UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
APLICAÇÃO DE QUITOSANA E ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum
vulgare L.) NA INIBIÇÃO DE Staphylococcus aureus EM HAMBÚRGUER
Vitória de Santo Antão
2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
APLICAÇÃO DE QUITOSANA E ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum
vulgare L.) NA INIBIÇÃO DE Staphylococcus aureus EM HAMBÚRGUER
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao Curso de Graduação em
Nutrição como requisito para conclusão do
Curso de Bacharel em Nutrição.
Aluna: Tacila Mendes da Silva
Orientadora: Profª Drª Roberta de Albuquerque Bento
Vitória de Santo Antão
2010
Dedicatória
A Deus, meu Senhor e Salvador.
A Cacildo e Lourdes, meus pais.
À professora, Roberta Bento, minha orientadora.
A Tulio, meu irmão e a todos os meus amigos.
Agradecimentos
A Deus autor e salvador da minha vida, obrigada por cuidar de mim. “Você não se
esqueceu, você insiste, você mudou a minha história e fez o que ninguém podia
imaginar, você acreditou e isso é tudo, só vivo pra você não sou do mundo não. A
honra, a glória, a força e o louvor a Deus e o levantar das minhas mãos é pra dizer
que te pertenço, Deus” ¹.
À minha mãe, Lourdes e ao meu pai Cacildo por serem minha base e porto seguro, aonde eu chegar e tenha o que eu tiver devo tudo a eles, obrigada por tudo. A minha família por estar sempre presente em todas as minhas realizações.
À minha Orientadora Roberta Bento, por ter me mostrado que é com muita
determinação que se alcança os objetivos, pela ajuda sempre prestada e por toda
assistência. Mostrou-me de uma maneira singular que com competência,
profissionalismo e persistência é possível ir muito além.
Aos meus amigos, Erika, Aninha, Marcela, Márcio, Bruno, Christian, Allison,
Duda, Rafaela, Antony, Waldir, Jonathan, por entenderem minha ausência na
maioria de nossas programações, por acreditarem em mim, amo muito vocês.
À Belinha pela companhia no laboratório, pela ajuda sempre prestada, por cada
troca de conhecimentos. A vivência do laboratório deu-me uma amiga muito especial
que quero levar por toda a vida.
A Rafael, Danúbia, Edilene e Sílvio a melhor equipe de técnicos do mundo,
Rafa, perdia todo o seu tempo me ajudando a pesar minhas amostras, ele foi a
pessoa mais prestativa que conheci, o mundo merecia mais pessoas como ele, Dan,
sempre foi disponível e ajudava em tudo que fosse possível, Dilene, mesmo sendo a
ajudadora oficial de Rapha e de Mari, me ajudou muito, ensinou-me muito sobre as
práticas de laboratório, sou grata por toda sua paciência, Sílvio, obrigada por deixar
eu incomodar mais cedo pela autoclave,ajudou-me de maneira singular.
1 Da música: “Te agradeço”, Kleber Lucas.
A Rapha e Mari, pela troca de material, pelas dicas, pela convivência, pela troca de
experiência.
Aos Professores avaliadores, por compartilharem comigo da finalização dessa
etapa, além do tempo cedido à avaliação deste trabalho.
A todos que me ajudaram direta e indiretamente, MUITO OBRIGADA!
Resumo
A comercialização de produtos cárneos tem experimentado um crescimento contínuo nos últimos anos, sendo dentre seus derivados de grande consumo, o hambúrguer. Entretanto, tais produtos, devido à constituição rica em nutrientes provenientes da carne e vida de prateleira longa, constituem-se como veículos contaminantes de natureza biológica, física ou química. Dessa forma, é obrigatório o uso de estratégias preventivas para a redução dos focos, ou eliminação dos contaminantes alimentares. Mediante as exigências dos consumidores, por produtos de qualidade, as indústrias se vêem obrigadas a restringirem o uso de conservantes químicos em alimentos. Como tentativa de reduzir os níveis dos aditivos químicos utilizados nos produtos cárneos, pesquisas buscam nos compostos naturais um emprego alternativo mais adequado dos conservantes, proporcionando maior qualidade de vida para os consumidores. Nesse contexto o óleo essencial de orégano se apresenta como agente antimicrobiano, pois elimina uma ampla variedade de microorganismos patógenos/deteriorantes. Outro conservante natural é a quitosana, que tem sido proposto como aplicação para usos em diversos alimentos, por se tratar de um polímero natural, biodegradável e atóxico. Assim, este estudo objetivou verificar a ação antimicrobiana da quitosana e do óleo essencial de orégano (Origanum vulgare L.) na inibição de Staphylococcus aureus em hambúrguer. A preparação dos inóculos da cepa utilizada nos ensaios antimicrobianos foram obtidos através de suspensões de tal cepa em solução salina (NaCl a 0.85% p/v) estéril a partir de culturas overnight cultivadas em BHI inclinado a ± 35 °C, sendo a turbidez padronizada de acordo com a escala McFarland correspondendo à concentração de aproximadamente 108 UFC/mL. Os testes para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) da quitosana e do óleo de orégano, foram realizados através da técnica de macrodiluição em caldo carne. Para os testes em matriz alimentar, foi produzido o hambúrguer em laboratório, e adicionado os antibacterianos e a suspensão bacteriana, realizando o controle concomitantemente, e com posterior contagem de células viáveis nos intervalos em dias (0, 1, 2, 3, 4 e 15). Os resultados demonstraram que a CIM e a CBM do S. aureus em caldo carne, foi 5 mg/ml e 10 µL/ml para quitosana e óleo, respectivamente. Dessa forma, essas concentrações foram utilizadas em matriz alimentar (hambúrguer), onde os melhores resultados foram obtidos nos experimentos que continham óleo e quitosana em associação. Com isso, conclui-se que a aplicação de quitosana e óleo essencial de orégano em hambúrguer pode ser uma alternativa natural no controle de S. aureus, diminuindo assim os riscos de contaminação bacteriana que tanto acometem à saúde dos consumidores.
