–צביעת תאים התא 1מעבדה :מבוא -לסימון או זיהוי של חומר ביולוגי כגון מאקרובסיסית ) היא שיטת עבודה Staining( צביעה מולקולות,

תאים. בחקר התא משמשים בצביעה לרוב על מנת לסמן מבנים תאיים לזיהוי ואברונים בתא. צביעה נםלזהות את מיקומם וארגו תמאפשר מיטוכונדריהלדוגמא, צביעה של במיקרוסקופ.יל המוכנס לתא באופן פע היא צביעה בחומרלדוגמא, צביעת חיות .כמבדק ביולוגיגם יכולה לשמש

באופן ישיר בכמות או מידת הפעילות ר קישור או כניסת הצבע תלוייםאשולכן צובע רק תאים חיים. כשל החומר הביולוגי ניתן לכמת את הצביעה. דוגמא לכך היא למשל קביעה של ריכוז חלבון על ידי

החלבון. לכן עוצמת הצביעה היא יחסית לכמותחלבונים וב קשרים פפטידים שימוש בחומר המזהה

.שיכול להשפיע על פעילות הדוגמאא ביעה של חומר ביולוגי דורשת הוספה של חומר זר לדוגמצצביעה ,יתרה מכך .לתא ויכולים להפריע לפעילותו התקינה צבע רבים הם רעילים יחומרלמעשה,

קיבוע נעשה בשמטרתו לשמר מבנים. )Fixationבחומרים מסוימים מחייבת תהליך של קיבוע (. המבנים התאיים החוזק שלמגביר את לכן שימוש בחומר שיוצר קשרים כימים בין מולקולות בתא ו

) על מנת permeabillizationבתהליך של הגברת חדירות (גם עבור צביעות מסוימות יש צורך התהליכים הללו מוסיפים גורמים נוספים ומלאכותיים לניסוי בע לתוך התא.צה אפשר כניסה שלל

-(ארטיפקטים Artifacts.יש צורך לבחון מה שיטת הצביעה ,לכן ) שעלולים להשפיע על התוצאהכחלק מהמהלך התקין של הניסוי. לשלילת השפעה של ארטיפקטים המתאימה לניסוי ולבצע ביקורות

:מערכת הניסוי

רקמה צפופה של תאים צמודים המצפה חללים ומשטחים פנימיים או תאי אפיתל בונים : לתתאי אפיעל פי ,הפרדה מהסביבה. תאי אפיתל יםובכך יוצר תאי העור ותאי הריאה, , לדוגמא,בגוף חיצוניים

על רקמת חיבור (ללא מגע תיושבשכבת התאים הראשונה מאורגנים במבנה שכבתי כאשר ,רוב), Apical) ואפיקלי (Basalתאי אפיתל הם קוטביים ויוצרים שני משטחים, באזלי (ישיר עם כלי הדם).

השונים בתכונות שלהם ובפעילות שלהם.

אפיתל מתחלקים מהר ובכך מחדשים את הרקמה. בתאי אפיתל מרובד, שיוצרים מבנה רב תאי את התאים ודוחפים )Basal Laminaשכבתי, התאים המתחלקים קרובים לשכבה הבסיסית (

., לדוגמא שכבת העור החיצוניתהתאים החיצוניים נושרים .מעליהם כלפי חוץ

:יםצבע Trypan blue ומספר אברונים. הצבע הציטופלסמההחודר לתוך תאים מתים וצובע את : חומר צבע

התא החי ולכן משמש לזיהוי ספציפי של תאים מתים. ממברנתחודר את אינו

Janus green: וצבעו שקוף כאשר הוא מחוזר וירוק חומר צבע החודר לתוך תאים- כאשר הוא כחול cytochromeה יש אנזימים מחמצנים (מחומצן. מאחר ובממברנה הפנימית של מיטוכונדרי

oxidaseנדריה נראות צבועות. ו) רק מיטוכ

Methylene blueחומר צבע בעל מטען חיובי הנקשר לשלד החיצוני של מולקולת ה :- DNA שטעונההצבע צובע את הגרעין בצבע כחול.שלילית (בגלל קבוצות הפוספט).

Coommassie blue : הצבע נקשר בעיקר לשיירים . םבלתי ספציפי לחלבוניצבע הנקשר באופן חומר

הצבע צובע את הציטופלסמה בכחול בהיר עם עם לכן .בתנאים חומציים חומצות אמינו ארומטיותשל נקודות כהות של אגרגטים של חלבונים. בנוסף הצבע צובע את קרום הגרעין ובתוך הגרעין את

-תן לראות את אזור ה. לעיתים ניכרומטיןהגרעינון וחלבונים קושרי endoplasmic reticulum . בשביל צביעה זו יש צורך לקבע את התאים ולהגביר את חדירות הממברנה.

