JORLANA CATRINE CORRÊA FERREIRA
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cyperus
articulatus L. EM MACRÓFAGOS
Santarém
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS
JORLANA CATRINE CORRÊA FERREIRA
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cyperus
articulatus L. EM MACRÓFAGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Biociências da Universidade
Federal do Oeste do Pará, como requisito para
obtenção do título de Mestre em Biociências.
Orientador: Prof. Dr. Waldiney Pires Moraes.
Coorientadora: Profa. Dra. Grazielle Ribeiro
Goes.
Santarém
2018
DEDICATÓRIA
A Deus, a Ele toda honra e glória.
À minha mãe, Maria Lusanira Cunha Corrêa, meu exemplo de mulher e de ser humano, que
sempre se dedicou e me apoiou durante meus estudos.
À minha avó, Lucimar Cunha Corrêa, in memoriam, pelos ensinamentos e palavras de
sabedoria.
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu porto seguro e refúgio, que nunca me deixou esmorecer diante das
adversidades e sempre me fez (e faz) enxergar uma luz em meio à escuridão.
À minha família, pelo amor e apoio incondicionais. Aos meus pais, Maria Lusanira
Cunha Corrêa e Jorge Ivan Repolho Ferreira, pela compreensão nos momentos de ausência.
As minhas irmãs, Lanna Cristina Ferreira de Sousa e Luanna Caroline Corrêa Ferreira, pelo
incentivo e momentos de serenidade.
Ao meu orientador Waldiney Pires Moraes, pela oportunidade e confiança concedidas
a mim, e por não medir esforços para a concretização deste trabalho.
À Profa. Dra. Leda Quercia Vieira, por abrir as portas de seu laboratório para a
realização dos ensaios in vitro, e pelo acolhimento imensurável.
À minha co-orientadora, Grazielle Ribeiro Goes, pelos conhecimentos transmitidos a
mim, pela paciência e pelos diversos momentos que viabilizou e tornou possível a realização
deste trabalho.
À Profa. Dra. Tânia Mara Pires Moraes, pelo incentivo e palavras de sabedoria,
mesmo quando este trabalho representava um anseio inatingível.
Ao prof. Dr. Lauro E. S. Barata e a Me. Aline Aparecida Kasper, do Laboratório de
Pesquisa & Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos, da Universidade Federal do
Oeste do Pará, pela contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao José de Sousa Almeida Junior e Edén Bruno Sousa da Silva, pela parceria e auxílio
nas análises estatísticas.
Ao farmacêutico Daniel Jackson Pinheiro Costa, pela gentileza concedida a mim
durante uma fase de transição.
Aos meus amigos Jardel Araújo da Silva e Omero Martins, por tornarem essa jornada
mais leve.
A todos do Laboratório de Farmacologia, da Universidade Federal do Oeste do Pará,
pela contribuição para a consolidação deste trabalho.
A todos do Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, da Universidade Federal de
Minas Gerais, pela hospitalidade e aprendizado.
Aos colegas e professores do Programa de Pós-Graduação em Biociências, da
Universidade Federal do Oeste do Pará, pelo convívio e agregação de conhecimento.
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desta pesquisa:
muito obrigada!
“Todas as coisas cooperam para o bem daqueles que amam a Deus.”
Romanos 8:28
RESUMO
As plantas medicinais são uma das melhores fontes de compostos bioativos candidatos a
novos fármacos. Dentre elas, destaca-se a Cyperus articulatus L., nativa da Amazônia, na
qual o seu óleo essencial é amplamente empregado na medicina tradicional. Considerando as
aplicações etnofarmacológicas, este estudo tem como objetivo investigar a composição
química e avaliar a atividade anti-inflamatória do óleo essencial da Cyperus articulatus L
(OECA) em macrófagos. A análise da composição química do OECA foi realizada em um
cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-6890 equipado com um detetor seletivo de massas
Agilent, modelo HP-5975 utilizando uma coluna capilar HP-5MS. Macrófagos da linhagem
celular RAW 264.7 foram estimulados com LPS e IFN-γ, e em seguida, tratados com as
concentrações (250, 500 e 1000 µg/mL) do OECA para análise da viabilidade celular e
dosagem de mediadores inflamatórios (NO, IL-1β, TNF-α e PGE2). A viabilidade celular foi
realizada de acordo com o método MTT, a produção de NO pelo método de Griess, as
dosagens de IL-1β, TNF-α e PGE-2 foram quantificadas pelo método de ELISA. Os
resultados demonstraram que o OECA reduziu significativamente a produção de NO, TNF-α
e PGE2, nos grupos estimulados com LPS+INF-γ e tratados com as concentrações de 250,
500 e 1000 µg/mL do OECA. Os resultados dos níveis de IL-1β demonstraram que o OECA
promoveu uma redução significativa apenas no grupo estimulado com LPS+INF-γ e tratado
com a concentração de 1000 µg/mL do OECA. Foi observado também que o OECA não
promoveu efeito citotóxico em concentrações inferiores a 2000 µg/mL. A análise da
composição química indicou a presença de monoterpenos, sesquiterpenos e cetonas
sesquiterpênicas como constituintes majoritários do OECA. Os resultados obtidos indicam
que o tratamento com OECA exerce uma potente atividade anti-inflamatória e inibição de
importantes mediadores inflamatórios.
Palavras-chave: Inflamação, Cyperus articulaus L, óleo essencial, priprioca, citocinas.
ABSTRACT
Medicinal plants are one of the best sources of bioactive compounds that are candidates for
new drugs. Among them, stands out Cyperus articulatus L., native to the Amazon, in which
its essential oil is widely used in traditional medicine. Considering ethnopharmacological
applications, this study aims to investigate the chemical composition and to evaluate the anti-
inflammatory activity of the essential oil of Cyperus articulatus L (OECA) in macrophages.
Analysis of the chemical composition of OECA was performed on an Agilent gas
chromatograph, model HP-6890 equipped with an Agilent mass-selective detector, model HP-
5975 using an HP-5MS capillary column. Macrophage RAW 264.7 cells were stimulated with
LPS and IFN-γ, and then treated with OECA concentrations (250, 500 and 1000 µg/mL) for
analysis of cell viability and dosage of inflammatory mediators (NO, IL-1β, TNF-α e PGE2).
The cell viability was performed according to the MTT method, the NO production by the
Griess method, the IL-1β, TNF-α and PGE2 dosages were quantified by the ELISA method.
The results demonstrated that OECA significantly reduced the production of NO, TNF-α and
PGE2 in the LPS+INF-γ stimulated groups and treated with OECA concentrations of 250, 500
and 1000 µg/mL. Results of IL-1β levels demonstrated that OECA promoted a significant
reduction only in the LPS+INF-γ stimulated group and treated with the 1000 µg/mL
concentration of OECA. It was also observed that OECA did not promote cytotoxic effect at
concentrations lower than 2000 µg/mL. The analysis of the chemical composition indicated
the presence of monoterpenes, sesquiterpenes and sesquiterpene ketones as major constituents
of OECA. The results indicate that treatment with OECA exerts a potent anti-inflammatory
activity and inhibition of important inflammatory mediators.
Keywords: Inflammation, Cyperus articulaus L, essential oil, priprioca, cytokines.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Priprioca 6
Figura 2 Formato dos rizomas da Priprioca 7
Figura 3 Migração de neutrófilos 9
Figura 4 Infecção e lesão celular 12
Figura 5 Ativação de TLR4 por LPS 16
Figura 6 Modelo de ativação de macrófagos 18
Figura 7A
Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a
viabilidade celular de macrófagos RAW 264.7 após 24 h de
tratamento
31
Figura 7B
Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a
viabilidade celular de macrófagos RAW 264.7 após 48 h de
tratamento
31
Figura 8
Efeito do OECA sobre a produção de nitrito em macrófagos
RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100
ug/mL)
32
Figura 9
Efeito do OECA sobre a Produção de TNF-α em macrófagos
RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100
ug/mL)
33
Figura 10
Efeito do OECA sobre a Produção de IL-1β em macrófagos
RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100
ug/mL)
33
Figura 11 Efeito do OECA sobre a Produção de PGE2 em macrófagos
RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100 35
ug/mL)
LISTA DE TABELA
Tabela 1 Composição química do óleo essencial de C. articulatus L 29
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
AA Ácido araquidônico
AIEs Anti-inflamatórios esteroidais
AINEs Anti-inflamatórios não-esteroidais
APC Células apresentadoras de antígenos
COX Ciclooxigenase
CLRs Receptores de lectina tipo C
DMSO Dimetilsulfóxido
DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
GM-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos
G-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos
IFN—γ Interferon—γ
IL-1 Interleucina 1
IL-1β Interleucina-1β
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-7 Interleucina 7
IL-13 Interleucina 13
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
LT Leucotrienos
LPS Lipopolissacarídeo
LOX Lipoxigenases
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
M-CSF Fator de estimulação de colônias de macrófagos
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium
NF-kB Fator nuclear Kb
NLRs Receptores do tipo NOD
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido Nítrico
OECA Óleo essencial de Cyperus articulatus L.
OMS Organização Mundial de Saúde
PAF Fator ativador plaquetário
PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos
PBS Tampão fosfato salino
PIs Prostaciclinas
PGs Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandinas tipo-2
PRRs Receptores de reconhecimento de padrões
RLRs Receptores RIG-I-like
TLRs Receptores Toll-like
TXs Tromboxanos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------- 1
1.1. Produtos Naturais -------------------------------------------------- 1
1.2. Família Cyperaceae--------------------------------------------------- 4
1.3. Cyperus articulatus L. ----------------------------------------------- 5
1.4. Inflamação ------------------------------------------------------------- 8
1.4.1. Macrófagos ----------------------------------------------------------- 14
1.5. Mediadores Inflamatórios ------------------------------------------- 18
1.5.1. Citocinas-------------------------------------------------------------- 18
1.5.2. Eicosanóides ---------------------------------------------------------- 19
1.5.3. Óxido Nítrico -------------------------------------------------------- 20
2. JUSTIFICATIVA -------------------------------------------------- 22
3. OBJETIVOS--------------------------------------------------------- 22
3.1. GERAL --------------------------------------------------------------- 23
3.2. ESPECÍFICOS ------------------------------------------------------ 23
4. MATERIAL E MÉTODOS -------------------------------------- 24
4.1. Coleta e identificação do material vegetal------------------------- 24
4.2. Extração do OECA --------------------------------------------------- 24
4.3. Análise cromatográfica do OECA -------------------------------- 24
4.4. Drogas e soluções ---------------------------------------------------- 25
4.5. Modelos experimentais --------------------------------------------- 25
4.5.1. Cultura de macrófagos murinos RAW 264.7 -------------------- 25
4.5.2. Análise da viabilidade celular -------------------------------------- 26
4.5.3. Planejamento Experimental ----------------------------------------- 26
4.5.4. Dosagem de nitrito --------------------------------------------------- 27
4.5.5. Método ELISA para dosagem de IL-1β, TNF-α PGE2 ---------- 28
4.6. Análise Estatística -------------------------------------------------- 28
5. RESULTADOS ----------------------- ------------------------------ 28
5.1. Análise da composição química do OECA------------------------ 28
5.2. Análise da viabilidade celular -------------------------------------- 30
5.3. Avaliação da Produção de Nitrito em macrófagos RAW 264.7 32
estimulados com LPS + IFN-γ e tratados com OECA-----------
5.4. Produção de TNF-α por macrófagos RAW 264.7 estimulados
com LPS+IFN-γ e tratados com OECA ---------------------------
32
5.5. Produção de IL-1β por macrófagos RAW 264.7 estimulados
com LPS+IFN-γ e tratados com OECA-------------------
33
5.6. Produção de PGE2 por macrófagos RAW 264.7 estimulados
com LPS+IFN-γ e tratados com OECA
34
6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------- 35
7. CONCLUSÃO ---------------------------------------------------- 44
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------- 45
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Produtos Naturais
Os produtos naturais, principalmente aqueles derivados de plantas, são utilizados
pela humanidade desde tempos imemoriais como fontes terapêuticas. A busca por alívio e
cura de enfermidades pela ingestão de ervas e folhas talvez tenham sido uma das primeiras
formas de utilização de produtos naturais. Até meados do século XIX, os recursos
terapêuticos eram pautados no uso empírico de plantas e extratos vegetais, porém, a partir de
1950, a flora medicinal foi substituída lentamente por medicamentos contendo substâncias
ativas dela extraída ou seus derivados sintéticos, impulsionado pelo interesse do homem no
isolamento de princípios ativos, dando início a uma nova fase de pesquisa envolvendo os
produtos naturais (SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2003; VIEGAS; BOLZANI;
BARREIRO, 2006; CRAGG; NEWMAN, 2013).