Descritores: Hambúrguer, Quitosana, Óleo essencial de orégano, Antimicrobiano
Sumário
Introdução com justificativa ....................................................................................... 08
Objetivos ................................................................................................................... 12
Hipóteses ou questões investigativas ....................................................................... 13
Metodologia ............................................................................................................... 14
Resultados e Discussão ............................................................................................ 19
Conclusões ou Considerações Finais ....................................................................... 24
Referências ............................................................................................................... 25
8
Introdução com justificativa
Na produção e industrializações de alimentos, inúmeros avanços ocorreram
nos últimos anos, tanto no desenvolvimento tecnológico, como nas condições
higiênico-sanitárias. Entretanto, apesar da evolução, as doenças transmissíveis por
alimentos (DTAs), ainda classificam-se entre os maiores problemas de saúde pública
do mundo contemporâneo, fato que tem modificado o comportamento do
consumidor, tornado-o mais exigente, o que requer maiores precauções pela
indústria devido a competitividade do mercado.
A comercialização de produtos cárneos tem experimentado um crescimento
contínuo nos últimos anos, sendo dentre seus derivados de grande consumo, o
hambúrguer. Entretanto, tais produtos, devido à constituição rica em nutrientes
provenientes da carne e vida de prateleira longa, constituem-se veículos em
potencial de contaminantes de natureza biológica, física ou química. Dessa forma, é
obrigatório o uso de estratégias preventivas para a redução dos focos, ou eliminação
dos contaminantes alimentares (KASNOWSKI, 2004).
O controle inadequado dos alimentos pode vir a causar alterações, seja do
ponto de vista organoléptico, como microbiano, podendo este último trazer riscos a
saúde dos consumidores. Segundo alguns estudos (BRAGA et al. 2005; BLAIOTTA
et al., 2004), dentre as três maiores causas de DTA de origem bacteriana do mundo,
o agente patogênico que vem se destacando é o Staphylococcus aureus, no qual
encontra na carne e em seus derivados um dos principais veículos de contaminação.
Diante da necessidade de controlar a proliferação microbiana, as indústrias
utilizam quantidades de aditivos artificiais acima do permitido por lei, podendo com
isso ocasionar problemas à saúde humana, devido a possibilidade de originarem
compostos tóxicos, de ação carcinogênica (MELO, 2004). Mediante as exigências
dos consumidores, por produtos de qualidade, as indústrias se vêem obrigadas a
restringirem o uso de conservantes químicos em alimentos (LEUSCHER;
ZAMPARINI, 2002). Como tentativa de reduzir os níveis dos aditivos químicos,
pesquisas buscam nos compostos naturais um emprego alternativo mais adequado
dos conservantes, proporcionando maior qualidade de vida para os consumidores.
9
As técnicas de preservação mais modernas têm demonstrado um interesse
pela segurança microbiológica através do uso de algumas especiarias, pois além de
participarem como ingredientes de inúmeros alimentos, tornando-os mais saborosos
e digestivos, as especiarias também se apresentam como potentes agentes
antimicrobianos devido à presença dos óleos essenciais. (ERNANDES et al., 2007).
Dentre inúmeros óleos essenciais, o de O. vulgare L. (orégano) tem se
destacado devido a sua eficácia na inibição de algumas cepas bacterianas, como
Aeromonas hydrophilla, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Corynebacterium
xerosis, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus,
Mycobacterium smegmatis, Staphylococcus aureus, Y. enterocolítica, entre outros
(BAYDAR et al., 2004).
Souza (2006) demonstrou o intenso poder de inibição do óleo essencial de
orégano sob a flora autócne de amostras de carne moída armazenadas sob
refrigeração. Trabalhos (Pereira et al. 2007; Serpa, et al., 2007) ratificaram a ação
inibitória do óleo essencial de orégano contra bactérias contaminantes em carnes e
derivados. Oliveira (2010), recentemente, em seu trabalho faz o uso dos
componentes do óleo essencial de orégano, timol e carvacrol, comprovando sua
eficácia na inibição do S. aureus numa concentração de 1,25 e 0,6 µL/mL,
respectivamente, resultando na diminuição de 2 ciclos logarítmicos.
