowując
wartości bioenergetyczne oraz walory smakowe.
W licznych pracach [1 ,4, 5, 9] wspomina się także o wadach suszenia
sublimacyjnego takich jak:
wysokie koszty procesu ograniczają w znacznym stopniu stosowanie
tej metody suszenia na skalę przemysłową. Koszty liofilizacji cztero-
pięciokrotnie przewyższają koszty suszenia rozpyłowego i ośmio-
dziesięciokrotnie jednoetapowego odparowania;
sam koszt inwestycyjny jest około trzykrotnie większy niż koszt
innych suszarek;
proces liofilizacji jest bardzo energochłonny, co za tym idzie duży
koszt stanowi eksploatacja urządzeń – dwu-trzykrotnie wyższy
w porównaniuz innymi metodami;
suszenie sublimacyjne trwa stosunkowo długo – od 12 do 24 godzin;
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
240
krucha i otwarta struktura liofilizowanych owoców sprzyja
przemianom chemicznym oraz uszkadzaniu produktu w czasie
wytwarzania, pakowania, transportu i przechowywania.
Podsumowując, suszenie sublimacyjne ma znacznie więcej zalet niż
wad. W zasadzie podstawową wadą jest wysoki koszt procesu, co często
może być największym ograniczeniem do zastosowania tej metody.
By udoskonalić proces liofilizacji rozpoczęto badania nad modyfikacjami,
które pozwoliłyby obniżyć koszt, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej
jakości produktu końcowego. Pomyślne wprowadzenie nowych rozwiązań
byłoby zbawienne dla wprowadzenia tej metody na skalę przemysłową.
7. Podsumowanie
Stały wzrost zapotrzebowania na żywność wysokoprzetworzoną
prowadzi do intensyfikacji badań nad poprawą metod utrwalania żywności,
dzięki czemu będzie można nie tylko przedłużyć jej trwałość, ale także
zaoferować nowe produkty, o wysokiej jakości i atrakcyjności dla
konsumenta.
Taką szansę stwarza wykorzystanie metody suszenia sublimacyjnego,
będącą połączeniem osiągnięć chemii, biologii, fizyki oraz biochemii.
Proces liofilizacji łączy w sobie dwie metody utrwalania: zamrażanie
i suszenie pod obniżonym ciśnieniem. Jest procesem długotrwałym,
a w związku z tym kosztownym, co w znacznym stopniu ogranicza jego
stosowanie na skalę przemysłową. Mimo to suszenie sublimacyjne jest
cenioną metodą utrwalania żywności, dlatego też celem kolejnych badań
naukowych będzie zapewne próba obniżenia kosztów procesu przy
niezmienionej wysokiej jakości produktu. Umożliwiłoby to poprawę
jakości oferowanych na rynku produktów, a w konsekwencji ich korzystny
wpływ na organizm społeczeństw.
Literatura
1. Rząca M., Witrowa-Rajchert D., Suszenie żywności w niskiej temperaturze, Przemysł Spożywczy, 2007, vol. 4, s. 30-35
2. Muzzio C., Dini N., Simulation of freezing step in vial lyophilization using finite element method, Computers and Chemical Engineering, 2011, vol. 35, s. 2274-2283
3. Ivancevic S., Mitrovic D., Tosic D., Lyophilisation – new treatment of preserving food, Tractors and power machines, 2003, vol. 8(4), s. 198-202
4. Kondratowicz J., Burczyk E., Technologiczne aspekty procesu liofilizacji, Chłodnictwo, 2010, vol. 4, s. 54-59
5. Witrowa-Rajchert D., Suszarki sublimacyjne do żywności, Przemysł Spożywczy, 2008, vol. 4, s. 14-20
,
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
241
6. Dziugan P., Zastosowanie tac z kratownicą w procesie liofilizacji biopreparatu zawierającego bakterie Lactobacillus plantarum, Zeszyty Naukowe Politechniki Łódzkiej, 2006, s. 37-42
7. Gawlik P., Liofilizacja żywności w aspekcie przemian fazowych roztworów amorficznych [W:] Pierwszy Portal Rolny [online], 2011, [dostęp luty 2014]. Dostępny w World Wide Web: http://www.ppr.pl/artykul-liofilizacja-zywnosci-w-aspekcie-przemian-fazowych-2901.php
8. Kawala Z., Kapłon J., Kramkowski R., Ważniejsze aspekty suszenia sublimacyjnego, Przemysł Spożywczy, 1993, vol. 3, s. 64-67
9. Ciurzyńska A., Lenart A., Liofilizacja – innowacyjne produkty, Bezpieczeństwo i Higiena Żywności, 2010, vol. 4/81, s. 68-70
10. Lis T., Lis H., Kłoczek E., Zależność cech jakościowych liofilizatu, czasu suszenia i zużycia energii od jego wilgotności, Acta Agrophysica, 2004, vol. 4(3), s. 747-752
11. Irzyniec Z., Klimczak J., Suszenie sublimacyjne, [W:] Michałowski S. (red.): Technologia chłodnictwa żywności. Procesy i ich kontrola, Wyd. Politechniki Łódzkiej, Łódź, 1994, s. 117-123
12. Lentas K., Witrowa-Rajchert D., Hankus M., Wpływ parametrów blanszowania oraz metody suszenia na właściwości mechaniczne suszonych pieczarek, Acta Agrophysica, 2011, vol. 17(2), s. 359-368
13. Gawałek J., Wpływ warunków konwekcyjnego i sublimacyjnego suszenia korzeni marchwi na jakość suszu, Inżynieria Rolnicza, 2005, vol. 11, s. 119-127
14. Jakubczyk E., Gondek E., Głód K., Charakterystyka właściwości fizycznych proszku jabłkowego otrzymanego metodą suszenia pianowo-sublimacyjnego, Acta Agrophysica, 2010, vol. 15(2), s. 281-291