Na busca por novos fármacos, os produtos naturais destacam-se pela diversidade
estrutural e, assim, as plantas são candidatas importantes para a prospecção de novos
compostos bioativos, e ao mesmo tempo, representam um desafio para a química
farmacêutica, farmacologia e bioquímica, no que diz respeito à elucidação dos componentes
ativos das plantas, bem como seus mecanismos de ação. Os produtos vegetais apresentam
uma vasta gama de atividades biológicas, que incluem analgésicas, anticonvulsivantes,
sedativos, anti-inflamatórios, anticoagulantes e antialérgicos (GIORDANI et al.,2008;
PEREIRA; CARDOSO, 2012; KATZ; BALTZ, 2016).
Dentre os produtos naturais, encontram-se as plantas medicinais, definidas como
vegetais que contém em sua estrutura compostos que podem ser empregados para finalidades
terapêuticas, e que são amplamente utilizadas na medicina tradicional. O uso de plantas
medicinais é uma prática comum entre a população mundial, e em algumas comunidades e
grupos étnicos, o conhecimento sobre essas plantas simboliza o único recurso (PUPO;
GALLO, 2007; FIRMO et al., 2011; GOMES; FIRMO;VILANOVA, 2014).
No Brasil, o emprego de plantas para resolução de problemas com a saúde está
presente desde antes da colonização, quando os índios já as utilizavam para a cura de doenças.
Tais conhecimentos ainda são transmitidos de geração para geração e praticados nos dias
2
atuais não apenas pelos indígenas, mas também pelas comunidades tradicionais como as
ribeirinhas e os quilombolas, e também nas populações contemporâneas (LIMA et al., 2012).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial
recorrem à medicina tradicional para atender as suas necessidades primárias de assistência à
saúde, até mesmo nos países desenvolvidos, nos quais a população possui acesso fácil aos
medicamentos modernos, porém preferem o uso de plantas medicinais por razões históricas e
tradicionais. Em contrapartida, nos países em desenvolvimento 65%-80% da população
depende exclusivamente das plantas medicinais para os cuidados básicos, devido ao fácil
acesso e baixo custo (SIXEL; PECINALLI, 2005; VENDRUSCOLO; MENTZ, 2006;
AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007).
Embora os fatores econômicos e sociais sejam os principais motivos para o uso das
plantas medicinais, principalmente, nas regiões menos favorecidas, eles não são os únicos.
Estudos relatam que outros fatores também influenciam o uso de medicamentos produzidos a
partir de matérias-primas vegetais, como a preferência dos consumidores por terapias naturais,
a falha dos medicamentos sintéticos no tratamento de doenças, aumento do volume de
informação acerca dos medicamentos fitoterápicos, automedicação, e principalmente, a busca
por alternativas terapêuticas com menos efeitos adversos e complicações decorrentes do uso
de medicamentos (RIBEIRO; MOURA, 2009; BRUNING; MOSEGUI; VIANNA, 2012).
Os efeitos adversos a medicamentos estão relacionados diretamente a não-adesão ao
tratamento medicamentoso dos pacientes, em especial, daqueles acometidos por doenças
crônicas como por exemplo, a artrite reumatoide, cujo tratamento requer terapia com
medicamentos anti-inflamatórios que comumente resultam em complicações gastrointestinais.
Dessa forma, estudos são necessários para a descoberta de fármacos que proporcionem
maiores benefícios clínicos e menos efeitos adversos, otimizando a terapia medicamentosa do
paciente, bem como sua qualidade de vida (DE MARTINO et al., 2017; SYNGLE et al.,
2017).
Para Simões et al. (1988) o conhecimento popular pode fornecer dados importantes
para descobertas científicas e resultar na aplicação de tais conhecimentos para o
desenvolvimento de novos fármacos. Adicionalmente, pesquisas evidenciam que é muito mais
provável encontrar atividade biológica em plantas a partir de uma orientação do seu uso
3
popular do que em plantas escolhidas ao acaso (VILLANUEVA; ESTEBAN;
VILLANUEVA, 2017).
Neste contexto, o interesse acadêmico sobre as informações etnofarmacológicas
aumentou após a constatação de que a base empírica, fruto do conhecimento repassado entre
gerações, pode resultar em comprovação científica, contribuindo assim para a desmistificação
na questão do uso de fitoterápicos, uma vez que esses medicamentos sofrem rejeição por parte
de alguns pacientes e prescritores por acreditarem que essa terapia medicamentosa é uma
prática do curandeirismo. Isto é evidenciado, com o crescente interesse, nos últimos anos, no
aproveitamento de recursos naturais, principalmente, no que se refere ao uso de plantas para
finalidades terapêuticas (VIEIRA et al., 2014; AKRAM; NAWAZ, 2017).
Este interesse por parte da comunidade científica ocasionou um avanço nos estudos
químicos e farmacológicos envolvendo plantas, que além do seu uso na medicina popular, tem
contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção de novos fármacos, que até hoje estão
inseridos na prática clínica. Dentre eles, podemos citar a pilocarpina, alcalóide extraído de
folhas das plantas do gênero Pilocarpus sp., utilizada no tratamento do glaucoma; a
vincristina e vimblastina, ambas drogas antineoplásicas de origem vegetal (Catharanthus
roseus); a artemisinina, substância utilizada no tratamento da malária, obtida da espécie
Artemisia annua, dentre outras (GUERRA; NODARI, 2007; BRAGA, 2009; CRAGG;
NEWMAN, 2013).
Considerando a grande biodiversidade vegetal que detém o Brasil, com mais de
55.000 espécies catalogadas de um total estimado de 350-550.000, as plantas medicinais
brasileiras, principalmente da região amazônica, são consideradas altamente promissoras para
o desenvolvimento de novos fármacos. Entretanto, estudos sobre possíveis efeitos
terapêuticos dessas plantas ainda são escassos. Nesse contexto, a pesquisa de novos fármacos
oriundos de plantas medicinais é bastante promissora no Brasil, devido à vastíssima
biodiversidade brasileira e ainda ao baixo número de espécimes vegetais explorados na região
e que dispõe de grande potencial terapêutico (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).
Um exemplo de destaque é a “priprioca’’ (Cyperus articulatus L), pertencente à
família Cyperaceae, a qual apresenta uma ampla distribuição geográfica no norte do Brasil, e,
atualmente, destaca-se por seu alto valor econômico e aplicação de seu óleo essencial à
4
indústria de cosméticos. O produto natural desta espécie, o óleo essencial, é muito utilizado na
medicina tradicional da Amazônia como anti-inflamatório, e ainda no tratamento de
enxaqueca, diarreia, malária, epilepsia, e outras moléstias, fatos estes, que justificam a
necessidade de pesquisa do óleo essencial desta espécie endêmica da Floresta Nacional do
Tapajós (FLONA TAPAJÓS) (ZOGHBI et al., 2008a).
Mesmo com sofisticados métodos de análises disponíveis, ainda existem lacunas no
conhecimento sobre a atividade biológica e da composição química dos princípios ativos da
grande maioria das plantas medicinais. Dentre as diversas famílias de plantas consideradas
como medicinais encontra-se a família das Cyperacea, na qual estudos evidenciam que muitos
óleos essenciais isolados desta família têm demonstrado exercer atividade biológica, o que
motivou a investigação de sua atividade farmacológica em modelo experimental in vitro, a
partir de informações da medicina tradicional, focada na avaliação da atividade anti-
inflamatória da priprioca (SAKLANI; KUTTY, 2008).
1.2. Família Cyperaceae
A família Cyperaceae é composta por cerca de 5.000 espécies e 104 gêneros. É a
terceira maior das plantas monocotiledôneas, após gramíneas e orquídeas, e é muito
conhecida nos sistemas tradicionais da medicina. São plantas herbáceas, de pequeno porte,
cosmopolitas, encontrada, principalmente, associada às formações vegetais mal drenadas,
como brejos e margens de rios. Esta família divide-se em duas subfamílias, são elas:
Mapanioideae e Cyperoideae (MUASYA et al., 2008; KAKARLA; KATRAGADDA,
BOTLAGUNTA, 2015; ROCHA et al., 2016).
A subfamília que apresenta uma quantidade maior de gêneros é a Cyperoideae, com
91 gêneros, e os demais estão incluídos na subfamília Mapanioideae. No Brasil as Cyperaceae
estão bem representadas, com aproximadamente 670 espécies e 39 gêneros, distribuídos em
todas as regiões do país. Estes números representam quase 15% do total de espécies e 40% do
total de gêneros da família encontrados no mundo (SIMPSON et al., 2007).
5
Das cinco regiões geográficas do Brasil, a mais rica em número de gêneros é a região
norte, com 34 gêneros. Na região amazônica, dentre as espécies, destaca-se a Cyperus
articulatus L, pertencente ao gênero Cyperus e subfamília Cyperoideae (ALVES et al., 2009).
1.3. Cyperus articulatus L.
A Cyperus articulatus L, conhecida vulgarmente como priprioca ou piri-piri,
pertence à família Cyperaceae que são geralmente ervas perenes, rizomatosas, cosmopolitas,
com corpo vegetativo constituído por raízes, folhas e escapo triangular em secção transversal
(Figura 1) (JUDD et al., 2009; SANTOS et al., 2012).
A priprioca tem distribuição nas Américas tropical e subtropical, apresenta rizoma
endurecido, com lâmina foliar ausente, com tubérculos cobertos por brácteas avermelhadas. É
uma espécie herbácea aromática, considerada como uma planta rústica e apresenta tolerância
a solos ácidos, típicos na Amazônia; quanto à reprodução, é predominantemente assexuada,
viabilizada sob o ponto de vista agronômico pela divisão dos tubérculos, já que a reprodução
através de sementes é mínima, pois menos de 5% das sementes formadas são viáveis
(ROCHA, 2008; CASTELLANI et al., 2011).
Esta espécie destaca-se pela produção do óleo essencial amarelo intenso, de interesse
econômico na confecção de perfumes e fragrâncias na indústria cosmética, devido seu odor
forte e agradável. Há relatos, de que o uso do óleo essencial desta espécie na perfumaria seria
uma prática milenar, como no caso das mulheres egípcias que perfumavam os adornos dos
cabelos utilizando a fragrância obtida dos tubérculos de C.articulatus (ZOGHBI et al.,
2008a).
6
Figura 1: Priprioca. Fonte: Zoghbi et al., 2005
Segundo Simões et al. (1999), os óleos essenciais são compostos voláteis,
caracterizados por serem misturas complexas de diversos compostos, conferindo aromas
agradáveis e sabores característicos. São metabólitos secundários e instáveis, principalmente,
na presença de luz, calor, umidade, ar e metais, e em temperatura ambiente, apresentam-se
como líquidos oleosos de alta volatilidade, o que os difere dos óleos fixos. Quanto à estrutura
química, são basicamente formados por oxigênio, carbono e hidrogênio, entretanto, sua
composição química é bastante variada, podendo ser formada de derivados fenilpropanóides e
terpenóides, preponderando o último com aproximadamente, 90% da composição química dos
óleos essenciais, destacando-se os monoterpenos e sesquiterpenos (BAKKALI et al., 2008).