Pesquisa realizada por Skandamis et al. (2002) demonstrou que ao associar
dois métodos de conservação em filés de carne bovina, neste caso representado
pelo óleo essencial de orégano e a refrigeração, a quantidade do óleo no alimento
pode ser diminuída, sem contanto interferir na ação inibitória, uma vez que resultou
em uma redução inicial da população de bactérias de 1 a 2 ciclos logarítmicos,
partindo-se o ensaio de um inóculo inicial de aproximadamente 5 log10 UFC/g a
uma temperatura de 5°C.
Outro antimicrobiano que tem se mostrado atender as perspectivas de
mercado é a quitosana. Polissacarídeo encontrado na natureza, produzido por
processo de baixo custo através dos exoesqueletos dos insetos, crustáceos, e
parede celular de fungos; Produção esta de grande interesse ambiental por ser
biodegradável. Diante da abundância e atoxicidade da quitosana, o seu potencial de
aplicação tem sido cada vez mais ampliado, indo desde o uso para a terapia
10
genética, até a indústria alimentícia, como base na fabricação de suplementos
nutricionais, emulsificantes, conservantes, fibras em biscoitos dietéticos,
estabilizantes em alimentos em conservas, clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al.,
1999; BORGOGNI et al., 2006; LI et al., 2007).
A principal utilização da quitosana está relacionada à sua propriedade
antimicrobiana, que têm como responsável à natureza policatiônica da molécula, a
qual interage com a região superficial da bactéria. Micrografias eletrônicas
realizadas por Lifeng et. al. (2004) de S. aureus (bactéria gram-positiva) e E. coli
(bactéria gram-negativa) na presença de quitosana mostram que a membrana do S.
aureus foi enfraquecida ou até mesmo fragmentada, enquanto o citoplasma da E.
coli foi concentrado e o interstício da célula, ampliado.
Zheng e Zhu (2003) demonstraram que a atividade antimicrobiana contra
bactérias gram-positivas aumenta quanto maior a massa molecular do polímero,
enquanto que, para bactérias gram-negativas, quanto menor a massa molecular da
quitosana, maior a atividade antimicrobiana. Esses resultados sugerem que os
efeitos da quitosana são distintos nos dois tipos de bactérias: no caso das gram-
positivas, a hipótese é que quitosana de alta massa molecular forma películas ao
redor da célula que acabam por inibir a absorção de nutrientes, enquanto que
quitosana de baixa massa molecular penetra mais facilmente em bactérias gram-
negativas, causando distúrbios no metabolismo desses microrganismos.
Alguns estudos já demonstraram a eficiência da quitosana como
antimicrobiano sob microrganismos contaminantes em produtos cárneos, como
Staphylococcus aureus, Escherichia coli (LI et. al., 2007) e Listeria monocytogenes
(COMA et al., 2002). Dentre os produtos cárneos com inclusão da quitosana, podem
ser citadas pesquisas com bacalhau (SHAHIDI et al., 2002), carne de cordeiro
(KANATT et al., 2004), salsicha (DAMIAN, 2005) e mortadela (CHI et al, 2006) e em
patê de carne (BENTO, 2008).
CHI et al., 2006, apontaram em seu trabalho inédito, o efeito combinado de
filmes de quitosana enriquecidos com o óleo essencial de orégano, incorporadas em
fatias de mortadela armazenada a 10ºC/5 dias, observando-se uma redução do
número de células bacterianas de aproximadamente 4 ciclos logarítmicos,
comparada com um redução de 1 a 3 ciclos logarítmicos quando aplicado somente o
11
filme de quitosana, constatando ainda que este tipo de processo foi bem aceito em
termos sensoriais.
Neste contexto das inúmeras vantagens para aplicação dos conservantes
naturais em alimentos, deve-se relatar que o uso do óleo essencial de orégano como
aditivo inibidor de crescimento microbiano em alimentos, é limitado pela alteração no
flavor, visto que a dose antimicrobiana efetiva para utilização exclusiva do óleo
essencial de orégano, não atinge o nível organoléptico aceitável. Sendo assim, a
combinação do óleo de orégano e de outras barreiras antimicrobianas sem sabor,
como a quitosana, podem viabilizar uma possível redução na quantidade de aditivos
artificiais, bem como melhorar a estabilidade da vida de prateleira dos alimentos,
sem contanto influenciar nas características sensoriais. Com isso, pesquisas com
intuito de verificar a bioatividade da combinação destes compostos como aditivo
alimentar na inibição de contaminantes em produtos cárneos é essencial, gerando
assim novos horizontes na área da ciência e da biotecnologia, uma vez que a
quitosana e o óleo de orégano são de fontes naturais, seguras e de baixo custo.
12
Objetivos
Geral
Verificar a aplicação de quitosana e óleo essencial de orégano na inibição de
Staphylococcus aureus em hambúrguer.
