8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5
1/7
1991, 57(8):2240.Appl. Environ. Microbiol.
F H Pri and M H Goldby the white rot fungus Dichomitus squalens.peroxidase expression and lignin degradationManganese regulation of manganese
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2/7
V o l .
5 7 ,
N o . 8
P P L I E D AND ENVIRONMENTAL
M I C R O B I O L O G Y , A u g . 1 9 9 1 ,
p . 2 2 4 0 - 2 2 4 5
0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 1 / 0 8 2 2 4 0 - 0 6 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t
C
1 9 9 1 ,
A m e r i c a n
S o c i e t y
f o r
M i c r o b i o l o g y
M a n g a n e s e
R e g u l a t i o n
o f
M a n g a n e s e
P e r o x i d a s e
E x p r e s s i o n a n d
L i g n i n
D e g r a d a t i o n b y
t h e
W h i t e
R o t
F u n g u s
D i c h o m i t u s
s q u a l e n s
FREDERIC
H .
PERIE AND
MICHAEL H .
GOLD*
D e p a r t m e n t o f
C h e m i c a l and
B i o l o g i c a l S c i e n c e s ,
O r e g o n
Graduate I n s t i t u t e
o f
S c i e n c e and
T e c h n o l o g y ,
1 9 6 0 0
N . W .
vo n
Neumann
D r i v e , B e a v e r t o n ,
O r e g o n
9 7 0 0 6 - 1 9 9 9
R e c e i v e d 4
A p r i l
1 9 9 1 / A c c e p t e d 3 J u n e 1 9 9 1
E x t r a c e l l u l a r
ma ng a n es e
p e r o x i d a s e
and l a c c a s e a c t i v i t i e s
w e r e
d e t e c t e d i n c u l t u r e s
o f
D i c h o m i t u s
s q u a l e n s
( P o l y p o r u s
a n c e p s )
u n d e r c o n d i t i o n s
f a v o r i n g l i g n i n
d e g r a d a t i o n .
I n
c o n t r a s t ,
n e i t h e r e x t r a c e l l u l a r
l i g n i n
p e r o x i d a s e
n or
a r y l
a l c o h o l o x i d as e
a c t i v i t y
was d e t e c t e d i n c u l t u r e s
grown
under a wide
v a r i e t y
o f
c o n d i t i o n s .
T h e m i n e r a l i z a t i o n
o f
' 4 C - r i n g - ,
- s i d e
c h a i n - ,
and
- m e t h o x y - l a b e l e d s y n t h e t i c
g u a i a c y l
l i g n i n s b y
D.
s q u a l e n s
a n d
t h e
e x p r e s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r
m angan es e
p e r o x i d a s e
we r e
d e p e n d e n t
on
t h e
p r e s e n c e
o f
M n ( I I ) ,
s u g g e s t i n g
t h a t
m a n g a n e s e p e r o x i d a s e
i s a n
i m p o r t a n t c o m p o n e n t
o f t h i s
o r g a n i s m ' s
l i g n i n
d e g r a d a t i o n s y s t e m .
The
e x p r e s s i o n
o f
l a c c a s e
a c t i v i t y
wa s
i n d e p e n d e n t
o f
manganese.
I n c o n t r a s t
t o
p r e v i o u s
f i n d i n g s
w i t h
P h a n e r o -
c h a e t e
c h r y s o s p o r i u m ,
l i g n i n d e g r a d a t i o n
b y
D .
s q u a l e n s
p r o c e e d e d
i n
t h e
c u l t u r e s
c o n t a i n i n g
excess carbon
a n d
n i t r o g e n .
L i g n i n
i s
a c o m p l e x ,
h e t e r o g e n e o u s ,
a n d
r a n d o m
p h e n y l -
p r o p a n o i d p o l y m e r
t h a t c o n s t i t u t e s
2 0
t o
30
o f
w o o d y
p l a n t s
9 ,
3 6 ) . W h i t e r o t
b a s i d i o m y c e t o u s f u n g i a r e
p r i m a r i l y
r e s p o n s i b l e
f o r t h e i n i t i a t i o n
o f l i g n i n
d e c o m p o s i t i o n i n wood
( 7 , 1 8 , 2 6 ) .
Wh e n c u l t u r e d
u n d e r
l i g n i n o l y t i c
c o n d i t i o n s ,
P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ,
t h e b e s t - s t u d i e d w h i t e r o t
b a s i d i o m y c e t e ,
p r o d u c e s t w o
e x t r a c e l l u l a r
h e m e p e r o x i -
d a s e s - m a n g a n e s e
p e r o x i d a s e ( M n P ) a n d
l i g n i n p e r o x i d a s e
( L i P ) - w h i c h , a l o n g
w i t h a n
H 2 0 2 - g e n e r a t i n g
s y s t e m , c o n -
s t i t u t e t h e
m a j o r
c o m p o n e n t s o f i t s
l i g n i n - d e g r a d i n g s y s t e m
( 1 8 , 2 4 ,
2 6 ,
2 8 ) .
O t h e r
w h i t e
r o t
f u n g i
a p p a r e n t l y
s e c r e t e
u n i q u e
c o m b i n a t i o n s
o f p e r o x i d a s e s
a n d
o x i d a s e s .
C o r i o l u s
v e r s i c o l o r a n d
P h l e b i a
r a d i a t a
e a c h
p r o d u c e o n e o r
m o r e
l a c c a s e s i n
a d d i t i o n
t o
L i P a n d M n P ( 1 0 , 1 1 ,
2 3 , 3 1 ,
3 2 ) .
P l e u r o t u s
s a j o r - c a j u
s e c r e t e s
a n
a r y l
a l c o h o l
o x i d a s e
( 5 ) ,
a
l a c c a s e , a n d
s e v e r a l
p e r o x i d a s e s
( 1 3 ) .
B j e r k e nd e r a a du s t a
s e c r e t e s
a n
a r y l
a l c o h o l o x i d a s e
( 2 9 ) ,
a n d
R i g i d o p o r u s
l i g n o -
s u s
a p p a r e n t l y s e c r e t e s
a l a c c a s e
a n d a
M n P
( 1 4 ) .
P r e v i o u s
r e p o r t s d e m o n s t r a t e d t h a t
D i c h o m i t u s
s q u a l e n s
( P o l y p o r u s
a n c e p s ) , u n d e r
v a r i o u s
c o n d i t i o n s ,
e f f i c i e n t l y
d e g r a d e s
n a t u r a l
l i g n i n f r o m
b i r c h
( 2 ) , a s p e n ( 3 0 ) ,
a n d
s p r u c e
wood
( 8 ) a n d
f r o m w h e a t ,
b a r l e y , a n d
g r a p e s t r aw ( 4 3 ) .
To
b r o a d e n
o u r
u n de r s t a n d i ng o f
t h e l i g n i n o l y t i c
e n z y m e s e l a b -
o r a t e d
b y
v a r i o u s
w h i t e
r o t
f u n g i ,
we
h a v e u n d e r t a k e n
t h e
t a s k o f
i d e n t i f y i n g
a n d
c h a r a c t e r i z i n g t h e
e x t r a c e l l u l a r o x i -
d a t i v e
e n z y m e s
o f
D .
s q u a l e n s a n d t h e i r r e g u l a t i o n .
I n t h i s
r e p o r t ,
we e x a m i n e
t h e a b i l i t y o f D .
s q u a l e n s t o d e g r a d e
s y n t h e t i c
l i g n i n s u n d e r
v a r i o u s c o n d i t i o n s .
I n a d d i t i o n ,
we
d e m o n s t r a t e
t h a t
u n d e r l i g n i n o l y t i c
c o n d i t i o n s
t h i s
o r g a n i s m
e x p r e s s e s a l a cc as e
( 3 4 )
a n d
a
M n P
a n d
t h a t
t h e
e x p r e s s i o n
o f M n P
i s
r e g u l a t e d b y Mn.
I n
c o n t r a s t ,
n e i t h e r
e x t r a c e l l u l a r
L i P
n o r
v e r a t r y l a l c o h o l
o x i d a s e a c t i v i t y w a s
d e t e c t e d
i n
c u l t u r e s
g r o w n u n d e r
a w i d e
v a r i e t y o f c o n d i t i o n s .
MATERIALS A N D
METHODS
O r g a n i s m .
D i c h o m i t u s
s q u a l e n s ( K a r s t ) R e i d
( P o l y p o r u s
a n c e p s P e ck ) ( C B S
4 3 2 . 3 4 )
w a s o b t a i n e d f r o m F .
Z a d r a z i l
a n d
m a i n t a i n e d
o n
p o t a t o
d e x t r o s e - y e a s t e x t r a c t
a g a r s l a n t s .
*
C o r r e s p o n d i n g
a u t h o r .