Os rizomas da priprioca destacam-se por ser a parte da planta que apresenta uma maior
concentração do óleo essencial (figura 2). Segundo Zoghbi et al. (2005) alguns fatores podem
ocasionar variação na composição química deste óleo, como as práticas agronômicas, período
do plantio e diferentes tempos de colheita, sendo recomendado o plantio no início da época
chuvosa e a colheita na estação do verão devido ao maior estresse da planta no período da
seca, e consequentemente, índices mais elevados no rendimento de seu óleo essencial.
Em trabalhos iniciais, Couchman et al. (1964) identificaram a presença de mirtenal,
mirtenol e articulona a partir da caracterização química do óleo essencial de C.articulatus.
Nyasse et al. (1988) identificaram a presença de mustacona, corimbolona e álcool α-
corimbolol. Zoghbi et al. (2008a) relataram predominância de compostos terpênicos do óleo
7
essencial de C.articulatus cultivados no Pará e os principais componentes químicos foram α-
pineno, mustacona e óxido de cariofileno.
No Brasil, com a recente introdução do óleo essencial da priprioca na indústria
cosmética, o cultivo da espécie C.articulatus elevou-se, principalmente, no estado do Pará,
representando uma fonte de renda aos agricultores da região, que já forneciam o produto às
empresas locais para a composição de fragrâncias e banhos aromáticos tradicionais,
principalmente, no período de festas juninas (ROCHA, 2008; ZOGHBI et al.,2008b).
O interesse pelos óleos essenciais está baseado não somente na possibilidade de
obtenção de compostos aromáticos, mas também daqueles possuidores de efeitos
farmacológicos, já que apresentam uma larga tradição de uso como agentes medicinais. Em
diversas partes do mundo, a Cyperus articulatus é utilizada na medicina tradicional para o
tratamento de várias doenças como epilepsia, malária, enxaqueca e outras. Dentre essas
finalidades terapêuticas, várias já foram comprovadas por diversos autores, como atividade
antimicrobiana (DESMACHELIER et al., 1996; OLADUSU et al., 2011), propriedade
anticonvulsivante (BUM et al., 2003), atividade antiparasitária (METUGE et al., 2014) e
atividade antioxidante (DESMACHELIER et al., 1997). No entanto, o papel anti-inflamatório
dessa espécie tão importante da região amazônica ainda tem sido pouco explorado pelos
pesquisadores, apesar de seu vasto uso pela medicina popular.
Figura 2: Formato dos rizomas da priprioca. Fonte: Gordon-Gray et al., 2006
8
1.4. Inflamação
A inflamação é uma resposta de defesa a estímulos agressivos que envolvem uma
série de alterações bioquímicas, fisiológicas e imunológicas, as quais o organismo recorre
para localizar, inativar e destruir o agente agressor, além de promover a cicatrização e
reparação do tecido danificado. Em termos moleculares, refere-se ao processo de
recrutamento de leucócitos e proteínas plasmáticas, seguida do seu acúmulo nos tecidos que
auxiliam na defesa e remoção do estímulo lesivo (KULKARNI et al., 2016; VILLANUEVA;
ESTEBAN; VILLANUEVA, 2017).
É desencadeada após dano celular causado por agentes patogênicos (vírus, bactérias,
parasitas), agentes físicos (radiação, trauma, queimaduras), químicos (toxinas) e reações
imunológicas, e apresenta como sinais clínicos característicos rubor, calor, edema, dor e
prejuízo funcional, resultantes dos fenômenos vasculares e celulares do processo inflamatório
(JEONG et al., 2013; RIBEIRO et al., 2015).
Durante o processo inflamatório diversas vias intra e intercelulares são ativadas no
sentido de recuperar e manter o equilíbrio homeostático. Neste processo, a participação das
células (neutrófilos, monócitos, linfócitos, células dendríticas) do sistema imune é
fundamental, bem como a ativação das vias inflamatórias e liberação dos mediadores
inflamatórios (PARISI et al., 2017).
A inflamação ocorre em duas fases distintas: aguda e crônica. A primeira, fase
aguda, apresenta início imediato e duração relativamente curta, nela predomina fenômenos de
aumento da permeabilidade, vasodilatação e migração de leucócitos, predominantemente
neutrófilos, por meio da ativação das células endoteliais. Essa fase tem como objetivo
principal a eliminação do agente, porém se ele persistir, a inflamação poderá evoluir para a
segunda fase, a crônica. Diferentemente da aguda, a fase crônica tem início tardio e duração
maior, com predomínio de macrófagos, com formação de tecido conjuntivo e angiogênese
(TABAS; GLASS, 2013; RIBEIRO et al., 2015).
Na fase aguda, os neutrófilos são as primeiras células a responder, migrar para o
local da inflamação e fagocitar o micro-organismo. Eles migram para o local lesionado,
aderindo-se às células endoteliais através das moléculas de adesão expressas (selectinas,
9
integrinas, moléculas de adesão intercelular), e em seguida, migram em direção ao espaço
extravascular atraídos pelos agentes quimiotáticos, conforme figura 3. No final deste
processo, os neutrófilos sofrem apoptose e promovem a entrada de monócitos, que se
diferenciarão em macrófagos, para o local lesionado. Neste processo, três dos cinco sinais
cardinais da inflamação são manifestados: calor e rubor, consequência do aumento do fluxo
sanguíneo local, e o edema, formado por exsudato, proveniente do extravasamento das
proteínas plasmáticas e recrutamento dos leucócitos circulantes (HAJISSHENGALLIS, G.;
CHAVAKIS, T.; HAJISSHENGALLIS, E.; LAMBRIS, J., 2015; LIM; GRINSTEIN; ROTH,
2017; TENG, T; JI, A.; JI, X.; LI, Y., 2017).
Figura 3: Migração de neutrófilos - o processo de migração dos neutrófilos é caracterizado
pela adesão dessas células no revestimento endotelial das vênulas pós-capilares, seguida do
movimento através do endotélio e da membrana basal. Trata-se de uma sequência de
interações entre neutrófilos e o endotélio vascular, mediada por moléculas de baixa
(selectinas) e alta (integrinas) afinidade e envolve etapas distintas: ancoragem e rolamento,
adesão, rastejamento e transmigração. Fonte: Adaptado de Kolaczkowska e Kubes, (2013).
Apesar de os neutrófilos serem consideradas células de curta duração, estudos
demonstram que eles permanecem na circulação por um tempo maior, e que a própria
inflamação aumentaria sua vida útil. Essa condição seria possível devido à presença de
citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF), por exemplo, no processo inflamatório que
impediriam a apoptose dos neutrófilos, prolongando assim sua vida útil. Um tempo de vida
10
mais longo dessas células pode permitir uma atuação mais complexa na resolução da
inflamação, e eventualmente, na modulação da resposta imune adaptativa (PILLAY et al.,
2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; PIETROSIMONE; LIU, 2015).
Geralmente o processo inflamatório é desencadeado com o intuito de proteger o
organismo, agindo no local e restringindo a extensão do dano tecidual, mas ocasionalmente
ele pode evoluir de maneira inadequada tornando-se prejudicial, consequência de uma
inflamação extensiva, prolongada ou não regulada. Isso pode ocorrer quando a resposta
inflamatória extravasa os limites do seu microambiente, perdendo o controle homeostático e
manifestando-se de modo sistêmico no organismo. Exemplo disso é a sepse, caracterizada
como uma síndrome decorrente de uma resposta desequilibrada do hospedeiro a uma infecção
(FANGKRATHOK; JUNLATAT; SRIPANIDKULCHAI, 2013; KULKARNI et al., 2016;
VAN DER POLL et al., 2017).
Em outras condições, os mecanismos de defesa da reação inflamatória podem ser
desencadeados de maneira inapropriada em resposta a outros tipos de agentes não
patogênicos, como substâncias estranhas inócuas (pólen) ou ainda contra as substâncias
endógenas do organismo. Nessas circunstâncias, a própria inflamação pode ocasionar lesão,
tanto na forma aguda, como por exemplo, na anafilaxia, ou na forma crônica, como por
exemplo, na artrite reumatoide. Por conta disso, as respostas inflamatórias são consideradas
críticas para a patogênese de doenças autoimunes. Além das doenças autoimunes, estudos
vêm demonstrando o envolvimento da inflamação como causa de dano tecidual e patogênese
de diversas doenças, tais como, doença de Alzheimer, doença renal e acidente vascular
encefálico (GLASS; SAIJO, 2010; KAHLENBERG; KAPLAN, 2013; PINEGIN;
VOROBJEVA; PINEGIN, 2015; KIMURA; ISAKA; YOSHIMORI, 2017).
O conhecimento dos mecanismos de defesa que o organismo utiliza contra micro-
organismos são mediados por reações das imunidades inata e adaptativa. A resposta inata é
ativada imediatamente após uma infecção ou lesão e é considerada a primeira linha de defesa
do hospedeiro contra micro-organismos. Os mecanismos celulares e bioquímicos envolvidos
neste tipo de reação estão presentes no organismo antes do contato com o patógeno e
respondem da mesma maneira a infecções repetidas (DESMET; ISHII, 2012; NOREEN et al.,
2012).
11
O sistema imune inato depende de componentes solúveis e células efetoras-
neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células natural killer (NK) - para controlar uma
infecção. Essas células são caracterizadas pela capacidade de fagocitar e eliminar os
patógenos, reconhecendo-os através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que
interagem com os PAMPs (padrões moleculares associados a patógenos) presentes na
superfície dos micróbios. Esses PRRs também podem detectar os DAMPs (padrões
moleculares associados a dano), moléculas liberadas por células hospedeiras danificadas,
provenientes de injúria celular, como por exemplo, em lesões de trauma ou queimaduras. O
resultado desta interação é a produção e secreção de mediadores inflamatórios, iniciando o
que chamamos de cascata inflamatória, como mostra a figura 4 (ZHANG et al., 2010;
KRISHNA; MILLER, 2012; RICHMOND; HARRIS, 2014; YEH et al., 2016; SAYOUR;
MITCHELL, 2017).
Esses eventos contribuem para a ativação da resposta imunológica adaptativa, que
somente é desencadeada após o reconhecimento do patógeno pelo sistema imune inato.
Consiste em um conjunto de reações específicas contra um determinado patógeno invasor,
auxiliando e tornando mais eficiente a resposta imune inata. A imunidade adaptativa possui
como componentes fundamentais os linfócitos T e B, os quais realizam o reconhecimento dos
patógenos por meio dos receptores de antígenos que estão distribuídos na superfície dessas
células, diferentemente do outro sistema, que o faz através de PRRs (TAKEUCHI; AKIRA,
2010; GABRIELLI et al., 2016).
A resposta imunológica adaptativa pode ser dividida em imunidade humoral e
celular. A primeira é mediada por anticorpos produzidos por células B, que desempenham a
função de reconhecer e neutralizar os antígenos extracelulares, promovendo a eliminação dos
micro-organismos através de mecanismos efetores. Já a imunidade celular é mediada pelas
células T, caracterizada pela capacidade de eliminar os patógenos fagocitados, já que os
anticorpos não possuem a eficácia de neutralizar os micro-organismos intracelulares
(SÁNCHEZ-TRUJILLO et al., 2017).
12
Figura 4: Infecção e lesão celular: resultam na produção de PAMPs e DAMPs,
respectivamente, desencadeando uma resposta inflamatória através dos TLRs localizados na
membrana celular e endossomas, seguida da ativação de transcrição nuclear do NFқB.
Adaptado de Brennan et al., (2010).
Os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória são fundamentais para o
desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Segundo Tak e Firestein (2001) as
formas utilizadas pelo organismo para cessar a inflamação incluem respostas celulares e
imunológicas, que podem ser iniciadas utilizando compostos anti-inflamatórios cuja atuação
está baseada na inibição de componentes inflamatórios ou fatores de transcrição ativadores.