Específicos
Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida
Mínima (CBM) da quitosana e do óleo essencial de orégano, individualmente e
em ação combinada, sobre cepas de S. aureus em caldo carne.
Avaliar a interferência da quitosana e do óleo essencial de orégano sobre a
dinâmica de crescimento do S. aureus em hambúrguer;
13
Hipóteses ou questões investigativas
A quitosana e o óleo essencial de orégano (origanum vulgare l.) têm ação
inibitória sob a cepa de Staphylococcus aureus em hambúrguer.
14
Metodologia
Cepas bacterianas reveladoras de atividade antimicrobianas
Para os ensaios antimicrobianos foi utilizada cepa padrão de Staphylococcus
aureus ATCC 6538, a qual foi cedida pelo Laboratório de Fermentação e
Experimentação em Alimentos, do Departamento de Nutrição (Campus Recife),
Centro de Ciências da Saúde, UFPE (Recife, Pernambuco, Brasil).
Os inóculos foram obtidos através da preparação de suspensões da cepa em
solução salina estéril (NaCl a 0.85% p/v), a partir de culturas overnight cultivada em
BHI a ± 35 °C. Tais suspensões tiveram sua turbidez padronizada de acordo com a
turbidez do tubo 0.5 da escala McFarland correspondendo à concentração de
aproximadamente 108 Unidades Formadoras de Colônia por mL (UFC/mL). Em
seguida, far-se-á diluições seriadas (1:9 v/v) em solução salina (0.85%) estéril para
obtenção do inóculo desejado (aproximadamente 10 -6UFC/mL).
Obtenção do óleo essencial de orégano e da quitosana
O óleo essencial de orégano foi obtido pela Polo produtos químicos LTDA
(Afogados, Recife, PE, Brasil). Por sua vez, a quitosana utilizada será de crustáceos,
obtido da Sigma- Aldrich (Alto de Pinheiros, São Paulo, SP, Brasil).
Elaboração dos substratos para cultivo de S. aureus
Os ensaios de dinâmica de crescimento microbiano foram realizados
utilizando caldo carne como substratos de cultivo. Para preparação do caldo carne,
aproximadamente 500 g de carne bovina livre de gordura aparente, cortadas em
tamanhos uniformes (3 x 3 x 3 cm), foram cozidas em 1000 mL de água destilada
durante 20 minutos. Em seguida, a porção líquida do material de cozimento
separada do material sólido, e submetida à filtração através da utilização de bomba
15
a vácuo utilizando papel de filtro Whartman n°1. O filtrado obtido foi esterilizado
através do uso de sistema de filtração Millipore (0,45 µm).
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM) do óleo essencial e quitosana em caldo carne
Os testes para determinar a Concentração Inibitória Mínima – CIM e
Concentração Bactericida Mínima – CBM, para a cepa de S. aureus com os
antibacterianos (óleo essencial de orégano e quitosana), foram realizados
isoladamente e em combinação, através da técnica de macrodiluição em caldo
(NOSTRO et al., 2001). Foram preparados tubos de ensaio contendo 5 ml de BHI
acrescido de 0,15% de Ágar bacteriológico, acrescentado de diferentes
concentrações dos antimicrobianos, sendo posteriormente adicionado 1 ml do
inoculo das cepas. O sistema foi incubado a 35-37°C por 24 horas. Ao término do
período de incubação, a mais baixa concentração (mais alta diluição) dos
antimicrobianos que não apresentou crescimento visível (turvação) foi considerada
como Concentração Inibitória Mínima. Após esta observação, alíquotas de 100µL
dos tubos que não apresenta crescimento microbiano visível, foram inoculadas em
placas de Baird Parked. A Concentração Bactericida Mínima foi considerada como a
menor concentração dos antimicrobianos capaz de inibir o crescimento das cepas
em Baird Parked após incubação de 35-37°C por 24-48 horas.
Figura 1: Plaqueamento da amostra Figura 2: Diluição do caldo
16
Produção do Hambúrguer de Carne Bovina
Na produção do Hambúrguer, foram utilizados cortes de carne bovina tipo
alcatra, sal (Pirâmide Ltda., Areia Branca, Brasil), açúcar (União, São Paulo, Brasil),
Óleo de Soja (Soya, Bunge, Recife, Brasil), farinha de Trigo (Dona Benta, Recife,
Brasil), cebola e coentro, disponíveis comercialmente em Supermercados da Cidade
de Recife, Pernambuco, Brasil. A pimenta do reino foi obtida seca e moída em casas
de comércio especializado.
A carne foi primeiramente submetida à trituração em moedor doméstico.
Posteriormente, foram adicionados à carne os demais ingredientes do hambúrguer,
nas quantidades conforme consta na tabela 1.
Tabela 1- Ingredientes para produção de hambúrguer
MATÉRIA- PRIMA QUANTIDADES (g.100g-1)
Carne (alcatra) 1000g
sal 15g
óleo 50 mL
açúcar 30g
pimenta do reino 0,1g
cebola triturada 50g
farinha de trigo 100g
coentro picado 25g
O processamento do hambúrguer foi realizado de acordo com o fluxograma
abaixo.