M y c e l i a l c l a m p
c o n n e c t i o n s w e r e
r e a d i l y
o b s e r v e d ,
i n d i c a t -
i n g
t h a t t h e i s o l a t e
w a s m a i n t a i n e d i n
t h e d i k ar y o t i c s t a t e
( 1 2 ,
3 5 ) .
C u l t u r e c o n d i t i o n s .
The
o r g a n i s m was
g r o w n
a t
2 8 C i n
2 5 0 - m l
E r l e n m e y e r
f l a s k s
i n e i t h e r
1 0 0 - m l
s h a k i n g c u l t u r e s
( 1 5 0 r p m , 2 . 5 - c m
r a d i u s ) o r 2 0 - m l
s t a t i o n a r y c u l t u r e s ,
a s
i n d i c a t e d .
C u l t u r e s
w e r e
i n c u b a t e d u n d e r a i r f o r
6
d a y s ,
a f t e r
w h i c h
t i m e t h e y
w e r e p u r g e d e v e r y
t h r e e d a y s w i t h
100
o x y g e n . A
v a r i e t y o f
g r o w t h m e d i a w e r e
u s e d
i n o u r
a t -
t e m p t s
t o i d e n t i f y t h e e x t r a c e l l u l a r
p e r o x i d a s e s a n d
o x i d a s e s
p r o d u c e d
b y
D .
s q u a l e n s . T h e o r g a n i s m
w a s
r o u t i n e l y
g r o w n
i n
s h a k i n g
c u l t u r e s
i n h i g h - c a r b o n ,
l o w - n i t r o g e n
(HCLN)
medium
( 2 g l u c o s e , 1 . 2
mM
ammonium
t a r t r a t e )
c o n t a i n -
i n g 3 F i M
m a n g a n e s e a s
p r e v i o u s l y d e s c r i b e d
( 2 7 )
o r
i n
a
s y n t h e t i c
medium
c o n t a i n i n g t h e
f o l l o w i n g
c o m p o n e n t s
( p e r
l i t e r ) : 2 0
g
o f g l u c o s e ,
2 . 5
g o f L - a s p a r a g i n e ,
0 . 1 5
g
o f L -
p h e n y l a l a n i n e ,
0 . 0 3
g
o f
a d e n i n e , 0 . 1 mg
o f
t h i a m i n e ,
1
g o f
KH2PO4, 0 . 1
g o f N a 2 P O 4 , 0 . 5
g o f MgSO4
7 H 2 0 , 1 0
mg
o f
FeSO4
7 H 2 0 , 5 mg
o f
CuSO4
5 H 2 0 , a n d
1 6
mg
o f
MnSO4 H 2 0 ,
a s w e l l a s 0 . 0 1
Tween 8 0 .
I n s p e c i f i c
e x p e r i m e n t s ,
t h e f i n a l Mn
c o n c e n t r a t i o n i n t h e
m e d i a
d e s c r i b e d
a b o v e was
a d j u s t e d
t o 0 ,
1 , 2 , 5 , 1 0 , a n d
1 0 0
, u M . I n
a d d i t i o n , v e r a t r y l
a l c o h o l ( 6 mM),
b e n z y l
a l c o h o l ( 6
mM), o r
g u a i a c y l
l i g n i n
d e h y d r o p o l y m e r i z a t e
( D H P ) ( 2
m g )
w a s a d d e d t o
t h e m e d i a d e s c r i b e d
a b o v e
c o n t a i n i n g 1 0 , u M
M n ,
a s
a
p o t e n t i a l
i n d u c e r
o f
L i P
( 2 5 ) .
A d d i t i o n a l m e d i a w e r e
u s e d i n
s t a t i o n a r y c u l t u r e s
i n
a t t e m p t s
t o d e t e c t L i P
a c t i v i t y .
S e v e r a l d i f f e r e n t
i n o r g a n i c
s a l t a n d
v i t a m i n
r e c i p e s ( 1 0 ,
2 1 , 2 7 )
w e r e
u s e d
i n
c o n j u n c t i o n
w i t h t h e
f o l l o w i n g m e d i a :
HCLN, 2 g l u c o s e a n d 1 . 2
mM
ammonium
t a r t r a t e ;
h i g h c a r b o n ,
h i g h n i t r o g e n
(HCHN), 2
g l u c o s e a n d 1 2
mM
ammonium t a r t r a t e ;
l o w
c a r b o n ,
h i g h
n i t r o g e n
( L C H N ) , 0 . 2
g l u c o s e a n d
1 2 mM
ammonium
t a r t r a t e ;
l o w
c a r b o n ,
l o w n i t r o g e n
( L C L N ) , 0 . 2
g l u c o s e
a n d
1 . 2 mM
ammonium
t a r t r a t e .
L i g n o c e l l u l o s e - c o n t a i n i n g m e d i a . T h e
o r g a n i s m
w a s
c u l -
t u r e d u n d e r
s t a t i o n a r y
c o n d i t i o n s o n
b i r c h
o r s p r u ce s a w d u s t
o r o n
g r o u n d
w h e a t
s t r a w
s a t u r a t e d w i t h
w a t e r . T h i s medium
was
n o t
s u p p l e m e n t e d
w i t h a n y
a d d i t i o n a l
n u t r i e n t s .
Two
s e t s
o f
s t a t i o n a r y
c u l t u r e s
w e r e
p r e p a r e d
w i t h
e a c h medium
(HCLN, HCHN, LCHN,
a n d
LCLN,
c o n t a i n i n g t h e
d e -
2 2 4 0
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5
3/7
MANGANESE
PEROXIDASE O F
DICHOMITUS
SQUALENS 2 2 4 1
s c r i b e d s a l t s [ 2 7 ] ) a s w e l l a s w i t h t h e b i r c h s a w d u s t m e d i u m .
T h e
f i r s t
s e t was a s d e s c r i b e d
h e r e; t h e
s e c o n d s e t c o n t a i n e d
v e r a t r y l a l c o h o l ( 6
m M ) .
Enzyme
a s s a y s .
U n l e s s
o t h e r w i s e
i n d i c a t e d ,
e n z y m e
a s -
s a y s
w e r e c o n d u c t e d
i n
1 - m l r e a c t i o n m i x t u r e s a t 3 0 C b y
u s i n g t h e e x t r a c e l l u l a r medium o f f u n g a l c u l t ur es a s a n
enzyme s o u r c e .
L a c c a s e
a c t i v i t y
w a s m e a s u r e d b y
m o n i t o r i n g
t h e
o x i d a -
t i o n
o f 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l
a t
A 4 6 9 .
R ea c t i o n m i x t u r e s
c o n t a i n e d
2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l ( 0 . 2
mM )
a n d enzyme i n 2 0
mM s u c c i n a t e b u f f e r ( p H 3 . 0 ) .
M n P a c t i v i t y
w a s m e a s u r e d b y
m o n i t o r i n g t h e
f o r m a t i o n
o f
a
M n ( I I I ) - m a l o n a t e
c o m p l e x a t A 2 7 0 ( 4 1 ) . R e a c t i o n m i x -
t u r e s c o n t a i n e d
MnSO4
( 0 . 2 mM), H202
( 0 . 1
mM), a n d
enzyme i n 5 0 mM s o d i u m m a l o n a t e ( p H 4 . 5 ) .
C e l l
e n v e l o p e - b o u n d M n P
w a s
a s s a y e d
b y
m o n i t o r i n g
t h e
o x i d a t i o n
o f 2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l a t A 4 6 9 .
R e a c t i o n
m i x t u r e s
c o nt a i ne d 2 , 6 - di m e t h o x y p h e no l ( 0 . 2
mM),
H202 ( 0 . 1 m M ) ,
MnSO4
( 0 . 2 m M ) ,
a n d c e l l
e n v e l o p e enzyme f r a c t i o n ( 1 0 m g )
i n
5 0
mM s o d i u m
m a l o n a t e ( p H
4 . 5 ) . T h e
r e a c t i o n w a s
i n c u b a t e d
f o r
1 h a t 2 8 C , a f t e r w h i c h t i m e t h e c e l l
d e b r i s
w a s
r e m o v e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n
a t 3 , 0 0 0
x
g a n d t h e A 4 6 9 o f t h e
s u p e r n a t a n t
was
m e a s u r e d .
I n t a c t - c e l l - b o u n d M n P was
m e a su r e d b y s u s p e n d i n g
a
m y c e l i a l p e l l e t i n a
r e a c t i o n m i x t u r e
c o n t a i n i n g 2 , 6 -
d i m e t h o x y p h e n o l ( 0 . 2 m M ) ,
H 2 0 2
( 0 . 1
mM),
a n d MnSO4
( 0 . 2
mM)
i n
5 0 mM s o d i u m
m a l o n a t e
( p H 4 . 5 ) . T h e r e a c t i o n w a s
i n c u b a t e d
f o r 1 5 m i n ,
a f t e r w h i c h
t i m e
t h e
m y c e l i u m
w a s
r e m o v e d
b y
f i l t r a t i o n a n d t h e
A 4 6 9
o f t h e f i l t r a t e w a s m e a -
s u r e d .