Dentre as classes de medicamentos para tratamento de doenças inflamatórias, os anti-
inflamatórios não-esteroidais (AINEs) são os mais utilizados para o manejo dessas patologias.
Os AINEs estão entre os medicamentos mais usados no mundo, e diariamente, mais de 30
milhões de pessoas utilizam esses fármacos para alívio de dor de cabeça, artrite e outras
condições. No Brasil encontram-se facilmente disponíveis como analgésico de venda livre, o
que representa um risco à saúde do paciente, quando em situação de uso prolongado sem
supervisão, e principalmente, devido aos efeitos adversos inerentes ao uso desses
medicamentos (AL-SAEED, 2011).
13
Geralmente, todos os AINEs podem causar efeitos indesejáveis devido ao próprio
mecanismo de ação desses fármacos, ou seja, a inibição da cicloxigenase. Acredita-se que
esses efeitos resultem particularmente da inibição da COX-1, enzima constitutiva, presente na
maioria dos tecidos, responsável pela formação de pequenas quantidades de prostaglandinas
necessárias para a homeostase. Dentre os efeitos adversos mais comuns dos AINEs incluem
sangramento gastrointestinal, alterações nas funções cardiovascular e renal, e ainda, as
complicações mais graves como hemorragia, perfuração ou morte que ocorrem com uma
incidência de aproximadamente 2% ao ano, chegando até 10% ao ano em usuários de alto
risco (pacientes idosos ou em uso concomitante de corticosteroides e/ou anticoagulantes)
(UNGPRASERT et al., 2016).
Outra classe importante utilizada para o tratamento de doenças inflamatórias são os
anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) que reduzem os efeitos pró-inflamatórios do ácido
araquidônico, atuando diretamente em receptores nucleares de esteroides que alteram a síntese
de mRNA e proteínas, inibindo a produção de importantes fatores de transcrição nuclear
envolvidos no processo inflamatório, como o NF-kB. Além disso, esses medicamentos
reduzem os níveis de citocinas inflamatórias, inibem a ativação da enzima fosfolipase A2, e
ainda, regulam negativamente a secreção de células pró-inflamatórias. Causam
imunossupressão devido à redução dos linfócitos no sangue periférico, e por conta disso,
também são drogas empregadas no manejo de doenças que envolvem mecanismos imunes
(LAW et al., 2015; WESTERGAARD et al., 2015).
Dexametasona, hidrocortisona e prednisona são exemplos de fármacos esteroidais
(glicocorticoides) altamente eficazes no controle de diversas doenças inflamatórias. Esses
medicamentos exercem ação mais ampla que os AINEs devido à inibição de inúmeras vias de
sinalização envolvidas no processo inflamatório, porém os AIEs apresentam vários efeitos
adversos, assim como os AINEs, e uma exposição sistêmica prolongada pode resultar em
diversas alterações fisiológicas, como miopatia, retenção de líquido, estado cushingoide,
osteoporose e diabetogênese (UINGS et al., 2013).
Embora o mercado farmacêutico disponha de uma diversidade de medicamentos anti-
inflamatórios, ainda não há um ideal, de menor toxicidade e com baixa incidência de efeitos
adversos. Tal situação estimula a busca por novas moléculas que deem origem a fármacos
14
mais seguros e com menos efeitos adversos e que possam ser inseridos na prática clínica para
o tratamento da inflamação (COUTINHO; MUZITANO, COSTA, 2009; IBRAHIM et al.,
2012).
1.4.1. Macrófagos
Os macrófagos são células essenciais na imunidade inata e sua atuação é
fundamental na resposta inflamatória e defesa do hospedeiro. Considerados como mediadores
centrais do sistema imunológico contribuem tanto para iniciação quanto para a resolução da
inflamação. Diferente dos neutrófilos, os macrófagos são células dominantes do estágio tardio
da inflamação. São classificadas como fagócitos mononucleares, cujo precursor, o monócito,
origina-se na medula óssea, circulam no sangue, e são ativados nos tecidos. Os monócitos são
derivados de uma célula precursora comum da linhagem mielóide na medula óssea e sua
diferenciação é dirigida pelos fatores de estimulação de colônias (CSFs), também
denominados de fatores de crescimento hematopoiéticos. Foram descritos três tipos de CSFs:
o fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de
colônia de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF),
sendo o último específico para a promoção da sobrevivência, proliferação, diferenciação e
ativação da linhagem de macrófagos (SICA; MANTOVANI, 2012; ZIMMERMANN;
TRAUTWEIN; TACKE, 2012; LIU; YANG, 2013; BAGYINSZKY et al., 2017).
Além dos macrófagos provenientes dos monócitos, há uma população com
denominações específicas conforme sua localização, os chamados macrófagos residentes. Por
exemplo, no fígado, são denominados de células de Kupffer, no pulmão são chamados de
macrófagos alveolares, nos rins denominados de células mesenquiais, no sistema nervoso
recebe a designação de células microgliais, e entre outros. Diferentemente dos macrófagos
“inflamatórios”, que migram para o tecido quando há uma infecção ou dano celular, esses
macrófagos encontram-se amplamente distribuídos no organismo e desempenham funções
fisiológicas distintas de acordo com o tecido em que residem (RANG et al., 2007;
TORROELLA-KOURI; RODRÍGUEZ; CASO, 2013).
15
Assim como as células que atuam no sistema imune inato, os macrófagos
reconhecem os micro-organismos através dos PRRs, que detectam os PAMPs ativando a
resposta inflamatória. Os PAMPs são componentes altamente conservados e comuns à classe
de agentes patogênicos (bactérias, fungos, vírus), como por exemplo, o LPS
(lipopolissacarídeo) e o peptidioglicano, constituinte da membrana externa das bactérias
gram-negativas e componente da parede celular da maioria das bactérias, respectivamente
(DE LA FUENTE-NÚNEZ, et al., 2017; VAN DER POLL et al., 2017).
Atualmente, quatro famílias de PRRs foram identificadas: receptores Toll-like
(TLRs), receptores de lectina tipo C (CLRs), receptores do tipo NOD (NLRs) e receptores
RIG-I-like (RLRs). Os macrófagos expressam diversos PRRs, e a maioria pertence à família
de receptoresToll-like (TLRs). Essa família detecta patógenos invasores e desempenha papel
essencial para o início da resposta imune inata com subsequente ativação de uma resposta
imune adaptativa. Cada um desses receptores apresenta três domínios: o domínio de interação
com o ligante, o domínio transmembranar e o domínio de sinalização, denominado Toll/IL-1R
(TIR). Os TLRs são classificados em 11 tipos de acordo com sua especificidade de ligante,
incluindo bactérias, fungos, protozoários e vírus. Alguns desses receptores (TLR3, -7, -8 e, -9)
encontram-se no compartimento endossomal/lissossômico, ou seja, no interior da célula, e
outros TLRs (TLR1, -2, -4, -5 e -6) estão localizados na membrana celular externa
(BRENNAN; LUNSFORD; KUO, 2010; NOREEN et al., 2012).
Como demonstrado na figura 5, o TLR4, presente na superfície dos macrófagos,
reconhece o LPS bacteriano e leva à ativação de vias de sinalização intracelular. Este
reconhecimento se dá, primeiramente, pela ligação do LPS a uma proteína solúvel (LBP), que
forma o complexo LPS-LBP. Esse complexo liga-se à outra proteína, CD14, e em seguida, é
apresentada ao TLR4, em estreita associação a outra proteína, MD2, presente na superfície
celular. O complexo CD14/TLR4/MD2 desencadeia a cascata de sinalização intracelular
levando à ativação de diferentes fatores de transcrição. Dentre os principais reguladores
transcricionais destacam-se o fator nuclear kB (NF- kB) e proteína ativadora 1 (AP-1), ambos
estimulam a expresão de citocinas pró-inflamatorias TNF-α (fator de necrose tumoral) , IL-1
(interleucina-1), IL-6 (interleucina- 6), quimiocinas, bem como outros mediadores
inflamatórios que atuam nas células endoteliais provocando a expressão de moléculas de
adesão e aumento da permeabilidade vascular, além do recrutamento de células sanguíneas
16
para o tecido inflamado. Outros fatores de transcrição também participam da sinalização
intracelular, como o fator regulador de interferon 3 (IRF-3) e o fator regulador de interferon 7
(IRF-7), que promovem a produção de interferons de tipo I, importantes nas respostas imunes
inatas virais (PEEK; FISKE; WILSON, 2010; MATSUI et al., 2012).
Figura 5: Ativação de TLR4 por LPS – O complexo LPS-LBP-CD14 induz a dimerização de
TLR4, levando a ativação de diversas vias de sinalização e fatores de transcrição que induzem
a expressão de genes que levam à produção de citocinas pró-inflamatórias e desenvolvimento
de respostas antivirais. Fonte: Adaptado de Bohannon et al., (2013) e Płóciennikowska, et al.,
(2015)
O reconhecimento inicial do patógeno realizado pelos macrófagos provoca a ativação
dessas células e produção de diversos mediadores inflamatórios, incluindo aminas vasoativas,
eicosanóides e produtos de cascatas proteolíticas. O efeito imediato destes mediadores é a
obtenção do exsudato inflamatório, seguido de proteínas plasmáticas e migração de leucócitos
para o espaço extravascular, decorrente da expressão de moléculas de adesão (selectinas,
ICAM-1 e VCAM-1), que contribuem para a amplificação da resposta protetora contra o
micro-organismo (MEDZHITOV, 2008).
17
Os macrófagos são considerados fagócitos profissionais, e uma vez ativados ligam-se
ao patógeno e os fagocitam. Vários mecanismos estão envolvidos nesse processo, seja na
resposta imune inata ou na adaptativa, dentre eles incluem a geração enzimática de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio, ativação via receptores Fc de anticorpos e receptores para
componentes do sistema complemento (JENKINS; HUME, 2014; LAUVAU et al., 2014).
A ativação dos macrófagos também pode ser desencadeada pela expressão de IFN-γ,
produzida pelos linfócitos T ativados, que potencializa a ação fagocítica dessas células, sendo
fundamental via de ativação na resposta imune adaptativa. Dessa forma, essas células
desempenham a função de apresentação de antígeno ao linfócito T, via expressão de
moléculas de MHC (complexo principal de histocompatibilidade) sendo assim designada
como célula apresentadora de antígeno (APC)(TORROELLA-KOURI; RODRÍGUEZ;
CASO, 2013).
O macrófago é uma célula caracterizada por sua diversidade e plasticidade. Diversos
sinais (por exemplo, células danificadas, produtos microbianos) podem levar à sua ativação,
conferindo assim fenótipos diferentes a essas células. Essa ativação se dá por duas vias
distintas: via clássica (M1) e a via alternativa (M2). A primeira é mediada por estímulos como
IFN-γ, receptores TLR e lipopolissacarídeo (LPS), enquanto que a via alternativa é mediada
pela interleucina-4 (IL-4) e interleucina (IL-13). Estes estados espelham a polarização Th1-
Th2 das células T, como demonstrado na figura 6. O fenótipo M1 está envolvido com a
resposta inflamatória, e consiste na expressão de citocinas pró-inflamatórias, produção de
óxido nítrico, além de forte atividade microbicida. Já o fenótipo M2 está envolvido com a
remodelação tecidual, progressão tumoral e função imunorreguladora, e atuam como resposta
de “feedback” terminando com a inflamação, na tentativa de restaurar a homeostase do tecido
(SICA; MANTOVANI, 2012; LOCATI; MANTOVANI; SICA, 2013).
Como célula majoritária na fase crônica da inflamação, os macrófagos atuam no
remodelamento dos tecidos após infecções e lesões, produzindo fatores de crescimento para
fibroblastos e células endoteliais, fundamentais para a promoção do reparo tecidual,
angiogênese e fibrose (RANG et al., 2007).
18
Figura 6: Modelo de ativação de macrófagos: via clássica M1(a) e via alternativa M2 (b).
Fonte: Martinez et al., 2009.