17
Na formulação, houve de dois tipos de hambúrgueres, sendo um padrão e
outro acondicionado de quitosana e óleo essencial de orégano. Ao se formular os
hambúrgueres não foi acrescentado nenhum percentual de gordura, sendo retiradas
às gorduras da peça da carne anteriormente à moagem. O hambúrguer foi
congelado a - 18°C por 24 horas, sendo as quantidades descongeladas apenas no
momento da realização dos experimentos.
Ação antimicrobiana da quitosana e do óleo essencial sob a Staphylococcus
aureus em hambúrguer
Inicialmente, 360g de hambúrgueres estéreis foram descongelados sob
refrigeração a 4° C, sendo em seguida adicionada à solução antimicrobiana
isoladamente (CBM do caldo carne), e em combinação (CBM/2), sendo a amostra
homogeneizada manualmente por pressão durante 10 minutos. Em seguida, 36 mL
do inoculo de Staphylococcus aureus foram adicionados à amostra, e também
homogeneizados por 10 minutos. Em sala asséptica, as amostras foram então
separadas em 36 sacos de polipropileno estéreis contendo 10g do produto cada,
sendo todos armazenados sob congelamento a aproximadamente -18º C. Nos
tempos 0, 24, 48, 72, 96 horas e 15 dias, as amostras em triplicata foram retiradas
Análises microbiológicas
Carne
Higienização e Visceração
Trituração
Mistura da carne bovina triturada com os ingredientes
Moldagem
Armazenamento (-31ºC)
Fritura em óleo
Fluxograma 01.: Processamento do hambúrguer
18
para a realização da contagem da Staphylococcus aureus. Para tal, 10 g de cada
amostra foi seriadamente diluída (1:10 p/v) em solução salina (0,85 % p/v) estéril,
homogenizada por 5 minutos utilizando vortex, e diluída seriadamente (10-1 a 10-6)
em solução salina (0,85 % p/v) estéril. Em seguida, uma alíquota de 100 µL de cada
diluição (10-1 a 10-6) foi uniformemente inoculada em placas de Petri estéreis
contendo Baird parked. As placas foram incubadas a 35 ºC por 48 horas, sendo os
resultados da contagem bacteriana expressos como Log UFC.g-1. Amostras de
hambúrgueres, preparadas e dividas conforme acima, não receberam os
antibacterianos, para serem utilizadas como controle.
19
Resultados e Discussão
Inicialmente foi determinado os valores da CIM (Concentração Inibitória
Mínima) e o CBM (Concentração Bactericida Mínima) em caldo carne de ambos os
antimicrobianos (óleo essencial de orégano e quitosana).
Nas amostras na qual foi adicionado apenas a quitosana, não houve
crescimento microbiano visível nos tubos e placas somente na diluição a 5 mg/ ml, o
que permite atribuir a esta concentração como sendo a CIM e CBM. Resultados
também satisfatórios relacionados com a inibição de S. aureus com quitosana foi
demonstrado por Fai (2008), que encontrou o valor de 1,50 mg/ml para a CIM. No
entanto, Bento (2008), ao avaliar a ação da quitosana sob cepa de Listeria
monocytogenes, encontrou valores superiores (2,5 mg/ml e 5,0 mg/ml) para a CIM e
CBM, respectivamente.
Os resultados contraditórios obtidos nos diferentes estudos podem ser
justificados pelo fato de diferentes meios de cultura utilizados, bem como diferentes
cepas utilizadas.
Resultados similares foram encontrados por Tsai e Hwang (2004), que
examinando a atividade antibacteriana in vitro frente a algumas bactérias patógenas
e probióticas relataram que para a quitosana com grau de desacetilação entre 70 e
95%, apresenta concentração mínima letal para Staphylococcus aureus, entre 50 a
200 ppm.
É importante relatar que o mecanismo de ação da quitosana sobre os
microrganismos não está completamente elucidado, mas várias propostas são
sugeridas. Segundo Kumar (2000) e Okamoto (2003), a atividade inibitória pode ser
explicada pela presença de grupos amínicos, que, em contato com os flúidos
fisiológicos, tornariam-se protonados e se ligariam a grupos aniônicos desses
microorganismos, provocando aglutinação das células e, como conseqüência,
levariam a inibição do seu crescimento.
Nas amostras que foi adicionado apenas o óleo essencial, não houve
crescimento microbiano visível no tubo, nem na placa, somente na diluição a 10
µL/mL, sendo determinada como sendo a CIM e CBM. Os resultados encontrados
20
neste estudo diferem dos encontrados por Souza (2006) e por Serpa (2007), que
determinou o valor de 20 µL/mL e 3,15 µL/mL respectivamente. Similiar ao que
ocorreu com a quitosana, os resultados contraditórios obtidos nos diferentes estudos
podem ser justificados pelo fato de diferentes meios de cultura utilizados, bem como
diferentes cepas utilizadas.
