Metode Imunokimiauntuk analisis senyawa aktif
Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy
Institut Teknologi Bandung
Analisis Imunokimia
Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara Antigen-Antibodi
Penggunaan senyawa penanda (label) untuk visualisasi reaksi
Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia
Prinsip Reaksi : meniru reaksi imunologi dalam tubuh
Reaksi imunologi di dalam mamalia :
AgAb Reaksi primer
Reaksi sekunder
Reaksi tersier (degranulasi,opsonisasi)
(Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)
memicu
Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?
Reaksi dan kekuatan antibodi untuk “specific and reproducible protein binding”
Prinsip reaksi : immunoassays
Antigen-Antibody Interaction for analysis
SUBSRATE
PRODUCT (visualized)Complex
Ag-Ab-Label
Metode analisis berbasis imunokimia
Imunopresipitasi Imunoaglutinasi Imunokimia berlabel : EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay) RIA (Radio ImmunoAssay) IFA (ImmunoFluorescence Assay) LIA (Luminescence Immuno Assay) dll
Antigen (antibody generator)
Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat menginduksi sistem imun mamalia
Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun mamalia
Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000),
chemical structure → Complex Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan
antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein untuk meningkatkan immunogenicity
Yang dapat menjadi antigen
Mikroba patogen dan atau toksin mikroba Toksin tanaman, hewan Protein spesifik atau senyawa lain yang
berstruktur spesifik Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak
imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan suatu protein carrier (contoh : BSA)
Senyawa pestisida, dll.
Apakah Antibodi? Antibodi adalah protein yang disekresi oleh
sel plasma limfosit B akibat stimulasi molekul asing (antigen) pada reseptor antigen limfosit B
Spesifik terhadap antigen yang memicunya Antibodi adalah molekul-molekul
glikoprotein yang dikenal sebagai immunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG
SIFAT UMUM ANTIBODI Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat
berikatannya antigen secara spesifik, disebut sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding) yang univalen, masing-masing memiliki satu situs pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala hal
Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable), fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh
Struktur Antibodi
Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua rantai ringan (light chain = L).
Rantai H IgG () memiliki massa molekul sekitar 50 –55 kDa, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massa molekul sekitar 65 – 70 kDa.
Rantai L (dengan massa molekul 20 – 25 kDa) memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan berikatan dengan seluruh kelas rantai H.
Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di reduksi atau oksidasi.
Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat berinteraksi dengan sel dan sistem efektor dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya dapat berinteraksi dengan antigen.
Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan dengan antibodi disebut ‘epitope’ atau disebut ‘antigenic determinant’, sedangkan lokasi pada struktur antibodi yang dapat berikatan dengan antigen disebut ‘paratop’.
IgG and IgM
IgG IgM
Specificity and Selectivity
Monoclonal Antibody Polyclonal Antibody Recombinant Monoclonal Antibody
KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL DIBANDINGKAN POLIKLONAL
Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah diseleksi sebelumnya.
Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi non-spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi poliklonal.
Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan antigen-antibodi poliklonal.
Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis kandungan antibodinya.
Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ, deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.
Teknik lain untuk produksi antibodi monoklonal Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi
cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau murine
Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.
Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri, skrining dengan western blot
Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan antibodi Fab yang murni
Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan modifikasi fungsi efektor
Penggunaan Prinsip reaksi Antigen-Antibodi di bidang Farmasi
Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosis untuk Penyakit Infeksi
Drug Monitoring and Toxicology Cancer Research Proteomic Study
KINETIKA INTERAKSI ANTIGEN-ANTIBODI
Antigen-Antibody Interaction
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)
Antigen
AntibodiKompleks Ag-Ab
Konjugat enzim pada Ag-Ab
Substrat
Produk berwarna
Reaksi enzimatik
Kinetika reaksi Antigen-Antibodi
Reaksi reversibel
Ag + Ab Ag-Abk1
k2
k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi
Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :
d (Ag-Ab)
dt= k1(Ag) (Ab) – k2 (Ag-Ab)
k1/k2 =(AgAb)
(Ag) (Ab)= K (konstanta kesetimbangan)
Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi, demikian sebaliknya
B (terikat)
B/F (rasio terikat dan bebas)
0
5.00
5.00
Bila F adalah antigen bebas, dan B adalah antigen yang terikat, Abx adalah konsentrasi awal Ab,maka pada kesetimbangan :
K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab)
= B / F [(Abx)-B]
Jadi B/F = K [(Abx)-B]
Slope = -K, potongan dgn x adalah b, potongan dgn y adalah Kb
Reaksi pada permukaan bahan padat dan cair
Kebanyakan metode imunokimia yang ada dibuat dalam media/fase padat (solid phase) untuk memudahkan proses pemisahan dalam percobaan yang heterogen
Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat, ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2 dipengaruhi oleh interaksi sterik
Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil dibandingkan reaksi di dalam larutan
Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padat-cair secara praktis merupakan reaksi irreversibel
Parameter analisis
Sensitivitas Spesifisitas Selektivitas
Hal yang mempengaruhi parameter : Reaksi silang Adanya senyawa yang mempengaruhi
aviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea
Bagaimana menentukan jenis analisis imunokimia berlabel?
Reaktan apa yang akan diberi label, antigen (analit) atau antibodi?
Apakah antigen atau antibodi yang akan ditentukan?