1.5. Mediadores Inflamatórios
Os mediadores inflamatórios atuam no sentindo de influenciar e amplificar a resposta
inflamatória. Quanto a sua origem, podem ser derivados de proteínas plasmáticas, secretados
por células, ou ainda podem ser pré-formados e armazenados nos grânulos de leucócitos. Os
principais são os seguintes: citocinas, eicosanoides e óxido nítrico (RANG et al., 2007).
1.5.1. Citocinas
As citocinas são reguladores peptídicos sintetizados e liberados por células do
sistema imune, principalmente os macrófagos. Realizam a intercomunicação celular por
mecanismos parácrino e autócrino influenciando na atividade, diferenciação, proliferação e/ou
ativação das células imunológicas. Sua atuação é feita, na grande maioria, através dos
receptores ligados a quinases, responsáveis pela cascata de fosforilação relacionada à
expressão gênica via fator nuclear kB (NF- kB), resultando no estímulo da célula-alvo.
Algumas citocinas, além de sua ação direta sobre as células, também potencializam a
inflamação e induzem à formação de outros mediadores inflamatórios (OLIVEIRA et al.,
2011; YEOM et al., 2015).
19
Esses mediadores estão agrupados em interleucinas (IL), fatores de necrose tumoral
(TNF), quimiocinas, interferons (IFN) e fatores de crescimento. Consideradas como citocinas
pró-inflamatórias, o TNF-α e a IL-1, são as principais citocinas primárias envolvidas no
processo inflamatório. O TNF-α é secretado por macrófagos, linfócitos ou monócitos, cujo
principal estímulo para a produção é o LPS, e uma vez secretado promove o recrutamento dos
neutrófilos e monócitos para o local da infecção, além de ocasionar vasodilatação, à nível
endotelial, e estimular a secreção de quimiocinas. As quimiocinas são consideradas citocinas
quimioatraentes, devido sua ação quimiotáxica que regula a migração dos leucócitos durante
as reações inflamatórias, e diferente das outras citocinas, atuam nos receptores acoplados à
proteína G. Nos macrófagos, o TNF-α age potencializando a fagocitose, bem como a
produção de outras citocinas pro-inflamatórias e prostaglandina E2 (PGE2) (VITALE;
RIBEIRO, 2007; KIM; MOUDGIL, 2017).
A IL-1 desempenha funções similares ao TNF e é secretada por macrófagos ou
leucócitos ativados e compreende uma família de três citocinas: dois agonistas (IL-1α e IL-
1β) e um antagonista do receptor IL-1 (IL-1AR), esse último atua como regulador endógeno.
A principal forma biologicamente ativa secretada é a IL-1β, responsável pela ativação da
ciclooxigenase-2, produção de óxido nítrico, substância-P e moléculas de adesão endotelial
(COUTINHO; MUZITANO, COSTA, 2009; OLIVEIRA et al., 2011; ARANGO DUQUE;
DESCOTEAUX, 2014).
As citocinas também desempenham função regulatória na inflamação. Como por
exemplo, a IL-10, citocina anti-inflamatória que pode inibir a geração de reações pró-
inflamatórias, bem como a ativação de macrófagos e produção de quimiocinas. É importante
ressaltar que as citocinas são essenciais na condução da resposta inflamatória, entretanto, a
produção exagerada de citocinas pró-inflamatórias pode resultar em patologias, tais como
desequilíbrio hemodinâmico e distúrbios metabólicos (OLIVEIRA et al., 2011; WYNN;
VANNELLA, 2016).
1.5.2. Eicosanóides
20
Como consequência de estímulos inflamatórios (físicos, mecânicos, bacterianos e/ou
mediadores), os fosfolipídios das membranas celulares liberam o ácido araquidônico (AA), a
partir da ativação da enzima fosfolipase A2
(PLA2). O AA pode ser metabolizado pelas vias
das cicloxigenases (COX-1 e COX2) e das lipoxigenases, cujo produto do metabolismo
denomina-se eicosanóides. São considerados um dos principais mediadores na inflamação, e
também moduladores de vários processos fisiológicos. Pela via das cicloxigenases, originam-
se as prostaglandinas (PGs), prostaciclinas (PIs) e os tromboxanos (TXs), e pela via das
lipoxigenases (LOX) são sintetizados os leucotrienos (LT) e lipoxinas (ANDRADE; DO
CARMO, 2006; LIMA et al.,2008).
A isoforma 1 da cicloxigenase (COX-1) está presente na fisiologia normal e atua
como reguladora homeostática e está presente de maneira constitutiva na maioria das células.
Já a isoforma 2 (COX-2) é expressa após estímulo das células migratórias ou tecidos
danificados durante os eventos inflamatórios, gerando a produção de diversos prostanóides.
Os principais envolvidos na inflamação são PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 e TXA2, com destaque
para PGE2 considerada o principal metabólito do ácido araquidônico, além disso, pode ser
expressa pela maioria das células (ANDRADE; DO CARMO, 2006; YEDGAR et al., 2007).
Os prostanóides desempenham diversas funções durante a reação inflamatória e suas
principais ações são: vasodilatação, inibição plaquetária, aumento da permeabilidade vascular,
sinergismo com outros mediadores, ação pirogênica e potencialização dos efeitos álgicos da
bradicinina e histamina. Essa última ação, estimula as fibras nervosas do tipo C, provocando a
dor, sinal cardinal da inflamação. Os eicosanóides desempenham importante participação no
processo patológico da inflamação, e por conta disso, a supressão de suas ações tornaram-se
um dos principais alvos terapêuticos no desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios
(YEDGAR et al., 2007).
1.5.3. Óxido Nítrico
O óxido nítrico é um radical solúvel gasoso de curta duração, sintetizado a partir de L-
arginina e oxigênio molecular por um grupo de enzimas denominadas óxido nítrico sintetase
(NOs). São conhecidas três isoformas: duas isoformas constitutivas endotelial e neuronal
21
(eNOS e nNOS, respectivamente), e uma isoforma induzível (iNOS). As isoformas
constitutivas estão presentes em condições fisiológicas no organismo, já a induzível é
expressa pelas células inflamatórias em resposta a diversos estímulos, como citocinas, LPS,
endotoxinas, entre outros (KRAUSZ; FRIEDMAN, 2015; SU, 2015).
A iNOS é um potente vasodilatador, com características pró-inflamatórias como
aumento da permeabilidade e produção de prostaglandinas. A nível endotelial inibe a
agregação plaquetária e adesão de leucócitos, regulando assim o recrutamento dessas células.
Nos macrófagos, o óxido nítrico e seus metabólitos (nitrito e nitrato) destacam-se pela
atividade microbicida e ações citotóxicas. No interior dos fagolisossomos, o gás (óxido
nítrico) se difunde e combina-se com o peróxido de hidrogênio ou ao superóxido, produzindo
radicais altamente tóxicos que destroem os micro-organismos (COUTINHO; MUZITANO,
COSTA, 2009; HODGKINSON; GRAYFER; BELOSEVIC, 2015).
22
2. JUSTIFICATIVA
As plantas medicinais são uma das melhores e mais efetivas fontes de compostos
candidatos a novas classes de medicamentos, e para muitas dessas plantas utilizadas na
medicina popular, já é possível comprovar o que a medicina tradicional reportou durante
milênios, ou seja, os produtos naturais constituem importantes fontes de agentes terapêuticos.
O Brasil é conhecido mundialmente não só por ser uma potência economicamente
emergente, mas também por apresentar uma flora bastante diversificada. A região amazônica
é rica em biodiversidade e apresenta um grande potencial terapêutico. Dentre as espécies de
interesse da região, encontra-se a Cyperus articulatus L., pertencente à família Cyperacea,
conhecida no estado do Pará como priprioca, cuja utilização mais conhecida é a produção de
seu óleo essencial, largamente empregado pela indústria cosmética.
O interesse pelos óleos essenciais está baseado não somente na possibilidade de
obtenção de compostos aromáticos, mas também daqueles possuidores de propriedades
terapêuticas, já que apresentam uma larga tradição de uso como agentes medicinais com
finalidades sedativas, antiespasmódicos, antidiarréicos, antimicrobianos e analgésicos.
De acordo informações etnofarmacológicas, o óleo essencial da Cyperus articulatus
L. apresenta um enorme potencial anti-inflamatório, fato esse que despertou o interesse da
pesquisa pela espécie para a investigação de efeitos possivelmente farmacológicos,
considerando a alta incidência de doenças inflamatórias agudas e crônicas, e principalmente, a
ocorrência de efeitos adversos relacionados ao uso de medicamentos anti-inflamatórios que
impacta diretamente na baixa adesão ao tratamento dos pacientes que fazem uso desses
fármacos. Outro fator que fundamenta esta pesquisa é a indisponibilidade de dados entre as
literaturas pesquisadas sobre o efeito anti-inflamatório dessa planta, apesar do uso na
medicina popular para essa finalidade.
23
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Avaliar a atividade anti-inflamatória in vitro do óleo essencial de Cyperus articulatus L
(OECA) em cultura de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ.
3.2 ESPECÍFICOS:
Identificar os principais componentes químicos do OECA;
Avaliar, in vitro, o efeito do OECA sobre a viabilidade de macrófagos da linhagem
RAW 264.7;
Analisar o efeito do OECA sobre a síntese de Óxido Nítrico em macrófagos
estimulados com LPS e IFN-γ;
Investigar o efeito do OECA sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α
e IL-1β, em cultura de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ;
Avaliar os efeitos do OECA sobre a produção do eicosanóide PGE2, em culturas de
macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ;
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta e identificação do material vegetal
Em março (período seco) foram coletados os rizomas da espécie C. articulatus L. em
uma área de cultivo na região do Tabocal, BR-163, no município de Santarém, Pará, [(-
54°43’00,10”W e -02°37’41,10”S)]. A espécie foi identificada pelo botânico Dr. Antônio
Elielson Sousa da Rocha. Um exemplar da exsicata foi depositado no herbário do Museu
Paraense Emílio Goeldi localizado em Belém, Pará, sob número de registro MG: 207174.
4.2. Extração do OECA
O óleo essencial de C. articulatus L. foi cedido gentilmente pelo Prof. Lauro E. S.
Barata (Laboratório de Pesquisa & Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos,
UFOPA, PA, Brasil). O procedimento de extração foi realizado pela empresa Beraca, no
município de Belém, Pará. Foram coletados 5 kg de rizomas de C. articulatus. Após a coleta
os rizomas foram submetidos à limpeza, secos por um período de 3 dias consecutivos e
moídos em moinho de facas em ambiente aberto. Após lavagem e secagem em estufa a 60 ºC,
o material foi triturado e submetido à hidrodestilação por arraste a vapor, em uma dorna de
150 L, com uma duração de 4 h. Após extração o óleo essencial foi armazenado em frasco
âmbar e seu rendimento foi de 0,7%.
4.3. Análise cromatográfica do OECA
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa é uma técnica utilizada
para análise e determinação de um grande número de compostos simultaneamente. Consiste
na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária,
seguida da obtenção de informação estrutural e massa molar para identificação dos compostos
a serem analisados. A análise da composição química do OECA foi realizada no Centro de
Pesquisas Químicas, Biológicas e Agronômicas da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), com a participação da Me. Aline Aparecida Kasper (Laboratório de Pesquisa &
Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos, UFOPA, PA, Brasil). O equipamento
utilizado foi o cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa Agilent, modelo HP-
6890 equipado com um detector seletivo de massas, com coluna capilar HP-5MS (30m x
0,25mm x 0,25µm) nas seguintes condições: temperatura do injetor = 220°C, coluna = 60°C,
25
taxa de aquecimento de 3°C/min até 280°C (20 min) e detetor = 250°C. Foi utilizado hélio
como gás de arraste numa vazão de 1mL/min. Os espectros de massa obtidos foram
comparados com a biblioteca eletrônica do equipamento (NIST-05) e com a bibliografia
Adams (2007).