י אדם מורכבת מתאים חהשכבה החיצונית של תאי אפיתל מל במעבדה נבחן האם: מטרת המעבדהן כחול החודר רק לתאים מתים. עשה שימוש בצביעה עם טריפנלצורך כך . או חיים מתים

ת מספר שיטובנוסף על מנת ללמוד על מבנה התא נערוך תצפית על מבני התא השונים בעזרת .אברונים שונים בתאצביעה, המסמנות מולקולות או

:ציוד לזוג /מכסה זכוכיות נושאות. 2 חד פעמי (סטרלי) .מקל1 לק שקוף. 3 . פיפטות פסטר 4 . צלחת קטנה6נייר סופג . 5

:חומרים לזוג להגברת חדירות : ממיס את הממברנה של התא(TRITON X-100 10%)דטרגנט .1

.הצבע2 . Phosphate Buffer Saline (PBS).תמיסה המכילה מומסים בריכוז דומה לזה שבתוך התא : משמשת לקיבוע התאים.חומצה ה. חומצה אצטית: 3 4 .Trypan blue 5 .Janus green 6 .Methylene blue 7 .Coommassie blue

(עבודה בזוגות)מהלך העבודה

:איסוף תאיםא. לתוך הצלחת הקטנה. PBSטיפות של מספרטפטפו בעזרת פיפטת פסטר .1 טבלו בעזרת מקל גרדו בעדינות את דופן הלחי הפנימית. מספר רב של תאים ייצמד למקל. .2

-בעדינות את המקל בתמיסת ה PBS .בצלחת על מנת להסיר את התאים מהמקל לתוך התמיסהניתן להבחין בעכירות התמיסה לאחר הוספת התאים.

:צביעת תאים. ב M וק ועבור יאנוס יר J ,צביעת טריפן כחול עבור T את האותרשמו על הקצה של זכוכית נושאת .1

על סימון נכון של הזכוכיות על מנת לא לבלבל בין הצביעות השונות. הקפידו עבור מתילן כחול.. בעזרת פיפטת פסטר טפטפו טיפה של תמיסת תאים על זכוכית נושאת .2 דקות. 5על התאים ומדדו ) לפי סימון הזכוכיותהמתאימה ( הצבעשל תמיסת טיפות שתיטפטפו .3 הצמידו את הנייר הסופג .תאיםשימו לב לא לגעת בנייר סופג. תמיסת הצבע על ידי ספגו את .4

לצד הטיפה והניחו לכוח הנימיות לספוג את הנוזל.. PBSשל טפטפו שתי טיפות . 5 נייר סופג.על ידי התמיסה ספגו את .6 על דפנות הזכוכית המכסה על מנת לק שקוףמריחו . הטיפההניחו בעדינות זכוכית מכסה מעל .7

. לאטום את הדוגמא הניחו על המגש והמשיכו בעבודה. הדוגמא מוכנה לצפייה במיקרוסקופ. .8

:צביעת חלבונים. ב –רשמו על הקצה של זכוכית נושאת .1 C. . בעזרת פיפטת פסטר טפטפו טיפה של תמיסת תאים על זכוכית נושאת .2 דקות. 2 ודומד על התאים )תמיסת הקיבוע( יתטחומצה אצ של טיפות שתי טפטפו .3 הצמידו את הנייר הסופג .תאיםשימו לב לא לגעת בנייר סופג. על ידי הקיבועתמיסת ספגו את .4

לצד הטיפה והניחו לכוח הנימיות לספוג את הנוזל.. PBSשל טפטפו שתי טיפות .5 נייר סופג.על ידי התמיסה ספגו את .6 שניות. 15 ודומד) Triton X-100(תמיסת הדטרגנט שלטפטפו שתי טיפות .7 נייר סופג. על ידי הדטרגנט תמיסת ספגו את .8 . PBSשל טפטפו שתי טיפות .9 נייר סופג.על ידי התמיסה ספגו את.10 דקות. 2 ודומד Coommassie blueהצבע תמיסת טיפות של שתיטפטפו .11 נייר סופג. את תמיסת הצבע על ידי ספגו .12 . PBSשל טפטפו שתי טיפות .13 נייר סופג.על ידי התמיסה ספגו את .14

על דפנות הזכוכית המכסה על מנת לק שקוףמריחו . זכוכית מכסה מעל הטיפההניחו בעדינות .15. לאטום את הדוגמא

הדוגמא מוכנה לצפייה במיקרוסקופ. .16

:התבוננות במיקרוסקופ. ג במיקרוסקופ. התייחסו לנקודות וחוברת העבודה התבוננו בתאים הצבועיםבהנחיית המדריכים

הבאות: בכל צביעה?. אילו אברונים נצבעו 1 . האם הצביעה הייתה בהתאם למצופה?2 חיים או מתים? תאי הלחיהאם החיות, מבדק. מה התוצאה של 3 מה אחוז התאים החיים או המתים מכלל התאים חיותהעל פי צביעת לדעת אם יכולים. האם 4

לא מה לדעתכם יש לעשות על מנת לקבוע זאת.אם שבדקנו?

יסייעו לכם בהכנת דו"ח המעבדה. הנחיות לכתיבת הדו"ח נמצאות באתר.התשובות לשאלות

בהצלחה!