L i P
a c t i v i t y
was m e a s u r e d
b y m o n i t o r i n g t h e o x i d a t i o n
o f
v e r a t r y l a l c o h o l a t A 3 1 0 ( 1 8 , 2 6 ) . E x t r a c e l l u l a r L i P a c t i v i t y
was
a l s o
m e a s u r e d b y
m o n i t o r i n g
t h e o x i d a t i o n o f
a
d i a r y l -
p r o p a n e a t A 3 1 0
a s p r e v i o us l y d es cr i b e d
( 2 8 ) .
R e a c t i o n
m i x t u r e s
c o n t a i n e d v e r a t r y l
a l c o h o l
( 2 . 5 m M ) , H 2 0 2 ( 0 . 1
m M ) , a n d enzyme i n 2 0
mM
s o d i u m
s u c c i n a t e b u f f e r ( p H
3 . 0 ) .
A r y l a l c o h o l o x i d a s e a c t i v i t y
w a s
m e a s u r e d b y m o n i t o r i n g
t h e
o x i d a t i o n o f v e r a t r y l o r a n i s y l a l c o h o l a t A 3 1 0 o r
A 2 9 0 ,
r e s p e c t i v e l y ,
a s
p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 5 , 2 9 ) . R ea c t i o n m i x -
t u r e s c o n t a i n e d
v e r a t r y l o r
a n i s y l
a l c o h o l
( 2 . 5 mM) i n
2 0
mM
s o d i u m
s u c c i n a t e
( p H 3 t o
5 . 5 )
o r
i n
2 0 mM s o d i u m p h o s -
p h a t e
( p H 6
t o 7 ) .
C e l l
e n v e l o p e e n z y m e p r e p a r a t i o n .
C u l t u r e s
w e r e f i l t e r e d
t h r o u g h M i r a c l o t h a n d t h e c e l l s w e r e
w a s h e d
w i t h
i c e - c o l d
0 . 0 5
N a C l . T h e
c e l l s
( 0 . 5 g )
w e r e
f r o z e n
i n
l i q u i d n i t r o g e n
a n d
g r o u n d
w i t h
s a n d
i n
a m o r t a r
a n d
p e s t l e . O n e
m i l l i l i t e r
o f
1 0
mM
s o d i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g g l y c e r o l ( 1 0 )
a n d
p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l
f l u o r i d e
( 0 . 5 mM) ( b u f f e r A )
was
a d d e d ,
a n d
t h e e x t r a c t
was s t i r r e d
f o r
5
m i n
a t
4 C . A f t e r t h e
s a n d
wa s
r e m o v e d
b y s e d i m e n t a t i o n ,
t h e
e x t r a c t
wa s
c e n t r i -
f u g e d
a t
3 , 0 0 0
x
g
f o r
1 0
m i n ; t h e
p e l l e t
was w a s h e d
i n b u f f e r
A
a n d
r e c e n t r i f u g e d
a t
3 , 0 0 0
x
g .
F i n a l l y t h e
p e l l e t
was
s u s p e n d e d
i n
5 0
mM s o d i u m
m a l o n a t e
( p H
4 . 5 ) .
M i c r o s c o p i c
e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d
t h a t
t h e c e l l s
w e r e
u n i f o r m l y
b r o k e n .
' 4 C - D H P
d e g r a d a t i o n .
2 - 1 4 C - s i d e
c h a i n - ,
1 4 C - m e t h o x y - ,
a n d
U - 1 4 C - r i n g - l a b e l e d
g u a i a c y l
DHPs w e r e
p r e p a r e d
f r o m
l a b e l e d
c o n i f e r y l a l c o h o l
p r e c u r s o r s
a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 1 7 ) .
T h e
s p e c i f i c
a c t i v i t y
o f
e a c h s u b s t r a t e
wa s
a d j u s t e d
t o
3
x
1 0 5
cpm/mg w i t h u n l a b e l e d g u a i a c y l
DHP.
R a d i o l a b e l e d
s u b s t r a t e s
( 5 0 , 0 0 0 cp m
p e r
f l a s k
i n
2 5
, u l
o f
d i m e t h y l f o r m -
a m i d e )
w e r e
a d d e d t o
e a c h
a g i t a t e d
c u l t u r e
on
t h e
t h i r d
d a y
o f
g r o w t h .
E v o l v e d
1 4 C O 2
wa s
m e a s u r e d
e v e r y
t h r e e
d a y s
a s
d e s c r i b e d
p r e v i o u s l y
( 1 7 ,
2 7 ) .
Ammonium
i o n ,
a m i n o
a c i d ,
a n d
g l u c o s e
d e t e r m i n a t i o n s .
P r i o r t o
a n a l y s i s , s a m p l e s
o f t h e e x t r a c e l l u l a r
f l u i d were
a
1
i
E
c
c
1 . 0
05
_:
E
EE
0
L
b
1 5
1 -
0
c
. 2
o
_ ._
_ .
0
0
SC
CC
3 0 0
-
E
c 2 0 0
.
u
1 0 0
3 0 0
E
-
-
2 00
V
_ 1
u
1 00
a
_
o
_
_ w
0
D a y s
F I G .
1 .
M i n e r a l i z a t i o n o f ' 4 C - l a b e l e d
DHPs
b y
D .
s q u a l e n s . ( a )
Time
course
f o r t h e e v o l ut i o n o f
1 4 C O 2
f r o m
m e t h o x y - ( A ) ,
s i d e
c h a i n -
( O ) , a n d
r i n g - l a b e l e d
( A ) DHP
i n
HCLN
c u l t u r e s .
The
t i m e
d e p e n d e n c e
o f
m y c e l i u m d r y
w ei g h t ( 0 )
a n d
n i t r o g en d e p l et i o n ( 0 )
i s
a l s o
s h o w n .
( b )
Time
course
f o r t h e
e v o l u t i o n o f
1 ' 4 C O 2
f r o m
m e t h o x y -
( A ) ,
s i d e
c h a i n -
( O ) ,
a n d
r i n g - l a b e l e d ( A )
DHP
i n A s n - P h e
c u l t u r e s . Th e t i m e
d e p e n d e n c e
o f
m y c e l i u m
d r y w ei g h t
( 0 ) ,
Asn
( V ) , a n d P h e ( 0 ) c o n c e n t r a t i o n s i s a l s o s h o w n . S h a k i n g
c u l t u r e s
were p u r g e d p e r i o d i c a l l y w i t h
100
02, a n d
e v o l v e d ' 4 C O 2
was
m e a s u r e d as d e s c r i b e d i n t h e t e x t .
u l t r a f i l t e r e d
t h r o u g h
a n Amicon D i a f l o
YCO5
membrane
( 5 0 0 - m o l e c u l a r - w e i g h t
c u t o f f ) .
The
c o n c e n t r a t i o n o f
ammo-
n i u m i o n
i n
HCLN
c u l t u r e s
was
m o n i t o r e d
b y
t h e
i n d o p h e -
n o l b l u e
m e t h o d ( 2 0 ) .
The t o t a l c o n ce n t r a t i o n o f
amino a c i d s
i n
t h e
medi um o f
A s n - P h e
c u l t u r e s
was
m o n i t o r e d
b y
t h e
n i n h y d r i n m e t h o d ( 4 2 ) .
The
i n d i v i d u a l
c o n c e n t r a t i o n s
o f Asn
a n d
P h e
were
m e a s u r e d
b y
h i g h - p e r f o r m a n c e
l i q u i d
c h r o m a -
t o g r a p h y
on
a
C 8
r e v e r s e - p h a s e
column
(Beckmann
U l t r a -
s p h e r e ,
5
p . m ) a f t e r
d e r i v a t i z a t i o n
w i t h
o - p h t h a l a l d e h y d e
( 3 )
b y
u s i n g
i s o c r a t i c
e l u t i o n w i t h
m e t h a n o l - w a t e r
( 7 : 3 ) .
F r e e
g l u c o s e
i n
t h e
e x t r a c e l l u l a r f l u i d
was d e t e r m i n e d
b y
t h e
p h e n o l - s u l f u r i c
a c i d method
( 1 ) .
RESULTS
A
t i m e course
f o r DHP
d e g r a d a t i o n
i n HCLN
s h a k i n g
c u l t u r e s
o f D .
s q u a l e n s
i s
shown
i n
F i g .
l a . Under t h e s e
c o n d i t i o n s ,
D.
s q u a l e n s
m i n e r a l i z e d
40
t o 5 0
o f
e a c h
s u b s t r a t e .
Th e
r e s i d u a l
ammoni um
c o n c e n t r a t i o n and
t h e
g r o w t h
c u r v e
f o r
t h e
o r g a n i s m
under
t h e s e c o n d i t i o n s are
a l s o shown
i n
F i g .
l a .