4.4. Drogas e Soluções
Foram utilizadas as seguintes substâncias neste estudo: dexametasona (Sigma
Chemical Co), penicilina (GIBCO), estreptomicina (GIBde CO), Dulbecco´s modified
Eagle´s medium (DMEM) (Cultilab, São Paulo, Brazil), LPS (InvivoGen, São Diego, CA,
EUA), IFN-γ (BD Biosciences), FBS (Cultilab, São Paulo, Brasil). O OECA, objeto de
estudo desta pesquisa, foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO), obtendo uma
concentração final de 10 mg/mL.
4.5 Modelos Experimentais
4.5.1 Cultura de macrófagos murinos RAW 264.7
Para este estudo, foi utilizada linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7 obtidos
da Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC, American Type Culture Collectio,
Rockville, MD, USA) de um cultivo cedido originalmente pela Dra. Juliana Vago
(Departamento de Morfologia – UFMG, MG, Brasil). Os ensaios in vitro foram realizados no
Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, coordenado pela Dra. Leda Quercia Vieira
(Departamento de Bioquímica e Imunologia – UFMG, MG, Brasil). As células RAW 264.7
foram cultivadas em meio DMEM, suplementadas com 10 % de soro fetal bovino (SFB) e
antibióticos (50 U/mL penicilina e 50 μg/mL estreptomicina), mantidas em garrafas de cultura
celular a 37 °C em estufa a 5 % de CO2.
Depois das células atingirem a confluência de 80-90%, foi descartado o meio DMEM
completo das garrafas de cultura celular com auxílio de uma pipeta sorológica, seguida da
lavagem dos frascos com PBS. As células aderidas à superfície dessas garrafas foram
desprendidas utilizando o raspador celular (Corning Cell Scraper, Nova Iorque, EUA) após
adição de 10 ml de meio DMEM completo. Posteriormente, o meio contendo as células foi
transferido para tubos esterilizados de 50 ml, centrifugados a 300 g, durante 10 minutos, a 4
26
°C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido com meio completo.
Utilizando a câmara de Neubauer, foi realizada a contagem global das células, a partir da
diluição de 1:20 em solução de Azul de Trypan. Os macrófagos foram cultivados em
microplacas de 96 poços, na concentração de 5 x 105
(célula/poço), incubadas durante 18 h, a
37 °C em estufa a 5 % de CO2. Após o período de incubação e adesão celular, as células
foram tratadas com as diferentes concentrações (2.000; 1.500; 1.000; 750; 500; 375; 250;
187,5; 125; 93,75; 62,5 e 31,75 μg/mL) do óleo essencial de Cyperus articulatus testado em
triplicata e em dois períodos de tratamento: 24 e 48 h. Como controle negativo foi avaliado
apenas o meio de cultura, e a fim de verificar a interferência do DMSO, optou-se por um
controle apenas desse diluente.
4.5.2 Análise da viabilidade celular
A viabilidade celular da linhagem RAW 264.7 foi avaliada pelo método MTT. Esse
teste é o mais empregado como indicador colorimétrico da viabilidade celular e consiste na
avaliação da função mitocondrial da célula, a partir da redução enzimática do sal tetrazólico
pela atividade das enzimas desidrogenases mitocondriais das células viáveis, gerando os
cristais de formazan. Esses cristais são solubilizados com DMSO o que dá origem a uma
coloração violeta, tornando possível a quantificação espectrofotométrica da citotoxicidade
induzida pela substância teste (MOSMANN, 1983; MELO, 2015).
As culturas de macrófagos foram lavadas com tampão PBS (pH: 7,4). Após a
lavagem, foi adicionado 100μL/ poço de MTT (1mg/ml) (brometo de 3-[4,5-dimetil-2-
tiazolil]-2,5-difenil-2H tetrazolio) diluído em PBS (1 mg/ml). As células foram incubadas
durante 4 h a 37º C em atmosfera contendo 5 % de CO2. Após o tempo de incubação o
sobrenadante foi retirado e os cristais formados foram solubilizados com 100 µL/poço de
dimetilsulfóxido (DMSO). A absorbância foi medida a 590 nm utilizando um leitor de
microplaca automático (Biochrom EZ Read 400).
4.5.3 Planejamento Experimental
Os macrófagos RAW 264.7 foram cultivados na concentração de 1 x 106
(célula/poço), em placas de 48 poços e incubadas por 24 h para adesão das células, a 37 °C em
estufa a 5 % de CO2, para a realização dos tratamentos desejados. Após o período de incubação
27
as células foram estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) e tratadas com as 4
concentrações (1.000; 500; 250 e 125 μg/mL) selecionadas para este estudo, e em seguida,
incubadas por mais 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2. A fim de obter o efeito comparativo da
resposta anti-inflamatória do óleo essencial de Cyperus articulatus foi utilizado como padrão a
dexametasona (10 µM), e como controle positivo o grupo tratado apenas com o estímulo (LPS
+ IFN-γ) nas mesmas condições experimentais. O sobrenadante da cultura foi submetido ao
ensaio de Griess para a determinação dos níveis de nitrito e avaliação de citocinas (estocado à -
20°C até a realização da dosagem). Os tratamentos foram divididos da seguinte forma:
Grupo 01: (controle negativo): células cultivadas apenas com o meio de cultura DMEM.
Grupo 02: diluente DMSO 0,5%.
Grupo 03: (controle positivo): células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml)
Grupo 03: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50UI/ml) + dexametasona (10
µM)
Grupo 05: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (125 μg)
Grupo 06: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (250 μg)
Grupo 07: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (500 μg)
Grupo 08: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (1.000 μg)
4.5.4 Dosagem de Nitrito
Este método baseia-se na quantificação indireta de NO pelo seu principal metabólito,
o nitrito. Para avaliar o efeito inibitório do óleo de Cyperus articulatus na produção de Óxido
Nítrico foi determinada a concentração de Nitrito (NO-2) presente no sobrenadante de culturas
de macrófagos, tratados ou não com óleo essencial de Cyperus articulatus, baseado na reação
de Griess (Green et al., 1982). Este método consiste em uma reação colorimétrica na qual o
sobrenadante da cultura é incubado com igual volume dos reagentes de Griess. Este reagente é
preparado pela mistura de volume de solução de naftiletileno-diamina a 0,1% (Sigma) com a
28
solução de sulfanilamida a 1 % (Sigma) em ácido fosfórico a 2,5%. Alíquotas de 50 µL dos
sobrenadantes foram incubadas com o mesmo volume de reagente de Griess, em temperatura
ambiente por 10 minutos no escuro. A concentração padrão de nitrito utilizado foi de 500 µM.
O resultado da reação é a coloração rosa púrpura, que em seguida foi submetida à leitura em
leitor de microplacas (540 nm).
4.5.5 Método ELISA para dosagem de IL-1β, TNF-α e PGE2
Os níveis de IL-1β, TNF-α e PGE2 foram quantificados por ELISA (do inglês,
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Este teste baseia-se em reações antígeno-anticorpo
detectáveis através de reações enzimáticas. Considerado um método de grande sensibilidade e
especificidade, é caracterizado pelo uso de uma enzima, geralmente a peroxidase, que se liga
a um anticorpo específico e reconhece o antígeno alvo, dando origem a um produto colorido a
partir desta reação. A dosagem dessas citocinas foi realizada a partir do sobrenadante da
cultura de macrófagos RAW 264.7, tratadas ou não com óleo essencial de Cyperus
articulatus. Para isto, foram utilizados Kits de ELISA comercialmente disponíveis. Os
resultados foram expressos em pg/mL.
4.6 Análise Estatística
Os dados obtidos foram analisados pela análise de variância (ANOVA), utilizando o
programa GraphPad Prism versão 5, seguido do pós-teste de comparações múltiplas Newman-
Keuls (p < 0,05 = nível de significância). Os dados são expressos como média ± erro padrão
da média (EPM).
5 RESULTADOS
5.1 Análise da composição química do OECA
Foi identificado um total de 88,43% dos constituintes do óleo essencial de C.
articulatus, conforme descrito na tabela 1. A análise da composição química do OECA
revelou a presença de oito compostos majoritários correspondendo a 54.7% de constituintes
29
totais do OECA, dos quais quatro apresentaram percentuais de concentração maiores que 6%:
α-copaeno, β-selineno, ciclocolorenona e mustacona (constituinte majoritário).
Tabela 01: Composição química do óleo essencial de C. articulatus
tR (min) IR Identificação % rel.
5,54 933 α-pineno 4,85
6,05 953 tuja-2,4(10)-dieno 0,56
6,66 977 β-pineno 1,94
8,08 1024 ρ-cimeno 0,83
8,21 1028 Limoneno 0,49
9,70 1071 trans-epoxi-ocimeno 2,12
10,35 1090 ρ-cimeneno 1,47
12,26 1139 trans-pinocarveol 3,08
12,64 1148 n.i. 0,69
13,39 1167 para-menta-1,5-dien-8-
ol
1,33
14,37 1191 alfa-terpineol 1,19
14,62 1198 Mirtenol 4,21
15,11 1209 Verbenona 2,77
21,66 1366 Ciclosativeno 0,69
22,06 1375 α-copaeno 6,57
22,99 1398 Cipereno 3,29
23,25 1404 cis-tujopsadieno 2,79
25,38 1457 Rotundeno 2,06
26,00 1473 isolongifolene, 4,5-
dehydro
1,32
26,12 1476 δ-cadineno 2,28
26,53 1486 β-selineno 8,45
27,01 1498 cycloisolongifolene,8,9-
dehydro
2,45
27,29 1505 α-bulneseno 2,38
27,61 1513 M = 202 0,86
30
27,96 1523 trans-calameneno 2,52
28,32 1532 M = 220 2,40
28,42 1534 M = 220 1,72
28,73 1542 α-calacoreno 2,63
29,04 1550 M = 220 0,90
29,69 1567 M = 220 1,41
30,20 1581 óxido de cariofileno 1,28
30,62 1591 β-copaen-4-α-ol 1,12
31,46 1614 epóxido de
humuleno
1,19
33,29 1664 M = 218 1,66
33,61 1672 M = 222 0,92
33,84 1679 Mustacona 10,65
34,36 1693 Ciperotundona 1,49
34,91 1708 cis-tujopseno 3,44
35,91 1737 M = 234 1,04
36,36 1750 Ciclocolorenona 6,99
Total de constituintes identificados 88.43%
tR = Tempo de retenção; IR = Índice de retenção; M = Massa molecular; % rel= Porcentagem relativa
5.2 Análise da Viabilidade Celular
O OECA foi testado em macrófagos RAW 264.7 com o objetivo de avaliar
preliminarmente o seu possível efeito citotóxico em função da concentração utilizada.
Conforme mostra as figuras 7A e B, observa-se que o tratamento com OECA não promoveu
efeito citotóxico nas concentrações inferiores a 1500 μg/mL após 24 e 48 h de incubação,
sendo tóxico na concentração de 2000 μg/mL, na qual foi observado uma diminuição
significativa da viabilidade celular. Desta forma, esta última concentração foi excluída dos
demais parâmetros de análise.
31
Figura 7A: Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a viabilidade celular de
macrófagos RAW 264.7 após 24 h de tratamento. Dados representados
por média ± EPM. ***p<0,001 quando comparados ao grupo controle; ANOVA One-way,
Teste de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
Figura 7B: Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a viabilidade celular de
macrófagos RAW 264.7 após 48 h de tratamento. Dados representados
por média ± EPM. ***p<0,001 quando comparados ao grupo controle; ANOVA One-way,
Teste de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
32
5.3 Avaliação da Produção de Nitrito em macrófagos RAW 264.7 estimulados com
LPS + IFN-γ e tratados com OECA
Conforme a figura 8, observa-se uma inibição significativa na produção de nitrito nas
culturas de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS + IFN-γ e tratados nas diferentes
concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL) de OECA, reduzindo os níveis de nitrito em 86.4,
95.5, 95.3%, respectivamente. A dexametasona (10 µM), usada como padrão de anti-
inflamatório, também inibiu a produção de nitrito significativamente comparado com controle
positivo, correspondendo a uma redução de 95.5%.