Sagdiç et al. (2002) também avaliando a ação inibitória do hidrossol de
orégano sobre bactérias patogênicas, observou sua efetividade na inibição de
Staphylococcus aureus. Em outro estudo, Marino et al. (2001) analisando o efeito
antimicrobiano de várias especiarias notaram que o óleo essencial de orégano foi o
mais efetivo na inibição de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, causando
um alongamento da fase lag.
Trabalhos realizados por Burt (2004), já apontavam o interesse na realização
de testes que demonstrassem a ação no alimento, visto que este autor relata que
apesar da quitosana possuir grande potencial na inibição de microrganismos, existe
uma barreira para uso como aditivo devido à interação entre agentes
antimicrobianos e os componentes dos alimentos, que poderiam ser responsável por
diferentes resultados.
Assim, o estudo seguinte procedeu para avaliar o poder da quitosana
isoladamente em matriz alimentar (hambúrguer), sendo os resultados expressos no
gráfico abaixo.
Gráfico 1- Efeito da quitosana sobre a concentração de S. aureus em hambúrguer.
Controle
Quitosana0 2 4 15
tempo (dias)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Lo
g u
fc/m
L
21
Conforme observado no gráfico 1, a presença de quitosana a 5 mg/ml, no
hambúrguer, reduziu de forma significativa ao longo do tempo a quantidade de
Sthaphylococcus aureus, sendo a menor contagem de microrganismo ocorrida no 3º
dia, com redução de 5 UFC/mL. Estes resultados foram bastante satisfatórios,
apontando assim como sendo o uso da quitosana de grande poder inibitório sob
cepa de S. aureus, em hambúrgueres bovinos.
Resultados também positivos referentes à inibição de microrganismos por
quitosana também foram achados por Olsen (2001), que também verificou a ação da
quitosana no combate do S. aureus, e por Li (2007) e Zheng. (2003). Aplicação da
quitosana em outros produtos cárneos também apresentou resultados satisfatórios
(SHAHIDI et al., 2002; KANATT et al., 2004; DAMIAN, 2005; CHI et al, 2006;
BENTO, 2008).
É importante ressaltar que diversos estudos apontam a quitosana como um
antimicrobiano em teste “in vitro”, entretanto, vale mencionar que este presente
estudo demonstra a ação da quitosana na inibição do S. aureus em matriz alimentar
(hambúrguer), o que o torna de suma importância para a comunidade científica e
para a indústria de alimentos.
O experimento seguinte foi para avaliar o poder do óleo isoladamente, bem
como o mesmo com a quitosana, em matriz alimentar de hambúrguer, sendo os
resultados expressos abaixo.
22
Gráfico 2- Efeito da quitosana e do óleo isolados e em combinação sobre a
concentração de S. aureus em hambúrguer.
De acordo com o demonstrado no gráfico 2, a presença tanto do óleo
essencial de orégano, bem como a associação do óleo e da quitosana, reduziram de
forma significativa (5 UFC/ mL), ao longo do tempo a contagem de Sthaphylococcus
aureus, quando comparados com o experimento controle. Ao verificar o declínio na
população de S. aureus no produto adicionado apenas do óleo, observa-se que a
menor contagem ocorreu no 4º dia, o que diferiu no produto adicionado de ambos os
antimicrobianos associados, no qual a menor contagem ocorreu logo no 3º dia.
Outro fato que chama atenção foi à eficácia imediata na redução de S. aureus nas
amostras com quitosana e óleo essencial, logo após o 1º dia, diferente do que
ocorreu nas amostras apenas com quitosana (gráfico 1), cuja a queda brusca na
contagem ocorreu somente após o 3º dia. É importante observar também que após o
4º dia de armazenamento, todas as amostras permaneceram com contagem de
cepas constantes, confirmando assim a estabilização do crescimento microbiano em
decorrência do frio (congelamento).
Assim, diante dos resultados relatados acima, esta pesquisa sugere que a
associação de quitosana e óleo essencial de orégano em hambúrguer, podem
reduzir a quantidade de antimicrobianos necessários quando utilizados em
combinação, uma vez que obteve melhores valores do que os antimicrobianos
utilizados isoladamente. Resultados também positivos na associação de ambos os
antimicrobianos, foram encontrados por Chi et al. (2006), ao relatarem que ao
Controle
Óleo
Quitosana + Óleo0 2 4 15
tempo (dias)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
log u
fc/m
L
23
incorporar filmes de quitosana com óleo essencial em orégano em fatias de
mortadela, também obteve uma redução de bactérias que são contaminantes em
carnes e sub-produtos. Dessa forma, a presença do óleo essencial junto à quitosana
representa segundo ambos os trabalhos, como sendo uma alternativa para o
aumento no controle de microrganismos de grande ocorrência em produtos cárneos.