Apakah analisis kompetitif atau non-kompetitif?
Apakah sistem analisis homogen atau heterogen?
Pengelompokkan jenis analisis imunokimia
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label
3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih
5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik
6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label : Analisis ini mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi, luminesensi atau enzim.
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label : analisis ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung pada afinitas antibodi berlabel
3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun: analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi, turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih: analisis sandwich seperti 2-site immunometric assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi yang tidak berikatan akan dibuang
1. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik : analisis ini melibatkan antigen amobil berlebih pada fase padat untuk menangkap antibodi spesifik di dalam sampel.
2. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal: analisis ini termasuk imunokimia homogen untuk memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label yang digunakan
Reaksi Imunokimia dengan jumlah antibodi berlebih (tipe I)
Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antibodi Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi
yang tidak terhingga Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi
reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi
oleh senyawa seperti garam atau urea Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel
2-site immunometric sandwich assay(non-kompetitif untuk Ag polivalen)
Ukur aktivitas labelnya
Ab1 Ag
pencucian
Ab2 berlabel
ditambahkan berlebih
inkubasi
Pencucian dan inkubasi
Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antigen Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi
antibodi mendekati 0 Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas
antibodi Sensitivitas maksimum 10-14 mol/liter (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang akan
menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada laju konstanta kesetimbangan antara analit dan antigen cross-reactant tersebut
Reaksi dalam percobaan lambat karena kesetimbangan harus tercapai
Reaksi Imunokimia dengan jumlah antigen berlebih (tipe II)
Imunokimia kompetitif dengan analit berlabel
+ +Ag Ag-berlabel Ab
+
Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit bebas
Sensitivitas metode
Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira 17%
Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira 10-11 liter/mol
Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira 10-13 mol/liter (kira-kira 108 molekul per mL)
ANALISIS IMUNOKIMIA
DENGAN LABEL NON-RADIOAKTIF
Karakteristik suatu label untuk analisis imunokimia
Memiliki aktivitas spesifik Mudah dideteksi Tidak berbahaya
Aktivitas spesifik label berhubungan dengan :
Fraksi pada label yang akan digunakan untuk deteksi
Derajat amplifikasi Efisiensi deteksi
Syarat Enzim yang ideal sebagai label Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km
rendah) Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral) Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi
lanjutan atau dalam penyimpanan Tersedia dalam keadaan murni (high purity) Harga murah Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang
akan diuji
Contoh enzim sebagai label
Enzim dan sumber
pH optimum Aktiv.spes (U/mg, 37 C)
BM
Alkalinfosfatase (usus sapi)
8-10 1000 100.000
-galaktosidase (E.coli)
6-8 600 540.000
HRP (lobak) 5-7 4500 40.000
Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin deaminase, invertase, -laktamase, dll.
Enzim dan sumbernya B-galaktosidase Peroksidase Glukosa oksidase A-amilase G6PDH MDH Heksokinase Propionil-CoA-karboksilase Lisozim
Escherichia coliLobakAspergillus sp.Bacillus subtilisLeoconostoc mesenteroidesLactobacillus arabinosusSaccharomyces sp.Saccharomyces sp.Egg-white
Senyawa berfluoresensi sebagai label Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar
terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama proses eksitasi
Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi dan sinyal semakin kecil
Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi, lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan polarisasi meningkat
Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label bebas menjadi hal yang penting, karena akan mempengaruhi polarisasi label yang terikat
Syarat ideal Senyawa Fluoresensi sebagai label
Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi (absorptivitas molar tinggi)
Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi pengaruh “latar belakang” (background) akibat scattering
Larut dalam air Mudah dikonjugasi dengan molekul lain Harga murah
Contoh label fluoresensiFluorofor Quantum
yieldLifetime (ns) Emisi/eksita
si (nm)Absorptivitas
(liter/mol)
Dansil klorida
0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3
Fluoresein isotiosianat
0,85 4,5 520/492 7x10 4
Rhodamin B isotiosianat
0,7 3,0 585/550 1,2x10 4
Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini banyak digunakan untuk label fluoresensi
Europium, terbium, samarium, memiliki emisi fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai milidetik)
Dapat menghilangkan pengaruh background
Reaksi silang (cross-reaction)
Ketepatan suatu analisis tergantung pada spesifisitas nya
Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik, namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur kimia dari analit lain
Reaksi silang dievaluasi dengan cara membandingkan kemampuan masing-masing analit terhadap ikatan dengan label
B (%)
Cross-reactantStd
x1 x2
100
50
Log konsentrasi
% reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%
Perkembangan metode Imunokimia Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik
pada Ag virus Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia
menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor berikatan dengan ligand yang dilabel dengan radioaktif (3H atau 125I)
Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil
Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay
Metode Scintillation Proximity
FI A + L* FI A L*
sinar
Radiasi
Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A) yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi akan memancarkan sinar
Metode Idiometrik Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis
antibodi “anti-idiotipik” (anti-idiotypic antibody) selain antibodi utama
Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel
Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau tidaknya analit pada situs ikatannya
Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian paratop (daerah ikatan Ag pada Ab)
Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya estradiol
Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay
Untuk mengukur kadar antigen yang sangat kecil : Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma
(pada kasus tumor) Thyrotropin dalam serum darah Luteinizing hormon dalam serum darah anak-
anak Growth hormon
Top Related