Th e
d r y
w e i g h t
o f t h e
m y c e l i u m
i n
t h e
-w
0~
D a y s
V O L .
5 7 ,
1 9 9 1
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5
4/7
2 2 4 2 P t R I E AND GOLD
c u l t u r e i n c r e a s e d u n t i l
d a y
2 0 ,
a f t e r
w h i c h
t i m e i t d e c r e a s e d
s i g n i f i c a n t l y ,
p r o b a b l y
a s
a
r e s u l t
o f
a u t o l y s i s .
T h e f r e e
ammonium c o n c e n t r a t i o n
i n
HCLN c u l t u r e s d e c r e a s e d
r a p -
i d l y
o v e r
t h e f i r s t
7
d a y s
a n d
wa s
n o t
d e t e c t a b l e a f t e r
d a y 1 0 .
A t i m e c o u r s e f o r
DHP
d e g r a d a t i o n
i n
A s n - P h e
c u l t u r e s i s
s h o w n i n
F i g .
l b .
C o m p a r i s o n
o f
t h e r e s u l t s
f r o m
t h e
t w o
c u l t u r e
c o n d i t i o n s d e m o n s t r a t e s t h a t
D .
s q u a l e n s
wa s
a b l e t o
d e g r a d e
DHP
i n
e i t h e r
medium
b u t
t h a t
r i n g -
a n d
s i d e
c h a i n - l a b e l e d
DHPs
were
d e g r a d e d
more
e x t e n s i v e l y
i n
HCLN m e d i u m . I n
c o n t r a s t ,
t h e
A s n - P h e
m e d i u m
s u p p o r t e d
a
c o n s i d e r a b l y
f a s t e r r a t e
a n d e x t e n t
o f
g r o w t h .
T h e
m a x i -
mum
m y c e l i u m
d r y w e i g h t
a c h i e v e d
i n
A s n - P h e m e d i u m was
a p p r o x i m a t e l y
1 5 0 o f
t h a t
i n
HCLN
m e d i u m .
D .
s q u a l e n s
a l s o
d e g r a d e d
s i d e
c h a i n - l a b e l e d
DHP
i n
HCHN
c u l t u r e s
( d a t a
n o t
s h o w n ) .
T h e
e x t e n t o f
s i d e
c h a i n - l a b e l e d
DHP
d e g r a d a t i o n
i n HCHN c u l t u r e s
was 3 3
a n d
50
o f t h a t
a c h i e v e d i n HCLN
a n d A s n - P h e
c u l t u r e s ,
r e s p e c t i v e l y .
A
t i m e
c o u r s e
( d a y
3
t h r o u g h
d a y
3 0 )
f o r
e x t r a c e l l u l a r
M n P
a n d
l a c c a s e
e n z y m a t i c a c t i v i t y
i n HCLN
s h a k i n g
c u l t u r e s
c o n t a i n i n g
3
, u M
Mn i s
s h o w n i n
F i g .
2 a . C u l t u r e s
g r o w n
i n
t h e
a b s e n c e
o f
M n
h a d no d e t e c t a b l e M n P
a c t i v i t y t h r o u g h -
o u t t h e
c o u r s e o f t h e
e x p e r i m e n t ,
w h e r e a s
i n
c u l t u r e s
c o n t a i n i n g
M n ,
s o l u b l e e x t r a c e l l u l a r
M n P
a c t i v i t y
wa s
f i r s t
d e t e c t a b l e on
d a y 5 ,
r e a c h e d
a
maximum o n
d a y
1 8 ,
a n d
p e r s i s t e d
t h r o u g h o u t
t h e c o u r s e
o f t h e
e x p e r i m e n t .
I n
c o n -
t r a s t ,
e x t r a c e l l u l a r l a c c a s e
a c t i v i t y
a p p e a r e d
o n
d a y
3
a n d
r e a c h e d a
maximum o n
d a y 9 ,
a f t e r w h i c h t i m e
i t
s l o w l y
d e c l i n e d .
F u r t h e r m o r e ,
t h e
e x p r e s s i o n
o f l a c c a s e
a c t i v i t y
wa s
n o t
d e p e n d e n t
o n t h e
p r e s e n c e
o f Mn.
B e c a u s e
s o l u b l e
e x t r a c e l l u l a r
M n P
a c t i v i t y
wa s f i r s t d e t e c t a b l e
o n l y
a f t e r
5
d a y s
o f
g r o w t h
i n
HCLN
c u l t u r e s ,
c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
M n P
a c t i v i t y
was a l s o
a s s a y e d .
A s s h o w n
i n
F i g . 3 a ,
c e l l
e n v e -
l o p e - b o u n d
M n P
a c t i v i t y
was d e t e c t a b l e
on
d a y
3
a n d
i n c r e a s e d
s i g n i f i c a n t l y b e y o n d d a y
1 0 .
T h e
a p p e a r a n c e
o f
t h i s
c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
a c t i v i t y
a l s o wa s
c o m p l e t e l y
d e p e n -
d e n t
o n t h e
p r e s e n c e
o f Mn i n t h e
m e d i u m
( d a t a
n o t
s h o w n ) .
T h e
a p p e a r a n c e
o f
c e l l
e n v e l o p e - b o u n d a c t i v i t y
c o r r e l a t e d
w e l l w i t h t h e M n P
a c t i v i t y
m e a s u r e d
i n t h e
i n t a c t - c e l l
a s s a y .
A
t i m e
c o u r s e
f o r e x t r a c e l l u l a r
M n P a n d l a c c a s e
a c t i v i t y
i n
A s n - P h e
c u l t u r e s
g r o w n
i n
t h e
p r e s e n c e
o r a b s e n c e o f
5 0
, M
Mn
i s
s h o w n
i n
F i g .
2 b .
A g a i n ,
c u l t u r e s
g r o w n
i n
t h e a b s e n c e
o f
M n
e x h i b i t e d no d e t e c t a b l e
e x t r a c e l l u l a r
M n P
a c t i v i t y
t h r o u g h o u t
t h e
c o u r s e o f
t h e
e x p e r i m e n t .
I n
c o n t r a s t ,
i n
c u l t u r e s
g r o w n
i n
t h e
p r e s e n c e
o f
M n ,
e x t r a c e l l u l a r
M n P
a c t i v i t y
wa s
f i r s t d e t e c t a b l e
o n
d a y
3 a n d r e a c h e d a f i r s t
maximum a t
d a y
1 2 . A f t e r a b r i e f
d e c l i n e ,
M n P
a c t i v i t y
t h e n
i n c r e a s e d
s t e a d i l y
u n t i l
a p p r o x i m a t e l y d a y 2 4 ,
a f t e r
w h i c h
t i m e
i t r e m a i n e d
c o n s t a n t
t h r o u g h
d a y
3 0 .
A g a i n ,
t h e
e x p r e s -
s i o n o f l a c c a s e
a c t i v i t y
wa s
n o t
d e p e n d e n t
o n
t h e
p r e s e n c e
o f
Mn
i n
A s n - P h e
c u l t u r e s .
N o n - M n - d e p e n d e n t
l a c c a s e
a c t i v i t y
r e a c h e d a maximum
o n
a p p r o x i m a t e l y d a y
1 0
a n d
t h e n
s l o w l y
d e c l i n e d . T h e
l e v e l o f
l a c c a s e
a c t i v i t y
a t t a i n e d
i n
A s n - P h e
c u l t u r e s
( F i g . 2 b )
wa s
c o n s i s t e n t l y
a t l e a s t f i v e - t o
s i x f o l d
g r e a t e r
t h a n
t h a t
a t t a i n e d
i n
HCLN
c u l t u r e s ( F i g .
2 a ) .
I n
c o n t r a s t
t o
t h e r e s u l t s
d e s c r i b e d
a b o v e ,
n e i t h e r L i P n o r
a r y l
a l c o h o l
o x i d a s e
a c t i v i t y
wa s d e t e c t e d
i n
t h e
e x t r a c e l l u -
l a r
m e d i u m
o f HCLN
o r
A s n - P h e
s h a k i n g o r s t a t i o n a r y
c u l t u r e s i n c u b a t e d
i n t h e
p r e s e n c e
o f
0 ,
1 ,
2 , 5 , 1 0 ,
o r
1 0 0
, u M
M n S O 4 .
F u r t h e r m o r e ,
n e i t h e r
e x t r a c e l l u l a r L i P
n o r
a r y l
a l c o h o l o x i d a s e
a c t i v i t y
was
d e t e c t e d i n
s h a k i n g
o r s t a t i o n -
a r y
c u l t u r e s
c o n t a i n i n g HCHN, LCHN, LCLN,
o r
t h e
l i g n o c e l l u l o s e
m e d i u m w i t h
a n y
o f
t h e
p u t a t i v e i n d u c e r s
d e s c r i b e d
i n
M a t e r i a l s
a n d
M e t h o d s .