Evidências científicas tem respaldado a inclusão da quitosana em alimentos,
através de sua atuação como base na fabricação de suplementos nutricionais,
emulsificantes, conservantes, fibras em biscoitos dietéticos, estabilizantes em
alimentos em conservas, clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al., 1999; BORGOGNI
et al., 2006; LI et al., 2007) atuando ainda diretamente na produção de alimentos
como pães e desacidificadando frutas (DAMIAN, 2005). Além disso, a quitosana é
considerada pela legislação vigente como alimento com característica funcional e
tem apresentado destaque para o crescente consumo decorrente de suas inúmeras
qualidades (Decreto nº 55871/65).
Por fim, tais resultados estimulam a realização de pesquisas
complementarem, que avaliem se a adição destes antimicrobianos influencia nas
características de qualidade (físico-quimica e sensorial), bem como outros estudos
que também averiguem o controle de outros patógenos emergentes, tendo sempre
como objetivo a produção cada vez maior de alimentos com longa vida de prateleira,
seguros, e naturais.
24
Conclusões
Os resultados obtidos nesta pesquisa ratificam a ação dos antimicrobianos
naturais, quitosana e óleo essencial de orégano, isoladamente e em associação, no
controle de Staphylococcus aureus. Outro achado dessa pesquisa de grande
interesse para comunidade científica é a aplicação destes antimicrobianos em matriz
alimentar, neste caso representada pelo hambúrguer bovino, produto este de grande
consumo pela população. Dessa forma, conclui-se que o presente estudo irá
contribuir tanto para a comunidade científica e indústrias de produtos cárneos, como
também para os consumidores, uma vez que irão adquirir alimentos com menor
quantidade de aditivos artificiais, com segurança sanitária e qualidade total.
25
Referências
BARBOSA, L. N.; Propriedade antimicrobiana de óleos essenciais de plantas condimentares
com potencial de uso como conservante em carne e hambúrguer bovino e testes de aceitação.
2010. Dissertação de mestrado em Biologia. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
São paulo, Brasil.
BAYDAR, H.; SAGDIÇ, O.; OZKAN, G.; KARADOGAN, T. Antibacterial activity and composition of
essesntial oils from Origanum. Thymbra and Sartureja species with commercial importance in Turkey.
Food Control, v.15, n. 3, p. 169-172, 2004.
BENTO, R. A. Bioatividade de quitosana produzida por mucor rouxii no controle de listeria
monocytogenes em produto cárneo. 2008. Tese de Doutorado em Nutrição. Universidade Federal
de Pernambuco, Brasil.
BLAIOTTA, G.; ERCOLINI, D.; PENNACCHIA, C.; FUSCO, V.; CASABURI, A.; PEPE, O. PCR
detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp strain isolated from meat and
dairy products.Evidence for new variants of seg and sei in S. aureus AB-8802. Journal of Applied
Microbiology, v.97, p. 719-730, 2004.
BORGOGNI, C. F.; POLAKIEWICZ, B.; PITOMBO, R. N. M. Estabilidade de emulsões de d-limoneno
em quitosana modificada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 26, n. 3, p. 502-508, 2006.
BRAGA, L. C.; SHUPP, J. W.; CUMMINGS, C.; JETT, M.; TAKAHASHI, J. A.; CARMO, L.S.;
CHATTONE- SOUZA, E.; NASCIMENTO, A. M. A. Pomegrate extract inhibits Staphylococcus aureus
growth and subsequent enterotoxin production. Journal of Ethnopharmacology, v. 96, p. 335-339,
2005.
BURT, S. Essencial oils: their antibacterial properties and potential application in foods – a review.
International Journal of Food Microbiology, v. 94, n. 3, p. 223-253, 2004.
CHI, S.; ZIVANOVIC, S.; PENFIELD, M. P. Application of Chitosan Films Enriched with Oregano
Essential Oil on Bologna – Active Compounds and Sensory Attributes. Food Science and
Technology International, v. 12, n.2, p.111, 2006.
CHIEN, P. J. et al. Quality assessment of low molecular weight chitosan coating on sliced red pitayas.
Journal of Food Engineering, v.79, p. 736-740, 2007.
COMA, V. et al. Edible antimicrobial films based on chitosan matrix. Journal of Food Science, v. 67,
n. 3, p.1162-1169, 2002.
DAMIAN, C. Efeito da quitosana na digestibilidade aparente da gordura e na qualidade de
salsichas frankfurt. 2005. Tese de Doutorado em Nutrição. Universidade Federal de Santa Catarina,
Brasil.
ERNANDES, F. M. P. G.; GARCIA-CRUZ, C. H. Atividade antimicrobiana de diversos óleos
essenciais em microorganismos isolados do ambiente. B. CEPPA, Curitiba v. 25, n. 2, p. 193-206,
2007.
26
Fai, A. E. C.; Potencial do efeito antibacteriano in vitro de quitosana extraída de Mucor
circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos
Dissertação de mestrado em Biologia. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” São
paulo, Brasil.
KANATT, S. R.; CHANDER, R.; SHARMA, A. Effect of irradiated chitosan on the rancidity of radiation-
processed lamb meat. International Journal of Food Science and Technology, v.39, p. 997-1003,
2004.