Figura 8: Efeito do OECA sobre a produção de nitrito em macrófagos RAW 264.7
estimulados por IFN- γ (50 UI/mL) e LPS (100 ug/mL). Dados representados por média ± DP
(n=3). ***p<0,001 indica uma diferença significativa entre o grupo estimulado por LPS +
IFN-γ e o grupo tratado com OECA. ### P < 0,001 indica uma diferença significativa entre o
grupo de controle negativo e o grupo estimulado por LPS + IFN-γ; ANOVA One-way, Teste
de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
5.4 Produção de TNF-α por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e
tratados com OECA
Conforme figura 9, verifica-se que o tratamento com OECA promoveu nas
concentrações de 250, 500 e 1000 μg/mL uma diminuição significativa na produção de TNF-α
33
em cultura de macrófagos RAW 264.7, representando uma redução de 34.5, 48.4 e 59.1 %,
respectivamente, das concentrações testadas quando comparadas com o grupo tratado somente
com o estímulo. A dexametasona, droga padrão, também inibiu uma a produção de TNF-α
significativamente 66.4% quando comparado com o controle positivo.
Figura 9: Efeito do OECA sobre a produção de TNF-α em macrófagos RAW 264.7
estimulados por IFN- γ (50 UI/mL) e LPS (100 ug/mL). Dados representados por média ± DP
(n=3). ***p<0,001 indica uma diferença significativa entre o grupo estimulado por LPS +
IFN-γ e o grupo tratado com OECA. ### P < 0,001 indica uma diferença significativa entre o
grupo de controle negativo e o grupo estimulado por LPS + IFN-γ; ANOVA One-way, Teste
de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
5.5 Produção de IL-1β por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e
tratados com OECA
A figura 10 demonstra que apenas a concentração de OECA 1000 μg/mL promoveu
uma diminuição significativa nos níveis de IL-1β comparado com o controle positivo
(somente com estímulo), reduzindo 56.9% os níveis dessa citocina. Observamos também uma
diminuição significativa da produção de IL-1β no grupo tratado com dexametasona (10 µM)
usado como padrão, também em relação ao controle positivo, representando uma redução de
87.9%.
34
Figura 10: Efeito do OECA sobre a produção de IL-1β em macrófagos RAW 264.7
estimulados por IFN- γ (50 UI/mL) e LPS (100 ug/mL). Dados representados por média ± DP
(n=3). ***p<0,001 indica uma diferença significativa entre o grupo estimulado por LPS +
IFN-γ e o grupo tratado com OECA. ### P < 0,001 indica uma diferença significativa entre o
grupo de controle negativo e o grupo estimulado por LPS + IFN-γ; ANOVA One-way, Teste
de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
5.6 Produção de PGE2 por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e
tratados com OECA
A figura 11 demonstra que as diferentes concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL) de
OECA reduziram de maneira significativa a produção de PGE2 em cultura de macrófagos
RAW 264.7, quando comparados com o controle positivo (apenas o grupo estimulado),
representando uma redução de 18.2, 32.3, 54.1%, respectivamente. O anti-inflamatório
padrão, dexametasona (10 µM), também reduziu significativamente a produção de PGE2, em
relação ao controle positivo (grupo estimulado).
35
Figura 11: Efeito do OECA sobre a produção de PGE2 em macrófagos RAW 264.7
estimulados por IFN- γ (50 UI/mL) e LPS (100 ug/mL). Dados representados por média ± DP
(n=3). ***p<0,001 indica uma diferença significativa entre o grupo estimulado por LPS +
IFN-γ e o grupo tratado com OECA. ### P < 0,001 indica uma diferença significativa entre o
grupo de controle negativo e o grupo estimulado por LPS + IFN-γ; ANOVA One-way, Teste
de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.
6 DISCUSSÃO
Os produtos naturais, principalmente os derivados de plantas, desempenham um papel
fundamental na saúde humana em relação à prevenção e ao tratamento de diversas doenças.
Resultados de outras pesquisas utilizando o óleo essencial da Cyperus articulatus L (planta
amplamente utilizada na medicina tradicional) comprovaram diversas finalidades terapêuticas,
porém a atividade biológica anti-inflamatória dessa planta ainda é desconhecida, o que torna
esta pesquisa relevante e de grande contribuição para a literatura científica (IBRAHIM et al.,
2012).
A inflamação é uma resposta do organismo a qualquer injúria tecidual, envolvendo
vários tipos de células de defesa, sendo as principais os macrófagos. Uma vez ativados, eles
induzem à produção de mediadores inflamatórios, responsáveis pela sinalização e regulação
36
do processo inflamatório. Apesar de a inflamação ser um mecanismo de defesa, ela pode
progredir e tornar-se crônica, o que gera necessidade de intervenção medicamentosa. Por
conta disso, os mediadores inflamatórios liberados a partir da ativação dos macrófagos são
alvos considerados promissores para o tratamento de doenças inflamatórias (SEO et al.,
2016).
Existem vários tipos de modelos (in vivo, in vitro e in silico) experimentais de
inflamação que podem ser utilizados para avaliar a atividade anti-inflamatória de compostos
naturais. Neste estudo optou-se pelo ensaio in vitro que consiste na ativação de macrófagos
frente à presença de agentes patogênicos. Assim como em outros grupos de pesquisas que
atuam na avaliação de produtos naturais utilizando esse tipo de modelo, a linhagem celular
RAW 264.7 (células imortalizadas) foi a adotada para a avaliação da atividade anti-
inflamatória do OECA, devido sua semelhança com as células primárias, e ainda, por
apresentarem alta aderência e uma relativa facilidade no cultivo celular e manutenção para os
estudos in vitro. Devido a esses fatores, as células de macrófagos murinos RAW 264.7 são
consideradas atualmente um modelo adequado para a análise dos efeitos imunomoduladores e
anti-inflamatórios de drogas (RAELE, 2013; SHI et al., 2017).
A partir dos ensaios realizados neste trabalho, os resultados demonstraram que o
tratamento de macrófagos com o OECA foi capaz de reduzir de maneira significante
parâmetros inflamatórios in vitro como a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e
IL-1β), síntese do óxido nítrico e produção do eicosanóide PGE2, o que pode estar relacionado
com a composição química do óleo essencial da espécie estudada.
A primeira etapa realizada antes do início dos ensaios in vitro foi o processo de
extração para a obtenção do óleo essencial, o qual foi realizado pelo método de
hidrodestilação por arraste a vapor, cujo valor de rendimento resultou em um percentual de
0,7%. Esse resultado mostra ser coerente ao descrito na literatura, uma vez que se aproxima à
faixa de rendimento obtido por Zoghbi et al. (2006), cujos valores foram de 0,9 a 1,6%,
utilizando a mesma metodologia de extração.
Os óleos essenciais são misturas complexas encontradas, principalmente, em plantas
aromáticas, e são regidos pelo tipo e quantidade de seus constituintes químicos, que em geral,
são terpenos, compostos oxigenados e isoprenóides. Conforme os dados apresentados na
37
tabela 1, que representa a análise da composição química do OECA, foram identificados um
total de 40 compostos, tendo como constituintes majoritários monoterpenos, sesquiterpenos e
cetonas sesquiterpênicas. Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Nyasse et al.
(1988) que identificaram a presença de compostos sesquiterpênicos no extrato dos rizomas de
Cyperus articulatus, e ainda determinaram a presença de mustacona, composto que passou a
ser considerado como marcador biológico da priprioca (TONGNUANCHAN; BENJAKUL,
2014).
Considerando o total (88,43%) de compostos identificados a partir da caracterização
química do OECA foi evidenciada a presença de quatro constituintes majoritários
sesquiterpênicos correspondendo a um percentual superior a 6%, destacando-se a mustacona
(10,65%), seguida de ciclocolorenona (6,99%), β-selineno (8,45%) e α-copaeno (6,57%). No
trabalho realizado por Zoghbi et al. (2006) também foi observada uma presença abundante de
mustacona com variações de 7,3 a 14,5% nas amostras dos óleos essenciais obtidos a partir
dos rizomas da espécie Cyperus articulatus, caracterizando esse composto como o principal
sesquiterpeno presente nessa planta. Os compostos α-copaeno e β-selineno também foram
identificados no estudo realizado por Zoghbi et al. (2006).
Rukunga et al. (2008) identificaram a presença de dois sesquiterpenos, mustacona e
corimbolona, isolados do extrato de clorofórmio dos rizomas de Cyperus articulatus L., os
quais exibiram propriedades anti-plasmodiais significativas, destacando-se a mustacona por
apresentar dez vezes mais ativa contra o Plasmodium falciparum, o que sugere que tal
composto pode ser considerado como “composto marcador’’ dos medicamentos naturais a
partir de Cyperus articulatus L. Um alto índice de mustacona também foi descrito no trabalho
de Silva et al. (2014), a partir do óleo essencial de Cyperus articulatus L, incluindo α-
cipereno e α-pineno. Mattoso (2005) que também utilizou o processo de hidrodestilação para
obtenção do óleo essencial observou em seu estudo a presença de cinco compostos
identificados nesta pesquisa, sendo eles α-pineno (hidrocarboneto monoterpênico), α-copaeno,
cipereno, β-selineno e α-calacoreno, os quatro últimos pertencem à classe de hidrocarbonetos
sesquiterpênicos. Isso demonstra que a composição química do OECA se assemelha ao perfil
descrito na literatura.
No trabalho realizado por Zoghbi et at. (2008b) em que compararam as variações da
38
composição química dos óleos essenciais de espécies do gênero Cyperus, foi detectada uma
maior porcentagem de mustacona e óxido de cariofileno, comparado com os outros compostos
químicos nos óleos analisados das espécies C. articulatus var. articulatus e C. articulatus var.
nodosus. Ambos compostos também foram identificados no OECA, porém os resultados se
assemelham apenas quando comparados à concentração de mustacona, pois a concentração de
óxido de cariofileno (1,28%) em nosso estudo foi acentuadamente abaixo do identificado no
trabalho mencionado anteriormente, o qual foi registrado concentrações de até 13,7%. Isso
demonstra a diferença na composição química dos óleos essenciais de diferentes espécies do
gênero Cyperus, o que pode estar relacionado a diversos fatores, dentre eles o clima, período
da coleta, sazonalidade, estresse hídrico, tipo de solo e outros (ZHANG et al., 2017).
Os sesquiterpenos são metabólitos secundários conhecidos por diversas ações
biológicas e farmacológicas, incluindo atividades anti-inflamatórias. Alguns dos compostos
sesquiterpênicos identificados no OECA já possuem atividade biológica anti-inflamatória
comprovada, como por exemplo, podemos citar o estudo de Afoulous et al. (2013) no qual
avaliaram diversas atividades biológicas do óleo essencial da espécie Cedrelopsis grevei, e
atribuíram a atividade anti-inflamatória à presença do monoterpeno α-pineno e a de outros
sesquiterpenos presente no óleo. Adicionalmente, estudos demonstram que espécies do
gênero Cyperus tem apresentado atividade biológica anti-inflamatória, em modelos in vitro e
in vivo, o OECA, também é formado em grande parte por compostos terpenóides
(KANGRALKAR et al., 2010; JUNG et al., 2013; SOUMAYA et al., 2013; PIRZADA et al.,
2015; AZIMI et al., 2016)
A presença dos compostos terpenóides na constituição química do OECA é um dado
importante, visto que, diversos fármacos foram desenvolvidos a partir de produtos naturais,
com menos efeitos adversos e mais segurança para tratamento a longo prazo (SIBI; RABINA,
2016).