T h e
e f f e c t
o f t h e
p r e s e n c e
o f
M n
o n t h e
d e g r a d a t i o n
o f
1 4 C - l a b e l e d
DHP
i s
s h o w n i n
F i g .
3 . A
t i m e c o u r s e f o r
t h e
d e g r a d a t i o n
o f
1 4 C - r i n g - ,
- s i d e
c h a i n - ,
a n d
- m e t h o x y - l a b e l e d
a
'O
0 . 8
4
'h i
W
o
a,
0 . 6
: 2 E
x
0
o
.
a .
e
e
4
0 . 4
c
0
0 . 2
U
0
b
E
4
._
I
E
4
V
i
D a y s
D o
y s
F I G . 2 .
E f f e c t
o f
Mn
o n
t h e
e x p r e s s i o n
o f e x t r a c e l l u l a r
M n P a n d
l a c c a s e
a c t i v i t y .
S o l u b l e
M n P
a c t i v i t y
f r o m
c u l t u r e s
g r o w n
i n t h e
p r e s e n c e
( 0 )
a n d
a b s e n c e
( 0 )
o f
M n ,
s o l u b l e
l a c c a s e a c t i v i t y
f r o m
c u l t u r e s
g r o w n
i n t h e
p r e s e n c e
( U )
a n d
a b s e n c e
( O )
o f
M n ,
a n d c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
M n P
a c t i v i t y
f r o m
c u l t u r e s
g r o w n
i n
t h e
p r e s e n c e
( A )
o f
M n
w e r e
d e t e r m i n e d a s
d e s c r i b e d
i n t h e t e x t .
S h a k i n g
c u l t u r e s
w e r e
g r o w n
i n HCLN
( a )
a n d
A s n - P h e
( b )
m e d i a .
DHP i n
HCLN
c u l t u r e s
c o n t a i n i n g
3
, u M
Mn i s s h o w n
i n
F i g .
3 a . A l l t h r e e
l a b e l e d
DHPs w e r e
d e g r a d e d
e x t e n s i v e l y
o v e r
t h e
3 0
d a y s
o f
t h e
e x p e r i m e n t
i n
M n - c o n t a i n i n g
c u l t u r e s .
T h e
su m o f t h e
1 4 C O 2
e v o l v e d a f t e r 3 0
d a y s
was
b e t w e e n
4 0 a n d
50 o f t h a t i n t r o d u c e d
f o r e a c h o f
t h e s u b s t r a t e s .
I n
c o n -
t r a s t ,
i n
c u l t u r e s
g r o w n
i n t h e a b s e n c e
o f
M n ,
a l l
t h r e e
l a b e l e d
DHPs w e r e
d e g r a d e d
v e r y s l o w l y ,
w i t h
l e s s
t h a n
10 o f t h e l ab e l ed DHPs
b e i n g
m i n e r a l i z e d
d u r i n g
t h e
3 0 - d a y
e x p e r i m e n t .
A
t i m e
c o u r s e f o r
t h e e v o l u t i o n o f
1 4 C O 2 f r o m
l a b e l e d
DHPs
i n
A s n - P h e
c u l t u r e s i s
s h o w n i n
F i g .
3 b . I n
A s n - P h e
m e d i u m ,
t h e
d e g r a d a t i o n
o f b o t h
1 4 C - r i n g -
a n d - s i d e c h a i n -
l a b e l e d
DHP
a l s o
was
d e p e n d e n t o n
t h e
p r e s e n c e o f Mn
i n
t h e m e d i u m .
F o r
t h e s e t w o DHPs, t h e e x t e n t
o f
1 4 C O 2
e v o l v e d i n
t h e
a b s e n c e
o f Mn
was
l e s s
t h a n
15
o f t h a t
e v o l v e d
i n t h e
p r e s e n c e
o f Mn.
I n
c o n t r a s t , s i g n i f i c a n t
a m o u n t s
o f
1 4 C O 2
w e r e
e v o l v e d i n
A s n - P h e
c u l t u r e s
i n c u -
b a t e d
w i t h
1 4 C - m e t h o x y - l a b e l e d
DHP
i n t h e a b s e n c e
o f
Mn.
A f t e r
3 0
d a y s ,
c u l t u r e s
i n c u b a t e d
w i t h
1 4 C - m e t h o x y - l a b e l e d
DHP
i n
t h e
a b s e n c e
o f Mn e v o l v e d
a p p r o x i m a t e l y
70
a s
much
C O 2
a s
t h a t e v o l v e d i n
t h e
p r e s e n c e o f
Mn.
A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5
5/7
MANGANESE
PEROXIDASE
OF
DICHOMITUS
SQUALENS
2 2 4 3
U6
5
2
I.
o
G
0
1 - 0
w
U
10
2 0
Days
3 0
Days
F I G .
3 .
E f f e c t
o f
Mn
on
t h e m i n e r a l i z a t i o n
o f 1 4 C - l a b el e d
DHPs.
Th e e v o l u t i o n of
4 C O 2
f r o m r i n g - l a b e l e d DHP i n t h e
presence
( 0 )
a n d
a b s e n c e
( 0 )
o f
Mn
i s s h o w n ,
a s a re t h e
e v o l u t i o n
o f
4 C O 2 f r o m
s i d e c h a i n - l a b e l e d DHP i n t h e presence
( M )
a n d
a b s e n c e
O I ) o f Mn
and
t h e e v o l u t i o n of 1 4 C O 2 f r o m
m e t h o x y - l a b e l e d
DHP i n
t h e
presence ( A )
a n d
a b s e n c e ( A )
o f
Mn.
S h a k i n g c u l t u r e s were grown
i n HCLN
( a )
a n d A sn -P h e
( b)
m e d i a .
DISCUSSION
LiP a n d MnP
were f i r s t i s o l a t e d f r o m t h e e xt r ac el l u la r
m e d i u m o f P . c h r y s o s p o r i u m ( 1 8 , 2 6 ,
2 8 ) , a n d t h e
enzymes
from
t h i s
o r g a n i s m
h a v e b een c h a r a c t e r i z e d e x t e n s i v e l y .
Both
enzymes are
e x t r a c e l l u l a r h e m e - c o n t a i n i n g
g l y c o p r o -
t e i n s which e x i s t
a s
a
s e r i e s o f i s o z y m e s .
C o n s i d e r a b l e
c h e m i c a l
and
p h y s i o l o g i c a l
e v i d e n c e
r e v i e w e d
p r e v i o u s l y
( 7 ,
1 8 , 2 2 ,
2 6 ,
2 8 , 3 7 ) suggests t h a t t h e s e
enzymes
c o n s t i t u t e
t h e
m a j o r c o m p o n e n t s
o f t h e l i g n i n d e g r a d a t i v e system
o f
P .
c h r y s o s p o r i u m .
Li P
c a t a l y z e s
t h e o x i d a t i v e
c l e a v a g e
o f
n o n p h e n o l i c l i g n i n
model
compounds
b y
a
mechanism i n -
v o l v i n g t h e
f o r m a t i o n
o f
a
s u b s t r a t e a r y l c a t i o n r a d i c a l
( 1 8 ,
2 2 , 2 6 ,
3 7 ) . A r ecen t report a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t
c r u d e
l i g n i n p e r o x i d a s e p r e p a r a t i o n s c a t a l y z e , a t
l e a s t p a r t i a l l y ,
t h e
d e p o l y m e r i z a t i o n o f s y n t h e t i c a n g i o s p e r m
l i g n i n ( 1 9 ) . M n P
c a t a l y z e s t h e o x i d a t i o n o f M n ( I I) t o M n ( I I I ) , a n d
t h e
l a t t e r ,
complexed w i t h an o r g a n i c a c i d ,
r e a d i l y o x i d i z e s
p h e n o l i c
l i g n i n
model
compounds
( 1 5 ,
1 6 ,
3 3 , 3 8 ,
3 9 ) .
R e c e n t l y , we
demonstrated t h a t homogeneous MnP a l s o
c a t a l y z e s
p a r -
t i a l l y t h e
d e p o l y m e r i z a t i o n
o f s y n t h e t i c
a n g i o s p e r m
a n d
gymnosperm l i g n i n
( 4 0 ) . I n
a d d i t i o n , i t
h a s
b e e n
d e m o n -
s t r a t e d
r e c e n t l y
i n P .
c h r y s o s p o r i u m
t h a t
M n ,
t h e
p r i m a r y
s u b s t r a t e o f
MnP,
r e g u l a t e s
t h e
e x p r e s s i o n
o f t h e
e n z y m e
( 4 ,
6 )
b y
a c t i v a t i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e
M n P
g e n e
( 6 ) .
