第四章 柠檬酸发酵机制•
柠檬酸又名枸橼酸,学名α-羟基丙烷三羧酸,是生物体主要代谢产物之一。
• 性质:
• 分子式 C6H8O7,分子量 192.12
有两种形式
• 水合物: 100℃时融解,密度 1.542g/cm3(18℃) 无水物:无色晶体或粉末,熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚
用途:
• 1 )食品行业
• 2 )医药行业
• 3 )化工行业
• 4 )其它行业
柠檬酸的生产:
• 1874 年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体; 1913 年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。
一、柠檬酸合成途径
葡萄糖
丙酮
酸 柠檬酸
乙酰 -CoA
草酰乙酸
EMP 途径 氧化脱羧
羧化
• 1953 年, Jagnnathan 等证实了黑曲霉中存在 EMP 途径的所有酶;
• 1954 年, Shu 提出葡萄糖分解代谢中约80%走 EMP 途径;
• 1958 年, MeDomough 等发现黑曲霉还存在 HMP 途径的酶,但 HMP 途径主要存在于孢子形成阶段;
• 1954 - 1955 年, Ramakrishman 和 Martin 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环;
淀粉 葡萄糖 6-磷酸果糖
1, 6- 二磷酸果糖
磷酸丙糖
磷酸烯醇丙酮酸
丙酮酸 乙酰 CoA
苹果酸
草酰乙酸 柠檬酸
顺乌头酸
异柠檬酸
α-酮戊二酸琥珀酸
富马酸
CO2
Fe 2+
CO2CO2
•存在两个 CO2固定系统(需 Mg2 +、 K +):
• 1 )丙酮酸( PYR )在丙酮酸羧化酶作用下,生成草酰乙酸(此作用更强)
• 2 )磷酸烯醇丙酮酸( PEP )在 PEP激酶的作用下,生成草酰乙酸
碳平衡和能量平衡
C6H12O6 EMP 途径
2ADP2ATP
2H2
9ADP 9ATP
2×C3H4O3
丙酮酸脱羧CO2 固定C4C2 缩合
H2O
3/2O23H2O
C6H8O7
柠檬酸
• (一)、糖酵解及丙酮酸代谢的调节• 1 、正常情况下,柠檬酸、 ATP 对磷酸果糖激酶有抑制作用,而 AMP 、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用,特别是还能解除柠檬酸、 ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系,正是由于细胞内浓度升高,使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。
二、柠檬酸生物合成的代谢调节
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1, 6- 二磷酸果糖
磷酸丙糖
磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸 乙酰 CoA
草酰乙酸 柠檬酸
CO2
CO2CO2
NH4+
Pi
K+
AMP ATP
• 2. 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现,锰缺乏时黑曲霉的组成(合成)代谢受损伤,这与柠檬酸的积累有关。
• 锰缺乏时,细胞内 NH4+ 浓度高, Aa浓度高
(蛋白合成受阻,导致升高)。因此,锰离子效应是通过 NH4
+升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。
• 3. 丙酮酸激酶是 EMP 途径的第 2个调节点,在某些真菌得到证实,但黑曲霉未被证实。
(二) TCA 循环的调节
• 1 、 TCA 环的起始酶:柠檬酸合成酶是一种调节酶。但
在黑曲霉中,柠檬酸合成酶没有调节作用,这是黑曲霉 TCA 环的第一个特点。
• 顺乌头酸酶失活,阻断 TCA 环是柠檬酸积累的必要条件,顺乌头酸水合酶需要 Fe2 +。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0 时失活,线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸 =90 : 3: 7的平衡,这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使 pH值降低。
• 2. 第二个特点:黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱 氢酶缺
失或活力很低( TCA 环被阻断),它被葡萄糖和 NH4+
抑止 。(是 TCA 循环中唯一不可逆的反应步骤)
• 3. 氧和 pH值对柠檬酸发酵的影响很大。
• 氧是发酵过程( EMP 途径和丙酮酸脱 氢)生成的 NADH2
重新氧化时所需
• 标准呼吸链产生 ATP 积累,侧呼吸链不产生 ATP ,缺氧导致侧呼吸链失活,使 ATP 积累,柠檬酸积累减少。
磷酸烯醇丙糖酸
丙酮酸 乙酰 CoA
苹果酸
草酰乙酸 柠檬酸
顺乌头酸
异柠檬酸
α-酮戊二酸琥珀酸
富马酸
CO2
Fe 2+
CO2
CO2
抑制
α- 酮戊二酸脱 氢酶系
TCA 循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为:
• ( 1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键
• ( 2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基 本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱,而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供,增加了柠檬酸的合成能力
• ( 3) TCA 循环的阻断微弱,导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态,使柠檬酸积累,当柠檬酸浓度超过一定水平时,就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。
柠檬酸的积累机制归纳:①Mn 抑制蛋白
合成 NH4 解除磷酸果糖激酶的代谢调节,促进EMP 途径的畅通
有一条呼吸活力强的不产生 ATP的侧系呼吸链
② 由于丙酮酸羧化酶是 组成型酶,不被调节控制。
2+ ﹢缺乏
③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定两个反应的平衡,以及柠檬酸合成酶不被调节,增强了合成柠檬酸的能力。
④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡:
柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸 =90 : 3: 7 同时控制 Fe2+含量时,顺乌头酸酶活力降低,使柠檬酸积累。
⑤随着柠檬酸积累, pH降低到一定程度时,使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。
三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸
• 丙酮酸脱羧 反应是不可逆的,草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成
• 存在异柠檬酸裂解酶,合成柠檬酸的 C4二羧酸只能由乙醛酸提供。
乙醇 乙酸
乙酰 CoA
CoA
烃类 β- 氧化
草酰乙酸 柠檬酸
异柠檬酸
琥珀酸
乙醛酸
乙酰 CoA
苹果酸
富马酸
乙醛酸循环
• 作业:• 简述柠檬酸生物合成的代谢调节
Top Related