KASNOWSKI, M. C. Listeria ssp., Escherichia coli: Isolamento, identificação, estudo sorológico
e antimicrobiano em corte de carne bovina (alcatra) inteira e moída. 111p. 2004. Dissertação de
Mestrado, Universidade Federal Fluminense, Brasil.
KUMAR, M.N.V.R. A review of chitin and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers,
v. 46, n. 1, p. 1-27, 2000.
LEUSCHNER, R. G. K.; ZAMPARINI, J. Effects ofspices on growth and survival of Escherichia coli
0157 and Salmonella entérica serovar enteridis broth model systems and mayonnaise. Food Control,
v.13, n. 6-7, p. 339-404, 2002.
LI, Y.; CHEN, X. G.; LIU, N.; LIU, C. S.; LIU, C. G.; MENG, X. H.; YU, L. J.; KENEDY, J. F.
Physicochemical characterization and antibacterial property of chitosan acetates. Carbohydrate
Polymer, v. 67, n. 2, p. 227-232, 2007.
LIFENG, Q.; ZIRONG, X.; JIANG, X.; CAIHONG, H.; XIANGFEI, Z. Preparation and antibacterial
activity of chitosan nanoparticle. Carbohydrate Research, v. 339, n. 16, p.2693-2700, 2004.
MARINO, M.; BERSANI, C.; COMI, GIUSEPPE. Impedance measurements to study the antimicrobial
activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food
Microbiology. 67: 187-195, 2001.
MELO FILHO, A. B.; BISCONTINI, T. M. B. & ANDRADE, S. A. C. Níveis de Nitrito eNitrato em
salsichas comercializadas na Região Metropolitana do Recife. Revista Ciência e Tecnologia de
Alimentos, v.24, n.3, p.390, 2004.
NOSTRO, A. et al. Effects of Helichrysum italicum extract on growth and enzymatic activity of
Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 17, p. 517-520, 2001.
OKAMOTO, Y.; YANO, R.; MIYTAKE, K.; TOMOHIRO, I.; SHIGEMASA, Y.; MINAMI, S. Effects of
chitin and chitosan on blood coagulation. Carbohydrates polymers, v. 53, n. 3, p. 337- 342, 2003.
OLIVEIRA, C. E. V.; STAMFORD, T. L. M.; GOMES NETO, N. J.; SOUZA, E. L. Inihibition of
Staphylococcus aureus in vroth and meat model using synergies of phenolic compounds and organic
acids. Food Microbiology, v. 19, n. 1, p.97-108, 2010.
OLSEN, R et al. Biomedical applicatons of chitin and its derivatives. In: SKJAK BRACK, G.;
ANTHOSEN, T.; SANDFORD, P. A. (Eds.). Chitin and chitosan: sources, chemistry, biochemistry,
physical properties and applications. Elsevier Applied Sciences, New York, 2001.
PEREIRA, A. A. et al. Caracterização Química e Efeito Inibitório de Óleos esssenciais Sobre o
Crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.32,
n.3, p.887, 2008.
SAGDIÇ, O.; KUSÇU, A.; OZCAN, M.; OZÇELIC, S. Effects of Turkish spices extracts at various
concentrations on the growth of Escherichia coli 0157:H7. Food Microbiology. 19: 473-480, 2002.
27
SERPA, R.; LIMA, M. C.; ZARINI, S.; KRAUSE, L. C.; RODRIGUES, M. R. A.; RIBEIRO, G. A. Perfil
Químico e Avaliação da Atividade Antibacteriana do Óleo Essencial do “Orégano” - Origanum Vulgare
Linnaeus. In: XVI CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E IX ENCONTRO DE PÓS-
GRADUAÇÃO, Pelotas, 2007.
SHAHIDI F.; ARACHCHI, J. K. V.; JEON, Y. J. Food applications of chitin and chitosans. Trends in
Food Science e Technology, v.10, p. 37-51, 1999.
SHAHIDI, F. KAMIL, J., JEON, Y. -J., KIM, S. K. Antioxidant role of chitosan in a cooked cod (Gadus
Morhua) model system. Journal of Food Lipids, v.9, p.57-65. 2002.
SKANDAMIS, P.;TSIGARIDA, E.; NICHAS, G.J.E. The effect of orégano essential oil on survival/death
of Salmonella typhimurium in meat stored at 5 °C under aerobic, VP/MAP conditions. Food
Microbiology, V. 19, n. 1, p.97-108, 2002.
SOUZA, E. L. Potencial antimicrobiano do óleo essencial de orégano (origanum vulgare L.):
uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos. 134p. 2006. Tese de
Doutorado em Nutrição. Universidade Federal de Pernambuco, Brasil.
TSAI, G. –J., HWANG, S. –P. in vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some
intestinal bacteria. Fisheries Science, v.70, p. 675-681, 2004.
ZHENG, L. Y.; ZHU, J. F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights.
Carbohydrate Polymers, v. 54, p. 527-530, 2003.
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