I n t h i s
p a p e r ,
we e x t e n d o u r
s t u d i e s o n
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
b y
e x a m i n i n g t h e e x t r a c e l l u l a r
e n z y m e s
e l a b o r a t e d
b y t h e
l i g -
n i n - d e g r a d i n g
f u n g u s D .
s q u a l e n s .
T h e
r e s u l t s
s h o w n i n
F i g . 1
d e m o n s t r a t e t h a t ,
u n l i k e P .
c h r y s o s p o r i u m
( 1 8 , 2 6 ) , D . s q u a l e n s
d e g r a d e s
l i g n i n
u n d e r
n i t r o g e n - s u f f i c i e n t c o n d i t i o n s a s
w e l l
a s
n i t r o g e n - l i m i t i n g
c o n d i t i o n s .
As
s h o w n i n
F i g .
l b ,
a f t e r a n
i n i t i a l
l a g l i g n i n
d e g r a d a t i o n
p r o c e e d s
e f f i c i e n t l y i n
A s n - P h e
c u l t u r e s a n d
i n
HCLN
c u l t u r e s . F u r t h er m o r e , D .
s q u a l e n s
d e g r a d e s
s i d e
c h a i n - l a b e l e d
DHP
i n HCHN medium
t o
a p p r o x i m a t e l y
33
o f t h e
e x t e n t
o f t h e
d e g r a d a t i o n
i n
HCLN
m e d i u m
( d a t a
n o t
s h o w n ) .
M n P a c t i v i t y i s r e a d i l y
d e t e c t e d
i n
t h e
m e d i u m
f r o m
A s n - P h e
c u l t u r e s , a n d
t h e t i m e
c o u r s e s
f o r
b o t h
e x t r a c e l l u l a r
M n P
a n d l a c c a s e a c t i v i t i e s
c o r r e l a t e
w e l l
w i t h t h a t
f o r DHP
d e g r a d a t i o n
( F i g .
l b
a n d 2 b ) . I n
c o n t r a s t , i n
HCLN Mn-
c o n t a i n i n g
c u l t u r e s ,
s o l u b l e
M n P
a c t i v i t y
i s
d e t e c t a b l e
o n l y
a f t e r
5
d a y s
a n d
r e a c h e s
a
maximum
o n d a y
1 8 ,
w h e r e a s
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
p r o c e e d s
r a p i d l y f r o m
d a y
6
o n
( F i g .
l a
a n d
2 a ) . H o w e v e r , u n d e r
HCLN
c o n d i t i o n s ,
s i g n i f i c a n t
l e v e l s
o f c e l l e n v e l o p e - b o u n d
M n P
a c t i v i t y
a r e
d e t e c t a b l e
o n
d a y 4 , a n d t h i s
a c t i v i t y
p r o b a b l y
a c c o u n t s
f o r
t h e
e a r l y
o n s e t
o f l i g n i n d e g r a d a t i o n .
C e l l
e n v e l o p e - b o u n d M n P
a c t i v i t y
h a s
a l s o b e e n
d e t e c t e d i n
P .
c h r y s o s p o r i u m
( 3 3 ) .
P r e s u m a b l y
b o t h c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
a n d
s o l u b l e
e x t r a c e l l u l a r Mn P a r e
c a p a b l e
o f g en e r a t i n g f r e e l y
d i f f u s i b l e
M n ( I I I ) ,
w h i c h
i n
t u r n
o x i d i z e s
t h e t e r m i n a l
p h e n o l i c
s u b s t r a t e , l i g n i n .
W e
h a v e
v e r i f i e d
t h a t
c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
M n P i s
c a p a b l e o f
o x i d i z i n g
2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l
i n b o t h
c e l l - f r e e
a n d i n t a c t - c e l l
a s s a y
s y s t e m s .
T h e r e s u l t s
s h o w n
i n F i g .
2
d e m o n s t r a t e
t h a t
u n d e r
b o t h
h i g h - a n d
l o w - n i t r o g e n
c o n d i t i o n s ,
D .
s q u a l e n s
s e c r e t e s
b o t h
a l a c ca se a n d a
MnP.
H o w e v e r , i n
c o n t r a s t t o
P .
c h r y s o -
s p o r i u m ,
n o L i P
a c t i v i t y
i s
d e t e c t a b l e
i n
D . s q u a l e n s
c u l t u r e s
g r o w n u n d e r
a v a r i e t y
o f
c o n d i t i o n s ,
i n c l u d i n g t h e
p r e s e n c e
o f
v a r i o u s
c o n c e n t r a t i o n s
o f
c a r b o n ,
n i t r o g e n ,
a n d
M n
i n
b o t h
a g i t a t e d a n d
s t a t i o n a r y f l a s k s .
L i k e w i s e , L i P
a c t i v i t y
i s
n o t d et e c t e d
i n
D .
s q u a l e n s
c u l t u r e s
t r e a t e d
w i t h v a r i o u s
p u t a t i v e
i n d uc er s o f
P .
c h r y s o s p o r i u m L i P
a c t i v i t y
( 2 5 ) .
I n
a d d i t i o n , n o
e x t r a c e l l u l a r a r y l
a l c o h o l
o x i d a s e
i s d e t e c t a b l e
i n t h i s
o r g a n i s m .
T h e s e
r e s u l t s ,
a l o n g w i t h t h e
p r e v i o u s
r e p o r t s d e s c r i b e d a b o v e
( 1 4 ,
2 9 ) ,
s u g g e s t t h a t L i P
ma y
n o t
b e
a n e s s e n t i a l
c o m p o n e n t
o f t h e
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
s y s t e m
o f
e v e r y w h i t e
r o t
f u n g u s a n d
t h a t
a l t e r n a t i v e
o x i d a t i v e
e n -
z y m e s ,
s u c h a s
MnP,
a r e
c a p a b l e
o f
d e g r a d i n g
l i g n i n .
I n c o n t r a s t
t o
t h e
r e s u l t s
w i t h
n u t r i e n t
n i t r o g e n ,
t h e
p r e s e n c e o f M n
i n D .
s q u a l e n s
c u l t u r e s c o n t r o l s
t h e
e x p r e s -
s i o n
o f
Mn P a n d t h e
e x t e n t
o f l i g n i n
d e g r a d a t i o n .
T h e
r e s u l t s
i n
F i g .
2
d e m o n s t r a t e
t h a t
D .
s q u a l e n s p r o d u c e s
a n
e x t r a -
c e l l u l a r l a c c a s e i n
HCLN a n d
A s n - P h e
m e d i a
i n
t h e
p r e s e n c e
a n d a bs e n c e
o f
M n . I n
c o n t r a s t ,
t h e
a p p e a r a n c e
o f
b o t h
e x t r a c e l l u l a r s o l u b l e
a n d
c e l l
e n v e l o p e - b o u n d
M n P
a c t i v i t y
i s c o m p l e t e l y
d e p e n d e n t
o n
t h e p r e s e n c e
o f
M n
i n t h e
m e d i u m .
I n
HCLN
c u l t u r e s ,
t h e
e x t e n t o f
DHP
d e g r a d a t i o n
i n t h e a b s e n c e
o f M n
i s
l e s s
t h a n 15
o f
t h a t
i n
t h e
p r e s e n c e
o f
M n . T h e
s m a l l
a m o u n t
of
4 C O 2
e v o l u t i o n
o b s e r v e d
may
b e a r e s u l t o f
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
b y
t h e l a c c a s e
w h i c h
i s
e x p r e s s e d
i n t h e
a b s e n c e
o f
M n
o r
b y
a n o t h e r
e n z y m e .
I t
i s
l i k e l y
t h a t
t h e
M n
e f f e c t
o n
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
i s
t h e
r e s u l t
o f
M n i n d u c t i o n
o f
Mn P
e x p r e s s i o n ,
a s
h a s b e e n
s h o w n f o r P .
c h r y s o s p o r i u m
( 6 ) ,
a n d o f
t h e f a c t
t h a t Mn
s e r v e s
a s
t h e
a
0
~~~~~~~~~~~~
i o
o
6
0
o
o
3
o~~~~~6-
VOL.
5 7 ,
1 9 9 1
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1991 Pri 2240 5
6/7
2 2 4 4 PERIE AND
GOLD
s u b s t r a t e f o r
M n P .
H o w e v e r ,
a t
t h i s t i m e
we
c a n n o t r u l e
o u t
t h e l e s s
l i k e l y p o s s i b i l i t y
t h a t
a n o t h e r
M n - d e p e n d e n t e n z y m e
i s
i n v o l v e d
i n
l i g n i n d e g r a d a t i o n .
Enzyme a s s a y s
demon-
s t r a t e
t h a t D.
s q u a l e n s
MnP
e n z y m a t i c a c t i v i t y
i s
d e p e n d e n t
on
Mn,
and t h e r e s u l t s i n
F i g .
2 show t h a t
Mn
r e g u l a t e s
M n P
e x p r e s s i o n
i n D.
s q u a l e n s .
