Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Aula 5: Ferramentas Computacionais e
Técnicas para “Engenheirar” Proteínas
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Ferramentas Computacionais
Protein Data Bank (PDB)
Transcriptase Reversa do HIV-1
Transcriptase Reversa do HIV-1
Visualização de Estruturas
Visualização de Estruturas
Visualização de Estruturas
Visualização de Estruturas
Visualização de Estruturas
Visualização de Estruturas
Estudo de caso 1 – evolução estrutural
da pol γ
Maquinaria de replicação do DNAmt
Cielsielski et al., 2016. Enzymes 39:255-292.
Variabilidade oligomérica da pol γ
Humanos e camundongo = 1 α / 2 β
Drosophila melanogaster = 1 α / 1 β
Saccharomyces cerevisiae = 1 α / 0 β
Buscas por outras pol γs animais
Buscas por outras pol γs animais
Buscas por outras pol γs animais
Buscas por outras pol γs animais Species Common name Phylum Class Order Accession Number
Pol γ-α
Amphimedon queenslandica sponge Porifera Demospongiae Haplosclerida XM_003389221.1
Trichoplax adhaerens placozoan Placozoa Tricoplacia - XM_002116311.1
Nematostella vectensis starlet sea anemone Cnidaria Anthozoa Actiniaria scaffold_62
Hydra magnipapillata fresh water polyp Cnidaria Hydrazoa Hydroida XP_002166917.2
Crassostrea gigas pacific oyster Mollusca Bivalvia Ostreoida EKC38630.1
Caenorhabditis elegans roundworm Nematoda Chromadorea Rhabditida NM_064191.1
Bursaphelenchus xylophilus pine wood nematode Nematoda Chromadorea Tylenchida scaffold01109
Oscheius tipulae hermaphroditic soil
nematode
Nematoda Chromadorea Rhabditida 959 Nematode Genomes
Dirofilaria immitis heartworm Nematoda Chromadorea Spirurida 959 Nematode Genomes
RNA-seq
Loa loa eye worm Nematoda Chromadorea Spirurida XM_003141747
Daphnia pulex water flea Arthropoda Crustacea Diplostraca EFX73911.1
Pediculus humanus corporis human body louse Arthropoda Insecta Phthiraptera XM_002425672.1
Drosophila melanogaster fruitfly Arthropoda Insecta Diptera NM_057473.3
Drosophila sechellia fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002035723.1
Drosophila yakuba fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002088608.1
Drosophila erecta fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001969538.1
Drosophila simulans fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002079353.1
Drosophila persimilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002023169.1
Drosophila pseudoobscura
pseudoobscura
fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001356205.2
Drosophila ananassae fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001962747.1
Drosophila willistoni fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002066715.1
Drosophila grimshawi fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001988310.1
Drosophila virilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002057431.1
Drosophila mojavensis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002004015.1
Aedes aegypti yellow fever mosquito Arthropoda Insecta Diptera XM_001647501.1
Alinhamento de sequências
Alinhamento de sequências
Alinhamento de sequências
Alinhamento de sequências
pol γ-α
Alinhamento de sequências
pol γ-α
Identificação de um novo motivo
Identificação de um novo motivo na
subunidade catalítica
Cadê a subunidade acessória?
Lewis et al. (2015) PLOS Genetics 11: e1004985
Distribuição do domínio de dimerização
na subunidade acessória
Alinhamento + Estrutura
HLH-β3
Distribuição do domínio de dimerização
na subunidade acessória
Modelagem de Estrutura
HLH-β3
Modelagem de Estrutura
HLH-β3
Modelagem de Estrutura
HLH-β3
usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para
predizer a estrutura de uma proteína homóloga
Modelagem por Homologia
usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para
predizer a estrutura de uma proteína homóloga
Modelagem por Homologia
Modelagem por Homologia
https://www.bioscience.org/2004/v9/af/1437/fulltext.php?bframe=figures.htm
Resumo: algumas (poucas) ferramentas
Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.
Buscas por sequências similares – BLAST e suas
variações
Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,
Jmol, etc.
Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,
T-Cofee, etc.
Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,
etc.
Estudo de caso 2 – o sítio ativo da Twinkle
Alinhamento de sequências
Estudos fisiológicos e bioquímicos
Modelagem do sítio ativo
Ziebarth et al., 2010. JBC 285:14639-14647.
Resumo: mesmo tipo de ferramentas
Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.
Buscas por sequências similares – BLAST e suas
variações
Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,
Jmol, etc.
Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,
T-Cofee, etc.
Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,
etc.
Estudo de caso 3 – aqueles que não são, mas se parecem,
e aqueles que se parecem, mas não são...
Similaridade Estrutural
Fribourg S , and Conti E EMBO Rep. 2003;4:699-703
Mex67 e TAP – proteínas homólogas
Mtr2 e p15 – nenhuma similaridade de sequência / análogos funcionais
em leveduras em animais
Similaridade Estrutural
Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64
As primases de bactéria e de bacteriófagos são homólogas, e possuem similaridade
de sequência com o domínio N-terminal da Twinkle mitocondrial de animais
Mas a Twinkle não faz primers durante a replicação do DNAmt animal (no
entanto, ela faz em plantas...)
Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64
Mas como engenheirar a proteína de interesse?
Como testar a relação estrutura-função?
Análise de Estruturas
Análise de Estruturas
Análise de Estruturas
Análise de Estruturas
E se sua proteína favorita não possui
estrutura já determinada?
Conservação de sequências
pol γ-α
Conservação de sequências
pol γ-α
Conservação de sequências
Clonagem em Vetor de Expressão
Clonagem em Vetor de Expressão
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
CDS proteína de interesse
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
CDS proteína de interesse
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
Com o gene da sua proteína clonado em
vetor de expressão…
GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT
CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA
G H E R S R K A D Q S
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
Primer 2: 3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
Template
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR Primer 1
Primer 2
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Mutagênese Sítio-Dirigida
PCR
Mutagênese Sítio-Dirigida
…dentro do tubo de PCR no final.
Mutagênese Sítio-Dirigida
…dentro do tubo de PCR no final.
Mutagênese Sítio-Dirigida
Digestão com DpnI
Mutagênese Sítio-Dirigida
Digestão com DpnI
Mutagênese Sítio-Dirigida
Transformação em E. coli
Inóculo em
meio líquido
Minipreparação do
DNA plasmidial
Mutagênese Sítio-Dirigida
Transformação em E. coli
Mutagênese Sítio-Dirigida
Verificação e Testes
Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas Faça testes de solubilidade e purificação Parta para os experimentos para comparar a proteína mutada com a tipo selvagem (WT)
Mutagênese Sítio-Dirigida
Resumo
Mutagênese Sítio-Dirigida
Resumo
Mutagênese Sítio-Dirigida
Substituições
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC
CG
CG
GC
Codons para Ala:
GCU
GCA
GCG
GCC
Mutagênese Sítio-Dirigida
Deleções e Inserções
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA… G
C G T
C A
Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT3’
3’CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2
…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…
…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…
G
C G T
C A
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