Suszenie sublimacyjne – aspekty technologiczne i wyzwania
Streszczenie
Problematyka utrwalania żywności stanowi jedno z największych wyzwań przemysłu
spożywczego. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie żywnością przetworzoną,
wygodną i szybką do przygotowania. Prowadzi to do dynamicznego rozwoju badań
związanych z poszukiwaniem jak najlepszych technologii, które zapewnią w jak
największym stopniu zachowanie cennych właściwości surowca. Liofilizacja jest jedną
z metod suszenia produktu, której głównym założeniem jest usunięcie wody z zamrożonego materiału wskutek procesu sublimacji lodu, z pominięciem fazy ciekłej. Suszenie
sublimacyjne jest połączeniem osiągnięć chemii, biologii, fizyki oraz biochemii. Najbardziej
rozpowszechnionymi suszarkami sublimacyjnymi są okresowe urządzenia, do których
ciepło jest dostarczane na drodze przewodzenia lub promieniowania. Wysokie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne procesu ograniczają w znacznym stopniu stosowanie tej
metody suszenia na skalę przemysłową. Kosztowny jest także długi czas trwania suszenia,
co stało się przyczyną poszukiwania sposobów jego intensyfikacji (m.in. doprowadzanie
energii w postaci promieniowania mikrofalowego). Niewątpliwie wielkim wyzwaniem będzie próba obniżenia kosztów procesu przy niezmienionej wysokiej jakości produktu, co
uzależnione jest od prowadzonych badań naukowych oraz kreatywności w projektowaniu
urządzeń.
Słowa kluczowe: liofilizacja, suszenie sublimacyjne, utrwalanie żywności
Ewelina Zielińska , Monika Michalak-Majewska, Damian Zieliński
242
Freeze drying - the technological aspects and challenges
Abstract The issue of food preservation is one of the biggest challenges of the contemporary food
industry. In recent years, consumers are interested in processed food, comfortable, limiting
the time required to prepare a meal. This leads to the dynamic development of research
related to the search for the best technology to ensure as much as possible to preserve valuable properties of the material. Lyophilization is one of the methods of drying the
product, whose main aim is to remove the water from the frozen material as a result of the
process of ice sublimation, excluding the liquid phase. Freeze drying is a combination of the
achievements of chemistry, biology, physics and biochemistry. Plant materials, meat and dairy products are the most often lyophilized products. The most common dryers
sublimation are periodic devices, to which heat is supplied by conduction or radiation. The
high investment and operating costs of the process are limited to a large extent the use of the
drying method on an industrial scale. At higher costs also affects long drying time, which
led to the search for ways to intensify (e.g. energy supply in the form of microwave
radiation). Undoubtedly, the big challenge will be to attempt to reduce the cost of the
process with unchanged high-quality product, which is dependent on scientific research and
creativity in the design of devices.
Keywords: lyophilization, freeze drying, food preservation
243
Indeks autorów:
Amarowicz M. ...................... 149
Bartosiak M. ............ 41, 127, 209
Chwil P. ................................ 149
Cieślak A. ........................ 41, 209
Czemierska M. ........................ 53
Dobrzańska A. ....................... 127
Gierada M. ............................ 221
Głogowska M. ....................... 171
Jarosz-Wilkołazka A.53, 158, 178
Kordowska-Wiater M. ............. 30
Kotuła L. ............................... 149
Lach J. ..................................... 67
Marczak M. ............................. 19
Matysiak P. ............................. 19
Michalak-Majewska M.. 196, 231
Mulawka D. ........................... 149
Mulawka P. ........................... 149
Niścior M. ....................... 89, 110
Odrzywolski A. ..................... 138
Osińska-Jaroszuk M. .............. 158
Podgórska I. ............................ 30
Polak J................................... 178
Rachwalik R. ......................... 221
Schab K................................. 149
Sęczkowska M. ....................... 78
Sęczyk Ł. ................................ 30
Skorupska A. ........................... 19
Sobstyl J. ............................... 149
Sobstyl P. .............................. 149
Szałapata K............................ 158
Szcześ A. ................................ 53
Szewczuk-Karpisz K. .............. 78
Terlecki K. ............................ 149
Urbańczuk M. ....................... 149
Waleczek K. .............................. 7
Wiśniewska M. ....................... 78
Wlizło K. .............................. 178
Zielińska E. ....................196, 231
Zieliński D. ....................196, 231
Top Related