3.2.2 Modifikasi gen apoptin dengan penambahan 12 histidin dan 8 arginin dengan
metode cut and ligate .
Apoptin merupakan protein yang diisolasi dari Chicken Anemia Virus (CAV). Apotin
terdiri dari 121 asam amino dan tidak memperlihatkan sekuens homolog yang signifikan
dengan protein yang telah diketahui. Protein ini memiliki kemampuan yang menyebabkan
apoptosis (perusakan sel) pada sel kanker. Namun proses pemusnahan sel kanker tersebut
tidak serta merta dapat dilakukan oleh protein ini pada bentuk aslinya (native form). Untuk
itu diperlukan modifikasi pada gen apoptin ini.
Sebelum dilakukan kloning, gen apoptin dimodifikasi dengan menambahkan sekuens 12-
histidin pada C-terminal dan 8-arginin pada N-terminal. Penambahan 12-histidin
dimaksudkan agar mengakibatkan apoptin lebih mudah larut. Kelarutan protein yang lebih
tinggi akan menyebabkan apoptin lebih mudah dipurifikasi atau dimurnikan. Penambahan 8-
arginin dimaksudkan untuk pelindung bagi apoptin untuk melewati kondisi ekstrim, sehingga
dapat dengan lebih mudah masuk (penetrasi) ke dalam sel.
Berikut merupakan sekuens dari DNA template apoptin:
5’ A T G A A C G C T C T C C A A G A A G A T A ....C G C A A G A A G G T G T A T
A A G A C T G T A A 3’
Kodon histidin:
CAT dan CAC
Kodon arginin:
GCG, GCT, GCC, TCT, GCA
Penambahan 12 histidin pada C-terminal dan 8 arginin pada N-terminal apoptin dilakukan
dengan metode potong sambung. Dalam metode potong sambung tersebut tentunya harus
diketahui enzim restriksi yang akan memotong gen apoptin. Sebenarnya, pemilihan enzim
restriksi didasarkan pada situs restriksi yang ada di sekuens gen apoptin. Namun karena gen
apoptin akan dimodifikasi pada bagian masing-masing ujungnya, maka disini akan
ditambahkan situs restriksi pada ujung gen apoptin. Sehingga pemilihan enzim restriksi itu
sendiri berdasarkan pada situs restriksi yang ada pada plasmid. Hal tersebut bertujuan agar
ketika gen disisipkan pada plasmid akan saling berkomplemen atau terhubung melalui situs
restriksi tersebut. Kemudian, selain itu juga dilakukan tahap pemillihan penambahan situs
restriksi pada histidin dan arginin yang situs tersebut sama dengan yang ada di plasmid.
Tujuannya adalah sama dengan penambahan situs restriksi pada apoptin.
Adapun pertimbangan yang kami diskusikan mengenai pemilihan situs restriksi yang
digunakan antara lain, enzim yang memotong situs tersebut mudah diperoleh dan
ketersediannya melimpah di dunia pasar plasmid, memiliki kemampuan high copy sehingga
membantu mempercepat proses ligase dan amplifikasi pada proses perbanyakan sel,
memiliki kemampuan yang dapat menghasilkan cukup besar sekuens DNA yang akan
dikloning. Pemilihan situs restriksi ini akan dijelaskan pada tahapan-tahapan sebagai berikut:
Tahap 1:
Menidentifikasi situs restriksi yang ada pada vektor, dalam hal ini adalah plasmid pET28a.
Identifikasi tersebut dengan melihat map restriksi plasmid. Dipilih pada area MCS (Multiple
Cloning Site)
Tahap 2:
Memilih situs restriksi yang tidak terdapat dalam sekuens apoptin sehinggga gen apoptin
tidak ikut terpotong.
Tahap 3:
Memastikan tidak ada duplikat situs restriksi dimanapun dalam gen apoptin atau pET28a
untuk menghindari penggandaan pemotongan DNA sehingga terjadi data misleading.
Tahap 4:
Lebih memilih enzim restriksi yag memotong dengan ujung lengket (sticky ends) daripada
yang tumpul (blunt ends). Sticky end terjadi ketik enzim memotong DNA rantai ganda
dengan kuat sedangkan blunt end dengan lembut yang mengakibatkan sulit untuk terpasang.
Tahap 5:
Memilih enzim restriksi yang berbeda di tiap ujung apoptin untuk memastikan apoptin
tersisipkan dalam plasmid pada orientasi yang benar dan untuk memastikan plasmid tidak
menyambung dengan sendirinya kembali.
Tahap 6:
Memilih enzim yang berfungsi baik pada sistem buffer dan suhu yang sama. Jika tidak
dimunngkinkan maka harus dilakukan proses pemotongan pada sistem yang terpisah.
Berdasarkan pertimbangan dan tahapan di atas, dipilih situs retriksi Xho1 dan BamH1. Situs
tersebut akan ditambahkan pada gen apoptin dengan Xho1 pada N-terminal dan BamH1 pada
C-terminal.
Xho1 : CTCGAG
BamH1 : GGATC
Sehingga
GGATCC A T G A A C G C T C T C C A A G A A G A T A ....C G C A A G A A G G T G
T A T A A G A C T G T A ACTCGAG
Karena gen apoptin akan digabungkan dengan 12-histidin pada C-terminal dan 8-arginin pada
N-terminal maka, kedua sekuens asam amino tersebut ditambahkan situs restriksi yang ada
pada plasmid pET28a seperti langkah pada penambahan situs restriksi untuk gen apoptin.
Penambahkan situs restriksi pada histidin dan arginin:
Pada ujung histidin ditambahkan situs restriksi. EcoR1 untuk ujung 5’ dan Xho1 untuk ujung
3’
Pada ujung arginin ditambahkan situs restriksi BamH1 pada ujung 5’ dan Sal1 pada ujung 3’
EcoR1: GAATTC
Sal1: GTCGAC
GAATTC CATCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCAC GGATCC
CTCGAG GCGGCTGCCTCTGCATCCGCTGCCGTCGAC
Penambahan situs restriksi dapat dilakukan dengan PCR yang menggunakan desain primer
khusus. Namun pada proses pengkloningan yang kami rancang, telah diperoleh gen apoptin
yang telah memiliki situs restriksi seperti pada sekuens yang telah kami susun. Sehingga,
penggabungan gen apoptin, dengan 12-histidine dan 8-arginin tinggal dilakukan dengan
memanfaatkan enzim T4 DNA ligase. Proses ligasinya dapat memanfaatkan kit yang sesuai
dengan enzim, plasmid dan gen yang digunakan. Bila kit untuk ligasi tersebut belum tersedia
pada perusahaan, maka kita perlu merancangnya sesuai dengan sifat dari bahan-bahan yang
digunakan. Dalam perancangan ini, dianggap dalam perusahaan tersedia buffer untuk proses
restriksi dan ligasi yang kami butuhkan dan tersedia pula protokolnya, yang tidak kami
jelaskan pada makalah ini.
Top Related