Th e r e s u l t s i n
F i g .
3 b
demonstrate t h a t
m e t h o x y - l a b e l e d
l i g n i n
i s
d e g r a d e d
i n
Asn-Phe
m e d i u m
b u t n o t
i n
HCLN
m e d i u m
i n t h e
absence
o f
M n ,
c o r r e l a t i n g
w i t h
t h e
e x p r e s -
s i o n
o f
l a c c a s e . Laccase
e x p r e s s i o n
i n
t h i s
o r g a n i s m
i s
i n d e p e n d e n t
o f
Mn
and i s a c t i v a t e d
b y
g r o w t h
under
h i g h -
n i t r o g e n
c o n d i t i o n s . These r e s u l t s
s u g g e s t
t h a t t h e
e x t r a c e l -
l u l a r
l a c c a s e i s
c a p a b l e
o f
d e m e t h o x y l a t i n g g u a i a c y l
DHP
i n
v i v o .
Th e
o x i d a t i o n
o f d i m e r i c
l i g n i n
model
c o m p o u n d s
b y
l a c c a s e
h a s
be e n
d e s c r i b e d
p r e v i o u s l y
( 2 2 ) .
I n
c o n c l u s i o n ,
t h e s e
r e s u l t s
s u g g e s t
t h a t
MnP
and
p r o b a -
b l y
l a c c a s e
p l a y
i m p o r t a n t
r o l e s
i n t h e
d e g r a d a t i o n
o f
l i g n i n
b y
a t l e a s t some
white
r o t
f u n g i
and t h a t
Li P
m a y
n o t
b e
a n
i n d i s p e n s i b l e c o m p o n e n t
o f t h e
l i g n i n
d e g r a d a t i v e
s y s t e m
o f
e v e r y
w h i t e r o t
f u n g u s .
Th e
r e s u l t s
a l s o
s u g g e s t
t h a t a
v a r i e t y
o f o x i d a t i v e
e n z y m es
m a y
b e
u t i l i z e d
b y
w h i t e
r o t
f u n g i
f o r
l i g n i n
d e g r a d a t i o n .
We
are
c o n t i n u i n g
ou r
s t u d i e s
on t h e
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
s y s t e m
o f D .
s q u a l e n s
t o
i d e n t i f y
t h e
enzymes
i n v o l v e d .
ACKNOWLEDGMENTS
This
work was
s u p p o r t e d
b y
G r o u p e m e n t
d e Recherches d e
L a c q - E l f
A q u i t a i n e ,
t h e
N a t i o n a l
S c i e n c e Foundation
( g r a n t
DMB-
8 9 0 4 3 5 8 ) ,
a n d
t h e U.S.
D e p a r t m e n t
o f
E n e r g y ,
O f f i c e
o f
B a s i c
E n e r g y
Sciences
( g r a n t
D E - F G 0 6 - 8 7 - E R 1 3 7 1 5 ) .
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1 9 6 6 .
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E n z y m o l .
8 : 8 5 - 9 4 .
2 .
B l a n c h e t t e ,
R .
A . ,
L .
O t j e n ,
and
M.
C .
C a r l s o n . 1 9 8 7 .
L i g n i n
d i s t r i b u t i o n
i n c e l l
w a l l s
o f b i r c h
wood
d e c a y e d b y
w h i t e r o t
b a s i d i o m y c e t e s . P h y t o p a t h o l o g y
7 7 : 6 8 4 - 6 9 0 .
3 .
B l a n k e n s h i p ,
D .
T . ,
M .
A .
K r i v a n e k ,
B . L .
A c k e r m a n ,
a n d A . D .
Cardin.
1 9 8 9 .
H i g h
s e n s i t i v i t y
amino
a c i d
a n a l y s i s
b y
d e r i v a t i -
zation with
o - p h t h a l a l d e h y d e
and
9 - f l u o r e n y l m e t h y l
c h l o r o f o r -
ma t e
u s i n g
f l u o r e s c e n c e
d e t e c t i o n :
a p p l i c a t i o n
i n
p r o t e i n
s t r u c -
t u r e d e t e r m i n a t i o n .
A n a l .
Biochem.
1 7 8 : 2 2 7 - 2 3 2 .
4 .
B o n a r m e , P . ,
and
T . W .
J e i f r i e s .
1 9 9 0 .
M n ( I I ) r e g u l a t i o n
o f
l i g n i n p e r o x i d a s e s
and
m a n g a n e s e - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e s
f r o m
l i g n i n - d e g r a d i n g
w h i t e r o t
f u n g i .
A p p l .
E n v i r o n .
M i c r o b i o l .
56:210-217.
5 .
B o u r b o n n a i s , R . ,
and
M.
G .
P a i c e .
1 9 8 8 .
V e r a t r y l
a l c o h o l
oxidases
from t h e
l i g n i n - d e g r a d i n g
b a s i d i o m y c e t e
P l e u r o t u s
s a j o r - c a j u .
Biochem.
J .
2 5 5 : 4 4 5 - 4 5 0 .
6 .
B r o w n ,
J .
A . ,
J .
K.
G l e n n ,
and
M.
H .
G o l d . 1 9 9 0 .
M a n g a n e s e
r e g u l a t e s
t h e
e x p r e s s i o n
o f
manganese
p e r o x i d a s e
b y
P h a n e r o -
chaete
c h r y s o s p o r i u m .
J .
B a c t e r i o l .
1 7 2 : 3 1 2 5 - 3 1 3 0 .
7 .
B u s w e l l ,
J .
A . ,
and E .
O d i e r .
1 9 8 7 .
L i g n i n b i o de g r ad a t io n .
C r i t .
Rev.
B i o t e c h n o l . 6 : 1 - 6 0 .
8 .
C h a n g ,
H . - M . ,
C . - L .
C h e n ,
and T . K .
K i r k . 1 9 8 0 .
T h e
c h e m i s t r y
of
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
b y
w h i t e - r o t
f u n g i ,
p .
2 1 5 - 2 3 0 . I n T .
K .
K i r k ,
T .
H i g u c h i ,
and
H.-M.
C h a n g ( e d . ) ,
L i g n i n
b i o d e g r a d a -
t i o n :
m i c r o b i o l o gy , c h e m i st r y ,
and
p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s , v o l . I .
CRC
P r e s s ,
I n c . ,
Boca
R a t o n ,
F l a .
9 .
C r a w f o r d ,
R . L .
1 9 8 1 .
L i g n i n
b i o d e g r a d a t i o n .
J o h n
W i l e y
S o n s ,
I n c . ,
New
Y o r k .
1 0 .
D o d s o n ,
P .
J . ,
C . S .
E v a n s ,
P .
J .
H a r v e y ,
a n d J . M.
P a l m e r .
1 9 8 7 .
P r o d u c t i o n and
p r o p e r t i e s
o f a n
e x t r a c e l l u l a r p e r o x i d a s e
fr om
C o r i o l u s
v e r s i c o l o r
which
c a t a l y z e s
C a - C 1 3
c l e a v a g e i n a
l i g n i n
model
c o m p o u n d .
FEMS
M i c r o b i o l . L e t t .
4 2 : 1 7 - 2 2 .
1 1 .
F a h r a e u s ,
G . ,
and B .
Reinhammar. 1 9 6 7 .
L a r g e - s c a l e
p r o d u c -
t i o n a nd
p u r i f i c a t i o n
o f
l a c c a s e
from
c u l t u r e s o f
P o l y p o r u s
v e r s i c o l o r
and some
p r o p e r t i e s
o f l a c c a s e
A . A c t a C h e m .
S c a n d .
2 1 : 2 3 6 7 - 2 3 7 8 .
1 2 .
F i n c h a m , J .
R .
S . ,
P .
R .
D a y ,
a n d A . R ad f o r d. 1 9 7 9 .
F u n g a l
g e n e t i c s ,
v o l .
4 .
B o t a n i c a l
m o n o g r a p h s .
U n i v e r s i t y
o f C a l i f o r n i a
P r e s s , B e r k e l e y .
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F u k u z u m i ,
T .
1 9 8 7 .
L i g n i n o l y t i c e n z y m e s
o f
P l e u r o t u s
s a j o r -
c a j u , p .
1 3 7 - 1 4 2 . I n
E . O d i e r
e d . ) ,
L i g n i n
e n z y m i c
a n d
m i c r o -
b i a l
d e g r a d a t i o n .
I n s t i t u t N a t i o n a l d e
l a R e c h e r c h e
A g r o n o -
m i q u e ,
P a r i s .
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H . ,
G .
G a s ,
a n d
A .
B o u d e t . 1 9 8 8 .
B i o d e g r a d a t i o n
o f
Hevea
b r a s i l i e n s i s
l i g n o c e l l u l o s e
b y
R i g i d o p o r u s
l i g n o s u s :
i n -
f l u e n c e
o f c u l t u r e c o n d i t i o n s
a n d
i n v o l v e m e n t
o f
o x i d i z i n g
e n z y m e s .