Considerando que o estudo da toxicidade garante a segurança necessária para o
desenvolvimento de novos medicamentos, nossos estudos com o OECA iniciaram com a
determinação do potencial citotóxico do óleo essencial a partir da avaliação da citotoxicidade
nos macrófagos RAW 264.7. Segundo Rogero et al. 2003, os testes de citotoxicidade são
fundamentais para avaliar a interferência dos compostos naturais nos processos que envolvem
39
a sobrevivência, proliferação e função celular, e consideram os testes in vitro mais vantajosos
comparados ao in vivo devido à facilidade na execução, controle ambiental das células,
rapidez para obtenção de dados, além de substituir o uso de animais nos testes (LOIODICE;
NOGUEIRA DA COSTA; ATIENZAR, 2017).
Nesse sentido, o método MTT foi o ensaio in vitro utilizado neste estudo para avaliar a
viabilidade celular, e consequentemente, a influência do OECA a partir das concentrações
testadas. A partir desse ensaio foi observado que as concentrações inferiores a 1500 μg/mL do
OECA não demonstraram efeito tóxico para as células, tanto no período de 24 h quanto de 48
h (figuras 7A e 7B). Apenas a concentração de 2000 μg/mL apresentou redução significativa
na viabilidade celular, o que indica uma redução da proliferação e morte celular, e por conta
disso, essa concentração foi excluída dos testes de avaliação anti-inflamatória. Diante deste
dado, foi estabelecido que as concentrações testes utilizadas nos ensaios anti-inflamatórios
seriam 250, 500 e 1000 μg/mL do OECA.
Não encontramos na literatura trabalhos que demonstrem à atividade citotóxica do
óleo essencial de Cyperus articulatus L, apenas de outras espécies pertencente ao mesmo
gênero, como por exemplo, o estudo de Jung et al. (2013) que demonstraram atividade
citotóxica na concentração de 200 μg/mL da fração n-hexano da Cyperus rotundus em células
RAW 264.7. Observa-se uma diferença acentuada da concentração citotóxica de ambas as
espécies, o que pode ser justificada pelo uso do composto concentrado extraído da planta
naquele estudo, e não o óleo essencial bruto, como o caso do presente trabalho, e ainda, por se
tratar de espécies diferentes.
A atividade anti-inflamatória do OECA, foi testada frente aos parâmetros in vitro
selecionados neste estudo. O primeiro parâmetro avaliado foi o efeito inibitório do óleo
essencial de Cyperus articulatus na produção de óxido nítrico por meio da determinação de
nitrito presente no sobrenadante de cultura dos macrófagos da linhagem RAW 264.7
estimulados por LPS + IFN-γ.
O óxido nítrico é um mediador importante que participa dos processos inflamatórios e
sua produção é consequência da ativação dos macrófagos após o estímulo por endotoxina
(LPS). Assim, a supressão na sua produção decorrente da inibição da expressão de iNOS ou
da atividade enzimática desta mesma enzima, é um importante mecanismo de ação, e drogas
40
que consigam exercer esta atividade, é um potente candidato para o desenvolvimento de
novos medicamentos para o tratamento de doenças inflamatórias (SHIN et al., 2015).
O efeito do OECA foi avaliado após o estímulo dos macrófagos RAW 264.7 com LPS
+ IFN-γ, seguida da determinação do nitrito no meio de cultura utilizando a reação de Griess.
Esse método consiste em uma reação colorimétrica que avalia indiretamente os níveis de NO,
é de simples execução e confiável, porém sua única desvantagem reside no fato de detectar
somente o nitrito (principal metabólito do óxido nítrico), já que o NO é um gás bastante
reativo e dificilmente dosado de forma direta.
De acordo com a figura 8, observa-se que o OECA reduziu de maneira significativa a
produção de óxido nítrico em todas as concentrações testadas, o que corresponde a uma
diminuição de 86.4, 95.5 e 95.3% nas concentrações de 250, 500 e 1000 μg/mL de OECA,
respectivamente. A droga padrão (dexametasona) utilizada no teste também apresentou uma
inibição significativa de 95.5% na produção de nitrito.
O resultado do presente trabalho corrobora com estudos de outros pesquisadores que
avaliaram a atividade anti-inflamatória de espécies do gênero Cyperus e demonstraram o
efeito inibitório de compostos dessas plantas sobre a produção de óxido nítrico, como por
exemplo, o trabalho realizado por Jung et al., (2013) que demonstraram efeito inibitório da
Cyperus rotundus sobre a produção de NO em células RAW 264.7 tratadas com fração
isolada n-hexano dessa planta. Do mesmo modo, Khan et al., (2011) demonstraram atividade
anti-inflamatória de sesquiterpenos isolados de Cyperus rotundus em células RAW 264.7 e a
capacidade desses compostos em reduzir de maneira significativa a expressão de iNOS,
relacionando tal redução à regulação negativa da via de sinalização NF-kB. Em nosso estudo,
não investigamos qual(is) via(s) de sinalização podem estar envolvidas na inibição da
produção de NO.
Outro parâmetro avaliado para investigar a capacidade anti-inflamatória do OECA foi
a influência desse óleo sobre a produção de citocinas pró-inflamatórias. Optou-se pela análise
de TNF-α e IL-1β, consideradas como umas das principais citocinas liberadas, após o
processo de ativação do macrófago ou monócito, na resposta inflamatória. É importante
ressaltar, que ambas ativam a imunidade celular para regular o processo inflamatório, o que
pode representar possíveis mecanismos para atuação de novos fármacos (SIBI; RABINA,
41
2016).
De acordo com análise da figura 9, observa-se que o OECA diminuiu
significativamente os níveis de produção de TNF-α, em células RAW 264.7, em todas as
concentrações avaliadas neste estudo, isto é, 250, 500 e 1000 μg/mL. Considerando que o
percentual da redução dos níveis desta citocina foi proporcional ao da concentração testada,
sugere-se uma redução do tipo concentração-dependente exercida pelo OECA neste ensaio.
Esse resultado difere do encontrado no trabalho de Jung et al. (2013) o qual testaram a
atividade biológica de α-ciperona, fração isolada dos rizomas de outra espécie do gênero,
Cyperus rotundus, e não constataram redução nos níveis de produção de TNF-α. Além de
espécies diferentes, no referido estudo foi avaliada a atividade biológica de uma fração
isolada, e não de um óleo essencial bruto, como é o caso do presente estudo. O OECA possui
diversos componentes químicos, em torno de 100 componentes, não identificamos quais os
responsáveis pela redução dos níveis de TNF-α, tendo em vista que esse não foi o propósito
do nosso estudo (ZOGHBI et al., 2006).
Quanto ao efeito do OECA sobre a produção de IL-1β, foi verificado que apenas a
concentração de 1000 μg/mL inibiu significativamente os níveis desta citocina, o que
corresponde uma redução de 56.9% comparada com o controle positivo. A dexametasona,
droga padrão, também promoveu redução comparada ao controle positivo, o que corresponde
a um percentual de 87.9 % (figura 10).
Esse resultado corrobora com o trabalho de Seo et al.(2016) que avaliaram a atividade
biológica de um sesquiterpeno isolado dos rizomas de Cyperus rotundos, o isociperol, no qual
esse composto inibiu significativamente a produção de IL-1β em macrófagos RAW 264.7
estimulados com LPS, suprimindo a expressão do gene responsável pela produção dessa
citocina. Esse composto também está presente no OECA, e pode ter inibido os níveis de
produção de outros mediadores inflamatórios avaliados neste estudo, como por exemplo, o
NO.
Em suma, foi possível verificar neste estudo que o OECA atenuou a produção das
principais citocinas envolvidas na resposta inflamatória, ou seja, TNF-α e IL-1β, contudo não
temos evidencias suficientes para afirmar quais os mecanismos de atuação responsáveis por
42
este resultado. Logo, estudos adicionais são necessários para a elucidação dos mecanismos
moleculares envolvidos no efeito anti-inflamatório do óleo essencial de Cyperus articulatus
L.
De acordo com a literatura, as principais vias de atuação dos fármacos anti-
inflamatórios consistem na inibição da atividade de células inflamatórias e de mediadores
inflamatórios. Nesse contexto, os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e
glicocorticoides são as drogas consideradas de escolha no manejo de doenças inflamatórias, e
parte de seus efeitos estão relacionados à inibição da atividade de NF-kB. NF-kB é um
modulador chave de sinalização envolvido na regulação da transcrição de inúmeros
mediadores inflamatórios e citocinas, como iNOS, COX-2 e IL-1β (SIBI; RABINA, 2016).
Há evidências de várias plantas com propriedades anti-inflamatórias, até mesmo
espécies do gênero Cyperus, que inibem a atividade de NF-kB. Esses dados apontam
possíveis vias de atuação do OECA que ainda são obscuras, mas que são promissoras para o
desenvolvimento de novos medicamentos anti-inflamatórios (HEO et al., 2016; JUNG et al.,
2013; SEO et al., 2016).
O último parâmetro inflamatório avaliado neste estudo para investigar a capacidade da
atividade anti-inflamatória do OECA, foi a influência deste óleo sobre a produção do
eicosanóide PGE2. PGE2 é uma prostaglandina gerada pela ciclooxigenase-2 (COX-2), que
participa da resposta inflamatória causando dor, febre, inchaço e rigidez, logo, sua regulação
representa uma importante abordagem terapêutica para o tratamento de desordens
inflamatórias (VYSAKH et al., 2018).
Como dito anteriormente, uma das principais estratégias para tratamento de doenças
inflamatórias consiste no uso de anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs), cujo mecanismo
de ação ocorre através da inibição das isoformas COX. Embora sejam amplamente usadas,
essas drogas causam sérios efeitos colaterais, fato esse que reforça a necessidade de pesquisas
em busca de novos compostos anti-inflamatórios com farmacologia mais seletiva e de menor
toxicidade (VYSAKH et al., 2018).
Neste estudo, observou-se que todas as concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL)
testadas do OECA diminuíram significativamente a produção dos níveis de PGE2,
43
demonstrando uma redução do tipo concentração-dependente (figura 11). A dexametasona
(droga-padrão) também demonstrou uma redução significativa comparada ao grupo
estimulado.
Embora não tenhamos conhecimento de outros trabalhos envolvendo a atividade anti-
inflamatória do óleo essencial de Cyperus articulatus L, esse resultado assemelha-se ao de
outros autores que avaliaram espécies do gênero Cyperus e evidenciaram a supressão de PGE2
em modelo in vitro com macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS. Exemplo disso é
ácido fulgídico, composto isolado dos rizomas de Cyperus rotundus, o qual reduziu de
maneira significativa a produção de PGE2, em células RAW 264.7, pela supressão da
transcrição de COX-2 (SHIN et al., 2015).
Como descrito em material e métodos, a droga padrão utilizada nos ensaios anti-
inflamatórios foi a dexametasona. Esse fármaco glicocorticoide, com atividade anti-
inflamatória bem estabelecida, atua inibindo múltiplas vias sinalizadoras envolvidas na
resposta inflamatória, e apesar de nosso estudo não avaliar o mecanismo de ação do OECA, é
possível que algum composto presente no OECA esteja atuando por uma(s) via(s) que a
dexametasona. Contudo, é necessária a realização de estudos adicionais para a elucidação de
seu mecanismo de ação molecular.
Não encontramos nenhum trabalho sobre a atividade anti-inflamatória do óleo
essencial da Cyperus articulatus L, o que torna este estudo inédito e pioneiro nesse aspecto e
base para futuros estudos dessa espécie que se mostrou uma fonte potencial para o
desenvolvimento de novos agentes anti-inflamatórios.
44
7 CONCLUSÃO
O OECA é constituído majoritariamente por monoterpenos, sesquiterpenos e cetonas
sesquiterpênicas.
Por meio de análise da viabilidade celular em macrófagos da linhagem RAW 264.7,
podemos afirmar que o OECA não demonstra atividade citotóxica em concentrações
inferiores a 1500 µg/mL.
O OECA exerce potente atividade anti-inflamatória e efeitos inibitórios sobre a
produção de importantes mediadores inflamatórios como TNF-α, IL-1β, NO e PGE2 em
macrófagos da linhagem RAW 264.7.
45
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