P l a n t
P h y s i o l .
B i o c h e m .
2 6 : 6 1 9 - 6 2 7 .
1 5 .
G l e n n , J . K . ,
L .
A k i l e s w a r a n ,
a n d M. H .
G o l d .
1 9 8 6 .
M n ( l I )
o x i d a t i o n
i s t h e
p r i n c i p a l
f u n c t i o n o f t h e
e x t r a c e l l u l a r M n -
p e r o x i d a s e
f r o m
P h a n e r o c h a e t e
c h r y s o s p o r i u m .
A r c h .
B i o -
c h e m .
B i o p h y s .
2 5 1 : 6 8 8 - 6 9 6 .
1 6 .
G l e n n ,
J .
K . ,
a n d
M. H .
G o l d . 1 9 8 5 .
P u r i f i c a t i o n
a n d
c h a r a c t e r -
i z a t i o n o f
a n e x t r a c e l l u l a r
M n ( I l ) - d e p e n d e n t
p e r o x i d a s e
f r o m
t h e
l i g n i n - d e g r a d i n g b a s i d i o m y c e t e ,
P h a n e r o c h a e t e
c h r y s o -
s p o r i u m .
A r c h . B i o c h e m .
B i o p h y s .
2 4 2 : 3 2 9 - 3 4 1 .
1 7 . G o l d ,
M.
H . ,
M.
B .
M a y f i e l d ,
T .
M.
C h e n g ,
K .
K r i s n a n g k u r a ,
A .
E n o k i ,
M.
S h i m a d a ,
a n d
J .
K .
G l e n n .
1 9 8 2 . A
P h a n e r o c h a e t e
c h r y s o s p o r i u m
m u t a n t
d e f e c t i v e
i n
l i g n i n d e g r a d a t i o n
a s
w e l l
a s
s e v e r a l
o t h e r
s e c o n d a r y
m e t a b o l i c f u n c t i o n s . A r c h .
M i c r o b i o l .
1 3 2 : 1 1 5 - 1 2 2 .
1 8 . G o l d , M. H . , H . W a r i i s h i ,
a n d
K .
V a l l i .
1 9 8 9 . E x t r a c e l l u l a r
p e r o x i d a s e s
i n v o l v e d
i n
l i g n i n
d e g r a d a t i o n
b y
t h e
w h i t e
r o t
b a s i d i o m y c e t e
P h a n e r o c h a e t e
c h r y s o s p o r i u m .
Am. C h e m .
S o c .
S y m p .
S e r . 3 8 9 : 1 2 7 - 1 4 0 .
1 9 .
H a m m e l ,
K .
E . ,
a n d
M. A . M o e n . 1 9 9 1 .
D e p o l y m e r i z a t i o n
o f a
s y n t h e t i c l i g n i n
i n v i t r o
b y l i g n i n
p e r o x i d a s e .
E n z y m e
M i c r o b .
T e c h n o l . 1 3 : 1 5 - 1 8 .
2 0 . H a n s o n , R .
S . ,
a n d
J .
A .
P h i l l i p s .
1 9 8 1 .
C h e m i c a l
c o m p o s i t i o n ,
p .
3 2 8 - 3 6 4 .
I n P .
G e r h a r d t ,
R .
G . E .
M u r r a y , R . N .
C o s t i l o w ,
E . W.
N e s t e r ,
W.
A .
W o o d ,
N . R .
K r i e g ,
a n d
G .
B .
P h i l l i p s
( e d . ) ,
M a n u a l
o f
m e t h o d s
f o r
g e n e r a l b a c t e r i o l o g y .
A m e r i c a n
S o c i e t y
f o r
M i c r o b i o l o g y ,
W a s h i n g t o n ,
D . C .
2 1 . H a t a k k a , A .
I . ,
a n d
A .
K .
U u s i - R a u v a . 1 9 8 3 . D e g r a d a t i o n
o f
' 4 C - l a b e l e d
p o p l a r
wood
l i g n i n
b y
s e l e c t e d
w h i t e r o t
f u n g i . E u r .
J . A p p l . M i cr o bi o l . B i o t e ch n o l .
1 7 : 2 3 5 - 2 4 2 .
2 2 .
H i g u c h i ,
T .
1 9 9 0 .
L i g n i n b i o c h e m i s t r y :
b i o s y n t h e s i s a n d
b i o d e g -
r a d a t i o n . Wood
S c i . T e c h n o l .
2 4 : 2 3 - 6 3 .
2 3 .
J o h a n s s o n , T . ,
a n d
P . 0 .
N y m a n . 1 9 8 7 . A
m a n g a n e s e ( I I ) -
d e p e n d e n t
e x t r a c e l l u l a r
p e r o x i d a s e
f r o m
t h e
w h i t e
r o t
f u n g u s
T r a m e t e s
v e r s i c o l o r . A c t a
C h e m . S c a n d .
B 4 1 : 7 6 2 - 7 6 5 .
2 4 . K e r s t e n
P .
J . ,
a n d
T . K .
K i r k . 1 9 8 7 . I n v o l v e m e n t
o f
a
new
e n z y m e , g l y o x a l o x i d a s e , i n
e x t r a c e l l u l a r
H 2 0 2 p r o d u c t i o n
b y
P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m .
J .
B a c t e r i o l .
1 6 9 : 2 1 9 5 - 2 2 0 2 .
2 5 .
K i r k , T . K . , S .
C r o a n , M. T i e n ,
K . E . M u r t a g h , a n d
R .
L .
F a r r e l l .
1 9 8 6
P r o d uc t i o n o f m u l t i p l e l i g n i n a s e s
b y
P h a n e r o c h a -
e t e
c h r y s o s p o r i u m :
e f f e c t o f s e l e c t e d g r o w t h
c o n d i t i o n s a n d
u s e
o f a m u t a n t
s t r a i n . Enzyme M i c r o b . T e c h n o l .
8 : 2 7 - 3 2 .
2 6 . K i r k, T . K . , a n d R .
L . F a r r e l l . 1 9 8 7 .
E n z y m a t i c
c o m b u s t i o n :
t h e m i c r o b i a l
d e g r a d a t i o n o f
l i g n i n .
A n n u .
R e v .
M i c r o b i o l .
4 1 : 4 6 5 - 5 0 5 .
2 7 . K i r k , T . K . ,
E . S c h u l t z W. J . C o n n o r s ,
L . F .
L o r e n z ,
a n d J .
G .
Z e i k u s . 1 9 7 8 . I n f l u e n c e o f
c u l t u r e
p a r a m e t e r s o n
l i g n i n
m e t a b o -
l i s m b y P h an e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m .
A r c h . M i c r o b i o l .
1 1 7 :
2 2 7 - 2 8 5 .
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K u w a h a r a , M . ,
J .
K . G l e n n ,
M.
A . M o r g a n , a n d
M. H .
G o l d .
1 9 8 4 .
S e p a r a t i o n
a n d
c h a r a c t e r i z a t i o n
o f
t w o
e x t r a c e l l u l a r
H 1 0 2 - d e p e n d e n t
o x i d a s e s f r o m l i g n i n o l y t i c
c u l t u r e s o f
P h a n e r -
o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . FEBS L e t t .
1 6 9 : 2 4 7 - 2 4 9 .
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Muheim,
A . , R . W a l d n e r , M. S . A . L e i s o l a ,
a n d
A .
F i e c h t e r .
1 9 9 0 . An e x t r a c e l l u l a r
a r y l a l c o h o l o x i d a s e
f r o m
t h e
w h i t e
r o t
f u n gu s B j e r k e nd e r a
a d u s t a . Enzyme M i c r o b . T e ch n o l .
1 2 : 2 0 4 -
2 0 9 .
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M y e r s ,
G .
C . , G .
F . L e a t h a m , T .
H . W e g n e r ,
a n d
R .
A .
B l a n c h e t t e . 1 9 8 8 . F u n g a l
p r e t r e a t m e n t
o f
a s p e n c h i p s
i m p r o v e s
s t r e n g t h o f r e f i n e d m e c h a n i c a l
p u l p s .
TAPPI J .
7 1 : 1 0 5 - 1 0 8 .
3 1 .
N i k u - P a a v o l a ,
M. L . ,
E .
K a r h u n e n , A . K a n t e l i n e n , L . V i i k a r i ,
T
L u n d e l l ,
a n d
A . H a t a k k a .
1 9 9 0 . T h e e f f e c t o f
c u l t u r e
c o n d i t i o n s
o n t h e
p r o d u ct i o n o f
l i g n i n - m o d i f y i n g
e n z y m e s b y
t h e
w h i t e - r o t
f u n gu s P h l eb i a
r a d i a t a .
J .
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